Summary
Nous présentons un protocole pratique, étape par étape, rapide pour l’ablation du cerveau de souris et la dissection de régions discrètes à partir de tissus cérébraux frais. L’obtention de régions cérébrales pour l’analyse moléculaire est devenue une routine dans de nombreux laboratoires de neurosciences. Ces régions du cerveau sont immédiatement congelées pour obtenir des données transcriptomiques de haute qualité pour l’analyse au niveau du système.
Abstract
Le cerveau est le centre de commande du système nerveux des mammifères et un organe doté d’une énorme complexité structurelle. Protégé à l’intérieur du crâne, le cerveau est constitué d’une enveloppe externe de matière grise sur les hémisphères connue sous le nom de cortex cérébral. Sous cette couche résident de nombreuses autres structures spécialisées qui sont essentielles pour de multiples phénomènes importants pour l’existence. L’acquisition d’échantillons de régions cérébrales macroscopiques spécifiques nécessite des étapes de dissection rapides et précises. Il est entendu qu’au niveau microscopique, de nombreuses sous-régions existent et traversent probablement les frontières régionales arbitraires que nous imposons aux fins de cette dissection.
Les modèles murins sont couramment utilisés pour étudier les fonctions cérébrales humaines et les maladies. Les changements dans les schémas d’expression génique peuvent être limités à des zones spécifiques du cerveau ciblant un phénotype particulier en fonction de l’état malade. Ainsi, il est d’une grande importance d’étudier la régulation de la transcription par rapport à son organisation structurelle bien définie. Une compréhension complète du cerveau nécessite d’étudier des régions cérébrales distinctes, de définir des connexions et d’identifier les différences clés dans les activités de chacune de ces régions du cerveau. Une compréhension plus complète de chacune de ces régions distinctes pourrait ouvrir la voie à des traitements nouveaux et améliorés dans le domaine des neurosciences. Ici, nous discutons d’une méthodologie étape par étape pour disséquer le cerveau de la souris en seize régions distinctes. Dans cette procédure, nous nous sommes concentrés sur l’ablation et la dissection cérébrale de souris mâles C57Bl / 6J (6-8 semaines) dans plusieurs régions en utilisant des repères neuroanatomiques pour identifier et échantillonner des régions cérébrales discrètes fonctionnellement pertinentes et comportementales. Ce travail aidera à établir une base solide dans le domaine des neurosciences, menant à des approches plus ciblées dans la compréhension plus profonde de la fonction cérébrale.
Introduction
Le cerveau, ainsi que la moelle épinière et la rétine, constituent le système nerveux central qui exécute des comportements complexes, contrôlés par des types de cellules spécialisées, positionnées avec précision et en interaction dans tout le corps1. Le cerveau est un organe complexe avec des milliards de neurones interconnectés et de glies avec des circuits précis remplissant de nombreuses fonctions. C’est une structure bilatérale avec deux lobes distincts et divers composants cellulaires2. La moelle épinière relie le cerveau au monde extérieur et est protégée par les os, les méninges et le liquide céphalorachidien et achemine les messages vers et depuis le cerveau 2,3,4. La surface du cerveau, le cortex cérébral, est inégale et possède des plis distincts, appelés gyri, et des rainures, appelées sulci, qui séparent le cerveau en centres fonctionnels5. Le cortex est lisse chez les mammifères avec un petit cerveau 6,7. Il est important de caractériser et d’étudier l’architecture du cerveau humain afin de comprendre les troubles liés aux différentes régions du cerveau, ainsi que ses circuits fonctionnels. La recherche en neurosciences s’est développée ces dernières années et diverses méthodes expérimentales sont utilisées pour étudier la structure et la fonction du cerveau. Les développements dans les domaines de la biologie moléculaire et systémique ont inauguré une nouvelle ère d’exploration de la relation complexe entre les structures cérébrales et le fonctionnement des molécules. De plus, la biologie moléculaire, la génétique et l’épigénétique se développent rapidement, ce qui nous permet de faire progresser nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents impliqués dans le fonctionnement des systèmes. Ces analyses peuvent être effectuées sur une base beaucoup plus localisée, pour aider à cibler l’investigation et le développement de thérapies plus efficaces.
