Summary
אנו מציגים פרוטוקול מהיר, שלב אחר שלב, להסרת מוח עכבר ודיסקציה של אזורים בדידים מרקמת מוח טרייה. השגת אזורי מוח לניתוח מולקולרי הפכה לדבר שבשגרה במעבדות רבות למדעי המוח. אזורי מוח אלה מוקפאים באופן מיידי כדי לקבל נתוני תעתיק באיכות גבוהה לניתוח ברמת המערכת.
Abstract
המוח הוא מרכז הפיקוד של מערכת העצבים של היונקים ואיבר בעל מורכבות מבנית עצומה. המוח, המוגן בתוך הגולגולת, מורכב מכיסוי חיצוני של חומר אפור מעל ההמיספרות הידועות בשם קליפת המוח. מתחת לשכבה זו שוכנים מבנים מיוחדים רבים אחרים החיוניים לריבוי תופעות החשובות לקיום. רכישת דגימות של אזורים ספציפיים במוח ברוטו דורשת שלבי דיסקציה מהירים ומדויקים. מובן כי ברמה המיקרוסקופית, קיימים תתי-אזורים רבים וסביר להניח שהם חוצים את הגבולות האזוריים השרירותיים שאנו כופים לצורך ניתוח זה.
מודלים של עכברים משמשים באופן שגרתי לחקר תפקודי מוח אנושיים ומחלות. שינויים בדפוסי ביטוי הגנים עשויים להיות מוגבלים לאזורי מוח ספציפיים המכוונים לפנוטיפ מסוים בהתאם למצב החולה. לפיכך, יש חשיבות רבה ללמוד את הרגולציה של תמלול ביחס לארגון המבני המוגדר היטב שלה. הבנה מלאה של המוח דורשת לחקור אזורים מובחנים במוח, להגדיר קשרים ולזהות הבדלים מרכזיים בפעילות של כל אחד מאזורי המוח האלה. הבנה מקיפה יותר של כל אחד מהאזורים הנפרדים הללו עשויה לסלול את הדרך לטיפולים חדשים ומשופרים בתחום מדעי המוח. במאמר זה נדון במתודולוגיה שלב אחר שלב לניתוח מוח העכבר ל-16 אזורים נפרדים. בהליך זה, התמקדנו בהסרת מוח של עכבר זכר C57Bl/6J (בן 6-8 שבועות) וניתוחו לאזורים מרובים באמצעות ציוני דרך נוירו-אנטומיים כדי לזהות ולדגום אזורי מוח נפרדים הרלוונטיים מבחינה תפקודית ורלוונטיים להתנהגות. עבודה זו תסייע להניח בסיס חזק בתחום מדעי המוח, ותוביל לגישות ממוקדות יותר בהבנה עמוקה יותר של תפקוד המוח.
Introduction
המוח, יחד עם חוט השדרה והרשתית, מרכיבים את מערכת העצבים המרכזית המבצעת התנהגויות מורכבות, הנשלטות על ידי סוגי תאים מיוחדים, ממוקמים במדויק ומתקשרים בכל הגוף1. המוח הוא איבר מורכב עם מיליארדי נוירונים מחוברים וגליה עם מעגלים מדויקים המבצעים פונקציות רבות. זהו מבנה דו-צדדי בעל שתי אונות נפרדות ומרכיבים תאיים מגוונים2. חוט השדרה מחבר את המוח לעולם החיצון ומוגן על ידי עצמות, קרום המוח והנוזל השדרתי ומנתב מסרים אל המוחוממנו 2,3,4. פני השטח של המוח, קליפת המוח, אינם אחידים ויש להם קפלים נפרדים, הנקראים gyri, וחריצים, הנקראים sulci, המפרידים את המוח למרכזים פונקציונליים5. קליפת המוח חלקה ביונקים עם מוח קטן 6,7. חשוב לאפיין וללמוד את הארכיטקטורה של המוח האנושי על מנת להבין את ההפרעות הקשורות לאזורי המוח השונים, כמו גם את המעגלים התפקודיים שלו. המחקר במדעי המוח התרחב בשנים האחרונות ומגוון שיטות ניסיוניות משמשות לחקר המבנה והתפקוד של המוח. התפתחויות בתחומי הביולוגיה המולקולרית והמערכותית הובילו לעידן חדש של חקר היחסים המורכבים בין מבנים מוחיים לתפקוד מולקולות. בנוסף, ביולוגיה מולקולרית, גנטיקה ואפיגנטיקה מתרחבות במהירות, ומאפשרות לנו לקדם את הידע שלנו על המנגנונים הבסיסיים המעורבים באופן שבו מערכות מתפקדות. ניתוחים אלה יכולים להתבצע על בסיס מקומי הרבה יותר, כדי לעזור למקד את החקירה והפיתוח של טיפולים יעילים יותר.
