Summary
Wir präsentieren ein praktisches, schrittweises, schnelles Protokoll für die Entfernung und Dissektion diskreter Regionen aus frischem Hirngewebe von Mäusen. Die Gewinnung von Hirnregionen für molekulare Analysen ist in vielen neurowissenschaftlichen Laboren zur Routine geworden. Diese Gehirnregionen werden sofort eingefroren, um qualitativ hochwertige transkriptomische Daten für die Analyse auf Systemebene zu erhalten.
Abstract
Das Gehirn ist die Kommandozentrale für das Nervensystem von Säugetieren und ein Organ mit enormer struktureller Komplexität. Geschützt im Schädel besteht das Gehirn aus einer äußeren Hülle aus grauer Substanz über den Hemisphären, die als Großhirnrinde bekannt ist. Unter dieser Schicht befinden sich viele andere spezialisierte Strukturen, die für mehrere Phänomene unerlässlich sind, die für die Existenz wichtig sind. Die Entnahme von Proben bestimmter grober Hirnregionen erfordert schnelle und präzise Sezierschritte. Es versteht sich, dass auf mikroskopischer Ebene viele Teilregionen existieren und wahrscheinlich die willkürlichen regionalen Grenzen überschreiten, die wir für diese Analyse auferlegen.
Mausmodelle werden routinemäßig verwendet, um menschliche Gehirnfunktionen und Krankheiten zu untersuchen. Veränderungen in den Genexpressionsmustern können auf bestimmte Gehirnbereiche beschränkt sein, die auf einen bestimmten Phänotyp abzielen, abhängig vom erkrankten Zustand. Daher ist es von großer Bedeutung, die Regulation der Transkription in Bezug auf ihre genau definierte strukturelle Organisation zu untersuchen. Ein vollständiges Verständnis des Gehirns erfordert die Untersuchung verschiedener Gehirnregionen, die Definition von Verbindungen und die Identifizierung wichtiger Unterschiede in den Aktivitäten jeder dieser Gehirnregionen. Ein umfassenderes Verständnis jeder dieser verschiedenen Regionen könnte den Weg für neue und verbesserte Behandlungen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften ebnen. Hier diskutieren wir eine Schritt-für-Schritt-Methodik zur Zerlegung des Mausgehirns in sechzehn verschiedene Regionen. In diesem Verfahren haben wir uns auf die Entfernung und Dissektion des Gehirns der männlichen Maus C57Bl / 6J (6-8 Wochen alt) unter Verwendung neuroanatomischer Orientierungspunkte konzentriert, um diskrete funktionell relevante und verhaltensrelevante Gehirnregionen zu identifizieren und zu beproben. Diese Arbeit wird dazu beitragen, eine starke Grundlage auf dem Gebiet der Neurowissenschaften zu schaffen, was zu fokussierteren Ansätzen im tieferen Verständnis der Gehirnfunktion führt.
Introduction
Das Gehirn bildet zusammen mit dem Rückenmark und der Netzhaut das zentrale Nervensystem, das komplexe Verhaltensweisen ausführt, die von spezialisierten, präzise positionierten und interagierenden Zelltypen im gesamten Körper gesteuert werden1. Das Gehirn ist ein komplexes Organ mit Milliarden von miteinander verbundenen Neuronen und Gliazellen mit präzisen Schaltkreisen, die zahlreiche Funktionen erfüllen. Es ist eine bilaterale Struktur mit zwei verschiedenen Lappen und verschiedenen zellulären Komponenten2. Das Rückenmark verbindet das Gehirn mit der Außenwelt und wird durch Knochen, Hirnhäute und Liquor geschützt und leitet Nachrichten zum und vom Gehirn 2,3,4. Die Oberfläche des Gehirns, die Großhirnrinde, ist uneben und hat deutliche Falten, genannt Gyri, und Rillen, genannt Sulci, die das Gehirn in funktionelle Zentren trennen5. Der Kortex ist bei Säugetieren glatt mit einem kleinen Gehirn 6,7. Es ist wichtig, die Architektur des menschlichen Gehirns zu charakterisieren und zu untersuchen, um die Störungen im Zusammenhang mit den verschiedenen Gehirnregionen sowie seine funktionellen Schaltkreise zu verstehen. Die neurowissenschaftliche Forschung hat sich in den letzten Jahren erweitert und eine Vielzahl von experimentellen Methoden wird verwendet, um die Struktur und Funktion des Gehirns zu untersuchen. Entwicklungen auf dem Gebiet der molekularen und systemischen Biologie haben eine neue Ära der Erforschung der komplexen Beziehung zwischen Gehirnstrukturen und der Funktionsweise von Molekülen eingeleitet. Darüber hinaus expandieren Molekularbiologie, Genetik und Epigenetik rasant, was es uns ermöglicht, unser Wissen über die zugrunde liegenden Mechanismen zu erweitern, die an der Funktionsweise von Systemen beteiligt sind. Diese Analysen können auf einer viel lokaleren Basis durchgeführt werden, um die Erforschung und Entwicklung wirksamerer Therapien gezielt zu unterstützen.
