Summary
In questo studio, presentiamo un metodo di imaging in tempo reale utilizzando la microscopia confocale per osservare le cellule che si muovono verso il tessuto danneggiato mediante incubazione ex vivo con l'epitelio cocleare contenente l'organo di Corti.
Abstract
Per studiare gli effetti delle cellule staminali mesenchimali (CSC) sulla rigenerazione e sul trattamento cellulare, questo metodo tiene traccia della migrazione MSC e dei cambiamenti morfologici dopo la co-coltura con epitelio cocleare. L'organo di Corti è stato immobilizzato su un coverslip di plastica premendo una porzione della membrana del Reissner generata durante la dissezione. I CSC confinati da un cilindro di vetro migrarono verso l'epitelio cocleare quando il cilindro fu rimosso. La loro localizzazione predominante è stata osservata nel modiolo dell'organo di Corti, allineato in una direzione simile a quella delle fibre nervose. Tuttavia, alcuni CSC erano localizzati nell'area limbus e mostravano una forma allungata orizzontalmente. Inoltre, la migrazione nell'area delle cellule cieche è stata aumentata e la morfologia dei CSC è cambiata in varie forme dopo il trattamento con kanamicina. In conclusione, i risultati di questo studio indicano che la cocultura dei CSC con epitelio cocleare sarà utile per lo sviluppo di terapie attraverso il trapianto cellulare e per studi di rigenerazione cellulare in grado di esaminare varie condizioni e fattori.
Introduction
La perdita dell'udito può verificarsi congenitamente o può essere causata progressivamente da diversi fattori, tra cui invecchiamento, farmaci e rumore. La perdita dell'udito è spesso difficile da trattare perché è molto difficile ripristinare la funzione compromessa una volta che le cellule ciliate responsabili dell'udito sonodanneggiate 1. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, si stima che 461 milioni di persone in tutto il mondo abbiano ipoacusia, che rappresenta il 6,1% della popolazione mondiale. Di coloro che hanno ipoacusia, il 93% sono adulti e il 7% sono bambini.
Sono stati tentati diversi approcci per trattare la perdita dell'udito; in particolare, un approccio di rigenerazione che utilizza i CTC è emerso come un trattamento promettente. Quando il tessuto è danneggiato, i CSC vengono naturalmente rilasciati nel sistema circolatorio e migrano verso il sito della lesione dove secernono varie molecole per formare un microambiente che promuove larigenerazione 2. Pertanto, è importante sviluppare un metodo per trattare i tessuti danneggiati attraverso la migrazione dei CBC impiantati esternamente agli organi bersaglio e la loro successiva secrezione di molecole che causano una potente regolazione immunitaria, angiogenesi e anti-apoptosi per migliorare il ripristino della funzionecellulare danneggiata 3,4,5.
Il processo di homing in cui i CSC migrano verso tessuti danneggiati può essere l'ostacolo più importante da superare. Gli MSC hanno un meccanismo sistemico di homing con passaggi sequenziali di tethering/rolling, attivazione, arresto, trasmigrazione/diapedesi e migrazione6,7,8. Attualmente sono in corso sforzi per individuare modi per migliorare questi passaggi. Varie strategie, tra cui la modificazione genetica, l'ingegneria delle superfici cellulari, l'adescamento in vitro e la guida magnetica,sono state testate 6,7. Inoltre, sono stati fatti diversi tentativi per promuovere la protezione e la rigenerazione delle cellule ciliate uditivi affinando i CTC nel sito della coclea danneggiata. Tuttavia, tenere traccia dei CSC in vivo richiede molto tempo e manodopera e richiede competenze altamente specializzate9.
Per risolvere questo problema, è stato messo a punto un metodo per osservare l'affinamento dei CFC nella coclizione attraverso la microscopia confocale time-lapse che fotografa la migrazione delle cellule per diverse ore (Figura 1). È stato sviluppato all'inizio del XX secoloed è recentemente diventato un potente strumento per studiare la migrazione di cellule specifiche.
