Summary
Presentamos un protocolo práctico, paso a paso, rápido para la extracción del cerebro del ratón y la disección de regiones discretas del tejido cerebral fresco. La obtención de regiones cerebrales para el análisis molecular se ha convertido en una rutina en muchos laboratorios de neurociencia. Estas regiones cerebrales se congelan inmediatamente para obtener datos transcriptómicos de alta calidad para el análisis a nivel de sistema.
Abstract
El cerebro es el centro de mando del sistema nervioso de los mamíferos y un órgano con una enorme complejidad estructural. Protegido dentro del cráneo, el cerebro consiste en una cubierta externa de materia gris sobre los hemisferios conocida como corteza cerebral. Debajo de esta capa residen muchas otras estructuras especializadas que son esenciales para múltiples fenómenos importantes para la existencia. La adquisición de muestras de regiones específicas del cerebro macroscópico requiere pasos de disección rápidos y precisos. Se entiende que a nivel microscópico, existen muchas subregiones y probablemente cruzan los límites regionales arbitrarios que imponemos con el propósito de esta disección.
Los modelos de ratón se utilizan rutinariamente para estudiar las funciones y enfermedades del cerebro humano. Los cambios en los patrones de expresión génica pueden limitarse a áreas específicas del cerebro dirigidas a un fenotipo particular dependiendo del estado de enfermedad. Por lo tanto, es de gran importancia estudiar la regulación de la transcripción con respecto a su organización estructural bien definida. Una comprensión completa del cerebro requiere estudiar distintas regiones cerebrales, definir conexiones e identificar diferencias clave en las actividades de cada una de estas regiones cerebrales. Una comprensión más completa de cada una de estas regiones distintas puede allanar el camino para tratamientos nuevos y mejorados en el campo de la neurociencia. Aquí, discutimos una metodología paso a paso para diseccionar el cerebro del ratón en dieciséis regiones distintas. En este procedimiento, nos hemos centrado en la extirpación y disección del cerebro C57Bl / 6J (6-8 semanas de edad) en ratones machos en múltiples regiones utilizando puntos de referencia neuroanatómicos para identificar y muestrear regiones cerebrales discretas funcionalmente relevantes y relevantes para el comportamiento. Este trabajo ayudará a sentar una base sólida en el campo de la neurociencia, lo que llevará a enfoques más centrados en la comprensión más profunda de la función cerebral.
Introduction
El cerebro, junto con la médula espinal y la retina, comprende el sistema nervioso central que ejecuta comportamientos complejos, controlados por tipos de células especializadas, posicionadas con precisión e interactivas en todo el cuerpo1. El cerebro es un órgano complejo con miles de millones de neuronas interconectadas y glía con circuitos precisos que realizan numerosas funciones. Es una estructura bilateral con dos lóbulos distintos y diversos componentes celulares2. La médula espinal conecta el cerebro con el mundo exterior y está protegida por hueso, meninges y líquido cefalorraquídeo y enruta mensajes hacia y desde el cerebro 2,3,4. La superficie del cerebro, la corteza cerebral, es desigual y tiene pliegues distintos, llamados giros, y surcos, llamados surcos, que separan el cerebro en centros funcionales5. La corteza es lisa en mamíferos con un cerebro pequeño 6,7. Es importante caracterizar y estudiar la arquitectura del cerebro humano para comprender los trastornos relacionados con las diferentes regiones cerebrales, así como sus circuitos funcionales. La investigación en neurociencia se ha expandido en los últimos años y se están utilizando una variedad de métodos experimentales para estudiar la estructura y función del cerebro. Los desarrollos en los campos de la biología molecular y de sistemas han marcado el comienzo de una nueva era de exploración de la compleja relación entre las estructuras cerebrales y el funcionamiento de las moléculas. Además, la biología molecular, la genética y la epigenética se están expandiendo rápidamente, lo que nos permite avanzar en nuestro conocimiento de los mecanismos subyacentes involucrados en cómo funcionan los sistemas. Estos análisis se pueden llevar a cabo de forma mucho más localizada, para ayudar a orientar la investigación y el desarrollo de terapias más efectivas.