מוח היונקים מוגדר מבחינה מבנית לאזורים בדידים הניתנים לזיהוי ברור; עם זאת, המורכבות הפונקציונלית והמולקולרית של מבנים בדידים אלה עדיין אינה מובנת בבירור. האופי הרב-ממדי והרב-שכבתי של רקמת המוח מקשה על חקר הנוף הזה ברמה התפקודית. בנוסף, העובדה כי פונקציות מרובות מבוצעות על ידי אותו מבנה ולהיפך מסבך עוד יותר את ההבנה של המוח8. חיוני שהגישה הניסויית המבוצעת לאפיון מבני ותפקודי של אזורי מוח תשתמש במתודולוגיות מחקר מדויקות כדי להשיג עקביות בדגימה לצורך קורלציה בין ארכיטקטורה נוירו-אנטומית לתפקוד. המורכבות של המוח הוסברה לאחרונה באמצעות ריצוף שלתא בודד 9,10 כגון הפיתול הטמפורלי של המוח האנושי המורכב מ-75 סוגי תאים שונים 11. על ידי השוואת נתונים אלה לאלה מאזור מקביל במוח העכבר, המחקר לא רק חושף קווי דמיון בארכיטקטורה ובסוגי התאים שלהם, אלא גם מציג את ההבדלים. כדי לפענח את המנגנונים המורכבים, חשוב אפוא לחקור אזורים שונים במוח בדיוק מלא. מבנים ותפקוד משומרים בין מוח אדם לעכבר מאפשרים שימוש בעכבר כפונדקאית ראשונית להבהרת תפקוד המוח האנושי ותוצאות התנהגותיות.
עם התקדמות הגישות של ביולוגיה מערכתית, קבלת מידע מאזורי מוח בדידים במכרסמים הפכה להליך מרכזי בחקר מדעי המוח. בעוד שפרוטוקולים מסוימים כגון מיקרודיסקציה ללכידת לייזר12 יכולים להיות יקרים, פרוטוקולים מכניים הם זולים ומבוצעים באמצעות כלים נפוצים13,14. השתמשנו באזורי מוח מרובים עבור מבחני תעתיק15 ופיתחנו הליך מעשי ומהיר לניתוח אזורי מוח של עכברים בעלי עניין באופן שלב אחר שלב תוך זמן קצר. לאחר הניתוח, דגימות אלה ניתן לאחסן מיד בתנאים קרים כדי לשמר את חומצות הגרעין והחלבונים של רקמות אלה. הגישה שלנו יכולה להתבצע מהר יותר מה שמוביל ליעילות גבוהה ומאפשר פחות סיכויים להידרדרות רקמות. זה בסופו של דבר, מגדיל את הסיכויים של יצירת ניסויים באיכות גבוהה, לשכפל באמצעות רקמות המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלי הטיפול והניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות האירופיות, הלאומיות והמוסדיות לטיפול בבעלי חיים. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז לחקר בריאות הסביבה של צבא ארה"ב, כיום מכון המחקר הצבאי וולטר ריד (WRAIR) ובוצעו במתקן שהוסמך על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומי (AAALAC).
הערה: ההליך יבוצע על עכברים זכרים בני שישה עד שמונה שבועות מזן C57BL/6j שהומתו על ידי נקע צוואר הרחם16. במעבדה שלנו לא מבוצעים זליפים, אך ניתן לשנות פרוטוקול זה לפיו ניתן לבצע זליגות לפינוי דם מכלי הדם. כל האספקה הנדרשת לנתיחה מפורטת בטבלת החומרים. הדיסקציה מחולקת לשלושה מרכיבים, כולל הסרת המוח, הסרת בלוטת יותרת המוח וכריתת המוח. הכוונה של איסוף רקמות המוח היא לעבד אותם לבדיקות תעתיק לאחר מיצוי RNA. ברגע שאזור המוח מנותח, אנו מעבירים מיד כל אחד מאזורי המוח לבקבוקון מקפיא שכבר מסומן ואז מאחסנים את הבקבוקון בחנקן נוזלי או -80 מעלות צלזיוס.
הערה: ידע מעמיק בנוירואנטומיה חיוני לביצוע הליך זה. יש ללמוד וללמוד קטעים אופקיים ואורכיים, כמו גם את הקטעים הרוחביים הרגילים. מאז רקמת המוח מתפרק מהר מאוד, אין זמן להתייעץ עם אטלס בעת ביצוע הליך זה.
1. הסרת מוח עכבר
- מהדקים את המקסילה של הראש הערוף באמצעות המוסטאט (איור 2i) ומשתמשים במשטח גזה כדי לשקף את הקרקפת באופן נוסף ויוצרים שדה יבש על הגב של הגולגולת (איור 2ii).
- הכנס את המספריים המעוקלים העדינים לתוך מגנום הפורמן כדי להפריד בין קרומי המוח הנדבקים. כאן, מכניסים את המספריים בפתח בבסיס הגולגולת הוא הפורמן מגנום, שבו חוט השדרה עובר כשהלהב מצביע אנכית (מיקום השעה 12), אך מקביל ולוחץ על פני השטח הפנימיים של עצם הלוח הבסיסית (כלומר, סקוואמה עורפית) ומסובב את הלהב ארבעים וחמש מעלות לצד שמאל ואז לצד ימין.
- ממשיכים לסובב את שורש כף היד כדי לחטט בעצם הלוח הבסיסית שתחתוך את מרכז העצם הנותרת ותמשיך לתוך העצם העורפית והעצמות התוך-פריאטליות יחטטו בעצמות שמאלה וימינה עד להסרתן. באופן דומה, להסיר את העצם העורפית ואת העצם intraparietal כדי לחשוף את המוח הקטן.
