Summary
Många egenskaper hos insektseusocialitet är beroende av kommunikation och arbetsfördelning inom kolonin. Genmanipulation av viktiga reglerande gener i myrembryon via mikroinjektion och CRISPR-medierad mutagenes ger insikter om arten av altruistiskt beteende hos eusociala insekter.
Abstract
De unika egenskaperna hos eusociala insekter, såsom socialt beteende och reproduktiv arbetsfördelning, styrs av deras genetiska system. För att ta itu med hur gener reglerar sociala egenskaper har vi utvecklat mutanta myror via leverans av CRISPR-komplex till unga embryon under deras syncytialstadium. Här tillhandahåller vi ett protokoll över CRISPR-medierad mutagenes i Harpegnathos saltator, en ponerinmyrart som uppvisar slående fenotypisk plasticitet. H. saltatormyror föds lätt upp i laboratoriemiljö. Embryon samlas in för mikroinjektion med Cas9-proteiner och in vitro-syntetiserade små guide-RNA (sgRNA) med hjälp av hemmagjorda kvartsnålar. Embryon efter injektion föds upp utanför kolonin. Efter uppkomsten av den första larven transporteras alla embryon och larver till en holk med några vårdpersonal för vidare utveckling. Detta protokoll är lämpligt för att inducera mutagenes för analys av kastspecifik fysiologi och socialt beteende hos myror, men kan också tillämpas på ett bredare spektrum av hymenopteraner och andra insekter.
Introduction
Utvecklingen av eusocialitet hos insekter, nämligen de av ordningarna Hymenoptera och Blattodea (tidigare Isoptera), har resulterat i unika och ofta sofistikerade beteendedrag som manifesterar sig på både individ- och koloninivå. Reproduktiv arbetsfördelning, ett drag som kännetecknar de mest avancerade grupperna av sociala insekter, involverar ofta kastsystem som består av flera beteendemässigt och ofta morfologiskt distinkta grupper. Sådan beteendemässig och morfologisk mångfald mellan kaster styrs inte bara av deras genetiska system utan också ofta av miljön 1,2,3,4, vilket gör eusociala insekter attraktiva ämnen för genetisk och epigenetisk forskning.
Förmågan att manipulera det genetiska systemet hos eusociala insekter har visat sig vara utmanande eftersom många arter inte parar sig och reproducerar sig i laboratoriemiljöer. De flesta eusociala insekter har också mycket få reproduktiva individer i en koloni, vilket begränsar antalet avkommor som kan produceras och följaktligen begränsar provstorleken för genetisk manipulation5. Dessutom har många eusociala insekter långa generationstider jämfört med insekter som vanligtvis används för genetiska studier (som Drosophila), vilket ökar svårigheten att etablera genetiska linjer5. Vissa eusociala arter kan dock generera en stor andel reproduktivt aktiva individer i en koloni, vilket lindrar utmaningarna och ger möjligheter att etablera mutanta eller transgena linjer.
När det gäller ponerinmyrarten, Harpegnathos saltator, kan alla kvinnliga arbetare bli reproduktivt aktiva vid en drottnings död eller social isolering. Dessa arbetare kallas "gamergates" och kan användas för att generera nya kolonier6. Dessutom kan det finnas mer än en gamergate närvarande i en koloni, vilket ökar avkommaproduktionen 5,7,8. Hittills har muterade och/eller transgena linjer utvecklats i det europeiska honungsbiet, Apis mellifera, och hos myrarterna H. saltator, Ooceraea biroi och Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Genetiska analyser hos sociala bin och myror har banat väg för en bättre förståelse av eusocialitet, vilket ger en rad möjligheter att studera gener och deras inverkan på eusocialt insektsbeteende och kastspecifik fysiologi.
Här tillhandahåller vi ett protokoll för genmodifiering via CRISPR/Cas9-systemet i H. saltator. Specifikt användes denna teknik för att generera en bakteriemutation i orco, genen som kodar för den obligatoriska samreceptorn för alla luktreceptorer (OR)10. OR-gener har utvidgats anmärkningsvärt i hymenopteran eusociala insekter16, och orco spelar en viktig roll i insektslukt; I avsaknad av detta monteras eller fungerar inte de yttersta randområdena normalt. Mutationer av orco-genen stör därför luktkänsla, neural utveckling och associerade sociala beteenden 9,10.