El cerebro de los mamíferos se define estructuralmente en regiones discretas claramente identificables; Sin embargo, las complejidades funcionales y moleculares de estas estructuras discretas aún no se comprenden claramente. La naturaleza multidimensional y de múltiples capas del tejido cerebral hace que este paisaje sea difícil de estudiar a nivel funcional. Además, el hecho de que múltiples funciones sean realizadas por la misma estructura y viceversa complica aún más la comprensión del cerebro8. Es vital que el enfoque experimental ejecutado para la caracterización estructural y funcional de las regiones cerebrales utilice metodologías de investigación precisas para lograr consistencia en el muestreo para correlacionar la arquitectura neuroanatómica con la función. La complejidad del cerebro se ha explicado recientemente utilizando la secuenciación de células individuales 9,10, como el giro temporal del cerebro humano, que se compone de 75 tipos de células distintas 11. Al comparar estos datos con los de una región análoga del cerebro del ratón, el estudio no solo revela similitudes en su arquitectura y tipos de células, sino que también presenta las diferencias. Por lo tanto, para desentrañar los complejos mecanismos, es importante estudiar diversas regiones del cerebro con total precisión. Las estructuras y funciones conservadas entre un cerebro humano y de ratón permiten el uso de un ratón como sustituto preliminar para dilucidar la función cerebral humana y los resultados conductuales.
Con el avance de los enfoques de biología de sistemas, la obtención de información de regiones cerebrales discretas en roedores se ha convertido en un procedimiento clave en la investigación de la neurociencia. Mientras que algunos protocolos, como la microdisección por captura láser12, pueden ser costosos, los protocolos mecánicos son económicos y se realizan utilizando herramientas comúnmente disponibles13,14. Hemos utilizado múltiples regiones cerebrales para ensayos transcriptómicos15 y hemos desarrollado un procedimiento práctico y rápido para diseccionar regiones cerebrales de ratón de interés paso a paso en poco tiempo. Una vez disecadas, estas muestras pueden almacenarse inmediatamente en condiciones frías para preservar los ácidos nucleicos y las proteínas de estos tejidos. Nuestro enfoque se puede realizar más rápido, lo que lleva a una alta eficiencia y permite menos posibilidades de deterioro de los tejidos. En última instancia, esto aumenta las posibilidades de generar experimentos reproducibles y de alta calidad utilizando tejidos cerebrales.
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Protocol
El manejo de animales y los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices europeas, nacionales e institucionales para el cuidado de los animales. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro de Investigación de Salud Ambiental del Ejército de los Estados Unidos, ahora Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed (WRAIR) y se realizaron en una instalación acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado Internacional de Animales de Laboratorio (AAALAC).
NOTA: El procedimiento se realizará en ratones machos de seis a ocho semanas de edad de la cepa C57BL/6j sacrificados por luxación cervical16. No se realizan perfusiones en nuestro laboratorio, pero este protocolo podría modificarse mediante el cual se podrían realizar perfusiones para limpiar la sangre de la vasculatura. Todos los suministros necesarios para la disección se enumeran en la Tabla de materiales. La disección se subdivide en tres componentes, incluida la extirpación del cerebro, la extirpación de la glándula pituitaria y la disección cerebral. La intención de la recolección de tejido cerebral es procesarlos para ensayos transcriptómicos después de extracciones de ARN. Tan pronto como se disecciona la región del cerebro, transferimos inmediatamente cada una de las regiones del cerebro a un vial congelador ya etiquetado y luego almacenamos el vial en nitrógeno líquido o -80 ° C.
NOTA: El conocimiento profundo de la neuroanatomía es esencial para realizar este procedimiento. Las secciones horizontales y longitudinales, así como las secciones transversales habituales, deben estudiarse y aprenderse. Dado que el tejido cerebral se degrada muy rápidamente, no hay tiempo para consultar un atlas mientras se realiza este procedimiento.
1. Eliminación del cerebro del ratón
- Sujete el maxilar de la cabeza decapitada con un hemostático (Figura 2i) y use una gasa para reflejar el cuero cabelludo rostralmente creando un campo seco en el dorso del cráneo (Figura 2ii).
- Inserte las finas tijeras curvas en el foramen magnum para separar las meninges adheridas. Aquí, inserte las tijeras en la abertura en la base del cráneo es el foramen magnum, donde la médula espinal pasa con la hoja apuntando verticalmente (posición de las 12 en punto), pero paralela y presionando contra la superficie interior del hueso de la placa basal (es decir, escama occipital) y girando la hoja cuarenta y cinco ° hacia el lado izquierdo y luego hacia el lado derecho.
