Summary
Neste estudo, apresentamos um método de imagem em tempo real utilizando microscopia confocal para observar células que se movem em direção ao tecido danificado pela incubação ex vivo com o epitélio coclear contendo o órgão de Corti.
Abstract
Para estudar os efeitos das células-tronco mesenquimais (MSCs) na regeneração e tratamento celular, este método acompanha a migração do MSC e as alterações morfológicas após a cocultura com epitélio coclear. O órgão de Corti foi imobilizado em uma mancha de plástico pressionando uma porção da membrana do Reissner gerada durante a dissecação. MSCs confinados por um cilindro de vidro migraram em direção ao epitélio coclear quando o cilindro foi removido. Sua localização predominante foi observada no modiol do órgão de Corti, alinhado em uma direção semelhante à das fibras nervosas. No entanto, alguns MSCs foram localizados na área do limbus e apresentaram uma forma horizontalmente alongada. Além disso, a migração para a área da célula ciliada foi aumentada, e a morfologia dos MSCs mudou para várias formas após o tratamento da kanamicina. Concluindo, os resultados deste estudo indicam que a cocultura de MSCs com epitélio coclear será útil para o desenvolvimento da terapêutica via transplante celular e para estudos de regeneração celular que possam examinar várias condições e fatores.
Introduction
A perda auditiva pode ocorrer congênitamente ou pode ser causada progressivamente por vários fatores, incluindo envelhecimento, drogas e ruído. A perda auditiva é muitas vezes difícil de tratar porque é muito desafiador restaurar a função prejudicada uma vez que as células ciliadas responsáveis pela audição são danificadas1. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que 461 milhões de pessoas em todo o mundo tenham perda auditiva, o que representa 6,1% da população mundial. Dos que têm perda auditiva, 93% são adultos e 7% são crianças.
Várias abordagens foram tentadas para tratar a perda auditiva; notavelmente, uma abordagem de regeneração usando MSCs emergiu como um tratamento promissor. Quando o tecido é danificado, os MSCs são naturalmente liberados para o sistema circulatório e migram para o local da lesão onde secretam várias moléculas para formar um microambiente que promove a regeneração2. Por isso, é importante desenvolver um método para tratar tecidos danificados através da migração de MSCs implantados externamente para órgãos alvo e sua subsequente secreção de moléculas que causam regulação imunológica potente, angiogênese e anti-apoptose para melhorar a restauração da função celular danificada3,4,5.
O processo de homing no qual os MSCs migram para tecidos danificados pode ser o obstáculo mais importante a ser superado. Os MSCs possuem um mecanismo de vagem sistêmica com etapas sequenciais de amarração/rolagem, ativação, prisão, transmigração/diápedese e migração6,7,8. Atualmente, estão em andamento esforços para identificar formas de melhorar essas etapas. Várias estratégias, incluindo modificação genética, engenharia de superfície celular, escoramento in vitro e orientação magnética, foram testadas6,7. Além disso, várias tentativas foram feitas para promover a proteção e regeneração de células ciliadas auditivas, lançando MSCs para o local da cóclea danificada. No entanto, o rastreamento de MSCs in vivo é demorado e trabalhoso e requer habilidades altamente especializadas9.
Para resolver esse problema, foi desenvolvido um método para observar o homing de MSCs na cóclea através de microscopia confocal de lapso de tempo que fotografa a migração de células ao longo de várias horas(Figura 1). Foi desenvolvido no início do séculoXX e recentemente tornou-se uma poderosa ferramenta para estudar a migração de células específicas.
Figura 1: Resumo gráfico. (A) Depois que o órgão dissecado de Corti é aderido a um deslizamento de tampas de plástico usando fórceps, o deslizamento de tampa é colocado em um prato microscópico de 35 mm com fundo de vidro, e(B)o cilindro de vidro é posicionado. (C) Depois de encher o interior do cilindro de vidro com MSCs médios,(D)com etiqueta GFP com meio são adicionados cuidadosamente fora do cilindro. (E) Após a incubação durante a noite,(F) o cilindro de vidro é removido, e as imagens são tiradas com um microscópio confocal. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; MSCs = células-tronco mesenquimais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
Todos os protocolos de pesquisa envolvendo camundongos ICR foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade yonsei da Faculdade de Medicina wonju. Os experimentos foram realizados de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial. Neste protocolo, os camundongos gestantes de ICR foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12/12 horas com livre acesso a alimentos e água.