הערה: בשלב זה, ניתן להסיר את המבנה הגרמי החלול שנקרא bullae tympanic, בחלק האחורי הגחוני של הגולגולת התוחם חלקים מהאוזן התיכונה והפנימית, אלא אם כן חותכים את האונות האחוריות והקדמיות של יותרת המוח (איור 2iii). - הסר את חיבורי השרירים לרכס הזמני באמצעות להב מספריים חד מעוקל. הניחו איבר אחד של המספריים החדים המעוקלים מתחת לתפר הלמבדואיד החודר לצומת הסינוסים הרוחביים והסגיטליים (איור 2iv).
- מקדמים את המספריים לאורך התפר המידסגיטלי עד לברגמה וחותכים אותו בעדינות רבה תוך הרמה זהירה כלפי מעלה כדי למנוע חתך של קליפת המוח. זהו שלב קריטי בהליך (איור 2v).
- בשלב זה, עצמות הקודקוד מורמות ומסובבות ובכך מגרדות את פני השטח הפנימיים של העצם כדי לזהות ולחתוך את חיבורי קרום המוח הנותרים. תפסו את העצם הטמפורלית החטטנית כלפי חוץ, הרחק מהמוח. הסר את העצם הקדמית מכל צד באמצעות מספריים מעוקלים או רונג'ור לתוך המסלול וחיתוך קורונלי בזווית ישרה לרכס המסלול, אך לא רחוק יותר מקו האמצע (איור 2vii).
- בצעו שני חתכים מקבילים ובהפרש של כ-4 מ"מ זה מזה במישור הסגיטלי (איור 2viii).
הערה: אין לחתוך את שני הצדדים במשיכה אחת. - הסירו את שברי העצם המצחית כדי להימנע מחיתוך פני השטח של המוח (איור 2ix). בשלב זה, השתמש מספריים עדינים כדי לחתוך את הדורה מאטר, אשר אמור להיות נגיש בין נורות חוש הריח.
- הפוך בעדינות את הגולגולת כדי לאפשר לכוח הכבידה לסייע בהסרת המוח, תוך המשך זיהוי וחיתוך של חיבורי קרום המוח הנותרים ועצבי הגולגולת. המוח ישוחרר על-ידי חיתוך העצב הטריגמינלי הגדול ביותר שמחובר למוח, ונראה בבירור המשתרע מבסיס הקלבריום (איור 2x).
הערה: העבירו את המוח לתמיסת מלח קרה (נתרן ציטראט קר כקרח ללא RNase (0.9%) או מי מלח פיזיולוגיים (0.9%) לצורך נתיחה נוספת.
2. כריתה של יותרת המוח הקדמית והאחורית
הערה: בלוטות יותרת המוח מכוסות בקרום דמוי אוהל קשיח מאוד, עם רכס העובר לרוחב בין העצבים הטריגמינליים השמאלי והימני. מבנים אלה רכים ועדינים במיוחד, וככאלה, מומלץ לנתח את האונות האחוריות והקדמיות של בלוטות יותרת המוח בנפרד בשלבים, באתרם, ישירות מהגולגולת. מיד לאחר דיסקציה, העבר את בלוטת יותרת המוח המתאימה לבקבוקון מסומן מראש ואחסן את הבקבוקון בחנקן נוזלי רצוי אחרת -80 מעלות צלזיוס. בלוטת יותרת המוח נחה בדיוק על צומת העצמות העורפיות והבסיספנואידים; אם הם מתגמשים, ארכיטקטורת יותרת המוח מופרעת.
- שמור על הבולות השמיעתיות שלמות כדי לוודא שהאנטומיה של יותרת המוח שלמה וניתנת לזיהוי בקלות (איור 2ix).
- לנתח את האונה האחורית של יותרת המוח ואחריו את האונה הקדמית של יותרת המוח, משאר הגולגולת.
- צרו חתך פרזגיטלי קטן במיוחד משני הצדדים ברכס האוהל הממברני והרימו את האונה האחורית של יותרת המוח בעזרת מלקחיים עדינים במיוחד, תוך הקפדה שלא לשבש את רקמת יותרת המוח הקדמית (איור 2x).
- בצעו חתך סגיטלי בין השוליים הצדדיים של האונה הקדמית של יותרת המוח לבין העצב הטריגמינלי הקרוב ביותר, והרימו את האונה הקדמית של יותרת המוח לאחר מכן (איור 2x).
3. דיסקציה של מוח עכבר
הערה: מיד לאחר הסרת המוח ויותרת המוח, מתבצעת דיסקציה נוספת על גוש נירוסטה מקורר מראש (איור 3). לאחר הדיסקציה, העבירו את אזורי המוח לבקבוקונים מסומנים מראש והעבירו את הבקבוקונים עדיף לחנקן נוזלי אחרת -80 מעלות צלזיוס. מבנים המיוצרים בשיטה מלמעלה למטה (בסדר כרונולוגי) עשויים לכלול את הדברים הבאים: המוח הקטן (CB), גזע המוח/המוח האחורי (pons and medulla oblongata) (HB), נורות חוש הריח (OB) כנורות חוש הריח, קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (MPFC), קליפת המוח הקדם-מצחית הלטרלית (FCX), סטריאטום קורפוס קדמי ואחורי (ST), סטריאטום גחוני (VS) המורכב מגרעין האקומבנס (NAC) ופקעת חוש הריח (OT), מחיצה (SE), אזור קדם-אופטי, קליפת המוח הפיריפורמית (PFM), ההיפותלמוס (HY), אמיגדלה (AY), היפוקמפוס (HC), פיתול החגורה האחורי (CNG), קליפת המוח האנטורינלית (ERC), המוח האמצעי (MB) עם התלמוס ושאר קליפת המוח (ROC) (טבלה 1). אזורים ספציפיים יידונו לפי סדר הבידוד, עבודה עם חצי כדור אחד.