- Continúe girando la muñeca para arrancar el hueso de la placa basal que cortará el centro del hueso restante continuando hacia el hueso occipital y los huesos intraparietales haciendo palanca en los huesos de izquierda a derecha hasta que se eliminen. De manera similar, retire el hueso occipital y el hueso intraparietal para exponer el cerebelo.
NOTA: En este punto, la estructura ósea hueca llamada ampollas timpánicas, en la porción posterior ventral del cráneo que encierra partes del oído medio e interno, se puede eliminar a menos que se diseccionen los lóbulos posterior y anterior de las hipófisis (Figura 2iii). - Retire las inserciones musculares a la cresta temporal con una cuchilla de tijera curva y afilada. Coloque una extremidad de las tijeras afiladas curvas debajo de la sutura lambdoidea que penetra en la unión de los senos transversal y sagital (Figura 2iv).
- Avance las tijeras rostralmente a lo largo de la sutura sagital media hasta el bregma y córtela muy suavemente mientras levanta cuidadosamente hacia arriba para evitar la laceración de las cortezas cerebrales. Este es un paso crítico en el procedimiento (Figura 2v).
- En este paso, los huesos parietales se levantan y rotan, raspando así la superficie interna del hueso para identificar y cortar las uniones meníngeas restantes. Agarra el hueso temporal haciendo palanca hacia afuera, lejos del cerebro. Retire el hueso frontal de cada lado usando tijeras curvas o un rongeur en la órbita y cortando coronalmente en ángulo recto con la cresta orbital, pero no más allá de la línea media (Figura 2vii).
- Haga dos cortes paralelos y separados aproximadamente 4 mm en el plano sagital (Figura 2viii).
NOTA: No corte ambos lados con un solo golpe. - Retirar los fragmentos del hueso frontal evitando lacerar la superficie cerebral (Figura 2ix). En este punto, use una tijera fina para cortar la duramadre, que debe ser accesible entre los bulbos olfativos.
- Invierta suavemente el cráneo para permitir que la gravedad ayude en la extirpación del cerebro, mientras continúa identificando y cortando los accesorios meníngeos restantes y los nervios craneales. El cerebro se liberará cortando el nervio trigémino más grande unido al cerebro y es claramente visible extendiéndose desde la base del calvario (Figura 2x).
NOTA: Transfiera el cerebro a una solución salina fría (citrato de sodio sin RNasa helado (0,9%) o solución salina fisiológica (0,9%) para una disección adicional.
2. Disección de las hipófisis anterior y posterior
NOTA: Las glándulas pituitarias están cubiertas por una membrana muy dura en forma de tienda de campaña, con una cresta que corre lateralmente entre los nervios trigémino izquierdo y derecho. Estas estructuras son extremadamente suaves y delicadas y, como tal, se recomienda que los lóbulos posterior y anterior de las glándulas pituitarias se diseccionen por separado en etapas, in situ, directamente del cráneo. Inmediatamente después de la disección, transferir la glándula pituitaria respectiva a un vial preetiquetado y almacenar el vial en nitrógeno líquido, preferiblemente a -80 °C. La glándula pituitaria descansa exactamente sobre la unión de los huesos occipital y basefenoides; Si se flexionan, la arquitectura pituitaria se interrumpe.
- Mantenga las ampollas auditivas intactas para asegurarse de que la anatomía pituitaria esté intacta y sea fácilmente identificable (Figura 2ix).
- Diseccionar el lóbulo posterior de la hipófisis seguido del lóbulo anterior de la hipófisis, del resto del cráneo.
- Haga un corte parasagital extremadamente pequeño en ambos lados en la cresta de la tienda membranosa y levante el lóbulo posterior de la hipófisis con fórceps ultrafinos, teniendo cuidado de no alterar el tejido pituitario anterior (Figura 2x).
- Haga un corte sagital entre los márgenes laterales del lóbulo anterior de la hipófisis y el nervio trigémino más cercano y levante el lóbulo anterior de la hipófisis a partir de entonces (Figura 2x).