Das Gehirn von Säugetieren ist strukturell in klar identifizierbare diskrete Regionen unterteilt; Die funktionelle und molekulare Komplexität dieser diskreten Strukturen ist jedoch noch nicht klar verstanden. Die multidimensionale und vielschichtige Natur des Hirngewebes macht es schwierig, diese Landschaft auf funktioneller Ebene zu untersuchen. Darüber hinaus erschwert die Tatsache, dass mehrere Funktionen von derselben Struktur ausgeführt werden und umgekehrt, das Verständnis des Gehirns weiter8. Es ist wichtig, dass der experimentelle Ansatz zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung von Hirnregionen präzise Forschungsmethoden verwendet, um eine Konsistenz bei der Stichprobe für die Korrelation der neuroanatomischen Architektur mit der Funktion zu erreichen. Die Komplexität des Gehirns wurde kürzlich mit Hilfe der Einzelzellsequenzierung 9,10 erklärt, wie z.B. dem Gyrus temporalis des menschlichen Gehirns, das aus 75 verschiedenen Zelltypen besteht 11. Durch den Vergleich dieser Daten mit denen aus einer analogen Region des Mausgehirns zeigt die Studie nicht nur Ähnlichkeiten in ihrer Architektur und Zelltypen, sondern zeigt auch die Unterschiede auf. Um die komplexen Mechanismen zu entschlüsseln, ist es daher wichtig, verschiedene Regionen des Gehirns mit voller Präzision zu untersuchen. Konservierte Strukturen und Funktionen zwischen einem menschlichen und einem Mausgehirn ermöglichen die Verwendung einer Maus als vorläufiges Surrogat zur Aufklärung der menschlichen Gehirnfunktion und der Verhaltensergebnisse.
Mit der Weiterentwicklung systembiologischer Ansätze ist die Gewinnung von Informationen aus diskreten Hirnregionen bei Nagetieren zu einem Schlüsselverfahren in der neurowissenschaftlichen Forschung geworden. Während einige Protokolle wie die Lasererfassungsmikrodissektion12 teuer sein können, sind mechanische Protokolle kostengünstig und werden mit allgemein verfügbaren Werkzeugendurchgeführt 13,14. Wir haben mehrere Gehirnregionen für transkriptomische Assays15 verwendet und ein praktisches und schnelles Verfahren entwickelt, um Maushirnregionen von Interesse Schritt für Schritt in kurzer Zeit zu sezieren. Nach dem Sezieren können diese Proben sofort unter kalten Bedingungen gelagert werden, um die Nukleinsäuren und Proteine dieser Gewebe zu erhalten. Unser Ansatz kann schneller durchgeführt werden, was zu einer hohen Effizienz führt und weniger Chancen für eine Gewebeverschlechterung zulässt. Dies erhöht letztendlich die Chancen, qualitativ hochwertige, reproduzierbare Experimente mit Hirngewebe zu generieren.
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Protocol
Die Handhabung und die Versuchsverfahren der Tiere wurden in Übereinstimmung mit europäischen, nationalen und institutionellen Richtlinien für die Tierpflege durchgeführt. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am US Army Center for Environmental Health Research, jetzt Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR), genehmigt und in einer von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditierten Einrichtung durchgeführt.
HINWEIS: Das Verfahren wird an sechs bis acht Wochen alten männlichen Mäusen des C57BL/6j-Stammes durchgeführt, die durch zervikale Dislokation eingeschläfert wurden16. In unserem Labor werden keine Perfusionen durchgeführt, aber dieses Protokoll könnte modifiziert werden, wodurch Perfusionen durchgeführt werden können, um Blut aus dem Gefäßsystem zu entfernen. Alle für die Sektion benötigten Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Dissektion ist in drei Komponenten unterteilt, darunter die Entfernung des Gehirns, die Entfernung der Hypophyse und die Hirndissektion. Die Absicht der Hirngewebeentnahme ist es, sie für transkriptomische Assays nach RNA-Extraktionen zu verarbeiten. Sobald die Hirnregion seziert ist, überführen wir sofort jede der Hirnregionen in ein bereits gekennzeichnetes Tiefkühlfläschchen und lagern das Fläschchen dann in flüssigem Stickstoff oder -80 °C.
HINWEIS: Gründliche Kenntnisse der Neuroanatomie sind unerlässlich, um dieses Verfahren durchzuführen. Horizontale und Längsschnitte sowie die üblichen Querschnitte sollten studiert und erlernt werden. Da Hirngewebe sehr schnell abgebaut wird, bleibt keine Zeit, während dieses Verfahrens einen Atlas zu konsultieren.
1. Entfernung des Gehirns der Maus
- Klemmen Sie den Oberkiefer des enthaupteten Kopfes mit einem Hämostat (Abbildung 2i) und verwenden Sie ein Mullkissen, um die Kopfhaut rostral zu reflektieren, wodurch ein trockenes Feld auf dem Rücken des Schädels entsteht (Abbildung 2ii).
- Führen Sie die fein gebogene Schere in das Foramen magnum ein, um die anhaftenden Hirnhäute zu trennen. Hier führen Sie die Schere an der Öffnung an der Schädelbasis ein, das Foramen magnum, wo das Rückenmark mit vertikal zeigender Klinge (12-Uhr-Position), aber parallel zur Innenfläche des Basalplattenknochens (dh Hinterhauptsquama) verläuft und die Klinge fünfundvierzig ° nach links und dann zur rechten Seite dreht.
- Drehen Sie das Handgelenk weiter, um den Basalplattenknochen abzureißen, der die Mitte des verbleibenden Knochens in den Hinterhauptknochen und die intraparietalen Knochen schneidet, die die Knochen nach links und rechts durchbohren, bis sie entfernt werden. In ähnlicher Weise entfernen Sie das Hinterhauptsbein und den intraparietalen Knochen, um das Kleinhirn freizulegen.
