Summary
在这项研究中，我们提出了一种实时成像方法，使用共聚焦显微镜观察细胞通过与含有Corti器官的耳蜗上皮的外活体孵化向受损组织移动。
Abstract
为了研究间质干细胞（MSCs）对细胞再生和治疗的影响，该方法跟踪MSC迁移和与声蜗上皮共同培养后的形态变化。Corti 的器官通过按压解剖过程中产生的里斯纳膜的一部分，在塑料盖上固定。当气缸被移除时，被玻璃缸限制的 MSC 迁移到高音表皮。它们的主要定位是在科尔蒂器官的修饰中观察到的，其方向与神经纤维的方向相似。然而，一些MSC在limbus区域被本地化，并显示出水平拉长的形状。此外，进入毛细胞区的迁移增加，在卡那霉素治疗后，MSC的形态转变为各种形式。最后，这项研究的结果表明，MSC与人工增生上皮的共生将有助于通过细胞移植和细胞再生研究，可以检查各种条件和因素的治疗发展。
Introduction
听力损失可能是先天发生的，也可以是由几个因素逐渐引起的，包括衰老、药物和噪音。听力损失往往很难治疗，因为一旦负责听力的毛细胞受损，恢复受损的功能是非常具有挑战性的。据世界卫生组织统计，全世界估计有4.61亿人听力损失，占世界人口的6.1%。在听力损失者中，93%是成年人，7%是儿童。
已尝试采取若干方法治疗听力损失：值得注意的是，使用MSC的再生方法已成为一种很有前途的治疗方法。当组织受损时，MSC自然释放到循环系统中，并迁移到损伤部位，在那里它们分泌各种分子，形成促进再生的微环境2。因此，重要的是要开发一种方法，通过外部植入的MSC迁移来治疗受损组织的目标器官及其随后的分子分泌，导致强大的免疫调节，血管生成和抗凋亡，以加强恢复受损细胞功能3，4，5。
MSC 迁移到受损组织的回程过程可能是最重要的障碍。MSC 具有系统性定位机制，具有连续的系绳/滚动、激活、逮捕、迁移/迁移和迁移6、7、8等步骤。目前，正在努力确定改进这些步骤的方法。各种策略，包括基因改造，细胞表面工程，体外启动，磁导，已经测试了6，7。此外，还多次试图通过将MSC吊到受损的科克菌部位来促进听觉毛细胞的保护和再生。然而，在体内跟踪MSC是耗时和劳动密集型的，需要高度专业化的技能9。
为了解决这个问题，开发了一种方法，通过延时共焦显微镜观察耳蜗中MSC的生长情况，该显微镜可拍摄细胞在几个小时内的迁移（图1）。它开发于20世纪初 ，最近已成为研究特定细胞迁移的有力工具。
图1：图形摘要。 （A） Corti 的解剖器官使用钳子粘附在塑料盖片上后，盖片被放置在 35 毫米玻璃底的圆角微碟上，并且（B） 玻璃缸被定位。（C） 在玻璃缸内填充中等物后，在气缸外小心添加带有中型的 GFP 标签的 MSC。（E） 在一夜之间孵化后，（F） 玻璃缸被移除，图像用共聚焦显微镜拍摄。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;MSC=中性干细胞。请单击此处查看此图的较大版本。
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Protocol
所有涉及ICR小鼠的研究协议都得到了元州医学院延世大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。实验是根据世界医学协会的道德规范进行的。在本协议中，怀孕的ICR小鼠被保存在12/12小时的光/暗循环中，可以自由获得食物和水。
1. 科克利解剖
- 通过打开紫外线约30分钟，对层层流动组织培养罩进行消毒，并在使用前用70%乙醇喷洒所有表面。让表面干燥。
- 将解剖仪器放在70%乙醇中10分钟，在使用前干燥。
- 使用手术刀片斩首产后3-4天大的老鼠（图2A）。
- 将头骨置于层压流罩的立体显微镜下，并将组织浸泡在 70% 乙醇中。
- 快速将组织浸泡在组织解剖溶液中（1x 汉克平衡盐溶液，1 mM HEPES），以去除乙醇。
- 用手术刀片切开头骨的中心线（图2B，C）。
- 通过前拉下皮肤并切割耳朵的外部听觉导管（图2D）来暴露头骨。