Le cerveau des mammifères est structurellement défini en régions discrètes clairement identifiables; Cependant, les complexités fonctionnelles et moléculaires de ces structures discrètes ne sont pas encore clairement comprises. La nature multidimensionnelle et multicouche du tissu cérébral rend ce paysage difficile à étudier au niveau fonctionnel. De plus, le fait que plusieurs fonctions soient assurées par la même structure et vice versa complique encore la compréhension du cerveau8. Il est essentiel que l’approche expérimentale exécutée pour la caractérisation structurelle et fonctionnelle des régions cérébrales utilise des méthodologies de recherche précises pour parvenir à une cohérence dans l’échantillonnage pour corréler l’architecture neuroanatomique avec la fonction. La complexité du cerveau a été récemment expliquée en utilisant le séquençage unicellulaire 9,10 tel que le gyrus temporal du cerveau humain qui est composé de 75 types cellulaires distincts 11. En comparant ces données à celles d’une région analogue du cerveau de la souris, l’étude révèle non seulement des similitudes dans leur architecture et leurs types de cellules, mais présente également les différences. Pour démêler les mécanismes complexes, il est donc important d’étudier diverses régions du cerveau avec une précision totale. Les structures et la fonction conservées entre un cerveau humain et un cerveau de souris permettent l’utilisation d’une souris comme substitut préliminaire pour élucider la fonction cérébrale humaine et les résultats comportementaux.
Avec l’avancement des approches de biologie des systèmes, l’obtention d’informations à partir de régions cérébrales discrètes chez les rongeurs est devenue une procédure clé dans la recherche en neurosciences. Alors que certains protocoles tels que la microdissection par capture laser12 peuvent être coûteux, les protocoles mécaniques sont peu coûteux et réalisés à l’aide d’outils couramment disponibles13,14. Nous avons utilisé plusieurs régions du cerveau pour des tests transcriptomiques15 et avons développé une procédure pratique et rapide pour disséquer les régions cérébrales d’intérêt de souris étape par étape en peu de temps. Une fois disséqués, ces échantillons peuvent être stockés immédiatement dans des conditions froides pour préserver les acides nucléiques et les protéines de ces tissus. Notre approche peut être réalisée plus rapidement, ce qui conduit à une efficacité élevée et permet moins de risques de détérioration des tissus. En fin de compte, cela augmente les chances de générer des expériences reproductibles de haute qualité utilisant des tissus cérébraux.
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Protocol
Les procédures de manipulation et d’expérimentation des animaux ont été menées conformément aux directives européennes, nationales et institutionnelles en matière de soins aux animaux. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Centre de recherche sur la santé environnementale de l’armée américaine, maintenant Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) et réalisées dans un établissement accrédité par l’Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).
NOTE: La procédure sera effectuée sur des souris mâles âgées de six à huit semaines de la souche C57BL / 6j euthanasiées par luxation cervicale16. Aucune perfusion n’est effectuée dans notre laboratoire, mais ce protocole pourrait être modifié afin que des perfusions pour éliminer le sang du système vasculaire puissent être effectuées. Toutes les fournitures requises pour la dissection sont énumérées dans le tableau des matériaux. La dissection est subdivisée en trois composantes, dont l’ablation du cerveau, l’ablation de l’hypophyse et la dissection cérébrale. L’objectif de la collecte de tissus cérébraux est de les traiter pour des tests transcriptomiques après des extractions d’ARN. Dès que la région du cerveau est disséquée, nous transférons immédiatement chacune des régions du cerveau dans un flacon de congélation déjà étiqueté, puis stockons le flacon dans de l’azote liquide ou -80 ° C.
REMARQUE: Une connaissance approfondie de la neuroanatomie est essentielle pour effectuer cette procédure. Les sections horizontales et longitudinales, ainsi que les sections transversales habituelles, devraient être étudiées et apprises. Comme le tissu cérébral se dégrade très rapidement, il n’y a pas le temps de consulter un atlas pendant l’exécution de cette procédure.
1. Enlèvement du cerveau de souris
- Serrez le maxillaire de la tête décapitée avec un hémostatique (Figure 2i) et utilisez un tampon de gaze pour refléter le cuir chevelu rostralement en créant un champ sec sur le dos du crâne (Figure 2ii).
- Insérez les fins ciseaux incurvés dans le foramen magnum pour séparer les méninges adhérentes. Ici, insérez les ciseaux à l’ouverture sur la base du crâne est le foramen magnum, où la moelle épinière passe avec la lame pointant verticalement (position 12 heures), mais parallèle et pressant contre la surface interne de l’os de la plaque basale (c’est-à-dire le squama occipital) et tournant la lame de quarante-cinq ° vers le côté gauche puis vers le côté droit.