I detta protokoll införs Cas9-proteiner och små guide-RNA (sgRNA) i myrembryon med användning av mikroinjektion i syfte att inducera mutagenes av en målgen. Här kommer vi att beskriva mikroinjektionsproceduren i detalj tillsammans med anvisningar om vård av kolonier och injicerade embryon. Dessa metoder är lämpliga för att inducera mutagenes i en mängd olika gener i H. saltatormyror och kan tillämpas på ett bredare spektrum av hymenopteraninsekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Regelbundet underhåll av Harpegnathos saltatorkolonier
- Håll vilda kolonier av H. saltator i transparenta plastlådor i ett myruppfödningsrum vid 22-25 ° C och en fotoperiod på 12 timmars ljus: 12 timmar mörkt (12L: 12D) belysningsschema.
- Använd små lådor (9,5 x 9,5 cm2) för att föda upp enskilda arbetare eller små kolonier. Använd medelstora lådor (19 x 13,5 cm 2) eller stora lådor (27 x 19 cm2) för att föda upp större kolonier (figur 1).
- För att skapa holkar, använd gips för att göra golv för lådorna. Eftersom det våta gipset torkar i mediet och de stora lådorna, tryck in ett skumblock i gipset några centimeter djupt och några centimeter från baksidan av lådan för att utse ett nedre boområde. När gipset har torkat, täck det utsedda boområdet med en fyrkantig glasbit.
I små lådor behöver du inte ange ett lägre boområde. Om myror försummar att använda den utsedda nedre boregionen kan det hjälpa att täcka glaset med en fyrkantig bit röd cellofan. Detta ger intrycket av ett mörkt underjordiskt utrymme som liknar bon som H. saltator använder i naturen och kan uppmuntra dem att flytta sin kull till den utsedda regionen.
- Foderkolonier med levande syrsor två gånger i veckan.
OBS: Kolonier bör matas tillräckligt för att de konsumerar alla syrsor innan de nästa utfodring. Foder alla isolerade myror och mutanta myrkolonier med syrsor som är förstuckna av arbetare i en vanlig koloni 2-3 gånger varje vecka. - Applicera vatten regelbundet på gipsholkgolvet med en tvättflaska.
OBS: Gipset ska vara tillräckligt fuktigt för att det inte ska kännas dammigt vid beröring, men det ska vara tillräckligt torrt för att allt tillsatt vatten absorberas av gipset. Det är viktigt att boet inte vattnas för mycket. I genomsnitt behöver holkar en liten mängd vatten tillsättas en gång i veckan. - När utfodring sker, ta bort skräp och döda individer. Frys allt avfall och döda myror över natten vid -30 °C innan du slänger dessa material som vanligt skräp.
- Tillsätt en nypa torkat sågspån till kolonier med jämna mellanrum; Detta hjälper larver när de genomgår valp och hjälper arbetare att hålla holken ren.
2. Beredning av kvartsglas mikroinjektionsnålar
- Använd en mikropipettdragare för att dra glasmikroinjektionsnålar.
- Välj glaset som ska dras. Se till att glaset som används har förvarats i en dammfri och ren miljö.
OBS: Här har tunnväggigt trådformigt kvartsglas med en ytterdiameter på 1,0 mm, innerdiameter på 0,5 mm och längd på 7,5 cm använts för att producera mikroinjektionsnålar. Om du injicerar ett mjukt embryo kan borosilikatnålar också vara tillämpliga, men borosilikatnålar kan inte tränga igenom hård korion. - Ställ in parameterinställningarna för avdragaren. Använd en tvåstegsprocess för att dra mikroinjektionsnålar för H. saltatorembryon : parametrar för det första steget inkluderar värme på 575, glödtråd på 3, hastighet på 35, fördröjning på 145 och ett drag på 75; Parametrar för det andra steget inkluderar värme på 425, glödtråd på 0, hastighet på 15, fördröjning på 128 och ett drag på 200. Efter det andra steget, se till att den resulterande nålen har en avsmalning på 2 mm och en spets på 0,5 μm (figur 2).