Figura 1: Astratto grafico. (A) Dopo che l'organo sezionato di Corti è stato aderito su un copripasta di plastica con forcep, il copripasta viene posizionato su un piatto microscopico confocale con fondo di vetro da 35 mm e (B) il cilindro di vetro è posizionato. (C) Dopo aver riempito l'interno del cilindro di vetro con CCC con etichetta GFP media,(D)con mezzo vengono aggiunti con attenzione all'esterno del cilindro. (E) Dopo l'incubazione durante la notte,(F)il cilindro di vetro viene rimosso e le immagini vengono scattate con un microscopio confocale. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC = cellule staminali mesenchimali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Tutti i protocolli di ricerca che coinvolgono topi ICR sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Yonsei University presso il Wonju College of Medicine. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo il Codice Etico della World Medical Association. In questo protocollo, i topi ICR in gravidanza sono stati tenuti in un ciclo chiaro / scuro di 12/12 h con libero accesso a cibo e acqua.
1. Dissezione delle cocche
- Sterilizzare la cappa di coltura del tessuto di flusso laminare accendendo la luce ultravioletta per ~ 30 minuti e spruzzare tutte le superfici con il 70% di etanolo prima dell'uso. Lasciare asciugare le superfici.
- Posizionare gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per 10 minuti e asciugare prima dell'uso.
- Utilizzare una lama operativa per decapitare topi postnatali di 3-4 giorni (Figura 2A).
- Posizionare il cranio sotto uno stereomicroscopio nella cappa di flusso laminare e immergere il tessuto in etanolo al 70%.
- Immergere rapidamente il tessuto nella soluzione di dissezione tissutale (1x soluzione di sale bilanciato di Hank, 1 mM HEPES) per rimuovere l'etanolo.
- Tagliare l'altura del cranio con una lama chirurgica(Figura 2B,C).
- Esporre il cranio tirando la pelle anteriormente e tagliando il canale uditivo esterno dell'orecchio (Figura 2D).
- Tagliare dalla parte anteriore a quella posteriore del cranio attraverso la linea degli occhi (Figura 2E).
- Aprire il cranio e rimuovere ilencefalo, il cervelletto e il tronco encefalico con forcep smussate (Figura 2F,G).
- Utilizzando micro forcep, separare i coclea dall'osso temporale (Figura 2H).
- Trasferire le cocche in una piastra di Petri contenente soluzione di dissezione tissutale.
- Sezionare con cura tutta la capsula otica cocleare, lasciando solo il tessuto molle cocleare interno(Figura 2I,J).
- Tenere il modiolo delle coclee con le flessori e il condotto cocleare con un'altra coppia di forcelle e separare lentamente i due tessuti (Figura 2K).
- Rimuovere la vascolarizzazione della striata e la membrana tectoriale staccandole delicatamente(Figura 2L,M).
- Posizionare un coverslip di plastica sterilizzato in una nuova soluzione di dissezione tissutale, quindi posizionare l'organo di Corti su un coverslip di 9 mm di diametro, assicurandosi che la membrana basilare sia rivolta verso il basso(Figura 2N-P).
- Immobilizzare il tessuto premendo la membrana del Reissner e il tessuto di modiolo rimanente sul copriletto con pinze(Figura 2N-P).
- Trasferire il copriletto con il tessuto incorporato al centro di un piatto confocale di 35 mm di diametro.
- Posizionare il cilindro di clonazione del vetro sul piatto, con l'espianto cocleare posizionato al centro del piatto, e aggiungere 100 μL di mezzo di coltura di espianto (DMEM/F12, 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di integratore N2, ampicillina (10 μg/mL))10 all'interno del cilindro(Figura 2Q).
- Piastra 5 × 103 cellule di MSC con proteina fluorescente verde derivata dal midollo osseo del topo (GFP) in 2 mL di mezzo di coltura (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% supplemento N2, 10 μg/mL di ampicillina) al di fuori del cilindro divetro (Figura 2R).
- Quando gli MBC sono confluenti all'80-90%, passare loro staccandoli con acido tetraacetico tripsideina-etilendiammina.