HINWEIS: An diesem Punkt kann die hohle knöcherne Struktur, die als Paukenbullae bezeichnet wird, auf dem ventralen hinteren Teil des Schädels, der Teile des Mittel- und Innenohrs umschließt, entfernt werden, es sei denn, man seziert die hinteren und vorderen Lappen der Hypophyse (Abbildung 2iii). - Entfernen Sie die Muskelansätze am Schläfenkamm mit einer gebogenen scharfen Scherenklinge. Legen Sie ein Glied der gekrümmten scharfen Schere unter die lambdoide Naht, die in die Verbindung der Quer- und Sagitalhöhlen eindringt (Abbildung 2iv).
- Schieben Sie die Schere rostral entlang der mittelsagittalen Naht bis zum Bregma und schneiden Sie sie sehr vorsichtig, während Sie vorsichtig nach oben heben, um ein Reißen der zerebralen Cortice zu vermeiden. Dies ist ein kritischer Schritt im Verfahren (Abbildung 2v).
- Bei diesem Schritt werden die Parietalknochen angehoben und gedreht, wodurch die innere Oberfläche des Knochens abgekratzt wird, um verbleibende meningeale Anhänge zu identifizieren und zu schneiden. Greifen Sie das Schläfenbein, das nach außen greift, weg vom Gehirn. Entfernen Sie das Stirnbein von jeder Seite mit einer gebogenen Schere oder einem Rongeur in die Augenhöhle und schneiden Sie koronal im rechten Winkel zum Orbitalkamm, jedoch nicht weiter als die Mittellinie (Abbildung 2vii).
- Machen Sie zwei Schnitte parallel und etwa 4 mm voneinander entfernt in der sagittalen Ebene (Abbildung 2viii).
HINWEIS: Schneiden Sie nicht beide Seiten mit einem einzigen Strich. - Entfernen Sie die Fragmente des Stirnbeins, ohne die Gehirnoberfläche zu zerreißen (Abbildung 2ix). Verwenden Sie an dieser Stelle eine feine Schere, um die Dura Mater zu schneiden, die zwischen den Riechkolben zugänglich sein sollte.
- Drehen Sie den Schädel vorsichtig um, damit die Schwerkraft die Entfernung des Gehirns unterstützen kann, während Sie weiterhin verbleibende meningeale Anhänge und Hirnnerven identifizieren und schneiden. Das Gehirn wird freigesetzt, indem der größte Trigeminusnerv, der am Gehirn befestigt ist, durchtrennt wird und deutlich sichtbar ist, der sich von der Basis des Schädels erstreckt (Abbildung 2x).
HINWEIS: Übertragen Sie das Gehirn zur weiteren Dissektion in eine kalte Kochsalzlösung (eiskaltes RNase-freies Natriumcitrat (0,9%) oder physiologische (0,9%) Kochsalzlösung.
2. Sektion der vorderen und hinteren Hypophyse
HINWEIS: Die Hypophyse ist von einer sehr zähen zeltartigen Membran bedeckt, mit einem Kamm, der seitlich zwischen dem linken und rechten Trigeminusnerv verläuft. Diese Strukturen sind extrem weich und empfindlich, und daher wird empfohlen, die hinteren und vorderen Lappen der Hypophyse separat in Etappen in situ direkt vom Schädel zu sezieren. Unmittelbar nach der Dissektion die jeweilige Hirnanhangsdrüse in eine vormarkierte Durchstechflasche überführen und die Durchstechflasche in flüssigem Stickstoff lagern, vorzugsweise sonst -80 °C. Die Hypophyse liegt genau über der Verbindung von Hinterhaupt- und Basisphenoidknochen; Wenn sie sich biegen, wird die Hypophysenarchitektur gestört.
- Halten Sie die Gehörblasen intakt, um sicherzustellen, dass die Anatomie der Hypophyse intakt und leicht erkennbar ist (Abbildung 2ix).
- Sezieren Sie den hinteren Lappen der Hypophyse, gefolgt vom vorderen Lappen der Hypophyse, vom Rest des Schädels.
- Machen Sie einen extrem kleinen parasagittalen Schnitt auf beiden Seiten im Kamm des membranösen Zeltes und heben Sie den hinteren Lappen der Hypophyse mit einer ultrafeinen Pinzette an, wobei Sie darauf achten, das vordere Hypophysengewebe nicht zu stören (Abbildung 2x).
- Machen Sie einen sagittalen Schnitt zwischen den seitlichen Rändern des Vorderlappens der Hypophyse und dem nächsten Trigeminusnerv und heben Sie danach den Vorderlappen der Hypophyse heraus (Abbildung 2x).