1. Dissecção de cochleae
- Esterilize a capa de cultura de tecido de fluxo laminar ligando a luz ultravioleta por ~30 min, e pulverize todas as superfícies com 70% de etanol antes de usar. Deixe as superfícies secarem.
- Coloque instrumentos de dissecção em 70% de etanol por 10 minutos e seque antes de usar.
- Use uma lâmina de operação para decapitar ratos pós-natais de 3 a 4 dias de idade(Figura 2A).
- Coloque o crânio sob um estereótipo na capa de fluxo laminar, e mergulhe o tecido em 70% de etanol.
- Mergulhe rapidamente o tecido na solução de dissecção tecidual (1x Hank's Balanced Salt Solution, 1 mM HEPES) para remover o etanol.
- Corte a linha central do crânio com uma lâmina cirúrgica(Figura 2B,C).
- Exponha o crânio puxando a pele anteriormente e cortando o canal auditivo externo da orelha(Figura 2D).
- Corte da parte anterior para a parte posterior do crânio através da linha ocular(Figura 2E).
- Abra o crânio e remova o cérebro, o cerebelo e o tronco cerebral com fórceps contundentes(Figura 2F,G).
- Utilizando micro fórceps, separe a cóclea do osso temporal(Figura 2H).
- Transfira a cóclea para uma placa de Petri contendo solução de dissecção tecidual.
- Disseca cuidadosamente toda a cápsula ótica coclear, restando apenas o tecido mole coclear interno(Figura 2I,J).
- Segure o modiólus da cóclea com fórceps e o duto coclear com outro par de fórceps, e separe lentamente os dois tecidos(Figura 2K).
- Remova a estria vascularis e a membrana tectorial descascando-as suavemente(Figura 2L,M).
- Coloque uma tampa plástica esterilizada em nova solução de dissecção tecidual e, em seguida, coloque o órgão de Corti em uma tampa de 9 mm de diâmetro,certificando-sede que a membrana basilareada fica para baixo(Figura 2N-P ).
- Imobilize o tecido pressionando a membrana do Reissner e o tecido modiolus restante na tampa com fórceps(Figura 2N-P).
- Transfira a tampa com o tecido incorporado para o centro de uma antena confocal de 35 mm de diâmetro.
- Coloque o cilindro de clonagem de vidro no prato, com a explanta coclear posicionada no centro do prato, e adicione 100 μL de cultura de explanta (DMEM/F12, 10% de soro bovino fetal (FBS), suplemento 1% N2, ampicillina (10 μg/mL))10 dentro do cilindro(Figura 2Q).
- Placa 5 × 103 células de proteína fluorescente verde derivada da medula óssea do rato (GFP) marcadas MSCs em 2 mL de meio de cultura (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, suplemento 1% N2, 10 μg/mL de ampicilina) fora do cilindro de vidro(Figura 2R).
- Quando os MSCs são 80-90% confluentes, passá-los desprendendo-os com ácido tetraácático de tripquitina-etilenodiamina.
- Transfira cuidadosamente o prato confocal para uma incubadora umidificada e incubar durante a noite a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2.
- Aspire todo o meio dentro e fora do cilindro e, em seguida, remova o cilindro de vidro do prato confocal.
- Adicione 2 mL de cultura fresca ao prato confocal, e incubar o prato de cultura tecidual em uma incubadora umidificada até estar pronta para análise.
Figura 2. Dissecção de cóclea de rato e cocultura do órgão de Corti e MSCs. (A) Decapitação do camundongo, (B) e (C) dissecção sagital midline da cabeça, (D) e (E) dissecção coronal do cérebro, (F) e (G) remoção do cérebro e osso temporal, (H) a coclesina, (I) remoção da parede coclear óssea,(J) isolamento da cadeia,(K) separação do duto coclear do transó, (L) separação da estria vascularis (SV) e ligamento espiral (SL) do órgão de Corti, (M) remoção da membrana tectorial, (N-P) fixação da cóclea em um deslizamento de tampa plástica,(Q) localização de deslizamento de tampa e cilindro de vidro na prato confocal, (R) inoculação de MSCs. Barra de escala branca (A-E) = 1 cm; laranja(F, G, P) e barra de escala amarela(H,I) = 1 mm; barra de escala verde (J-O) = 0,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Imagem de lapso de tempo
- Para os experimentos aqui apresentados, use um sistema de microscopia confocal com um sistema de incubadora de topo de estágio.