- Continuez à faire pivoter le poignet pour arracher l’os de la plaque basale qui coupera le milieu de l’os restant en continuant dans l’os occipital et les os intrapariétaux indiscrets à gauche et à droite jusqu’à ce qu’ils soient retirés. De la même manière, retirez l’os occipital et l’os intrapariétal pour exposer le cervelet.
REMARQUE : À ce stade, la structure osseuse creuse appelée bulles tympaniques, sur la partie postérieure ventrale du crâne qui entoure des parties de l’oreille moyenne et interne, peut être enlevée à moins que l’on ne dissèque les lobes postérieur et antérieur de l’hypophyse (figure 2iii). - Retirez les attaches musculaires à la crête temporale à l’aide d’une lame de ciseaux tranchante incurvée. Placer un membre des ciseaux pointus incurvés sous la suture lambdoïde pénétrant dans la jonction des sinus transverse et sagittal (Figure 2iv).
- Avancez les ciseaux rostralement le long de la suture médio-sagittale jusqu’au bregma et coupez-le très doucement tout en soulevant soigneusement vers le haut pour éviter la lacération du cortex cérébral. Il s’agit d’une étape critique de la procédure (figure 2v).
- À cette étape, les os pariétaux sont soulevés et tournés, grattant ainsi la surface interne de l’os pour identifier et couper les attaches méningées restantes. Saisissez l’os temporal indiscret vers l’extérieur, loin du cerveau. Retirer l’os frontal de chaque côté à l’aide de ciseaux incurvés ou d’un rongeur dans l’orbite et couper coronalement perpendiculairement à la crête orbitale, mais pas plus loin que la ligne médiane (Figure 2vii).
- Faire deux coupes parallèles et distantes d’environ 4 mm dans le plan sagittal (figure 2viii).
REMARQUE: Ne coupez pas les deux côtés avec un seul trait. - Retirez les fragments de l’os frontal en évitant de lacéré la surface du cerveau (Figure 2ix). À ce stade, utilisez un ciseau fin pour couper la dure-mère, qui devrait être accessible entre les bulbes olfactifs.
- Inversez doucement le crâne pour permettre à la gravité d’aider à l’élimination du cerveau, tout en continuant à identifier et à couper les attaches méningées restantes et les nerfs crâniens. Le cerveau sera libéré en coupant le plus gros nerf trijumeau attaché au cerveau et est clairement visible s’étendant à partir de la base du calvarium (Figure 2x).
REMARQUE : Transférer le cerveau dans une solution saline froide (citrate de sodium glacé sans RNase (0,9 %) ou solution saline physiologique (0,9 %) pour une dissection ultérieure.
2. Dissection des hypophyses antérieure et postérieure
REMARQUE: Les glandes pituitaires sont recouvertes d’une membrane très dure en forme de tente, avec une crête qui s’étend latéralement entre les nerfs trijumeaux gauche et droit. Ces structures sont extrêmement douces et délicates et, à ce titre, il est recommandé de disséquer séparément les lobes postérieur et antérieur de l’hypophyse par étapes, in situ, directement à partir du crâne. Immédiatement après la dissection, transférer l’hypophyse respective dans un flacon pré-marqué et conserver le flacon dans de l’azote liquide, de préférence sinon -80 °C. L’hypophyse repose exactement sur la jonction des os occipitaux et basisphénoïdes; S’ils fléchissent, l’architecture hypophysaire est perturbée.
- Gardez les bulles auditives intactes pour vous assurer que l’anatomie de l’hypophyse est intacte et facilement identifiable (Figure 2ix).
- Disséquer le lobe postérieur de l’hypophyse suivi du lobe antérieur de l’hypophyse, du reste du crâne.
- Faire une coupe parasagittale extrêmement petite des deux côtés dans la crête de la tente membraneuse et soulever le lobe postérieur de l’hypophyse avec une pince ultra-fine, en prenant soin de ne pas perturber le tissu hypophysaire antérieur (Figure 2x).
- Faire une coupe sagittale entre les marges latérales du lobe antérieur de l’hypophyse et du nerf trijumeau le plus proche et soulever le lobe antérieur de l’hypophyse par la suite (Figure 2x).