- Trasferire con cura il piatto confocale in un incubatore umidificato e incubare durante la notte a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
- Aspirare tutto il mezzo all'interno e all'esterno del cilindro, quindi rimuovere il cilindro di vetro dal piatto confocale.
- Aggiungere 2 mL di mezzo di coltura fresco al piatto confocale e incubare il piatto di coltura tissutale in un incubatore umidificato fino a quando non è pronto per l'analisi.
Figura 2. Dissezione di una coclea di topo e cocultura dell'organo di Corti e MSC. (A) Decapitazione del topo, (B) e (C) dissezione saligittale mediana della testa, (D) e(E) dissezione coronale del cervello, (F) e (G) rimozione del cervello e dell'osso temporale, (H) coclea, (I) rimozione della parete cocleare ossea, (J) isolamento della coclea, (K) separazione del condotto cocleare dal modiolo, (L) separazione della vascolarizzazione della striata (SV) e legamento a spirale (SL) dall'organo di Corti, (M) rimozione della membrana tectoriale, (N-P) fissazione della coccina su un foglietto di copertura di plastica, (Q) posizione di coverslip e cilindro di vetro nella piastra confocale,(R)inoculazione di MSC. Barra in scala bianca (A-E) = 1 cm; barra di scala arancione (F, G, P) e gialla (H,I) = 1 mm; barra in scala verde (J-O) = 0,5 mm.
2. Imaging time-lapse
- Per gli esperimenti qui presentati, utilizzare un sistema di microscopia confocale con un sistema di incubazione superiore dello stadio.
- Accendere il microscopio confocale, la luce fluorescente e il computer.
- Impostare le condizioni dell'incubatore stage-top posto sul palco del microscopio confocale a 37 °C e al 5% di atmosfera di CO2.
- Posizionare il piatto campione sul recipiente di fissaggio del piatto, coprire con il coperchio di fissaggio del piatto e chiudere la camera con il coperchio del riscaldatore superiore.
- Regola lo zoom e lo stato attivo per localizzare l'organo di Corti e MSC nel campo visivo.
- Aprire il software di elaborazione delle immagini. Nell'opzione di individuazione selezionare un obiettivo Plan-Apochromat 20x (apertura numerica 0.8) e una superficie di ritaglio 0,5x.
- In Acquisizionefare clic su configurazione intelligente e selezionare EGFP.
- Aprire la linguetta del canale in Acquisizionee impostare la potenza laser su 0,2%, il foro stenopeica a 44 μm, il guadagno principale a 750 Ve il guadagno digitale su 1,0.
- Fare clic su ESID in fase di configurazione dell'imaging e impostare il guadagno ESID su 4 e il guadagno digitale su 7.5.
- Clicca su Tessere e palo per produrre 210 tessere.
- Aprire la strategia focus e selezionare la modalità messa a fuoco.
- In serie temporaliimpostare la durata su 24 h e l'intervallo su 10 min.
- In Acquisizioneimpostare la dimensione del fotogramma su 512 x 512 pixel, la velocità di scansione su 8, la direzione in bidirezionale, la media su 4x e i bit per pixel su 16.
- Clicca sull'esperimento iniziale per iniziare l'esperimento.
3. Modifica del file di immagine
- In elaborazionefare clic su cucituree impostare la sovrapposizione minima sul 5% e il passaggio massimo al 10%.
- Fare clic sull'esportazionedei film , impostare uncompressoe impostare la velocità su 7.5.
4. Immunostaining
- Aspirare il mezzo con attenzione e lavare il campione due volte con soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) per 5 minuti.
- Fissare il campione con formalina al 4% in PBS per 15 minuti e lavare il campione 3 volte con PBS per 5 minuti.
- Permeabilizzare il campione nello 0,1% di Tritone X-100 in PBS per 10 minuti e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti.
- Aggiungere 250 μL di reagente phalloidin-iFluor 647 (diluizione 1:1000 in PBS) e incubare il campione per 1 h a temperatura ambiente sullo shaker.
- Lavare il campione 3 volte con PBS per 5 minuti.