3. Dissektion des Gehirns der Maus
HINWEIS: Unmittelbar nach der Entfernung von Gehirn und Hypophyse wird eine weitere Dissektion an einem vorgekühlten Edelstahlblock durchgeführt (Abbildung 3). Nach der Dissektion werden die Hirnregionen in vormarkierte Fläschchen überführt und die Fläschchen vorzugsweise in flüssigen Stickstoff überführt, ansonsten -80 °C. Zu den Strukturen, die nach der Top-Down-Methode (in chronologischer Reihenfolge) hergestellt werden, gehören möglicherweise die folgenden: Kleinhirn (CB), Hirnstamm / Hinterhirn (pons und medulla oblongata) (HB), Riechkolben (OB) als akzessorische Riechkolben, medialer präfrontaler Kortex (MPFC), lateraler präfrontaler Kortex (FCX), vorderer und hinterer Corpus striatum (ST), ventrales Striatum (VS) bestehend aus dem Nucleus accumbens (NAC) und dem Riechtuberkel (OT), Septum (SE), präoptischer Bereich, piriformer Kortex (PFM), Hypothalamus (HY), Amygdala (AY), Hippocampus (HC), posteriorer cingulärer Kortex (CNG), entorhinaler Kortex (ERC), Mittelhirn (MB) mit Thalamus und Rest der Großhirnrinde (ROC) (Tabelle 1). Spezifische Regionen werden in der Reihenfolge der Isolation diskutiert, wobei mit einer einzigen Hemisphäre gearbeitet wird.
- Seien Sie sehr vorsichtig bei der Entfernung des Gehirns aus dem Kalvarium, da die Landmarken im Falle von Platzwunden zerstört werden können. Führen Sie in diesem Schritt alle Dissektionen mit Gesichtsschutz durch, insbesondere mit einem 7x Juweliervisier, und die Beleuchtung erfolgt durch chirurgische Lampen, die über den Schultern des Dissektors angebracht sind. Ein Großteil der Dissektion wird mit kleinen gekrümmten Pinzetten im stumpfen Modus (z. B. Graefe-Pinzetten) durchgeführt.
- Legen Sie das Gehirn auf einen Edelstahlblock (Abbildung 4i und Abbildung 4ii). Halten Sie den Block kalt, indem Sie ihn mit Eis und einer eiskalten Kochsalzlösung umgeben. Befeuchten Sie das Gewebe regelmäßig mit eiskalter Kochsalzlösung, um die Strukturen zu erhalten.
- Positionieren Sie das Gehirn so, dass die Hirnkortices nach oben zeigen. Reflektieren Sie die CB vorsichtig mit einer kleinen, gebogenen Pinzette, indem Sie die oberen, mittleren und unteren Kleinhirnstiele freilegen und die CB entfernen (Abbildung 4iii und Abbildung 4iv).
- Machen Sie einen midsagittalen Schnitt ausgehend vom Rücken und zwischen dem OB und den zerebralen Hemisphären (Abbildung 4v) und achten Sie darauf, nicht weiter als die vordere Kommissur zu reichen. An diesem Punkt kann der Vermis leicht von den seitlichen Teilen getrennt werden und HB wird durch einen koronalen Schnitt am vorderen Rand der Pons erhalten.
- Trennen Sie die Medulla durch einen koronalen Schnitt am hinteren Rand der Pons.
HINWEIS: An diesem Punkt wird das Zwischenhirn, der hintere Teil des Vorderhirns, der Epithalamus, Thalamus, Hypothalamus und ventralen Thalamus enthält, und der dritte Ventrikel ventral nach oben gedreht, und ein Midsagittalschnitt wird aus dem optischen Chiasma rostral gemacht. Die Dissektion der zerebralen Hemisphären gefolgt von der Entfernung von OB aus einer der Hemisphären erfolgt in diesem Schritt (Abbildung 4v und Abbildung 4vi). - Trennen Sie die Gehirnhälften (Abbildung 4v), bevor Sie das Zwischenhirn weiter sezieren (Abbildung 4v). Der dorsale Ansatz wird durch sorgfältige stumpfe Sektion eingesetzt, um die kritisch hervorstechenden Mittellinien-Wahrzeichen zu erhalten. Visualisieren Sie jede interhemisphärische Verbindung, bevor Sie sie trennen, da dies die Möglichkeit einer Abweichung von der Mittellinie minimiert.
HINWEIS: In diesem Schritt kann eine der Gehirnhälften (Hemibrain) erhalten bleiben und die zweite Hemisphäre kann für die weitere Dissektion verwendet werden. - Schieben Sie die geschlossenen Klingen einer kleinen, gebogenen Pinzette unter das Corpus callosum und spreizen Sie vorsichtig, um den Neocortex bilateral zurückzuziehen. Das Corpus callosum ist ein breites Band von Nervenfasern, das die beiden Hemisphären verbindet, die durch Einklemmen mit der Pinzette stumpf seziert werden, ohne die darunter liegenden Mittellinienstrukturen zu stören.
HINWEIS: Mesialflächen der Hemisphären haben mehrere sichtbare Landmarken wie myelinisierte Strukturen wie das Genu des Corpus callosum, die Fornices und die vordere Kommissur. Auch wenn einige Millimeter seitlich zur Mittellinie, können auch der Mammillothalamustrakt und der Fasciculus retroflexus sichtbar sein. - Halbieren Sie die verschiedenen Strukturen, die die Mittellinie kreuzen. Dazu gehören das Corpus callosum, die vordere Kommissur, die ventrale Fornixkommissur, die hintere Kommissur, die dorsale Fornixkommissur, die supra mammilläre Decussation, die Colliculuskommissur superior, die ventrale Fornixkommissur und die periventrikulären Thalamusfasern.
- Seien Sie besonders vorsichtig bei diesem Schritt in oder in der Nähe der Mittellinie, der durch die dorsale Annäherungsmethode teilweise beeinträchtigt werden könnte. Alle Folgestrukturen sind gefährdet, wenn sie nicht sorgfältig durchgeführt werden.