3. Dissection cérébrale de souris
REMARQUE : Immédiatement après l’ablation du cerveau et de l’hypophyse, une autre dissection est effectuée sur un bloc d’acier inoxydable prérefroidi (figure 3). Après la dissection, transférer les régions du cerveau dans des flacons pré-marqués et transférer les flacons de préférence à l’azote liquide sinon -80 °C. Les structures produites par la méthode descendante (dans l’ordre chronologique) sont potentiellement les suivantes : cervelet (CB), tronc cérébral/cerveau postérieur (pons et bulbe rachidien) (HB), bulbes olfactifs (OB) comme bulbes olfactifs accessoires, cortex préfrontal médian (MPFC), cortex préfrontal latéral (FCX), corps striatum antérieur et postérieur (ST), striatum ventral (VS) composé du noyau accumbens (NAC) et tubercule olfactif (OT), septum (SE), aire préoptique, cortex piriforme (PFM), hypothalamus (HY), amygdale (AY), hippocampe (HC), cortex cingulaire postérieur (CNG), cortex entorhinal (ERC), mésencéphale (MB) avec thalamus et reste du cortex cérébral (ROC) (tableau 1). Des régions spécifiques seront discutées par ordre d’isolement, en travaillant avec un seul hémisphère.
- Prenez grand soin de retirer le cerveau du calvarium car les repères peuvent être détruits en cas de lacérations. À cette étape, effectuez toutes les dissections à l’aide d’une protection faciale, en particulier une visière de bijoutier 7x, et l’éclairage sera assuré par des lampes chirurgicales positionnées sur chacune des épaules du dissecteur. Une grande partie de la dissection sera réalisée à l’aide de petites pinces incurvées en mode émoussé (c.-à-d. pinces de Graefe).
- Placez le cerveau sur un bloc d’acier inoxydable (Figure 4i et Figure 4ii). Gardez le bloc froid en l’entourant de glace et d’une solution saline glacée. Humidifiez périodiquement le tissu avec une solution saline glacée pour préserver les structures.
- Positionnez le cerveau de telle sorte que les cortex cérébraux soient orientés vers le haut. À l’aide de petites pinces incurvées, réfléchissez doucement le CB en exposant les pédoncules cérébelleux supérieur, moyen et inférieur et retirez le CB (Figure 4iii et Figure 4iv).
- Faites une coupe mi-sagittale à partir du dos et entre l’obstétrique et les hémisphères cérébraux (Figure 4v) et veillez à ne pas s’étendre plus loin que la commissure antérieure. À ce stade, le vermis peut être facilement séparé des parties latérales et HB sera obtenu par une coupe coronale à la marge antérieure des pons.
- Séparer la moelle par une coupe coronale à la marge postérieure du pons.
REMARQUE: À ce stade, le diencéphale, la partie postérieure du cerveau antérieur contenant l’épithalamus, le thalamus, l’hypothalamus et le thalamus ventral et le troisième ventricule, sera tourné côté ventral vers le haut, et une coupe médio-sagittale sera faite à partir du chiasme optique rostrally. La dissection des hémisphères cérébraux suivie de l’ablation de l’obstétrique de l’un des hémisphères se fera à cette étape (Figure 4v et Figure 4vi). - Séparer les hémisphères cérébraux (Figure 4v) avant de disséquer davantage le diencéphale (Figure 4v). L’approche dorsale sera utilisée par dissection émoussée minutieuse pour préserver les points de repère médians saillants de la critique. Visualisez chaque connexion interhémisphérique avant de les couper, car cela minimisera la possibilité de dévier de la ligne médiane.
NOTE: À cette étape, l’un des hémisphères cérébraux (hémicerveau) peut être préservé et le deuxième hémisphère peut être utilisé pour une dissection ultérieure - Glissez les lames fermées d’une petite pince incurvée, sous le corps calleux et écartez-les doucement pour rétracter le néocortex bilatéralement. Le corps calleux est une large bande de fibres nerveuses qui relie les deux hémisphères qui seront carrément disséqués en pinçant avec la pince, sans perturber les structures médianes situées en dessous.
REMARQUE: Les faces mésiales des hémisphères auront plusieurs repères visibles tels que des structures myélinisées comme le genu du corps calleux, les fornices et la commissure antérieure. En outre, bien que quelques millimètres latéraux à la ligne médiane, le tractus mammillothalamique et le fasciculus retroflexus peuvent également être visibles. - Divisez en deux les multiples structures qui traversent la ligne médiane. Cela comprendra le corps calleux, la commissure antérieure, la commissure fornix ventrale, la commissure postérieure, la commissure fornix dorsale, la décussation supra mamillaire, la commissure colliculus supérieure, la commissure fornix ventrale et les fibres thalamiques périventriculaires.
- Faites particulièrement attention à cette étape dans ou près de la ligne médiane qui pourrait être partiellement compromise par la méthode d’approche dorsale. Toutes les structures de suivi sont à risque si elles ne sont pas effectuées avec soin.