- 从前切至颅骨的后部穿过眼线（图2E）。
- 打开头骨，用钝钳切除前脑、小脑和脑干（图2F，G）。
- 使用微钳，将科克菌与时间骨分离（图2H）。
- 将鸡毛虫转移到含有组织解剖溶液的培养皿中。
- 仔细解剖所有的软骨胶囊，只留下内部的软骨软组织（图2I，J）。
- 用钳子和绞蜗管用另一对钳子握住鸡毛虫的修饰，慢慢地将两个组织分开（图2K）。
- 通过轻轻剥去纹状血管和纹状膜去除纹状血管（图2L，M）。
- 将灭菌塑料盖片放在新的组织解剖溶液中，然后将Corti的器官放在直径为9毫米的盖片上，确保罗勒膜朝下（图2N-P）。
- 通过用钳子（图2N-P）将里斯纳的膜和剩余的模样组织压在盖上来固定组织。
- 将带嵌入式组织的盖片转移到直径为 35 mm 的圆盘中心。
- 将玻璃克隆缸放在盘子上，将仙人皮去植置于菜的中心，并在菜缸内加入100微升的去植物培养介质（DMEM/F12，10%胎儿牛血清（FBS），1%N2补充剂，安培素（10微克/毫升）10在圆柱体内（图2Q）。
- 板 5 × 103 细胞的小鼠骨髓衍生的绿色荧光蛋白 （GFP） 标签 MSC 在 2 mL 培养介质 （45% DMEM + 45% DMEM/F12， 10% FBS， 1% N2 补充， 10μg/mL 的安非他林） 玻璃缸外 （图 2R）.
- 当MSC是80-90%的对流，通过分离他们与锥蛋白-乙二胺四乙酸。
- 小心地将圆锥体菜转移到加湿的孵化器中，并在 5% 的 CO2 大气中以 37 °C 的温过夜孵化。
- 吸气缸内外的所有介质，然后从圆盘中取出玻璃缸。
- 在圆盘中加入 2 mL 的新鲜培养介质，并在潮湿的孵化器中孵化组织培养盘，直到准备好进行分析。
图2。解剖小鼠鸡皮和科尔蒂和MSC器官的共养。 （A） 斩首鼠标， （B） 和 （C） 头部的中线下垂解剖， （D）和 （E） 大脑的冠状解剖， （F）和 （G）大脑和时间骨的切除， （H）骨绞痛，（I）去除骨绞痛壁，（J）分离的绞痛，（K）从修饰品分离的古利叶管， （L） 将纹状血管 （SV） 和螺旋韧带 （SL） 与 Corti 器官分离，（M）去除地膜，（N-P） 将毛细管固定在塑料盖片上，（Q）盖片和玻璃缸的位置，（R）接种 MSC. 白色鳞片条（A-E） = 1 厘米：橙色（F， G， P）和黄色比例杆（H，I） = 1 毫米：绿色比例杆（J-O） = 0.5 mm.请点击这里查看此图的更大版本。
2. 延时成像
- 对于此处介绍的实验，请使用带舞台顶部孵化器系统的共聚焦显微镜系统。
- 打开共焦显微镜、荧光灯和计算机。
- 将放置在共焦显微镜舞台上的舞台顶孵化器的状况设置为 37 °C 和 5% CO2 大气。
- 将样品盘放在盘子固定容器上，用盘子固定盖盖住，用顶部加热器盖合腔盖。
- 调整变焦和对焦，使科尔蒂和MSC的器官在视界中定位。
- 打开图像处理软件。根据 定位 选项，选择 20 倍计划-阿波克罗马特目标（数孔径 0.8） 和 0.5 倍作物面积。
- 在收购下，单击智能设置并选择EGFP。
- 在获取下打开通道选项卡，并将激光功率设置为0.2%，针孔设置为44 μm，主增益为750 V，数字增益设置为1.0。
- 在成像设置下单击ESID，并将ESID 增益设置为4，数字增益设置为7.5。
- 点击 瓷砖 和 股份 ，生产210块瓷砖。
- 打开 对焦策略 并选择 对焦模式。
- 根据 时间系列，将 持续时间 设置 为24小时 ， 间隔 为 10分钟。
- 在收购下，将帧尺寸设置为512 x 512 像素，扫描速度设置为8，方向为双向，平均为 4 倍，每像素位为16。
- 单击 启动实验 以开始实验。
3. 图像文件修改
- 在处理下，单击拼接，并将最小覆盖物设置为5%，最大换档设置为10%。
- 点击电影出口，设置未压缩，并设置速度为7.5。
4. 免疫染色
- 小心吸气介质，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗样品两次，时间为 5 分钟。