3. Disección cerebral del ratón
NOTA: Inmediatamente después de la extirpación del cerebro y la hipófisis, se realiza una disección adicional en un bloque de acero inoxidable preenfriado (Figura 3). Después de la disección, transfiera las regiones cerebrales a viales preetiquetados y transfiera los viales preferiblemente a nitrógeno líquido de lo contrario -80 ° C. Las estructuras producidas por el método descendente (en orden cronológico) incluyen potencialmente las siguientes: cerebelo (CB), tronco encefálico/cerebro posterior (protuberancia y bulbo raquídeo) (HB), bulbos olfatorios (OB) como bulbos olfativos accesorios, corteza prefrontal medial (MPFC), corteza prefrontal lateral (FCX), cuerpo estriado anterior y posterior (ST), cuerpo estriado ventral (VS) compuesto por el núcleo accumbens (NAC) y tubérculo olfativo (OT), tabique (SE), área preóptica, corteza piriforme (PFM), hipotálamo (HY), amígdala (AY), hipocampo (HC), corteza cingulada posterior (CNG), corteza entorrinal (ERC), mesencéfalo (MB) con tálamo y resto de la corteza cerebral (ROC) (Tabla 1). Se discutirán regiones específicas en orden de aislamiento, trabajando con un solo hemisferio.
- Tenga mucho cuidado al extraer el cerebro del calvario, ya que los puntos de referencia pueden destruirse en caso de que haya laceraciones. En este paso, realice todas las disecciones utilizando protección facial, específicamente, una visera de joyero 7x, y la iluminación será proporcionada por lámparas quirúrgicas colocadas sobre cada uno de los hombros del disector. Gran parte de la disección se llevará a cabo utilizando pinzas curvas pequeñas de modo romo (es decir, pinzas Graefe).
- Coloque el cerebro sobre un bloque de acero inoxidable (Figura 4i y Figura 4ii). Mantenga el bloque frío rodeándolo con hielo y una solución salina helada. Humedezca periódicamente el tejido con solución salina helada para preservar las estructuras.
- Coloque el cerebro de tal manera que las cortezas cerebrales estén mirando hacia arriba. Usando pequeños fórceps curvos, refleje suavemente el CB exponiendo los pedúnculos cerebelosos superior, medio e inferior y retire el CB (Figura 4iii y Figura 4iv).
- Haga un corte sagital medio a partir del dorso y entre el obstetra y los hemisferios cerebrales (Figura 4v) y asegúrese de no extenderse más allá de la comisura anterior. En este punto, el vermis se puede separar fácilmente de las porciones laterales y HB se obtendrá mediante un corte coronal en el margen anterior de la protuberancia.
- Separe la médula mediante un corte coronal en el margen posterior de la protuberancia.
NOTA: En este punto, el diencéfalo, la parte posterior del cerebro anterior que contiene el epitálamo, el tálamo, el hipotálamo y el tálamo ventral y el tercer ventrículo, se girará hacia arriba con el lado ventral y se hará un corte sagital medio del quiasma óptico rostralmente. La disección de hemisferios cerebrales seguida de la eliminación de OB de uno de los hemisferios será en este paso (Figura 4v y Figura 4vi). - Separe los hemisferios cerebrales (Figura 4v) antes de diseccionar más el diencéfalo (Figura 4v). El enfoque dorsal se empleará mediante una disección contundente cuidadosa para preservar los puntos de referencia críticos de la línea media. Visualice cada conexión interhemisférica antes de cortarlas, ya que esto minimizará la posibilidad de desviarse de la línea media.
NOTA: En este paso, se puede preservar uno de los hemisferios cerebrales (hemicerebro) y el segundo hemisferio se puede usar para una disección adicional. - Deslice las cuchillas cerradas de un fórceps pequeño y curvo, debajo del cuerpo calloso y extiéndalo suavemente para retraer el neocórtex bilateralmente. El cuerpo calloso es una amplia banda de fibras nerviosas que une los dos hemisferios que se diseccionarán sin rodeos pellizcando con los fórceps, sin perturbar las estructuras de la línea media que se encuentran debajo.
NOTA: Las caras mesiales de los hemisferios tendrán múltiples puntos de referencia visibles, como estructuras mielinizadas como el genu del cuerpo calloso, los fornices y la comisura anterior. Además, aunque unos pocos milímetros laterales a la línea media, el tracto mamilotálmico y el fascículo retroflexo también pueden ser visibles. - Divide en dos las múltiples estructuras que cruzan la línea media. Esto incluirá el cuerpo calloso, la comisura anterior, la comisura del fórnix ventral, la comisura posterior, la comisura del fórnix dorsal, la decusación supramamilar, la comisura del colículo superior, la comisura del fórnix ventral y las fibras talámicas periventriculares.
- Tenga especial cuidado en este paso en o cerca de la línea media que podría verse parcialmente comprometido por el método de aproximación dorsal. Todas las estructuras de seguimiento están en riesgo si no se realizan con cuidado.