- Retirer l’OB (cunéiforme et couleur plus claire) et les bulbes olfactifs accessoires suivis d’une collecte du MPFC (aire 1 du cortex cingulaire, cortex prélimbique, infralimbique, orbital médian et moteur secondaire [M2]) et FCX par une coupe coronale qui est faite 1mm avant le genre du corps calleux (Figure 4vii). Diviser la section résultante par une coupe parasagittale de 1/3 de la distance entre la surface médiale et la surface latérale, en donnant MPFC médialement et le reste de FCX latéralement. Le cortex cingulaire est l’analogue murin du MPFC.
NOTE: Cette tranche de tissu contiendra également une petite quantité du M2 (cortex moteur secondaire) 17 et est inévitable. - Faire une coupe coronale au niveau de la commissure antérieure conduisant à la visibilité du membre antérieur de la commissure antérieure dans la section transversale sur la face rostrale de la section coronale résultante alors que la partie transversale sera révélée dans la face caudale de la section Ceci est un point de repère de confirmation pour NAC18. Le VS est composé du NAC et de l’OT.
NOTE: Il y a un membre antérieur en plus du segment transversal dans la commissure antérieure et il est appelé commissure antérieure, pars antérieur. - Couper partiellement horizontalement à travers la partie transversale de la commissure antérieure à partir de la ligne médiane sous la corne antérieure du ventricule latéral, pour libérer le noyau septal dorsalement et le VS ventralement. Retirez la petite quantité du cortex de la surface latérale où la NAC et l’OT seront enlevées.
- Séparer la partie rostrale du ST du cortex sus-jacent au moyen d’un scalpel incurvé coupé juste à l’extérieur de la capsule externe en prenant soin de ne pas inclure de tissu striatal dans l’échantillon cortical. A ce stade, les noyaux septaux /SE seront visibles et pourront être facilement prélevés sur cette tranche (Figure 4viii).
NOTE: Les limites antérieure et postérieure du PFM sont définies par des plans coronaux imaginaires qui sont alignés avec la commissure antérieure et les corps mamillaires respectivement. La limite médiale est définie par la capsule externe18. - Sur la surface latérale de l’hémisection restante du diencéphale, faire une coupe horizontale partielle le long du sillon rhinal s’étendant caudalement, mais seulement jusqu’au niveau du plan coronal imaginaire avec les corps mamillaires. Faire une coupe coronale partielle, s’étendant médialement à 1 mm de la surface corticale latérale dans le plan des corps mamillaires du HY. Ici, l’incision para-sagittale dans le plan du claustrum va libérer le PFM (Figure 4ix et Figure 4x).
NOTE: Sur la surface médiale de l’hémisection restante du diencéphale, de nombreuses caractéristiques anatomiques seront visibles, y compris les corps mamillaires, le fasciculus retroflexus et la strie médullarisée. Un motif semi-circulaire (côté concave dorsal) sera visible, ce qui indique la marge entre le thalamus et le HY. Le HY sera facilement identifié sur la vue de la section médio-sagittale par le chiasme optique antéroventralement et commissure antérieure antéro-dorsale et les corps mamillaires avec le fasciculus retroflexus postérieurement. Ces derniers repères ont été bien affichés dans l’atlas17 ainsi que dans le contexte du cerveau antérieur de souris albinos19. - Faire une coupe coronale partielle postérieure aux corps mamillaires, ne s’étendant que latéralement jusqu’au sillon hypothalamique. À ce stade, une coupe parasagittale le long du sillon hypothalamique libère maintenant le HY .
- Impliquer l’éversion du ventricule latéral pour révéler des connexions intra-limbiques supplémentaires et les composants restants du système limbique. En regardant la face médiale de l’hémisection restante du diencéphale, les pinces incurvées seront la meilleure option car elles permettent au technicien de manipuler autour d’autres sections délicates de la zone environnante utilisées pour sectionner le fornix et sont insérées dans le ventricule latéral et doucement dilatées, en utilisant une dissection contondante pour ouvrir le ventricule et faire pivoter le HC 90° du plan vertical au plan horizontal. Il peut être nécessaire d’utiliser la lame #11 pour sectionner l’artère choroïdienne / plexus choroïde car la pointe pointue peut aider à des coupes précises.
- Faites pivoter le GNC de 90° (mais dans le sens opposé au HC) pour qu’il soit dans le plan horizontal. À l’aide d’une pince, faites pivoter doucement le HC de 180° vers l’extérieur et latéralement, ce qui rendra la surface interne de l’ERC visible et orientée vers le haut.