- היזהרו מאוד בהסרת המוח מהקלבריום מכיוון שציוני הדרך עלולים להיהרס במקרה שיש חתכים. בשלב זה, בצע את כל הניתוחים באמצעות הגנה על הפנים, במיוחד, מגן תכשיטנים 7x, והתאורה תסופק על ידי מנורות כירורגיות הממוקמות מעל כל אחת מכתפיו של הדיסקטור. חלק גדול מהדיסקציה ייעשה באמצעות מלקחיים מעוקלים קטנים במצב קהה (כלומר, מלקחיים Graefe).
- הניחו את המוח על גוש נירוסטה (איור 4i ואיור 4ii). שמור על הבלוק קר על ידי הקפתו בקרח ותמיסת מלח קרה כקרח. מעת לעת לחות את הרקמה עם תמיסת מלח קר כקרח כדי לשמר את המבנים.
- מקם את המוח כך שקליפת המוח פונה כלפי מעלה. באמצעות מלקחיים מעוקלים קטנים, משקפים בעדינות את ה-CB על-ידי חשיפת הדוכנים העליונים, האמצעיים והנחותים של המוח הקטן ומסירים את ה-CB (איור 4iii ואיור 4iv).
- בצעו חתך מידסגיטלי החל מהדורסום ובין ה-OB להמיספרות המוחיות (איור 4v) והקפידו לא להתארך רחוק יותר מהקומיסור הקדמי. בשלב זה, ניתן להפריד בקלות את הוורמיס מהחלקים הצדדיים ו - HB יתקבל על ידי חתך קורונלי בשוליים הקדמיים של הפונס.
- מפרידים את המדולה על ידי חתך קורונלי בשוליים האחוריים של הפונס.
הערה: בשלב זה, הדיאנצפלון, החלק האחורי של המוח הקדמי המכיל את האפיתלמוס, התלמוס, ההיפותלמוס והתלמוס הגחוני והחדר השלישי, יהפוך את הצד הגחוני כלפי מעלה, וחתך מידסגיטלי ייעשה מהכיאזמה האופטית ברוסטרלי. הדיסקציה של ההמיספרות המוחיות ואחריה הסרת ה-OB מאחת מחצי הכדור תהיה בשלב זה (איור 4v ואיור 4vi). - הפרד את ההמיספרות המוחיות (איור 4v) לפני שתנתח את הדיאנצפלון עוד יותר (איור 4v). הגישה הגבית תשמש על ידי דיסקציה קהה זהירה כדי לשמר את ציוני הדרך הבולטים ביותר בקו האמצע. דמיינו כל קשר בין-יבשתי לפני ניתוקו, שכן הדבר ימזער את האפשרות לסטות מקו האמצע.
הערה: בשלב זה ניתן לשמר את אחת ההמיספרות המוחיות (Hemibrain) ואת ההמיספרה השנייה לצורך נתיחה נוספת - מחליקים את הלהבים הסגורים של מלקחיים קטנים ומעוקלים, מתחת לקורפוס קלוסום ומתפשטים בעדינות כדי לסגת מהניאוקורטקס באופן דו-צדדי. קורפוס קלוסום הוא רצועה רחבה של סיבי עצב המחברת את שתי ההמיספרות אשר ינותחו בבוטות על ידי צביטה עם המלקחיים, מבלי להפריע למבני קו האמצע השוכנים מתחת.
הערה: לפנים המזיאליות של חצי הכדור יהיו ציוני דרך רבים הנראים לעין כגון מבנים מיאליניים כמו הגנו של קורפוס קלוסום, הפורניקים והקומיסור הקדמי. כמו כן, למרות כמה מילימטרים לרוחב לקו האמצע, ניתן לראות גם את דרכי הממילותלמיה ואת ה- fasciculus retroflexus. - חוצים את המבנים המרובים שחוצים את קו האמצע. זה יכלול את קורפוס קלוסום, קומיסור קדמי, קומיסור פורניקס גחוני, קומיסור אחורי, קומיסור פורניקס גבי, דקוסיה סופרה ממימית, קומיסור קוליקולוס מעולה, קומיסור פורניקס גחוני וסיבים תלמיים פריונטריקולריים.
- נקוט זהירות מיוחדת בשלב זה בקו האמצע או בסמוך לו, שעלול להיפגע חלקית על ידי שיטת הגישה הגבית. כל מבני המעקב נמצאים בסיכון אם אינם מבוצעים בקפידה.