- Entfernen Sie den OB (keilförmige und hellere Farbe) und die zusätzlichen Riechkolben, gefolgt von der Sammlung des MPFC (cingulärer Kortexbereich 1, prälimbische, infralimbische, mediale orbitale und sekundäre motorische Kortices [M2]) und FCX durch einen koronalen Schnitt, der 1 mm vor dem Genu des Corpus callosum gemacht wird (Abbildung 4vii). Teilen Sie den resultierenden Abschnitt durch einen parasagittalen Schnitt 1/3 des Abstands von der medialen zur lateralen Oberfläche, wodurch MPFC medial und der Rest von FCX lateral entsteht. Der cinguläre Kortex ist das Mausanalogon von MPFC.
HINWEIS: Diese Gewebescheibe enthält auch eine kleine Menge des M2 (sekundärer motorischer Kortex) 17 und ist unvermeidlich. - Machen Sie einen koronalen Schnitt auf Höhe der vorderen Kommisssur, der zur Sichtbarkeit der pars vorderen Extremität der vorderen Kommissur im Querschnitt auf der Rostralseite des resultierenden koronalen Abschnitts führt, während der transversale Teil in der Schwanzfläche des Abschnitts sichtbar wird Dies ist ein bestätigender Meilenstein für NAC18. Der VS setzt sich aus NAC und OT zusammen.
HINWEIS: Es gibt eine vordere Extremität zusätzlich zum Quersegment in der vorderen Kommisssur und es wird anteriore Kommissur, Pars anterior genannt. - Teilweise horizontal durch den transversalen Teil der vorderen Kommisssur von der Mittellinie unterhalb des Vorderhorns des lateralen Ventrikels schneiden, um den Septumkern dorsal und den VS ventral zu befreien. Entfernen Sie die kleine Menge des Kortex von der lateralen Oberfläche, wo NAC und OT entfernt werden.
- Trennen Sie den rostralen Teil des ST vom darüber liegenden Kortex durch ein gebogenes Skalpell, das direkt außerhalb der äußeren Kapsel geschnitten wird, und achten Sie darauf, kein striatales Gewebe in die kortikale Probe aufzunehmen. An diesem Punkt sind die Septumkerne /SE sichtbar und können leicht aus dieser Scheibe entnommen werden (Abbildung 4viii).
HINWEIS: Die vorderen und hinteren Grenzen des PFM werden durch imaginäre koronale Ebenen definiert, die mit der vorderen Kommissur bzw. den Mammillarkörpern übereinstimmen. Die mediale Grenze wird durch die äußere Kapsel18 definiert. - Machen Sie auf der lateralen Oberfläche des verbleibenden Hemi-Abschnitts des Zwischenhirns einen partiellen horizontalen Schnitt entlang des rhinalen Sulcus, der sich kaudal erstreckt, aber nur bis zur imaginären koronalen Ebene mit den Mammillarkörpern. Machen Sie einen partiellen koronalen Schnitt, der sich medial 1 mm von der lateralen kortikalen Oberfläche in der Ebene der Mammillarkörper des HY erstreckt. Hier befreit ein para-sagittaler Schnitt in der Ebene des Claustrums das PFM (Abbildung 4ix und Abbildung 4x).
HINWEIS: Auf der medialen Oberfläche des verbleibenden Hemi-Abschnitts des Zwischenhirns sind zahlreiche anatomische Merkmale sichtbar, darunter die Mammillarkörper, der Fasciculus retroflexus und die Stria medullaris. Es wird ein halbkreisförmiges Muster (dorsale konkave Seite) sichtbar, das den Rand zwischen dem Thalamus und dem HY anzeigt. Der HY wird auf der mittleren Schnittansicht anhand des optischen Chiasmas anteroventral und anterioren Kommissur anterodorsal und der Mammillarkörper zusammen mit dem Fasciculus retroflexus posterior leicht identifiziert werden. Die letztgenannten Landmarken wurden sowohl im Atlas17 als auch im Albino-Maus-Vorderhirnkontext19 gut dargestellt. - Machen Sie einen partiellen koronalen Schnitt hinter den Mammillarkörpern, der sich nur seitlich bis zum hypothalamischen Sulcus erstreckt. An dieser Stelle befreit nun ein parasagittaler Schnitt entlang der Länge des hypothalamischen Sulcus den HY .
- Schließen Sie die Eversion des lateralen Ventrikels ein, um zusätzliche intralimbische Verbindungen und die verbleibenden limbischen Systemkomponenten freizulegen. Wenn man die mediale Seite des verbleibenden Hemi-Abschnitts des Zwischenhirns betrachtet, sind gebogene Pinzetten die beste Option, da sie es dem Techniker ermöglichen, um andere empfindliche Abschnitte der Umgebung zu manipulieren, die zum Durchtrennen des Fornix verwendet werden und in den lateralen Ventrikel eingeführt und sanft erweitert werden, wobei eine stumpfe Dissektion verwendet wird, um den Ventrikel zu öffnen und den HC zu drehen. 90° von der vertikalen zur horizontalen Ebene. Es kann notwendig sein, die Klinge # 11 zu verwenden, um die Aderhautarterie / den Plexus choroidalis zu schneiden, da die spitze Spitze bei präzisen Schnitten helfen kann.