- Retire el OB (en forma de cuña y color más claro) y los bulbos olfativos accesorios seguidos de la recolección del MPFC (área 1 de la corteza cingulada, prelímbica, infralímbica, orbital medial y motora secundaria [M2]) y FCX mediante un corte coronal que se hace 1 mm anterior al genu del cuerpo calloso (Figura 4vii). Divida la sección resultante por un corte parasagital 1/3 de la distancia desde la superficie medial a la lateral, produciendo MPFC medialmente y resto de FCX lateralmente. La corteza cingulada es el análogo del ratón de MPFC.
NOTA: Este corte de tejido también contendrá una pequeña cantidad de M2 (corteza motora secundaria) 17 y es inevitable. - Haga un corte coronal a nivel de la comisura anterior que conduzca a la visibilidad de la extremidad anterior pars de la comisura anterior en la sección transversal en la cara rostral de la sección coronal resultante, mientras que la porción transversal se revelará en la cara caudal de la sección. El VS está compuesto por el NAC y el OT.
NOTA: Hay una extremidad anterior además del segmento transversal en la comisura anterior y se llama comisura anterior, pars anterior. - Corte parcialmente horizontal a través de la porción transversal de la comisura anterior desde la línea media debajo del asta anterior del ventrículo lateral, para liberar el núcleo septal dorsalmente y el VS ventralmente. Retire la pequeña cantidad de la corteza de la superficie lateral donde se eliminarán NAC y OT .
- Separe la porción rostral del ST de la corteza suprayacente a través de un corte de bisturí curvo justo fuera de la cápsula externa, teniendo cuidado de no incluir tejido estriado en la muestra cortical. En este punto, los núcleos septales /SE serán visibles y se pueden tomar fácilmente de este corte (Figura 4viii).
NOTA: Los límites anterior y posterior de la GFP están definidos por planos coronales imaginarios que están en línea con la comisura anterior y los cuerpos mamilares respectivamente. El límite medial está definido por la cápsula externa18. - En la superficie lateral de la hemisección restante del diencéfalo, haga un corte horizontal parcial a lo largo del surco rinal que se extiende caudalmente, pero solo hasta el nivel del plano coronal imaginario con los cuerpos mamilares. Realizar un corte coronal parcial, extendiéndose medialmente 1 mm desde la superficie cortical lateral en el plano de los cuerpos mamilares del HY. Aquí, la incisión parasagital en el plano del claustrum liberará el PFM (Figura 4ix y Figura 4x).
NOTA: En la superficie medial de la hemisección restante del diencéfalo, numerosas características anatómicas serán visibles, incluidos los cuerpos mamilares, el fascículo retroflexo y la estría medular. Un patrón semicircular (lado cóncavo dorsal) será visible, que denota el margen entre el tálamo y el HY. El HY se identificará fácilmente en la vista de la sección sagital media por el quiasma óptico anteroventralmente y la comisura anterior anterodorsal y los cuerpos mamilares junto con el fascículo retroflexo posterior. Estos últimos puntos de referencia se han mostrado bien en el atlas17 , así como en el contexto del cerebro anterior del ratón albino19. - Haga un corte coronal parcial posterior a los cuerpos mamilares, extendiéndose solo lateralmente hasta el surco hipotalámico. En este punto, un corte parasagital a lo largo del surco hipotalámico ahora libera el HY .
- Implican la eversión del ventrículo lateral para revelar conexiones intralímbicas adicionales y los componentes restantes del sistema límbico. Al ver la cara medial de la hemisección restante del diencéfalo, los fórceps curvos serán la mejor opción, ya que permiten al técnico manipular alrededor de otras secciones delicadas del área circundante utilizadas para cortar el fórnix y se inserta en el ventrículo lateral y se expande suavemente, utilizando disección roma para abrir el ventrículo y rotar la HC 90° del plano vertical al horizontal. Puede ser necesario usar la cuchilla #11 para seccionar la arteria coroidea / plexo coroideo, ya que la punta puntiaguda puede ayudar con cortes precisos.
- Gire el GNC 90° (pero en la dirección opuesta al HC) para que esté en el plano horizontal. Usando fórceps, gire suavemente el HC otros 180° hacia afuera y lateralmente, lo que hará que la superficie interna del ERC sea visible y esté orientada hacia arriba.