- הסר את נורות הריח OB (בצורת טריז וצבע בהיר יותר) ולאחר מכן אוסף של MPFC (אזור פיתול החגורה 1, קליפת המוח הפרה-לימבית, האינפרה-לימבית, האורביטלית המדיאלית והמוטורית המשנית [M2]) ו-FCX על-ידי חתך קורונלי שנעשה 1 מ"מ קדמי לסוג של קורפוס קלוסום (איור 4vii). חלק את הקטע המתקבל על ידי חתך parasagittal 1/3 של המרחק מן המדיאלי למשטח הלטרלי, מניב MPFC מדיאלי ושאר FCX לרוחב. פיתול החגורה הוא אנלוגי העכבר של MPFC.
הערה: פרוסת רקמה זו תכיל גם כמות קטנה של M2 (קליפת המוח המוטורית המשנית) 17 והיא בלתי נמנעת. - בצע חתך קורונלי ברמה של הקומיסורה הקדמית המובילה לנראות של האיבר הקדמי של הקומיסורה הקדמית בחתך על פני הרוסטרל של החתך הקורונלי שנוצר ואילו החלק הרוחבי יתגלה בפנים הקאודליות של הסעיף זהו ציון דרך מאשר עבור NAC18. ה-VS מורכב מ-NAC ו-OT.
הערה: יש איבר קדמי בנוסף לקטע הרוחבי בקומיסורה הקדמית והוא נקרא קומיסור קדמי, pars קדמי. - חתך חלקי אופקית דרך החלק הרוחבי של הקומיסורה הקדמית מקו האמצע מתחת לקרן הקדמית של החדר הצדדי, כדי לשחרר את גרעין המחיצה באופן דורסלי ואת הגחון VS. הסר את הכמות הקטנה של קליפת המוח מהמשטח הצדדי שבו יוסרו NAC ו-OT.
- יש להפריד את החלק הרוסטרלי של ה-ST מקליפת המוח העליונה באמצעות אזמל מעוקל שנחתך ממש מחוץ לקפסולה החיצונית, תוך הקפדה שלא לכלול רקמת סטריאטלית בדגימת קליפת המוח. בנקודה זו, גרעיני המחיצות /SE יהיו גלויים לעין וניתן יהיה לקחת אותם בקלות מהפרוסה הזו (איור 4viii).
הערה: הגבולות הקדמיים והאחוריים של ה-PFM מוגדרים על ידי מישורים קורונליים דמיוניים התואמים את הקומיסורה הקדמית ואת גופי החלב בהתאמה. הגבול המדיאלי מוגדר על ידי הקפסולה החיצונית18. - על פני השטח הצדדיים של החלק הנותר של הדיאנצפלון, בצע חתך אופקי חלקי לאורך סולקוס הרינל המשתרע באופן קאוודי, אך רק עד לרמת המישור הקורונלי הדמיוני עם גופי השתן. בצע חתך קורונלי חלקי, המשתרע מדיאלי 1 מ"מ ממשטח קליפת המוח לרוחב במישור של גופי החלב של HY. כאן, חתך פארא-סגיטלי במישור הקלאוסטרום ישחרר את ה-PFM (איור 4ix ואיור 4x).
הערה: על פני השטח המדיאליים של החלק הנותר של הדיאנצפלון, תכונות אנטומיות רבות ייראו כולל גופי השן, ה- fasciculus retroflexus וה- stria medullaris. תבנית חצי עגולה (הצד הקעור הגבי) תהיה גלויה, המציינת את השוליים בין התלמוס לבין HY. ה - HY יזוהה בקלות בתצוגת החתך המידסגיטלי לפי הכיאזמה האופטית האנטרובנטרלית והקומיסורה הקדמית anterodorsally וגופי החלב יחד עם ה- fasciculus retroflexus אחורית. ציוני הדרך האחרונים הוצגו היטב באטלס17 כמו גם בהקשר הקדמי של עכבר לבקנים19. - בצע חתך קורונלי חלקי אחורי לגופי המחלבה, המשתרע רק לרוחב כמו הסולקוס ההיפותלמי. בשלב זה חתך parasagittal לאורך הסולקוס ההיפותלמי עכשיו משחרר את HY .
- כרוך בהיפוך של החדר הלטרלי כדי לחשוף קשרים תוך-לימביים נוספים ואת שאר רכיבי המערכת הלימבית. צפייה בפנים המדיאליות של חתך ההמי-הנותר של הדיאנצפלון, מלקחיים מעוקלים תהיה האפשרות הטובה ביותר מכיוון שהם מאפשרים לטכנאי לתפעל סביב חלקים עדינים אחרים של האזור שמסביב המשמשים לניתוק הפורניקס ומוכנס לחדר הצדדי ומורחב בעדינות, תוך שימוש בדיסקציה קהה כדי לפתוח את החדר ולסובב את HC 90° מהמישור האנכי למישור האופקי. ייתכן שיהיה צורך להשתמש בלהב #11 כדי לחתוך את העורק הכורואידי / מקלעת הכורואיד מכיוון שהקצה המחודד יכול לעזור בחתכים מדויקים.
- סובב את ה-CNG ב-90° (אך בכיוון ההפוך מה-HC) כך שיהיה במישור האופקי. באמצעות מלקחיים, סובבו בעדינות את ה-HC עוד 180° החוצה ולרוחב, מה שיגרום למשטח הפנימי של ה-ERC להיראות ופונה כלפי מעלה.