- On verra converger vers un rayon de fibres myélinisées provenant de la CRE pour former le faisceau angulaire, y compris le chemin perforant et sa fixation au HC. Faites pivoter le thalamus et MB de 180° dorsalement pour révéler ventralement l’AY.
- Si nécessaire, soulevez le tractus optique pour révéler la fixation de la strie terminale, car il contiendra des bandes de fibres le long de la marge latérale de la surface ventriculaire du thalamus jusqu’à l’AY et clarifiera les contours de l’AY .
REMARQUE: Le HC et le fornix seront clairement visibles dans leur intégralité, imbriqués dans le ventricule latéral et peuvent être facilement soulevés. Le ventricule latéral sera tapissé de pie-mère et les origines en éventail du chemin perforant à travers l’aspect sous-piaire très transparent de la CRE seront visibles20. - La surface externe de la CRE médiane aura une couche proéminente visible de grandes cellules pyramidales. En outre, une convergence dense de fibres colorant Golgi sera une caractéristique saillante de l’ERC médial. Dans cette procédure de dissection, après avoir éversé le ventricule latéral, ces fibres seront facilement visibles sur la surface médiale à travers la pie-mère, qui tapisse les surfaces internes des ventricules, formant une structure en éventail très proéminente.
- Remarquez que les fibres s’accumulent subpialement, descendent et quittent l’ERC ventral, s’étendent vers l’arrière puis montent verticalement pour perforer le HC. Cette structure en éventail dans le CEE sera utilisée pour définir les marges aux fins de la dissection. Identifier et retirer dans l’ordre des structures AY, ERC, CNG et HC .
NOTE: La définition d’un bon point de repère pour la dissection AY sera une clé pour la prochaine étape et la jonction sur la marge postérieure où la strie terminale rencontre l’AY sera un bon point. - À ce stade, les structures restantes comprennent le thalamus et le MB. Confirmer l’identification du thalamus par visualisation de la strie médullaire sur sa surface dorsale s’étendant dans le plan rostrocaudal médian. Séparer complètement le thalamus du mésencéphale par une caudale coronale coupée à l’habenula et rostrale aux collicules supérieurs. Le ROC est enregistré à cette étape.
- À ce stade, complétez la collecte de toutes les régions du cerveau et, immédiatement (au fur et à mesure que chacune est obtenue), stockez les échantillons congelés jusqu’à un traitement ultérieur.
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Representative Results
Notre compréhension de la structure et de la fonction complexes du cerveau évolue et s’améliore rapidement. Le cerveau contient plusieurs régions distinctes et la construction d’une carte moléculaire peut nous aider à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau. Dans cet article de méthode, nous avons discuté de la dissection du cerveau de la souris en plusieurs régions distinctes (tableau 1). Dans ce protocole, les structures sont identifiées en fonction des repères critiques et sont obtenues en gardant le tissu humide avec une solution saline en conservant sa robustesse pour une dissection immédiate. La méthode couvre plus de régions que les autres rapports21 et est complémentaire aux méthodes de dissection utilisant des cerveaux congelés22,23. Ces tissus disséqués peuvent être conservés et traités ultérieurement en fonction des exigences de l’étude. La méthode discutée ici est l’ablation immédiate du cerveau du crâne suivie d’une dissection qui fournit suffisamment de tissu de manière rapide pour les tests en aval compte tenu de la taille du cerveau de la souris. Notre équipe a extrait l’ARN de plusieurs tissus disséqués et analysé pour le profilage de l’expression génique à l’aide de microréseaux pour les tissus cérébraux; AY, HC, MPFC, région septale, corpus striatum et VS et les résultats ont été publiés15. Ces cerveaux récoltés ont été stockés à -80°C pendant plusieurs mois avant l’extraction de l’ARN. Cette méthode peut être adoptée en combinaison avec d’autres méthodes pour diversifier l’utilité en aval des régions du cerveau. Cette méthode de dissection est axée sur le suivi de repères parmi des régions adjacentes anatomiquement distinctes au lieu d’être strictement des dissections coronales ou sagittales. Les différentes régions du cerveau ainsi que les données sur le poids ont été recueillies dans le cadre du modèle de stress social exposé à l’agresseur des concentrations de SSPT16 et d’ARN ainsi que les lectures spectrophotométriques sont présentées à la figure 5.