- Ligue o microscópio confocal, a luz fluorescente e o computador.
- Defina as condições da incubadora de topo de palco colocada no palco do microscópio confocal para 37 °C e 5% de atmosfera de CO2.
- Coloque o prato de amostra no recipiente de fixação do prato, cubra com a tampa de fixação do prato e feche a câmara com a tampa superior do aquecedor.
- Ajuste o zoom e o foco para localização do órgão de Corti e MSCs no campo de visão.
- Abra o software de processamento de imagens. Na opção localizar, selecione um objetivo plan-apochromat de 20x (abertura numérica 0,8) e uma área de cultivo de 0,5x.
- Em Aquisição,clique em configuração inteligente e selecione EGFP.
- Abra a guia do canal em Aquisição, e ajuste a potência laser para 0,2%, o pinhole para 44 μm, o ganho mestre para 750 V, e o ganho digital para 1.0.
- Clique em ESID em configuração de imageme defina o ganho do ESID para 4 e o ganho digital para 7,5.
- Clique em Telhas e estaca para produzir 210 telhas.
- Abra a estratégia do Focus e selecione o modo de foco.
- Em sériestemporência, defina a duração para 24h e o intervalo para 10 min.
- Em Aquisição,defina o tamanho do quadro para 512 x 512 pixels, a velocidade de varredura até 8, a direção para bidirecional,a média para 4x, e os bits por pixel para 16.
- Clique no experimento iniciar para iniciar o experimento.
3. Modificação do arquivo de imagem
- Em processamento,clique na costurae defina a sobreposição mínima para 5% e a mudança máxima para 10%.
- Clique na exportação defilme , definir descompactadoe definir a velocidade para 7.5.
4. Imunostaining
- Aspire o meio com cuidado e lave a amostra duas vezes com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) por 5 minutos.
- Fixar a amostra com 4% de formalina em PBS por 15 minutos e lavar a amostra 3 vezes com PBS por 5 min.
- Permeabilize a amostra em 0,1% Triton X-100 em PBS por 10 minutos, e lave 3 vezes com PBS por 5 min.
- Adicione 250 μL de reagente de falo-iFluor 647 (diluição de 1:1000 em PBS), e incubar a amostra por 1h à temperatura ambiente no shaker.
- Lave a amostra 3 vezes com PBS por 5 minutos.
- Transfira a tampa para o escorregador de vidro e adicione 2 gotas de solução de montagem.
- Coloque uma mancha de cobertura no slide suavemente.
- Sele a tampa com esmalte claro e guarde a 4 °C no escuro até que as células sejam observadas.
- Imagem do slide usando um microscópio confocal com um filtro apropriado na excitação/emissão (Ex/Em)=650/665 nm para phalloidina e em Ex/Em=488/507 nm para EGFP.
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Representative Results
A migração in vitro de MSCs no modo tridimensional foi avaliada por um sistema Transwell ou pelo método tradicional de cicatrização de feridas para observar a migração no modo bidimensional (2D)11. O órgão de Corti é uma estrutura complexa composta por várias células como células Boettcher, células de Cláudio, células de Deiters, células pilares, células de Hensen, células ciliar externas, células ciliar internas, fibras nervosas, membrana manjericão e lamina reticular12. Quando os MSCs são transplantados em tecido composto por células tão complexas, o uso da tecnologia para verificar onde as células são recrutadas e estabilizadas é fundamental para entender o mecanismo da terapia celular e da regeneração usando MSCs. Além disso, para determinar como os MSCs são localizados na presença ou ausência de danos, um método 2D como um método de cicatrização de feridas é mais adequado do que um sistema Transwell no qual as células se movem aleatoriamente para baixo em uma direção.