- קרינה דמוית מניפה של סיבים מיאלינים הנובעת מה-ERC תיראה מתכנסת ליצירת הצרור הזוויתי, כולל הנתיב המחורר וחיבורו ל-HC. סובבו את התלמוס ואת MB 180° באופן דורסלי כדי לחשוף את ה-AY.
- במידת הצורך, הרם את המערכת האופטית כדי לחשוף את החיבור של הסטריה טרמינליס מכיוון שהוא יכיל רצועות של סיבים העוברים לאורך השוליים הצדדיים של פני השטח של התלמוס ל- AY ויבהיר את קווי המתאר של ה - AY .
הערה: ה-HC והפורניקס ייראו בבירור בשלמותם, מקוננים בחדר הצדדי, וניתן להרימו בקלות. החדר הצדדי יהיה מרופד בפיה-מאטר ומקורות דמויי מניפה של הנתיב המחורר דרך ההיבט התת-שקוף מאוד של ה-ERC יהיו גלויים20. - על פני השטח החיצוניים של ERC המדיאלי תהיה שכבה בולטת נראית לעין של תאים פירמידליים גדולים. בנוסף, התכנסות צפופה של סיבי גולג'י-מכתים תהיה תכונה בולטת ב-ERC המדיאלי. בהליך דיסקציה זה, לאחר אוורור החדר הלטרלי, סיבים אלה ייראו בקלות על המשטח המדיאלי דרך הפיה מאטר, המרפדת את המשטחים הפנימיים של החדרים, ויוצרת מבנה בולט מאוד דמוי מניפה.
- שימו לב שהסיבים מתקבצים באופן תת-קרקעי, יורדים ועוזבים את ה-ERC הגחוני, מתרחבים לאחור ואז עולים אנכית כדי לנקב את ה-HC. מבנה דמוי מאוורר זה ב- ERC ישמש להגדרת השוליים לצורך נתיחה. זהה והסר לפי הסדר של מבני AY, ERC, CNG ו- HC.
הערה: הגדרת נקודת ציון טובה עבור נתיחת AY תהיה מפתח לשלב הבא והצומת בשוליים האחוריים שבו stria terminalis פוגש את ה- AY תהיה נקודה טובה. - בשלב זה, המבנים הנותרים כוללים את התלמוס ואת MB. אשר את זיהוי התלמוס על ידי הדמיה של הסטריה מדולאריס על פני השטח הגביים שלה המשתרעים במישור הרוסטרוקאודלי של קו האמצע. מפרידים את התלמוס לחלוטין מהמוח האמצעי על ידי חתך קורונלי להאבנולה ורוסטרל לקוליקולי העליון. ה - ROC נשמר בשלב זה.
- בשלב זה יש להשלים את האיסוף של כל אזורי המוח, ומיד (כפי שכל אחד מהם מתקבל) לאחסן את הדגימות בהבזקים קפואים עד לעיבוד נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההבנה שלנו לגבי מבנה המוח המורכב ותפקודו מתפתחת ומשתפרת במהירות. המוח מכיל מספר אזורים מובחנים, ובניית מפה מולקולרית יכולה לעזור לנו להבין טוב יותר כיצד המוח פועל. במאמר שיטה זה דנו בנתיחה של מוח העכבר למספר אזורים נפרדים (טבלה 1). בפרוטוקול זה, המבנים מזוהים על סמך ציוני הדרך הקריטיים ומושגים על ידי שמירה על הרקמה לחה עם תמיסת מלח על ידי שמירה על איתנותה לנתיחה מיידית. השיטה מכסה יותר אזורים מאשר דוחותאחרים 21 והיא משלימה לשיטות דיסקציה באמצעות מוחות קפואים22,23. רקמות מנותקות אלה יכולות להישמר ולעבד מאוחר יותר בהתאם לדרישות המחקר. השיטה הנדונה כאן היא הסרה מיידית של המוח מהגולגולת ואחריה דיסקציה המספקת מספיק רקמות בצורה מהירה לבדיקות במורד הזרם בהתחשב בגודל מוח העכבר. הצוות שלנו חילץ RNA ממספר רקמות מנותקות ונבדק ליצירת פרופילים של ביטוי גנים באמצעות מיקרו-מערכים לרקמות מוח; AY, HC, MPFC, אזור המחיצות, קורפוס סטריאטום ו- VS והתוצאות פורסמו15. המוחות שנקטפו אוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים לפני מיצוי הרנ"א. ניתן לאמץ שיטה זו בשילוב של שיטות אחרות כדי לגוון את התועלת במורד הזרם של אזורי המוח. שיטת דיסקציה זו מתמקדת במעקב אחר ציוני דרך בין אזורים סמוכים מובחנים אנטומית במקום להיות דיסקציות קורונליות או סגיטליות בלבד. אזורי המוח המובהקים יחד עם נתוני המשקל שנאספו במסגרת מודל הלחץ החברתי החשוף של PTSD16 וריכוזי RNA יחד עם קריאות ספקטרופוטומטריות מוצג כאיור 5.