- Drehen Sie den CNG um 90° (aber in die entgegengesetzte Richtung vom HC), um sich in der horizontalen Ebene zu befinden. Drehen Sie den HC mit einer Pinzette vorsichtig um weitere 180° nach außen und seitlich, wodurch die innere Oberfläche des ERC sichtbar und nach oben zeigt.
- Eine fächerartige Strahlung myelinisierter Fasern, die aus dem ERC hervorgehen, wird gesehen, wie sie konvergieren, um das Winkelbündel zu bilden, einschließlich des perforanten Weges und seiner Bindung an das HC. Drehen Sie den Thalamus und MB um 180° dorsal, um ventral den AY freizulegen.
- Heben Sie bei Bedarf den Sehtrakt an, um die Befestigung der Stria-Terminalis freizulegen, da er Faserbänder enthält, die entlang des lateralen Randes der ventrikulären Oberfläche des Thalamus zum AY verlaufen und die Umrisse des AY klar machen.
HINWEIS: HC und Fornix sind in ihrer Gesamtheit deutlich sichtbar, im lateralen Ventrikel verschachtelt und können leicht herausgehoben werden. Der laterale Ventrikel wird mit Pia mater ausgekleidet und fächerartige Ursprünge des perforalen Pfades durch den sehr transparenten subpialen Aspekt des ERC werden sichtbar sein20. - Die äußere Oberfläche des medialen ERC wird eine sichtbare prominente Schicht großer Pyramidenzellen aufweisen. Darüber hinaus wird eine dichte Konvergenz von Golgi-Färbefasern ein hervorstechendes Merkmal im medialen ERC sein. Bei diesem Dissektionsverfahren sind diese Fasern nach dem Stechen des lateralen Ventrikels auf der medialen Oberfläche durch die Pia mater, die die inneren Oberflächen der Ventrikel auskleidet, leicht sichtbar und bilden eine sehr prominente fächerartige Struktur.
- Beachten Sie, dass sich die Fasern subpiell sammeln, absteigen und den ventralen ERC verlassen, sich nach hinten ausdehnen und dann vertikal aufsteigen, um den HC zu perforieren. Diese fächerartige Struktur im ERC wird verwendet, um die Ränder für die Sektion zu definieren. Identifizieren und entfernen Sie in der Reihenfolge von AY-, ERC-, CNG- und HC-Strukturen.
HINWEIS: Die Definition eines guten Orientierungspunkts für die AY-Dissektion wird ein Schlüssel für den nächsten Schritt sein, und die Verbindung am hinteren Rand, wo die Stria-Terminalis auf die AY-Sektion trifft, wird ein guter Punkt sein. - Zu diesem Zeitpunkt umfassen die verbleibenden Strukturen den Thalamus und den MB. Bestätigen Sie die Identifizierung des Thalamus durch Visualisierung der Striaa medullaris auf ihrer dorsalen Oberfläche, die sich in der Mittellinienebene rostrocaudal erstreckt. Trennen Sie den Thalamus vollständig vom Mittelhirn durch einen koronalen Schnitt kaudal zur Habenula und rostral zu den oberen Colliculi. Der ROC wird bei diesem Schritt gespeichert.
- An diesem Punkt vollständige Sammlung aller Gehirnregionen und sofort (sobald jede erhalten wird) speichern Sie die Proben schockgefroren bis zur weiteren Verarbeitung.
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Representative Results
Unser Verständnis der komplexen Gehirnstruktur und -funktion entwickelt sich schnell weiter und verbessert sich. Das Gehirn enthält mehrere verschiedene Regionen und der Aufbau einer molekularen Karte kann uns helfen, besser zu verstehen, wie das Gehirn funktioniert. In diesem Methodenpapier haben wir die Dissektion des Mausgehirns in mehrere verschiedene Regionen diskutiert (Tabelle 1). In diesem Protokoll werden die Strukturen anhand der kritischen Orientierungspunkte identifiziert und erreicht, indem das Gewebe mit Kochsalzlösung feucht gehalten wird, indem seine Robustheit für eine sofortige Dissektion erhalten bleibt. Die Methode deckt mehr Regionen ab als andere Berichte21 und ergänzt die Seziermethoden mit gefrorenen Gehirnen22,23. Diese sezierten Gewebe können je nach den Anforderungen der Studie konserviert und später verarbeitet werden. Die hier diskutierte Methode ist die sofortige Entfernung des Gehirns aus dem Schädel, gefolgt von einer Dissektion, die angesichts der Größe des Mausgehirns schnell genug Gewebe für nachgeschaltete Assays liefert. Unser Team hat RNA aus mehreren sezierten Geweben extrahiert und für die Genexpressionsprofilierung mit Microarrays für Hirngewebe untersucht. AY, HC, MPFC, Septumregion, Corpus striatum und VS und die Ergebnisse wurden veröffentlicht15. Diese geernteten Gehirne wurden vor der RNA-Extraktion mehrere Monate bei -80 ° C gelagert. Diese Methode kann in Kombination mit anderen Methoden angewendet werden, um den nachgeschalteten Nutzen von Gehirnregionen zu diversifizieren. Diese Dissektionsmethode konzentriert sich darauf, Landmarken zwischen anatomisch unterschiedlichen benachbarten Regionen zu verfolgen, anstatt streng koronale oder sagittale Dissektionen zu sein. Die verschiedenen Gehirnregionen zusammen mit den Gewichtsdaten wurden im Rahmen des Studienaggressor-exponierten sozialen Stressmodells von PTBS16 gesammelt, und die RNA-Konzentrationen zusammen mit spektrophotometrischen Messwerten sind in Abbildung 5 dargestellt.