Neste estudo, o caminho bidimensional dos MSCs foi rastreado em um método de cicatrização de feridas simplesmente usando um cilindro de vidro como barreira entre os MSCs e o órgão de Corti e removendo o cilindro após a fixação dos MSCs. Quando o órgão de Corti foi cultivado, os fibroblastos cresceram muito rapidamente para fora das células ciliadas externas presentes na camada mais externa(Figura 3, Vídeo 1). Portanto, a maioria dos MSCs rotulados por GFP pareciam ser empurrados para fora por fibroblastos de rápido crescimento(Vídeo 1). No entanto, alguns MSCs rotulados por GFP penetraram na camada de fibroblastos e migraram com sucesso para o órgão de Corti (Figura 3, Vídeo 1).
Figura 3. Imagem confocal do órgão de MSCs corti e gfp rotulado. Após a remoção do cilindro de vidro e foram realizadas 4h adicionais de incubação, fixação e coloração. Barra de escala =100 μm. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; MSCs: células-tronco mesenquimais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Microscopia confocal de lapso de tempo do órgão de MSCs corti e gfp. Após a remoção do cilindro de vidro e foram realizadas 4h adicionais de incubação, fixação e coloração. Barra de escala =100 μm. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; MSCs: células-tronco mesenquimais. Clique aqui para baixar este vídeo.
Os resultados de 72 h de incubação mostraram que os MSCs migraram para o órgão de Corti e foram localizados principalmente no modiolus e na área onde as fibras nervosas cocleares separadas do modiolus foram coletadas; a morfologia dos MSCs foi alterada para uma forma radial semelhante à das fibras nervosas(Figura 4B). Curiosamente, as células foram transformadas em uma forma linear ao longo da linha limbus em vez da área da célula ciliada(Figura 4E, ver seta). Embora as extremidades apical e basal do órgão de Corti tenham sido combinadas para evitar que os MSCs se deslocassem para o lado medial da membrana basilar, os MSCs foram capazes de migrar e crescer na área de coleta de fibras nervosas penetrando nas várias camadas celulares e barreiras físicas(Figura 4E). Quando os danos às células ciliadas foram induzidos pelo tratamento com kanamicina de 1 mM por 16 h, e as células foram cultivadas por mais 72 h após a remoção da kanamicina, os MSCs foram localizados não apenas no modiolus, mas também nas células ciliadas externas(Figura 4C,D).
Figura 4. Imagens confocal do órgão de MsCs corti e gfp. (A) Após a remoção do cilindro de vidro e mais 16 horas de incubação, uma imagem foi tirada após fixação e coloração. Barra de escala =200 μm. (B) OS MSCs foram predominantemente distribuídos na área de modiolus, barra de escala =20 μm. Após a remoção do cilindro de vidro do prato, as células foram incubadas com kanamycina de 1,0 mM por 16 h, cultivadas com meio livre de kanamicina por 72 h, e depois fixadas e manchadas. Imagens da região da célula ciliar exterior (C),barra de escala= 20 μm; (D) região modiólus, barra de escala= 50 μm; e (E)cóclea inteira, barra de escala= 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Esses resultados indicam que o sistema experimental demonstrado neste estudo seria uma ferramenta de teste útil para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas celulares utilizando MSCs e pode ser aplicado especificamente para estudar a perda auditiva causada por vários fatores.
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Discussion
O transplante de MSCs em locais danificados para promover a regeneração de células danificadas tem sido extensivamente estudado, e o efeito terapêutico é evidente. O transplante e a subsequente diferenciação dos MSCs foram relatados para restaurar a audição em ratos com perda auditiva induzida por ácido 3-nitropropídico13. Embora Lee et al. aplicassem MSCs aos seres humanos transvenosamente, eles não alcançaram qualquer melhora significativa na audição14. Até recentemente, cerca de 12 experimentos eram realizados para restaurar a audição no modelo de roedores pelo transplante de MSC. Embora o resultado não esteja claro por causa da heterogeneidade, há alguma indicação de que os MSCs podem promover a audição.