OBS: Denna uppsättning parametrar, tillsammans med parametrar för andra nåltyper, finns i bruksanvisningen17. Manualer för pipettdragare ger ofta rekommenderade parametrar för en mängd olika tekniker. Vissa försök och fel kan krävas för att avgöra vilka parametrar som genererar de bästa nålarna för specifika behov. En kort avsmalning är idealisk för H. saltatorinjektioner, eftersom den kan tränga igenom den hårda korionen av H. saltatorembryon. Om du injicerar ett mjukt embryo, t.ex. ett som har dekorionerats (t.ex. Drosophila), kan en längre avsmalning på cirka 10 mm ge bättre resultat. Bruksanvisningar för pipettdragare ger vanligtvis specifika parametrar för att dra nålar som är lämpliga för olika behov. Det är viktigt att handskar bärs vid hantering av glasfilament och dragnålar. Oljor från bara händer kan överföras till glaset om handskar inte bärs. - När parametrarna är inställda, använd en mikropipettdragare för att dra nålar för mikroinjektion. Se till att nålarna förvaras i en dammfri och ren miljö tills de används.
OBS: Det rekommenderas att använda nydragna mikroinjektionsnålar. Om fördragna nålar används ska de förvaras ordentligt i en låda för att förhindra skador på nålspetsar och potentiell kontaminering. Nålar som har genomgått långvarig lagring rekommenderas inte för embryoinjektioner.
3. Beredning av mikroinjektor
- Använd en mikroinjektor för att injicera önskat material i myrembryon.
- Förbered mikroinjektionsblandningen av Cas9-proteiner och in vitro-syntetiserade små guide-RNA (sgRNA)10. Håll blandningen på is tills det är dags att ladda en mikroinjektionsnål. När mikroinjektionsblandningen inte används, förvara den vid -80 °C.
OBS: Koncentrationerna varierar i olika arter. Hög koncentration kan orsaka hög dödlighet, medan låg koncentration kan minska effektiviteten. Vi använder 0,2 μg/μL Cas9-proteiner och 0,2 μg/μL sgRNA för H. saltator embryoinjektion. Utformningen av våra sgRNA följde ett tidigare etablerat protokoll18. Gensekvenser erhölls från DNA-databaser. Genomsekvensen för H. saltator rapporterades också tidigare19,20. - Justera injektionsparametrarna för H. saltatorembryon : ett injektionstryck på 140 hektopascal (hPa), ett konstant tryck på 70 hPa och en tid på 0,4 sekunder. Justera konstant tryck så att materialet bara flyter i en riktning. Justera injektionstrycket och tiden endast om inget material flyter från nålen till embryot.
OBS: Om du injicerar en annan typ av embryo är den primära parametern som kan förändras konstant tryck, vilket är ansvarigt för att säkerställa att vätska från embryot inte strömmar tillbaka in i nålen. Volymen kontrolleras inte för i detta protokoll. Inställning av parametrarna för mikroinjektorn är tillräcklig för att erhålla konsekventa injektioner. - Ladda en mikroinjektionsnål med 2 μL av blandningen med hjälp av mikroladdarpipettspetsar. Gör detta långsamt för att säkerställa att inga bubblor bildas i blandningen.
OBS: Om bubblor bildas kan det vara svårt att upprätthålla konsekventa mikroinjektioner. - Bryt bara nålspetsen genom att bryta längs tejpens kant så att en smal avsmalning fortfarande bibehålls. Se till att nålen är bruten precis så att spetsen öppnas, men inte så mycket att avsmalningen bryts av.
OBS: Viktigt, om nålens öppning är för bred efter att ha gått sönder, kommer användaren att se vätska rinna ut ur nålen när den är monterad på den trycksatta mikroinjektorn före applicering av injektionstryck. Vissa mikroinjektionsprotokoll rekommenderar att du bryter nålar genom att klippa spetsen med sax. Denna metod rekommenderas inte, eftersom sax kan orsaka att nålspetsen splittras. Att injicera embryon med en krossad nål kommer att vara mycket skadligt. - Montera nålen på mikromanipulatorn
4. Injektion av embryon
- Välj embryon för mikroinjektion från syncytialstadiet: den tid under utveckling där kärnor delar sig utan cytokinese.