- 在 PBS 中用 4% 正式素修复样品 15 分钟，用 PBS 清洗样品 3 次 5 分钟。
- 在PBS中将样品渗透到0.1%的Triton X-100中10分钟，用PBS清洗3次5分钟。
- 加入 250 μL 的法洛丁-iFluor 647 试剂（PBS 中稀释 1：1000），并在摇床的室温下将样品孵育 1 小时。
- 用PBS清洗样品3次5分钟。
- 将盖子滑移到玻璃滑梯上，并添加 2 滴安装解决方案。
- 轻轻地在幻灯片上放置盖子。
- 用透明指甲油密封盖片，在黑暗中储存在 4 °C，直到观察到细胞。
- 使用带适当滤光片的对焦显微镜在兴奋/发射时（Ex/Em）=650/665 nm 用于法勒林，在 Ex/Em=488/507 nm 上为 EGFP 映像幻灯片。
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Representative Results
在三维模式下，MSC的体外迁移已通过Transwell系统或传统的伤口愈合方法进行评估，以观察二维（2D）模式11中的迁移。科尔蒂的器官是一个复杂的结构，由各种细胞组成，如博彻细胞，克劳迪斯细胞，神细胞，支柱细胞，汉森的细胞，外毛细胞，内毛细胞，神经纤维，罗勒膜，和网状拉米纳12。当MSC被移植到由这种复杂细胞组成的组织中时，使用技术确定细胞的招募和稳定位置对于了解使用MSC进行细胞治疗和再生的机制至关重要。此外，为了确定 MSC 在存在或不存在损伤的情况下如何本地化，2D 方法（如伤口愈合方法）比 Transwell 系统更适合细胞在一个方向上随机向下移动。
在这项研究中，MSC 的二维路径通过简单地使用玻璃缸作为 MSC 和 Corti 器官之间的屏障，并在 MSC 连接后移除气缸，以伤口愈合方法进行跟踪。当科尔蒂的器官被培养时，成纤维细胞从最外层的外毛细胞向外生长非常快（图3，视频1）。因此，大多数GFP标签的MSC似乎被快速增长的成纤维细胞（视频1）推出。尽管如此，一些GFP标记的MSC穿透成纤维细胞层，并成功地迁移到Corti的器官（图3，视频1）。
图3。科尔蒂和 GFP 标记的 MSC 器官的对焦图像。 在取出玻璃缸和额外的4小时的孵化后，进行了固定和染色。比例杆 +100 μm。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;MSC：中性干细胞。请单击此处查看此图的较大版本。
视频 1： 科尔蒂和 GFP 标记的 MSC 器官的延时共焦显微镜。在取出玻璃缸和额外的4小时的孵化后，进行了固定和染色。比例杆 +100 μm。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;MSC：中性干细胞。请点击这里下载此视频。
72小时孵化的结果表明，MSC迁移到科尔蒂的器官，主要在流体和从流变中分离的毛利叶神经纤维聚集区域局部：MSC的形态被改变为类似于神经纤维的径向形状（图4B）。有趣的是，细胞沿着limbus线被转换成线性形状，而不是毛细胞区域（图4E，见箭头）。虽然Corti器官的肛门和基底两端结合在一起，以防止MSC移动到巴西拉膜的中间侧，但MSC通过穿透各种细胞层和物理屏障（图4E）能够在神经纤维收集区迁移和生长。当用1mM卡那霉素治疗16小时，并培养细胞72小时后，去除卡那霉素，MSC不仅在修饰符，而且在外毛细胞（图4C，D）中局部化。
图4。科尔蒂和 GFP 标记的 MSC 器官的对焦图像。（A） 在取出玻璃缸和另外16小时的孵化后，在固定和染色后拍摄图像。比例杆 +200μm. （B） MSC 主要分布在莫多卢斯地区，比例杆 +20μm。从盘子中取出玻璃缸后，细胞被进一步孵育1.0 mM卡那霉素16小时，培养无卡那霉素介质72小时，然后固定和染色。（C ）外毛细胞区域的图像，比例杆= 20 μm;（D） 莫多卢斯地区， 规模酒吧 = 50μm;和 （E） 整个科克伦， 规模酒吧 = 100 μm.请点击这里查看此图的更大版本。