Abbildung 1: Darstellung des Mausgehirns mit verschiedenen gesammelten Gewebetypen. Diese Abbildung ist eine kosmetische Darstellung der Strukturen und wird nicht auf eine zugeordnete Datenbank skaliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Entfernung des Gehirns aus der Schädelhöhle mit anschließender Entfernung der Hypophyse. Schrittweise Verfahren zur Entfernung des Gehirns (i) Klemmen und Halten nach der Haarentfernung (ii) Sichern der Klemme mit einem Kimwipe, um Haare vom Gewebe fernzuhalten (iii) vor dem Entfernen der Muskeln (iv) nach Entfernung der Muskeln (v) Trennung von Méninges (vi) Entfernung von Globus / Auge (vii) Schnitt auf dem Orbitalkamm (viii) Entfernung von Parietal- und Stirnknochen (ix) Gehirnanzeige und Entfernung (x) Gehirnablösung (xi) Hypophysenansicht (xii) Entfernung der Hypophyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Dissection Setup Station. Dieses Bild zeigt die Einrichtung für die Gehirndissektion nach der Entfernung von Hirn- und Hypophysengewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Dissektion des Gehirns. Schrittweise Vorgehensweise zur Entfernung des Gehirns (i) Draufsicht des Gehirns (ii) Dorsale Ansicht des Gehirns (iii) Entfernung des Kleinhirns (iv) Zerebrale Trennung (v) Halbkugeldissektion (vi) Entfernung von Riechkolben (vii) MPFC, FCX und akzessorische Riechdissektion (viii) SE-, VS- und ST-Dissektion (ix) PFM-Entfernung (x) Dissektion des limbischen Systems Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Daten, die nach der Probenentnahme generiert wurden (A) Das Gewicht des Hirngewebes und (B) die RNA-Konzentration und (C) OD 260/280 aus jedem Hirngewebe sind dargestellt. Hier werden die Daten von Kontrollgruppen (n= 3-6) aus einer Studiengruppe erhoben, wie zuvor berichtet15,16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| # | Abkürzungen | Beschreibung der Hirnregion |
| 1 | Cb | Kleinhirn |
| 2 | Hb | Hirnstamm/Hinterhirn (Pons und Medulla oblongata) |
| In die beiden Hemisphären trennen | ||
| 3 | Ob | Riechkolben und Zubehör-Riechkolben |
| 4 | MPFC | Medialer präfrontaler Kortex |
| 5 | FCX | Lateraler präfrontaler Kortex |
| 6 | Se | Septum oder Septumregion |
| 7 | Vs | Ventrales Striatum umfasst den Nucleus accumbens (NAC) und den Riechtuberkel (OT) |
| 8 | St | Vorderer und hinterer Corpus striatum |
| 9 | Hy | Hypothalamus |
| 10 | PFM | Piriformer Kortex |
| 11 | Hc | Hippocampus |
| 12 | ERC | Entorhinaler Kortex |
| 13 | CNG | Hinterer cingulärer Kortex |
| 14 | Ja | Amygdala |
| 15 | MB | Mittelhirn mit Thalamus |
| 16 | Roch | Rest der Großhirnrinde |
Tabelle 1: Beschreibung verschiedener Regionen aus dem Mausgehirn. Diese Tabelle enthält eine Liste aller Gehirnregionen, die mit ihrer Abkürzung gesammelt wurden.
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Discussion
Das Gehirn von Säugetieren ist ein komplexes Organ, das aus einer Reihe morphologisch unterschiedlicher und funktionell einzigartiger Zellen mit verschiedenen molekularen Signaturen und mehreren Regionen besteht, die spezialisierte und diskrete Funktionen erfüllen. Das hier beschriebene Präparierverfahren kann je nach den Anforderungen des Labors mehrere Ziele haben. In unserem Labor untersuchten wir die Transkription in mehreren Gehirnregionen, die von Mäusen gesammelt wurden, die PTBS wie Stress ausgesetzt waren16 . Wir möchten den Einfluss des genetischen Hintergrunds des Stammes24 auf die Expressionsniveaus in mehreren Gehirnregionen weiter untersuchen. Dieses Protokoll hat mehrere kritische Schritte, die für eine erfolgreiche Reproduzierbarkeit der Experimente berücksichtigt werden müssen. Jede der lokalisierten Regionen des Gehirns spielt eine unterschiedliche Rolle bei neuropathologischen Zuständen und detaillierte Kenntnisse der geeigneten Hirnregion fehlen. Daher ist es wichtig, den Datensatz zur Gehirnregion zu generieren. So können die Daten nicht nur durch Auswahl der Gehirnregion, sondern auch nach Datenkategorie (z. B. Transkriptom, Protein, Zelle (zytoarchitektonisch) oder andere) abgefragt werden, was zu genaueren Informationen führt. Zuvor wurde gezeigt, dass die Gewebe wie Riechkolben, frontaler Kortex, Striatum und Hippocampus in frischem Rattenhirngewebe mit einem Mikroskop seziertwurden 25. Alternativ können Abschnitte seziert werden, während das Gehirn eingefroren wird14 gefolgt von RNA- und Proteinextraktionen, aber diese Methode ist auf Gehirnregionen beschränkt, die durch klare Landmarken identifiziert werden können. Gesamt-RNA-Extraktionen wurden nach der Mikrodissektion25 aus wichtigen Hirnregionen sowie unter Verwendung eines Nicht-Laser-Capture-Mikroskopie-Ansatzes für Genexpressionsstudien durchgeführt13. Hier konzentrieren wir uns auf die Dissektion des frischen Mausgehirns, um die spezifischen Gehirnstrukturen zu trennen, die die Kontrolle über physiologische und Verhaltensfunktionen haben. Unsere Methode erklärt die Zerlegung von mehr Regionen als bereits veröffentlichte Berichte, ist jedoch komplementär zu anderen verfügbaren Seziermethoden. Dieser Ansatz kann zu einer umfassenden Beurteilung des Gewebes und seiner Assoziation mit schwächenden Zuständen beitragen. Diese Sezierstrategie bietet eine praktikable Option zu bestehenden Probensammelstrategien, die Möglichkeiten für neue Entdeckungen eröffnen.