OBS: Detta är den perfekta tiden under utveckling för genomredigering genom mikroinjektion, som tidigare upptäckts i Drosophila21. H. saltatorembryon passerar syncytialstadiet och når cellularisering runt 36 timmar efter äggavsättning10. Högre effektivitet uppnås om yngre embryon används för injektioner. - Linje embryon på en bit dubbelsidig tejp som sitter fast på en glasmikroskopglas. Se till att embryon är väl säkrade på tejpen för att förhindra rörelse under injektionen. Lägg embryona i vertikal riktning, så att embryonets laterala sida ligger vid tejpens kant (figur 3). Placera bilden och fodrade embryon på mikroskopets scen vid en utsedd mikroinjektionsarbetsstation.
OBS: Det rekommenderas att embryona är ordnade så att successiva injektioner kan utföras genom att flytta bilden på scenen istället för att justera nålens position med varje injektion. Detta gör det möjligt att utföra successiva injektioner mer effektivt. - Rikta in nålen mot det första embryot som ska injiceras med mikromanipulatorn (figur 4a).
- Punktera nålen i sidled i det första embryot längs dess dorsala/ventrala axel under ett mikroskop.
- Injicera mikroinjektionsblandningen. Leta efter liten rörelse av embryot, vilket indikerar en ökning av det inre trycket på grund av den injicerade vätskan. Se dessutom efter bildandet av en liten droppe som innehåller synliga spår av vävnad och/eller lipid på embryots yttre membran (figur 4b).
OBS: Förekomst av spår av vävnad och/eller lipid i droppen indikerar att nålen framgångsrikt har punkterat både korion och vitellinmembran i embryot. Om spår av dessa material inte finns, utfördes injektionen inte framgångsrikt och bör upprepas. Efter några sekunder kommer droppen att reabsorberas av embryot och kommer inte längre att vara synligt. - Ta försiktigt bort nålen från embryot omedelbart och fortsätt till nästa genom att justera mikroskopglasets position. Upprepa tills alla embryon har injicerats.
- När alla embryon på bilden har injicerats framgångsrikt, överför bilden till en fuktig låda i 1 timme för att ge embryona tid att återhämta sig från injektionsprocessen innan de tas bort från bilden.
5. Uppfödning av injicerade embryon
- Efter 1 timmes inkubation i en fuktig låda, ta försiktigt bort de injicerade embryona från tejpen med fjäderviktstång och överför dem till ett rör fyllt med en liten mängd 70% etanol. Invertera röret flera gånger för att överföra embryon till botten av röret. Upprepa etanoltvätten en gång, följt av tre tvättar med autoklaverat vatten.
- Använd en liten och mjuk pensel, överför alla injicerade embryon till 1% agarplattor med 2% antibiotika-antimykotisk. Applicera antibiotikum-antimykotiska efter att hällda agarplattor har svalnat genom att sprida sig över plattans yta med hjälp av en cellspridare. Försegla agarplattan med parafilm för att förhindra uttorkning av agar.
OBS: Försök inte att återföra injicerade embryon till en koloni efter injektioner eftersom arbetare kan förstöra de flesta injicerade embryon. Överlevnaden optimeras därför genom att embryon kan utvecklas på agarplattor utanför en normal kolonimiljö. - Inkubera agarplattorna vid 25 °C i cirka 4 veckor. Kontrollera regelbundet för kläckning.
- När det första embryot har kläckts till en larv, återför alla embryon och larver till en holk med några unga sjuksköterskor för att ta hand om kläckningarna. Mata med syrsor som är förstuckna av en större vildtypskoloni, ta bort avfallsprodukter och tillsätt vatten enligt samma protokoll som diskuteras i avsnitt 1.
OBS: Små lådor (9,5 x 9,5 cm2) är idealiska för sådana kolonier. H. saltator reproducerar väl i fångenskap. Därför kan mutanta embryon uppfödas till vuxen ålder. Isolering av mutanta vuxna inducerar övergång till det reproduktiva gamergate-stadiet. Kontrollerade kors används för att etablera mutantkolonier med heterozygota eller homozygota individer (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av protokollet som tillhandahålls här utfördes genomredigering i Harpegnathos saltatorembryon framgångsrikt. Dessa resultat validerades via polymeraskedjereaktion och pGEM-kloning av DNA extraherat från injicerade embryon följt av DNA-sekvensering. Effektiviteten av somatisk mutagenes med användning av detta protokoll nådde cirka 40%. F1-mutanta hanar parades med vilda honor för att producera heterozygota F2-honor som, om de inte parades, producerade F3-hanar. Mutanta F3-hanar parades med heterozygota honor för att producera F4-homozygota mutanta honor. Frånvaron av målpeptiden bekräftades ytterligare via masspektrometri hos dessa F4-homozygota kvinnliga individer. Vingar klipptes från män med mikrodissektionssax och användes för genotypningsändamål. Eftersom arbetare inte har vingar offras de normalt och genotypas efter experiment. Som ett resultat av framgångsrik mutagenes observerades ovanliga beteenden som korrelerade med förlust av målgenen. Förlusten av orco resulterade i onormala beteenden relaterade till förlust av feromonavkänning, oförmåga att upptäcka byte, nedsatt fecundity och vandring från kolonin. Dessutom uppvisade orcomutanta myror ett minskat antal luktreceptorneuroner och antennallobsglomeruli, vilket tyder på att neuroanatomi hos myror är beroende av luktreceptorfunktionalitet10.