- Trasferire il coverslip sullo scivolo di vetro e aggiungere 2 gocce di soluzione di montaggio.
- Posizionare delicatamente una coverlip sullo scivolo.
- Sigillare il copripago con smalto chiaro e conservare a 4 °C al buio fino a quando non si osservano le cellule.
- Immagina la diapositiva usando un microscopio confocale con un filtro appropriato a eccitazione/emissione (Ex/Em)=650/665 nm per la filloidina e a Ex/Em=488/507 nm per EGFP.
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Representative Results
La migrazione in vitro dei CSC in modalità tridimensionale è stata valutata da un sistema Transwell o dal tradizionale metodo di guarigione delle ferite per osservare la migrazione in modalità bidimensionale (2D)11. L'organo di Corti è una struttura complessa composta da varie cellule come cellule boettcher, cellule claudio, cellule deiters, cellule di pilastro, cellule di Hensen, cellule ciliate esterne, cellule ciliate interne, fibre nervose, membrana basiolare e lamina reticolare12. Quando i CSC vengono trapiantati in tessuti composti da cellule così complesse, l'uso della tecnologia per accertare dove le cellule vengono reclutate e stabilizzate è fondamentale per comprendere il meccanismo della terapia cellulare e della rigenerazione utilizzando i CBC. Inoltre, per determinare come i CSC sono localizzati in presenza o assenza di danni, un metodo 2D come un metodo di guarigione delle ferite è più adatto di un sistema Transwell in cui le cellule si muovono casualmente verso il basso in una direzione.
In questo studio, il percorso bidimensionale dei CSC è stato tracciato in un metodo di guarigione delle ferite semplicemente usando un cilindro di vetro come barriera tra i CSC e l'organo di Corti e rimuovendo il cilindro dopo che i CSC sono stati attaccati. Quando l'organo di Corti è stato coltivato, i fibroblasti sono cresciuti molto rapidamente verso l'esterno dalle cellule ciliate esterne presenti nello strato più esterno (Figura 3, Video 1). Pertanto, la maggior parte dei CSC etichettati GFP sembrava essere spinta fuori dai fibroblasti in rapida crescita (Video 1). Tuttavia, alcuni MSC etichettati GFP penetrarono lo strato di fibroblasti e migrarono con successo all'organo di Corti (Figura 3, Video 1).
Figura 3. Immagine confocale dell'organo dei CBC con etichetta Corti e GFP. Dopo la rimozione del cilindro di vetro e altre 4 ore di incubazione, sono state eseguite fissazioni e colorazioni. Barra di scala =100 μm. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC: cellule staminali mesenchimali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Microscopia confocale time-lapse dell'organo dei CBC etichettati Corti e GFP. Dopo la rimozione del cilindro di vetro e altre 4 ore di incubazione, sono state eseguite fissazioni e colorazioni. Barra di scala =100 μm. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC: cellule staminali mesenchimali. Clicca qui per scaricare questo video.
I risultati di 72 ore di incubazione hanno mostrato che i CSC migravano all'organo di Corti ed erano principalmente localizzati nel modiolo e nell'area in cui venivano raccolte le fibre nervose cocleari separate dal modiolo; la morfologia dei CSC è stata alterata a una forma radiale simile a quella delle fibre nervose (Figura 4B). Curiosamente, le cellule sono state trasformate in una forma lineare lungo la linea limbus piuttosto che nell'area delle cellule ciliate(Figura 4E,vedi freccia). Sebbene le estremità apicali e basali dell'organo di Corti siano state combinate per impedire ai CSC di spostarsi sul lato mediale della membrana basiolare, i CSC sono stati in grado di migrare e crescere nell'area di raccolta delle fibre nervose penetrando nei vari strati cellulari e barriere fisiche(Figura 4E). Quando i danni alle cellule ciliate sono stati indotti dal trattamento con 1 mM di kanamicina per 16 ore e le cellule sono state coltivate per altre 72 ore dopo la rimozione della kanamicina, i CSC sono stati localizzati non solo nel modiolo, ma anche nelle cellule ciliate esterne(Figura 4C,D).