这些结果表明，本研究所展示的实验系统将是利用MSC开发细胞治疗策略的有用测试工具，可专门用于研究各种因素造成的听力损失。
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Discussion
对MSC移植到受损部位，促进受损细胞再生进行了广泛的研究，治疗效果明显。据报道，MSC的移植和随后的分化，以恢复大鼠的听力损失引起的3硝基丙酸13。虽然李等人将MSC应用于人类，但他们在听力14方面并没有取得任何显著改善。直到最近，通过MSC移植，还进行了近12项实验，以恢复啮齿动物模型的听力。虽然由于异质性，结果有些不清楚，但有迹象表明，MSC可以促进听力。
与化疗相关的各种生长因子和化疗因子都涉及移植干细胞向受损区域的迁移，无论异质性或同质性如何。切莫金是组织间质、免疫反应和伤口愈合的细胞迁移的关键调节器。由于体内和体外实验条件的差异，化学诱发的体外化疗可能与体外化疗不同。虽然体外实验条件有其自身的局限性，但在体内研究中很难促进细胞16的有效迁移、招募和再生。
虽然对移植用于听力恢复的MSC的跟踪在再生医学研究中很重要，但在体内实验中，特别是涉及听力的实验中，大多数情况下都是劳动密集型的，因此很难在样本量大的情况下进行。因此，结果的同质性较低，偏差严重。因此，在体外条件下首先研究这种基于移徙的事件是有效的。大多数关于细胞迁移的体外研究都是通过使用特兰斯韦尔或伤口愈合方法进行的。
建立了一种用MSC去除绞痛的造币方法，以跟踪迁移的干细胞，这些干细胞识别损伤部位并朝它们移动。大多数研究都使用一种方法，在去除后涂有β-甲基乙醇的玻璃盖上附着科尔蒂器官。虽然这里也使用了同样的方法，但很难检查组织，因为它们经常从盖片上分离或卷起。因此，进行了新的试验，以便更容易监测组织。首先，Corti 的器官被放置在塑料盖上，然后通过使用钳子按压在解剖过程中产生的 Reissner 膜的剩余部分，组织在盖片上固定。
这使得 Corti 器官稳定地附着在盖片上，以便通过共聚焦显微镜成功获取图像。虽然这里提出的组织培养方法价格低廉且省时，但解剖熟练程度的发展确实需要一些时间。已知的组织培养方法包括通过涂上多L-ornithine和层氨酸16的盖片来附着组织：应用不需要胶粘剂或涂层材料的有机细胞培养插入物17， 从而消除对粘合物质的需求，从而减少除草剂损伤：并使用由从海洋贝类中提取的蛋白质组成的组织粘合剂10。该协议既不需要涂层材料，也不需要有机膜，也不需要组织粘合剂：便宜的塑料盖子就足够了。如果考虑 8 mm x 8 mm 的面积以及 Corti 器官组织厚度的 Z 堆栈，则可以获得更好的图像。考虑到要存储的大量数据和时间推移的适当时间，获得了整个细胞运动的图像，重点是 MSC 而不是 Corti 的器官。
图4中显示的结果似乎表明，当拍摄的图像长 2 mm 且 Z 栈与时间推移相结合时，Corti 和 MSC 的器官都可以可视化为清晰的视频图像。在这里，虽然与MSC和去剂进行了共同培养实验，但此设置可以应用于不同的细胞类型或条件，供将来研究使用。例如，它将有助于应用此协议来检查保护科克菌损害的药物或外体的影响。胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPSCs）可以在功能和形态上再生成机械感性毛细胞状细胞18。因此，此协议可用于研究 iPSC 或 ESC 在听觉毛细胞或支持细胞中的分化。这种前活体方法可以帮助再生医学恢复听力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了韩国国家研究基金会（NRF-2018-R1D1A1B07050175，HURF-2017-66）和韩国国家研究基金会（NRF）和哈莱姆大学研究基金的研究赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
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