Figur 1: Harpegnathos saltator bon. (A) Yttre egenskaper hos en 19 x 13,5 cm2 holk som innehåller en H. saltatorkoloni. (B) Inre egenskaper hos en 19 x 13,5 cm2 holk som innehåller en H. saltatorkoloni. Observera närvaron av ett nedre boområde under en fyrkantig glasbit. (C) Yttre egenskaper hos en 9,5 x 9,5 cm2 holk som innehåller en liten H. saltatorkoloni. En sådan holk är också lämplig för isolerade arbetare och mutantkolonier. (D) Inre egenskaper hos en 9,5 x 9,5 cm2 holk som innehåller en liten H. saltatorkoloni. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Nål för Harpegnathos saltator embryo mikroinjektion. Observera nålens tunna avsmalning (markerad med en pil). Nålen kan öppnas genom att bryta spetsen något. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Inriktning av embryon på dubbelsidig tejp. Embryon ska justeras så att deras längd är parallell med bandets långa kant. Detta gör att successiva injektioner kan utföras med lätthet genom att flytta bilden på scenen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Embryo och nål sett under mikroinjektion . (A) Nålens korrekta inriktning med embryot före injektionen. Nålen vilar vinkelrätt mot mittpunkten på embryots sida, det typiska injektionsstället. B) Embryot och nålen efter en lyckad injektion. En liten droppe sticker ut från embryots sida (markerad med en pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Diagram över grundläggande mutantkorsningar. CRISPR kan inducera mutationer på målgenen hos F0-honor, som därefter isoleras vid vuxen ålder för att inducera gamergate-övergången. Om mutationer förekommer i könsceller kan omogna gamergates lägga mutanta hanägg. F1-mutanta vuxna hanar kan paras med vilda honor för att generera heterozygota avkommor, eller så kan de paras med heterozygota honor för att generera homozygota eller heterozygota avkommor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av eusocialitet bland insekter, inklusive myror, bin, getingar och termiter, har resulterat i uppkomsten av nya beteendemässiga och morfologiska egenskaper, av vilka många förstås påverkas av en kombination av miljömässiga och genetiska faktorer 1,2,3,4. Tyvärr har eusociala insekters attraktivitet och användbarhet som forskningsmodeller inom genetikområdet hindrats av svårigheterna i samband med mutagenes i denna grupp. Detta hinder uppstår på grund av reproduktiv arbetsfördelning, ett viktigt drag hos eusociala insekter där endast ett fåtal medlemmar av en koloni kan reproducera. Denna egenskap sätter begränsningar för antalet mutanta avkommor och gör utvecklingen av genetiska linjer utmanande5. Ponerinmyrarten, Harpegnathos saltator, ger en lösning på detta dilemma, eftersom alla kvinnor kan bli reproduktiva gamergates när de isoleras5. Här tillhandahåller vi metoder för mutagenes i H. saltator med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet, som levereras via embryomikroinjektion.
Korrekt koloniunderhåll och urval av embryon vid lämpligt utvecklingsstadium för mikroinjektion är avgörande. Tidigare arbete fastställde att syncytialstadiet i insektsutveckling är det idealiska steget för genomredigering21, men tidpunkten för detta stadium i H. saltator embryonal utveckling var tidigare okänd. Via kärnfärgning av tidiga embryosektioner kunde vi fastställa att syncytialstadiet i H. saltatorembryon varar fram till 36 timmar efter äggavsättning, så att vi kan bestämma när vi ska välja nya embryon för mikroinjektion10.