- Se verá una radiación en forma de abanico de fibras mielinizadas que surgen del ERC convergiendo para formar el haz angular, incluida la trayectoria perforante y su unión al HC. Gire el tálamo y MB 180° dorsalmente para revelar ventralmente el AY.
- Si es necesario, levante el tracto óptico para revelar la unión de la estría terminal, ya que contendrá bandas de fibras que corren a lo largo del margen lateral de la superficie ventricular del tálamo al AY y aclarará los contornos del AY.
NOTA: La HC y el fórnix serán claramente visibles en su totalidad, anidados en el ventrículo lateral y se pueden levantar fácilmente. El ventrículo lateral estará revestido con piamadre y los orígenes en forma de abanico de la trayectoria perforante a través del aspecto subpial muy transparente del ERC serán visibles20. - La superficie externa del ERC medial tendrá una capa prominente visible de grandes células piramidales. Además, una densa convergencia de fibras de tinción de Golgi será una característica destacada en el ERC medial. En este procedimiento de disección, después de everting el ventrículo lateral, estas fibras serán fácilmente visibles en la superficie medial a través de la piamadre, que recubre las superficies internas de los ventrículos, formando una estructura en forma de abanico muy prominente.
- Observe que las fibras se están acumulando subpialmente, descendiendo y saliendo del ERC ventral, extendiéndose posteriormente y luego ascendiendo verticalmente para perforar el HC. Esta estructura en forma de abanico en el ERC se utilizará para definir los márgenes con fines de disección. Identificar y eliminar en el orden de las estructuras AY, ERC, CNG y HC .
NOTA: Definir un buen punto de referencia para la disección AY será clave para el siguiente paso y la unión en el margen posterior donde la estría terminal se encuentra con el AY será un buen punto. - En este punto, las estructuras restantes incluyen el tálamo y el MB. Confirmar la identificación del tálamo mediante la visualización de la estría medular en su superficie dorsal que se extiende en el plano rostrocaudal de la línea media. Separar el tálamo completamente del mesencéfalo mediante un corte coronal caudal a la habénula y rostral a los colículos superiores. El ROC se guarda en este paso.
- En este punto, complete la recolección de todas las regiones del cerebro e inmediatamente (a medida que se obtiene cada una) almacene las muestras congeladas hasta su posterior procesamiento.
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Representative Results
Nuestra comprensión de la compleja estructura y función del cerebro está evolucionando y mejorando rápidamente. El cerebro contiene múltiples regiones distintas y la construcción de un mapa molecular puede ayudarnos a comprender mejor cómo funciona el cerebro. En este documento de método, hemos discutido la disección del cerebro del ratón en múltiples regiones distintas (Tabla 1). En este protocolo, las estructuras se identifican en función de los puntos de referencia críticos y se logra manteniendo el tejido húmedo con solución salina conservando su robustez para la disección inmediata. El método cubre más regiones que otros relatos21 y es complementario a los métodos de disección utilizando cerebros congelados22,23. Estos tejidos disecados pueden ser preservados y procesados posteriormente dependiendo de los requerimientos del estudio. El método discutido aquí es la extracción inmediata del cerebro del cráneo seguida de una disección que proporciona suficiente tejido de una manera rápida para los ensayos posteriores dado el tamaño del cerebro del ratón. Nuestro equipo ha extraído ARN de múltiples tejidos disecados y ha analizado el perfil de expresión génica utilizando microarrays para tejidos cerebrales; AY, HC, MPFC, región septal, cuerpo estriado y VS y los resultados han sido publicados15. Estos cerebros cosechados se almacenaron a -80 ° C durante varios meses antes de la extracción de ARN. Este método se puede adoptar en combinación con otros métodos para diversificar la utilidad aguas abajo de las regiones del cerebro. Este método de disección se centra en seguir puntos de referencia entre regiones adyacentes anatómicamente distintas en lugar de ser estrictamente disecciones coronales o sagitales. Las distintas regiones cerebrales junto con los datos de peso se recopilaron bajo el modelo de estrés social expuesto al agresor del estudio de TEPT16 y las concentraciones de ARN junto con las lecturas espectrofotométricas se muestran como Figura 5.