Vários fatores de crescimento e quimiocinas relacionadas à quimioattracção estão envolvidos na migração de células-tronco transplantadas para áreas danificadas, independentemente da heterogeneidade ou homogeneidade15. Quimiocinas são os principais reguladores da migração celular para homeostase tecidual, respostas imunológicas e cicatrização de feridas. A quimioattracção induzida por quimiocina in vivo pode não funcionar da mesma forma que in vitro devido às diferenças entre condições experimentais in vivo e in vitro. Embora as condições experimentais in vitro tenham suas próprias limitações, é muito difícil realizar estudos in vivo para promover migração eficiente, recrutamento e regeneração de células16.
Embora o rastreamento de MSCs transplantados para restauração auditiva seja importante na pesquisa de medicina regenerativa, os experimentos in vivo, especialmente aqueles que envolvem audição, são intensivos em mão-de-obra na maioria dos casos e, portanto, são extremamente difíceis de realizar com grandes tamanhos amostrais. Assim, a homogeneidade dos resultados é baixa, e o viés é grave. Portanto, seria eficiente primeiro estudar tais eventos baseados em migração em condições in vitro. A maioria dos estudos in vitro sobre migração celular tem sido realizada usando transwell ou métodos de cura de feridas.
Um método de coincubação de explanar cócleas com MSCs foi estabelecido para rastrear as células-tronco migratórias, que reconhecem locais de lesões e se movem em direção a eles. A maioria dos estudos tem usado um método de anexar um órgão de Corti em tampas de vidro revestidas com β-mercaptoetanol após a explantação. Embora o mesmo método tenha sido usado aqui, foi difícil examinar os tecidos porque muitas vezes se separaram ou rolaram da tampa. Por isso, foi realizado um novo teste para facilitar o monitoramento do tecido. Primeiro, um órgão de Corti foi colocado em uma mancha de plástico, e então o tecido foi imobilizado na tampa pressionando a porção restante da membrana de Reissner gerada durante a dissecção usando fórceps.
Isso possibilitou a fixação estável do órgão de Corti ao deslizamento de cobertura para que uma imagem pudesse ser adquirida com sucesso por microscopia confocal. Embora o método de cultura tecidual apresentado aqui seja um barato e econômico, o desenvolvimento da proficiência na dissecção leva algum tempo. Métodos conhecidos de cultura tecidual incluem a fixação do tecido por revestimento do deslizamento de cobertura com poli-L-ornithine e laminina16; aplicação de inserções de cultura celular organotípica que não requerem materiais adesivos ou de revestimento17, eliminando assim a necessidade de substâncias adesivas, o que reduz o dano à explantagem; e utilizando um adesivo tecidual composto de proteínas extraídas de mexilhões marinhos10. Este protocolo não requer materiais de revestimento nem membranas organotípicas nem adesivos teciduais; um deslizamento de tampa de plástico barato é suficiente. Melhores imagens podem ser adquiridas se uma área de 8 mm x 8 mm for considerada juntamente com uma pilha de Z da espessura tecidual do órgão de Corti. Considerando a grande quantidade de dados a serem armazenados e o tempo adequado para o lapso de tempo, foram adquiridas imagens de todo o movimento celular, com foco nos MSCs em vez do órgão de Corti.
Os resultados mostrados na Figura 4 parecem sugerir que tanto o órgão de Corti quanto os MSCs podem ser visualizados como imagens de vídeo claras quando as imagens tiradas têm 2 mm de comprimento, e a pilha Z é combinada com um lapso de tempo. Aqui, embora um experimento de co-cultura tenha sido realizado com MSCs e uma explanta, esse ajuste poderia ser aplicado a diferentes tipos de células ou condições para estudos futuros. Por exemplo, ajudará a aplicar este protocolo para examinar os efeitos de drogas ou exosóis que protegem os danos da cóclea. As células-tronco embrionárias (ESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) podem se regenerar funcional e morfologicamente em células tipo células ciliar mecanosensíveis18. Portanto, este protocolo pode ser aplicado para estudar a diferenciação de iPSCs ou ESCs em células ciliar auditivas ou células de suporte. Este método ex vivo pode ajudar na medicina regenerativa para restaurar a audição.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) da National Research Foundation (NRF) da Coreia e do Hallym University Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L.
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
- Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
- Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
- Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
- Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