Figure 1 : Représentation du cerveau de souris avec des types de tissus distincts collectés. Cette figure est une représentation cosmétique des structures et n’est pas mise à l’échelle d’une base de données cartographiée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Ablation du cerveau de la cavité crânienne suivie d’une ablation hypophysaire. Procédure par étapes pour l’ablation du cerveau (i) clampage et maintien après l’épilation (ii) fixation de la pince avec un Kimwipe pour garder les poils loin du tissu (iii) avant l’ablation des muscles (iv) après l’ablation des muscles (v) séparation des méninges (vi) ablation du globe / œil (vii) coupe sur la crête orbitaire (viii) ablation des os pariétaux et frontaux (ix) affichage et ablation du cerveau (x) décollement du cerveau (xi) vue hypophysaire (xii) ablation de l’hypophyse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Station de configuration de la dissection. Cette image montre la configuration mise en place pour la dissection cérébrale après l’ablation des tissus cérébraux et hypophysaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Dissection cérébrale. Procédure par étapes pour l’ablation du cerveau (i) vue de dessus du cerveau (ii) vue dorsale du cerveau (iii) ablation du cervelet (iv) séparation cérébrale (v) dissection des hémisphères (vi) ablation du bulbe olfactif (vii) MPFC, FCX et dissection olfactive accessoire (viii) dissection SE, VS et ST (ix) élimination de la MFP (x) Dissection du système limbique Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Données générées après le prélèvement de l’échantillon (A) Le poids du tissu cérébral et (B) la concentration d’ARN et (C) la DO 260/280 de chacun des tissus cérébraux sont présentés. Ici, les données sont recueillies auprès de groupes témoins (n = 3-6) d’un groupe d’étude comme indiqué précédemment15,16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| # | Abréviations | Description de la région du cerveau |
| 1 | Cb | Cervelet |
| 2 | Hb | Tronc cérébral/cerveau postérieur (pons et bulbe rachidien) |
| Séparer dans les deux hémisphères | ||
| 3 | Ob | Bulbes olfactifs et ampoules olfactives accessoires |
| 4 | MPFC (en anglais seulement) | Cortex préfrontal médian |
| 5 | FCX | Cortex préfrontal latéral |
| 6 | SE | Septum ou région septale |
| 7 | Vs | Le striatum ventral comprend le noyau accumbens (NAC) et le tubercule olfactif (OT) |
| 8 | St | Corps striatum antérieur et postérieur |
| 9 | Hy | Hypothalamus |
| 10 | GFP | Cortex piriforme |
| 11 | HC | Hippocampe |
| 12 | Le | Cortex entorhinal |
| 13 | Le GNC | Cortex cingulaire postérieur |
| 14 | Oui | Amygdale |
| 15 | Mo | Mésencéphale avec thalamus |
| 16 | Roc | Reste du cortex cérébral |
Tableau 1 : Description des régions distinctes du cerveau de la souris. Ce tableau contient la liste de toutes les régions du cerveau collectées avec son abréviation.
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Discussion
Le cerveau des mammifères est un organe complexe composé d’un ensemble de cellules morphologiquement distinctes et fonctionnellement uniques avec diverses signatures moléculaires et de multiples régions qui remplissent des fonctions spécialisées et discrètes. La procédure de dissection décrite ici peut avoir plusieurs objectifs en fonction des exigences du laboratoire. Dans notre laboratoire, nous avons évalué la transcription dans plusieurs régions du cerveau recueillies chez des souris exposées au SSPT comme le stress16 . Nous aimerions étudier plus en détail l’impact du fond génétique de la souche24 sur les niveaux d’expression dans plusieurs régions du cerveau. Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques qui doivent être prises en compte pour une reproductibilité réussie des expériences. Chacune des régions localisées du cerveau joue un rôle distinct dans l’état neuropathologique et une connaissance détaillée de la région cérébrale appropriée à étudier fait défaut. Par conséquent, il est important de générer l’ensemble de données relatives à la région du cerveau. Ainsi, les données peuvent non seulement être interrogées en sélectionnant la région du cerveau, mais aussi par catégorie de données (par exemple, transcriptome, protéine, cellule (cytoarchitecturale) ou autre) conduisant à des informations plus précises. Auparavant, il a été démontré que les tissus tels que le bulbe olfactif, le cortex frontal, le striatum et l’hippocampe dans les tissus frais du cerveau du rat étaient disséqués à l’aide d’un microscope25. Alternativement, des sections peuvent être disséquées pendant que le cerveau est congelé14 suivies d’extractions d’ARN et de protéines, mais cette méthode est limitée aux régions du cerveau qui peuvent être identifiées par des repères clairs. Des extractions d’ARN total ont été effectuées après la microdissection25 à partir de régions principales du cerveau ainsi qu’en utilisant une approche de microscopie à capture non laser pour les études d’expression génique13. Ici, nous nous concentrons sur la dissection du cerveau frais de souris pour séparer les structures cérébrales spécifiques qui ont un contrôle dédié sur les fonctions physiologiques et comportementales. Notre méthode explique la dissection de plus de régions que les rapports déjà publiés, mais elle est complémentaire aux autres méthodes de dissection disponibles. Cette approche peut aider à fournir une évaluation complète des tissus et de leur association avec des conditions débilitantes. Cette stratégie de dissection offre une option viable aux stratégies de prélèvement d’échantillons existantes, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles découvertes.