Figura 1: Representación del cerebro del ratón con distintos tipos de tejido recolectados. Esta figura es una representación cosmética de las estructuras y no se escala a ninguna base de datos asignada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Extirpación del cerebro de la cavidad craneal seguida de extirpación de la hipófisis. Procedimiento paso a paso para la extirpación del cerebro (i) sujeción y sujeción después de la depilación (ii) fijación de la pinza con un Kimwipe para mantener el vello alejado del tejido (iii) antes de la extracción de los músculos (iv) después de la extracción de los músculos (v) separación de méninges (vi) eliminación del globo/ojo (vii) corte en la cresta orbitaria (viii) extirpación de los huesos parietales y frontales (ix) visualización y extirpación del cerebro (x) desprendimiento cerebral (xi) vista hipofisaria (xii) extirpación hipofisaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estación de configuración de disección. Esta imagen muestra la configuración para la disección cerebral después de la extirpación de tejidos cerebrales y pituitarios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Disección cerebral. Procedimiento paso a paso para la extirpación del cerebro (i) vista superior del cerebro (ii) vista dorsal del cerebro (iii) extirpación del cerebelo (iv) separación cerebral (v) disección de hemisferios (vi) extirpación del bulbo olfatorio (vii) MPFC, FCX y disección olfativa accesoria (viii) Disección SE, VS y ST (ix) Extirpación de PFM (x) Disección del sistema límbico Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Datos generados después de la recolección de la muestra (A) Se muestra el peso del tejido cerebral y (B) la concentración de ARN y (C) OD 260/280 de cada uno de los tejidos cerebrales. Aquí los datos se recogen de los grupos control (n= 3-6) de un grupo de estudio como se informó anteriormente15,16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| # | Abreviaturas | Descripción de la región del cerebro |
| 1 | Cb | Cerebelo |
| 2 | Hb | Tronco encefálico/cerebro posterior (protuberancia y bulbo raquídeo) |
| Separarse en los dos hemisferios | ||
| 3 | Ob | Bulbos olfativos y bulbos olfativos accesorios |
| 4 | MPFC | Corteza prefrontal medial |
| 5 | FCX | Corteza prefrontal lateral |
| 6 | SE | Tabique o región septal |
| 7 | Vs | El cuerpo estriado ventral incluye el núcleo accumbens (NAC) y el tubérculo olfativo (OT) |
| 8 | C | Cuerpo estriado anterior y posterior |
| 9 | Hy | Hipotálamo |
| 10 | GFP | Corteza piriforme |
| 11 | Hc | Hipocampo |
| 12 | ERC | Corteza entorrinal |
| 13 | GNC | Corteza cingulada posterior |
| 14 | Sí | Amígdala |
| 15 | MB | Mesencéfalo con tálamo |
| 16 | Roc | Resto de la corteza cerebral |
Tabla 1: Descripción de distintas regiones del cerebro del ratón. Esta tabla contiene una lista de todas las regiones del cerebro recopiladas con su abreviatura.
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Discussion
El cerebro de los mamíferos es un órgano complejo compuesto por una serie de células morfológicamente distintas y funcionalmente únicas con diversas firmas moleculares y múltiples regiones que realizan funciones especializadas y discretas. El procedimiento de disección que se informa aquí puede tener varios objetivos dependiendo de los requisitos del laboratorio. En nuestro laboratorio evaluamos la transcripción en múltiples regiones cerebrales recolectadas de ratones expuestos al TEPT como el estrés16 . Nos gustaría estudiar más a fondo el impacto de los antecedentes genéticos de la cepa24 en los niveles de expresión en múltiples regiones cerebrales. Este protocolo tiene múltiples pasos críticos que deben considerarse para una reproducibilidad exitosa de los experimentos. Cada una de las regiones localizadas del cerebro juega un papel distinto en la condición neuropatológica y falta un conocimiento detallado de la región cerebral apropiada para estudiar. Por lo tanto, es importante generar el conjunto de datos relacionados con la región del cerebro. Por lo tanto, los datos no solo se pueden consultar seleccionando la región del cerebro, sino también por categoría de datos (por ejemplo, transcriptoma, proteína, célula (citoarquitectónica) u otra) que conduce a información más precisa. Anteriormente, se ha demostrado que los tejidos como el bulbo olfatorio, la corteza frontal, el cuerpo estriado y el hipocampo en tejidos cerebrales frescos de ratas se diseccionan con un microscopio25. Alternativamente, las secciones se pueden diseccionar mientras el cerebro está congelado14 seguido de extracciones de ARN y proteínas, pero este método se limita a las regiones del cerebro que pueden identificarse mediante puntos de referencia claros. Las extracciones totales de ARN se han llevado a cabo después de la microdisección25 de las principales regiones del cerebro, así como utilizando el enfoque de microscopía de captura no láser para estudios de expresión génica13. Aquí nos centramos en la disección del cerebro fresco del ratón para separar las estructuras cerebrales específicas que tienen un control dedicado sobre las funciones fisiológicas y conductuales. Nuestro método explica la disección de más regiones que los informes ya publicados, sin embargo, es complementario a otros métodos de disección disponibles. Este enfoque puede ayudar a proporcionar una evaluación integral de los tejidos y su asociación con condiciones debilitantes. Esta estrategia de disección proporciona una opción viable a las estrategias de recolección de muestras existentes que abren posibilidades para nuevos descubrimientos.