Mit dem hierin beschriebenen Verfahren werden Hirngewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren, bevor es zur Langzeitlagerung auf -80 °C überführt wird. Es ist wichtig, dass die Werkzeuge und Gewebe während des gesamten Verfahrens zur Konservierung von Nukleinsäuren oder Proteinen kalt gehalten werden. Diese gefrorenen Gewebe werden später mit Labor-Standardarbeitsanweisungen homogenisiert. Einige dieser Hirngewebe sind sehr klein und während des Homogenisierungs- und Extraktionsprozesses sollte darauf geachtet werden, die Zielmoleküle vor dem Abbau bei höheren Temperaturen zu schützen.
Dabei ist es wichtig, klare Landmarken zu identifizieren, um die spezifischen Geweberegionen zu lokalisieren. Dies wird erreicht, indem das Gewebe mit Kochsalzlösung feucht gehalten wird, damit es nicht schnell weich wird und seine Robustheit für eine Weile behält. Unsere früheren Studien verglichen Genexpressionsänderungen zwischen Kontroll- und Aggressor-exponiertem Mausgewebe15 und untersuchten keine Veränderungen, die durch die während der Dissektion verwendete Kochsalzlösung verursacht wurden. Unserer Erfahrung nach ist dies besonders wichtig während der Inzision ausgehend vom Hypothalamus und dem 180°-Flipping, da es die regionale Trennschattierung der limbischen Regionen (AY, HC, ERC) sichtbar und deutlicher macht. Das limbische System befindet sich tief im Gehirn und wird durch eine Vielzahl von Reizen geschädigt und ist daher diagnostisch und therapeutisch wichtig. Das limbische System besteht aus Gehirnregionen, aber es gibt keine universelle Übereinstimmung über diese Liste26. Obwohl nicht untersucht, denken wir, dass es minimale oder keine Auswirkungen der Verwendung von Kochsalzlösung gibt. Dies liegt daran, dass der gesamte Vorgang bei Kälte während des gesamten Prozesses etwa 20 Minuten dauert.
Regionen innerhalb des Hirngewebes werden anhand von Landmarken identifiziert, die in Gehirnatlanten erwähnt werden. Bei dieser Technik müssen die Orientierungspunkte klar sein und dieses Verfahren sollte nacheinander durchgeführt werden. Die Dissektion muss durchgeführt werden, solange das Gehirn noch frisch und robust ist; (muss mit den ersten 15 bis 20 Minuten erledigt werden) - sonst sind die Orientierungspunkte nicht klar und Regionen werden nicht unterschieden, wenn das Gehirn länger bleibt und weicher wird.
Wie oben beschrieben, befinden sich innerhalb des Gehirns Subregionen, die mehrere Funktionsbereiche enthalten, die unabhängig oder in Koordination mit intrinsischen Verbindungsnetzwerken agieren. Es ist wichtig, diese Regionen mit großer Präzision zu erfassen, um ihre breiten Dimensionen zu untersuchen. Dies wird dazu beitragen, diese Konzepte zu integrieren, indem die spezialisierten Regionen, in denen jede einen bestimmten Prozess mit therapeutischem Potenzial bedient, kombiniert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Frau Seshmalini Srinivasan, Herrn Stephen Butler und Frau Pamela Spellman für die experimentelle Unterstützung und Frau Dana Youssef für die Bearbeitung des Manuskripts. Die finanzielle Unterstützung von USAMRDC wird dankbar gewürdigt. Die Genfer Stiftung trug zu dieser Arbeit bei und wurde durch Mittel des Military and Operational Medicine Research Area Directorate III über das US Army Research Office unterstützt.
Verzichtserklärung:
Das Material wurde vom Walter Reed Army Institute of Research überprüft. Gegen die Darstellung und/oder Veröffentlichung ist nichts einzuwenden. Die hierin enthaltenen Meinungen oder Behauptungen sind die privaten Ansichten des Autors und dürfen nicht als offiziell ausgelegt werden oder spiegeln wahre Ansichten des Department of the Army oder des Department of Defense wider. Die Forschung wurde unter einem genehmigten Tierverwendungsprotokoll in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und anderen Bundesgesetzen und -vorschriften in Bezug auf Tiere und Tierversuche durchgeführt und entspricht den Grundsätzen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren, NRC Publication, Ausgabe 2011.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
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