Avec la méthode décrite ici, les tissus cérébraux sont congelés dans de l’azote liquide avant d’être transférés à -80 °C pour un stockage à long terme. Il est important que les outils et les tissus soient conservés au froid pendant toute la procédure de conservation des acides nucléiques ou des protéines. Ces tissus congelés sont homogénéisés ultérieurement à l’aide de procédures opérationnelles normalisées en laboratoire. Certains de ces tissus cérébraux sont très petits et des précautions doivent être prises pendant le processus d’homogénéisation et d’extraction en protégeant les molécules cibles de la dégradation à des températures plus élevées.
Dans ce processus, il est important d’identifier des points de repère clairs pour identifier les régions tissulaires spécifiques. Ceci est réalisé en gardant le tissu humide avec une solution saline pour l’empêcher de devenir rapidement mou et de conserver sa robustesse pendant un certain temps. Nos études précédentes ont comparé les changements d’expression génique entre les tissus de souris témoins et les tissus de souris exposés à l’agresseur15 et n’ont étudié aucun changement causé par la solution saline utilisée pendant la dissection. D’après notre expérience, cela est particulièrement important lors de l’incision à partir de l’hypothalamus et du retournement à 180° car il expose et rend l’ombrage de séparation régionale des régions limbiques (AY, HC, ERC) évident et plus clair. Le système limbique est situé profondément dans le cerveau et est endommagé par une variété de stimuli, et est donc important sur le plan diagnostique et thérapeutique. Le système limbique est constitué de régions du cerveau mais il n’y a pas d’accord universel sur cette liste26. Bien que non étudié, nous pensons qu’il y a peu ou pas d’effets de l’utilisation de solution saline. En effet, l’ensemble de la procédure dure environ 20 minutes après des conditions froides pendant tout le processus.
Les régions du tissu cérébral sont identifiées à l’aide de points de repère mentionnés dans les atlas cérébraux. En utilisant cette technique, les points de repère doivent être clairs et cette procédure doit être effectuée séquentiellement. La dissection doit être effectuée alors que le cerveau est encore frais et robuste; (doit être fait avec les 15 à 20 premières minutes) - sinon les points de repère ne seront pas clairs et les régions ne seront pas distinctes si le cerveau reste plus longtemps et devient plus mou.
Comme décrit ci-dessus, dans le cerveau se trouvent des sous-régions, contenant de multiples zones fonctionnelles qui agissent indépendamment ou en coordination avec des réseaux conjonctifs intrinsèques. Il est important de récupérer ces régions avec une grande précision afin d’étudier leurs grandes dimensions. Cela aidera à intégrer ces concepts en combinant les régions spécialisées où chacune sert un processus distinct avec un potentiel thérapeutique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Mme Seshmalini Srinivasan, M. Stephen Butler et Mme Pamela Spellman pour leur aide expérimentale et Mme Dana Youssef pour l’édition du manuscrit. Le soutien financier de l’USAMRDC est vivement apprécié. La Fondation genevoise a contribué à ce travail et a été soutenue par des fonds de la Direction III du domaine de recherche en médecine militaire et opérationnelle via le US Army Research Office.
Démenti:
Le matériel a été examiné par le Walter Reed Army Institute of Research. Il n’y a pas d’objection à sa présentation et/ou à sa publication. Les opinions ou affirmations contenues dans le présent document sont les opinions privées de l’auteur et ne doivent pas être interprétées comme officielles ou comme reflétant de véritables opinions du Département de l’Armée ou du Département de la Défense. La recherche a été menée dans le cadre d’un protocole d’utilisation des animaux approuvé dans une installation accréditée par l’AAALAC, conformément à la Loi sur le bien-être des animaux et à d’autres lois et règlements fédéraux relatifs aux animaux et aux expériences avec des animaux, et adhère aux principes énoncés dans le Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, publication du CNRC, édition 2011.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
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