Con el método descrito en la presente invención, los tejidos cerebrales se congelan rápidamente en nitrógeno líquido antes de transferirse a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. Es importante que las herramientas y los tejidos se mantengan fríos durante todo el procedimiento para la preservación de ácidos nucleicos o proteínas. Estos tejidos congelados se homogeneizan posteriormente utilizando procedimientos operativos estándar de laboratorio. Algunos de estos tejidos cerebrales son muy pequeños y se debe tener cuidado durante el proceso de homogeneización y extracción protegiendo las moléculas objetivo de la degradación a temperaturas más altas.
En este proceso, es importante identificar puntos de referencia claros para identificar las regiones específicas del tejido. Esto se logra manteniendo el tejido húmedo con solución salina para evitar que se vuelva rápidamente suave y conserve su robustez por un tiempo. Nuestros estudios previos compararon los cambios en la expresión génica entre los tejidos de ratón expuestos al control y al agresor15 y no estudiaron ningún cambio causado por la solución salina utilizada durante la disección. En nuestra experiencia, esto es especialmente importante durante la incisión a partir del hipotálamo y el giro de 180 °, ya que expone y hace que el sombreado de separación regional de las regiones límbicas (AY, HC, ERC) sea obvio y más claro. El sistema límbico está situado en lo profundo del cerebro y se daña por una variedad de estímulos, y por lo tanto es importante desde el punto de vista diagnóstico y terapéutico. El sistema límbico consiste en regiones cerebrales, sin embargo, no existe un acuerdo universal sobre esta lista26. Aunque no se ha estudiado, se cree que hay efectos mínimos o nulos del uso de solución salina. Esto se debe a que todo el procedimiento dura unos 20 minutos después de condiciones frías durante todo el proceso.
Las regiones dentro del tejido cerebral se identifican utilizando puntos de referencia mencionados en los atlas cerebrales. Usando esta técnica, los puntos de referencia deben ser claros y este procedimiento debe hacerse secuencialmente. La disección debe hacerse mientras el cerebro aún está fresco y resistente; (tiene que hacerse con los primeros 15 a 20 minutos) - de lo contrario los puntos de referencia no serán claros y las regiones no serán distintas si el cerebro permanece durante más tiempo y se vuelve más suave.
Como se describió anteriormente, dentro del cerebro hay subregiones, que contienen múltiples áreas funcionales que actúan de forma independiente o en coordinación con redes conectivas intrínsecas. Es importante recuperar estas regiones con gran precisión para estudiar sus amplias dimensiones. Esto ayudará a integrar estos conceptos combinando las regiones especializadas donde cada una está sirviendo a un proceso distinto con un potencial terapéutico.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Sra. Seshmalini Srinivasan, al Sr. Stephen Butler y a la Sra. Pamela Spellman por su asistencia experimental y a la Sra. Dana Youssef por editar el manuscrito. Se agradece el apoyo financiero de USAMRDC. La Fundación de Ginebra contribuyó a este trabajo y fue apoyada por fondos de la Dirección III del Área de Investigación de Medicina Militar y Operacional a través de la Oficina de Investigación del Ejército de los Estados Unidos.
Renuncia:
El material ha sido revisado por el Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed. No hay objeción a su presentación y/o publicación. Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son opiniones privadas del autor, y no deben interpretarse como oficiales, o como reflejando verdaderas opiniones del Departamento del Ejército o el Departamento de Defensa. La investigación se llevó a cabo bajo un protocolo aprobado de uso de animales en una instalación acreditada por AAALAC en cumplimiento con la Ley de Bienestar Animal y otros estatutos y regulaciones federales relacionados con animales y experimentos con animales y se adhiere a los principios establecidos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Publicación NRC, edición 2011.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
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