Att välja parametrar för nåldragning och för mikroinjektion kan vara utmanande. Faktorer att tänka på när du väljer parametrar för nåldragning inkluderar (1) vilken typ av glas som används, (2) det önskade syftet med nålen, (3) önskad spetsstorlek, (4) mängden motstånd som nålen kommer att uppleva under injektionen, (5) önskad avsmalnande längd och (6) vilken typ av cell eller organism som kommer att injiceras. Förslag och riktlinjer för att dra olika nåltyper finns i olika bruksanvisningar17. På samma sätt finns det faktorer att ta hänsyn till när man väljer parametrar för mikroinjektion, inklusive (1) storleken på nålen som används och (2) de embryon som ska injiceras22. Medan detta protokoll fokuserar på mikroinjektion i H. saltatorembryon , kan teknikerna variera hos andra insekter med modifiering av dessa parametrar. I synnerhet kommer parametrarna för nåldragning och injektion att skilja sig åt om embryot i fråga är mjukt eller dekorionerat. H. saltatorembryon har en tuff korion, och injektionsresultaten är bäst när en nål med kort avsmalning används (ca 2 mm). Embryon som har mindre fast korion kan injiceras med nålar med längre avsmalningar (cirka 10 mm).
I H. saltator kan injicerade embryon inte omedelbart återföras till en koloni, eftersom det riskerar att förstöras av vårdpersonal. Om du tillämpar detta protokoll på andra sociala insektsarter kanske detta inte är fallet. Att bestämma de bästa uppfödningsmetoderna efter mikroinjektion hos andra arter kan kräva viss prövning och fel. När det gäller H. saltator måste embryon födas upp på agarplattor tills de kläcks. När de väl kläckts kan de återföras säkert till en liten koloni med några arbetare för att ta hand om den injicerade kullen10. En liknande metod för embryovård används i brandmyror (Solenopsis invicta) och klonala raidermyror (Ooceraea biroi) för att öka överlevnaden för injicerade embryon 9,15. Vid vuxen eklosion kan mogna mutanta honor hållas individuellt eller i små kolonier för att påbörja sin reproduktionscykel. Anvisningar för vård av H. saltatormutanter finns i detta protokoll, men om man använder en annan art bör anvisningar för vård av injicerade embryon och mutanta vuxna ändras för att passa artens behov.
Protokollet som tillhandahålls här är optimerat för mutagenes, där specifikt icke-väsentliga gener är riktade. I detta fall riktades orco-genen, och mutationer i orco påverkade inte myröverlevnad till vuxen ålder. På samma sätt kan detta protokoll användas för att rikta in sig på andra icke-väsentliga gener, inklusive de som är associerade med andra sensoriska receptorer. Om målgenen är väsentlig måste transgena myror genereras istället, antingen via CRISPR eller transposon. Transposonmedierad transgenes har använts i honungsbin13 och kan gälla myror. Om det önskade resultatet är transgena organismer måste de injicerade materialen vara olika. Processer efter injektion kommer emellertid att vara likartade, och därför kommer vissa aspekter av detta protokoll att vara fördelaktiga trots skillnaden i önskat resultat.
Sammantaget är H. saltator idealisk för användning som modellorganism och för prestanda av genetiska kors på grund av dess plastiska reproduktionssystem där arbetare börjar reproducera efter isolering10. Detta skiljer denna myrart från andra myror där CRISPR/Cas9-teknik har etablerats, till exempel O. biroi, en art där alla honor reproducerar klonalt. H. saltator erbjuder unika forskningsmöjligheter bland organismer i sitt slag eftersom genetiska släktlinjer kan etableras och mutationer kan upprätthållas över generationer av denna art. Nyheten i detta system gör det möjligt för forskare att inte bara generera mutanta myror utan också att utveckla transgena linjer i framtiden. Detta ger möjligheter till ny forskning för att studera genetisk kontroll av avancerad eusocialitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Danny Reinbergs och Claude Desplans laboratorier vid New York University och Jürgen Liebigs laboratorium vid Arizona State University för deras stöd för myrgenetik. Hua Yan erkänner stöd från National Science Foundation I/UCRC, Center for Arthropod Management Technologies under bidrag nr IIP-1821914 och av industripartners. Maya Saar stöddes av United States - Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. Drosophila Cytogenetics Protocols. , Humana Press. (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