איור 1: ייצוג של מוח עכבר עם סוגי רקמות שונים שנאספו. נתון זה הוא ייצוג קוסמטי של המבנים ואינו מותאם לשום מסד נתונים ממופה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הסרת המוח מחלל הגולגולת ואחריה הסרת יותרת המוח. הליך שלב להסרת המוח (i) הידוק והחזקה לאחר הסרת שיער (ii) אבטחת המהדק עם Kimwipe כדי להרחיק את השיער מהרקמה (iii) לפני הסרת השרירים (iv) לאחר הסרת השרירים (v) הפרדת méninges (vi) הסרת כדור הארץ /עין (vii) חתך על רכס מסלולי (viii) הסרת עצמות קודקודיות וחזיתיות (ix) תצוגת מוח והסרה (x) ניתוק המוח (xi) תצוגת יותרת המוח (xii) הסרת יותרת המוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תחנת הגדרת דיסקציה. תמונה זו מציגה את המערך להסרת רקמות המוח לאחר כריתת המוח ויותרת המוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: דיסקציה של המוח. הליך שלב להסרת המוח (i) מבט עליון על המוח (ii) מבט גבי של המוח (iii) הסרת המוח הקטן (iv) הפרדה מוחית (v) דיסקציה של המיספרות (vi) הסרת נורות חוש הריח (vii) MPFC, FCX ודיסקציה של חוש הריח (viii) SE, VS ו- ST דיסקציה (ix) הסרת PFM (x) דיסקציה של המערכת הלימבית אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: מוצגים נתונים שנוצרו לאחר איסוף דגימה (A) משקל רקמת המוח ו-(B) ריכוז RNA ו-(C) OD 260/280 מכל אחת מרקמות המוח. כאן הנתונים נאספים מקבוצות ביקורת (n = 3-6) מקבוצת מחקר כפי שדווח קודםלכן 15,16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| # | קיצורים | תיאור של אזור המוח |
| 1 | CB | המוח הקטן |
| 2 | HB | גזע המוח/מוח אחורי (פונס ומדולה אובלונגטה) |
| נפרדים לשתי ההמיספרות | ||
| 3 | אוב | נורות חוש הריח ונורות חוש הריח |
| 4 | MPFC | קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית |
| 5 | FCX | קליפת המוח הקדם-מצחית הלטרלית |
| 6 | לצפות | מחיצה או אזור מחיצה |
| 7 | לעומת | הסטריאטום הגחוני כולל את גרעין האקומבנס (NAC) ופקעת חוש הריח (OT) |
| 8 | סנט | סטריאטום קורפוס קדמי ואחורי |
| 9 | היי | ההיפותלמוס |
| 10 | פ.מ.מ. | קליפת המוח הפיריפורמית |
| 11 | HC | ההיפוקמפוס |
| 12 | ERC | קליפת המוח האנטורינלית |
| 13 | גז טבעי דחוס | פיתול החגורה האחורי |
| 14 | איי | אמיגדלה |
| 15 | מ"ב | המוח האמצעי עם התלמוס |
| 16 | ROC | שארית קליפת המוח |
טבלה 1: תיאור של אזורים מובחנים ממוח העכבר. טבלה זו מכילה רשימה של כל אזורי המוח שנאספו עם הקיצור שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מוח היונקים הוא איבר מורכב המורכב ממערך של תאים נבדלים מבחינה מורפולוגית וייחודיים מבחינה תפקודית עם חתימות מולקולריות מגוונות ואזורים מרובים המבצעים פונקציות מיוחדות ובדידות. להליך הנתיחה המדווח כאן יכולות להיות מספר מטרות בהתאם לדרישות המעבדה. במעבדה שלנו הערכנו שעתוק באזורי מוח מרובים שנאספו מעכברים שנחשפו ל- PTSD כמו מתח16 . ברצוננו לחקור עוד יותר את ההשפעה של רקע גנטישל זן 24 על רמות הביטוי באזורים רבים במוח. פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים שיש לקחת בחשבון לצורך שחזור מוצלח של הניסויים. לכל אחד מהאזורים המקומיים במוח יש תפקיד ייחודי במצב נוירופתולוגי, והידע המפורט על אזור המוח המתאים למחקר לוקה בחסר. לכן חשוב לייצר את מערך הנתונים הנוגע לאזור המוח. לפיכך, ניתן לשאול את הנתונים לא רק על ידי בחירת אזור במוח אלא גם לפי קטגוריית נתונים (למשל, תעתיק, חלבון, תא (ציטו-ארכיטקטורה) או אחרים) מה שמוביל למידע מדויק יותר. בעבר, רקמות כגון פקעת חוש הריח, קליפת המוח הקדמית, סטריאטום והיפוקמפוס ברקמות מוח של חולדות טריות הוכחו כמנותקות באמצעות מיקרוסקופ25. לחלופין ניתן לנתח מקטעים בזמן שהמוח קפוא14 ואחריו מיצויי RNA וחלבונים, אך שיטה זו מוגבלת לאזורי מוח שניתן לזהותם על ידי ציוני דרך ברורים. סך כל מיצויי ה-RNA בוצעו לאחר מיקרודיסקציה25 מאזורי מוח עיקריים, כמו גם שימוש בגישה מיקרוסקופית שאינה לכידת לייזר למחקרי ביטוי גנים13. כאן אנו מתמקדים בניתוח של מוח עכבר טרי כדי להפריד את המבנים המוחיים הספציפיים שיש להם שליטה ייעודית על תפקודים פיזיולוגיים והתנהגותיים. השיטה שלנו מסבירה את החלוקה של אזורים רבים יותר מאשר דוחות שכבר פורסמו, אולם היא משלימה לשיטות דיסקציה אחרות הזמינות. גישה זו יכולה לסייע במתן הערכה מקיפה של הרקמות והקשר שלה למצבים מתישים. אסטרטגיית דיסקציה זו מספקת אפשרות מעשית לאסטרטגיות איסוף דגימות קיימות הפותחות אפשרויות לתגליות חדשות.
בשיטה המתוארת כאן, רקמות המוח מוקפאות בחנקן נוזלי לפני שהן מועברות ל -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. חשוב שהכלים והרקמות יישמרו קרים במהלך כל ההליך לשימור חומצות גרעין או חלבונים. רקמות קפואות אלה הומוגניות מאוחר יותר באמצעות נהלי הפעלה סטנדרטיים במעבדה. חלק מרקמות המוח הללו קטנות מאוד ויש לנקוט בזהירות במהלך תהליך ההומוגניזציה והמיצוי המגן על מולקולות המטרה מפני התפרקות בטמפרטורות גבוהות יותר.
בתהליך זה, חשוב לזהות ציוני דרך ברורים כדי לאתר את אזורי הרקמה הספציפיים. זה מושג על ידי שמירה על לחות הרקמה עם תמיסת מלח כדי למנוע ממנה להפוך רכה במהירות ולשמור על החוסן שלה לזמן מה. המחקרים הקודמים שלנו השוו שינויים בביטוי גנים בין בקרה לבין רקמות עכבר חשופות תוקפן15 ולא חקרו שינויים כלשהם שנגרמו כתוצאה ממי מלח המשמשים במהלך דיסקציה. מניסיוננו, זה חשוב במיוחד במהלך החתך החל מההיפותלמוס וההיפוך של 180° כשהוא חושף והופך את הצללת ההפרדה האזורית של האזורים הלימביים (AY, HC, ERC) לברורה וברורה יותר. המערכת הלימבית ממוקמת עמוק בתוך המוח ונפגעת ממגוון גירויים, ולכן היא חשובה מבחינה אבחנתית וטיפולית. שם המערכת הלימבית מורכבת מאזורי מוח אולם אין הסכמה אוניברסלית ברשימה זו26. למרות שלא נחקר, אנו חושבים שיש השפעות מינימליות או ללא השפעות של שימוש במי מלח. הסיבה לכך היא כי ההליך כולו נמשך כ 20 דקות לאחר תנאי קור במהלך התהליך כולו.
אזורים בתוך רקמת המוח מזוהים באמצעות ציוני דרך המוזכרים באטלסים מוחיים. באמצעות טכניקה זו, ציוני הדרך צריכים להיות ברורים והליך זה צריך להיעשות ברצף. הדיסקציה צריכה להיעשות בזמן שהמוח עדיין טרי וחזק; (צריך להיעשות עם 15 עד 20 הדקות הראשונות) - אחרת ציוני הדרך לא יהיו ברורים ואזורים לא יהיו מובחנים אם המוח נשאר זמן רב יותר ונעשה רך יותר.
כפי שתואר לעיל, בתוך המוח ישנם תת-אזורים, המכילים אזורים תפקודיים מרובים הפועלים באופן עצמאי או בתיאום עם רשתות חיבור פנימיות. חשוב לאחזר אזורים אלה בדיוק רב על מנת ללמוד את ממדיהם הרחבים. זה יעזור לשלב את המושגים הללו על ידי שילוב האזורים המיוחדים שבהם כל אחד מהם משרת תהליך ייחודי עם פוטנציאל טיפולי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לגב' סשמאליני סריניוואסן, למר סטיבן באטלר ולגב' פמלה ספלמן על הסיוע הניסיוני ולגב' דנה יוסף על עריכת כתב היד. התמיכה במימון של USAMRDC היא אסירת תודה. קרן ז'נבה תרמה לעבודה זו ונתמכה על ידי כספים ממנהל אזור המחקר הצבאי והתפעולי III באמצעות משרד המחקר של צבא ארה"ב.
כתב ויתור:
החומר נבדק על ידי מכון המחקר הצבאי על שם וולטר ריד. אין התנגדות להצגתו ו/או לפרסומו. הדעות או הקביעות הכלולות במסמך זה הן דעותיו הפרטיות של המחבר, ואין לפרשן כרשמיות, או כמשקפות דעות אמיתיות של מחלקת הצבא או משרד ההגנה. המחקר נערך תחת פרוטוקול מאושר לשימוש בבעלי חיים במתקן מוכר של AAALAC בהתאם לחוק רווחת בעלי חיים ולחוקים ותקנות פדרליים אחרים הנוגעים לבעלי חיים ולניסויים המערבים בעלי חיים ומצייתים לעקרונות המפורטים במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, הוצאת NRC, מהדורת 2011.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
- P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L.
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
- Spijker, S.
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E.