Figura 4. Immagini confocali dell'organo dei CBC con etichetta Corti e GFP. (A) Dopo la rimozione del cilindro di vetro e altre 16 ore di incubazione, è stata scattata un'immagine dopo la fissazione e la colorazione. La barra di scala =200 μm. (B) I CSC erano distribuiti prevalentemente nell'area del modiolo, barra di scala =20 μm. Dopo la rimozione del cilindro di vetro dal piatto, le cellule sono state ulteriormente incubate con kanamicina da 1,0 mM per 16 ore, coltivate con mezzo privo di kanamicina per 72 ore, e quindi fissate e macchiate. Immagini della regione esterna delle cellule cieche (C), barra di scala= 20 μm; (D) regione di modiolo, barra di scala= 50 μm; e (E) cochlea intera, barra di scala= 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Questi risultati indicano che il sistema sperimentale dimostrato in questo studio sarebbe un utile strumento di prova per lo sviluppo di strategie terapeutiche cellulari utilizzando i CSC e può essere applicato specificamente allo studio della perdita dell'udito causata da vari fattori.
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Discussion
Il trapianto di MBC in siti danneggiati per promuovere la rigenerazione delle cellule danneggiate è stato ampiamente studiato e l'effetto terapeutico è evidente. Il trapianto e la successiva differenziazione dei CSC sono stati segnalati per ripristinare l'udito nei ratti con perdita dell'udito indotta da acido 3-nitropropionico13. Sebbene Lee et al. Fino a poco tempo fa, quasi 12 esperimenti sono stati condotti per ripristinare l'udito nel modello di roditore mediante trapianto MSC. Sebbene il risultato non sia chiaro a causa dell'eterogeneità, vi è qualche indicazione che i CSC possano promuovere l'udito.
Vari fattori di crescita e chemiochine legati alla chemioa attrazione sono coinvolti nella migrazione delle cellule staminali trapiantate verso aree danneggiate, indipendentemente dall'eterogeneità o dall'omogeneità15. Le chemiochine sono regolatori chiave della migrazione cellulare per l'omeostasi tissutale, le risposte immunitarie e la guarigione delle ferite. La chemioa attrazione indotta dalla chemiochina in vivo potrebbe non funzionare allo stesso modo in vitro a causa delle differenze tra condizioni sperimentali in vivo e in vitro. Sebbene le condizioni sperimentali in vitro abbiano i loro limiti, è molto difficile condurre studi in vivo per promuovere una migrazione, un reclutamento e una rigenerazione efficienti dellecellule 16.
Sebbene il monitoraggio dei CSC trapiantati per il ripristino dell'udito sia importante nella ricerca sulla medicina rigenerativa, gli esperimenti in vivo, specialmente quelli che coinvolgono l'udito, sono ad alta intensità di lavoro nella maggior parte dei casi e sono quindi estremamente difficili da eseguire con campioni di grandi dimensioni. Quindi, l'omogeneità dei risultati è bassa e la distorsione è grave. Pertanto, sarebbe efficiente studiare prima tali eventi basati sulla migrazione in condizioni in vitro. La maggior parte degli studi in vitro sulla migrazione cellulare sono stati eseguiti utilizzando transwell o metodi di guarigione delle ferite.
È stato istituito un metodo di coincubazione per l'espianto delle cocleae con i CSC per tracciare le cellule staminali migratorie, che riconoscono i siti di lesione e si muovono verso di esse. La maggior parte degli studi ha utilizzato un metodo per attaccare un organo di Corti su coverlips di vetro rivestiti con β-mercaptoetanolo dopo l'espianto. Sebbene lo stesso metodo sia stato utilizzato qui, era difficile esaminare i tessuti perché spesso si staccavano o rotolavano dal copripazzo. Pertanto, è stato eseguito un nuovo studio per facilitare il monitoraggio del tessuto. In primo luogo, un organo di Corti è stato posto su un coverslip di plastica, e poi il tessuto è stato immobilizzato sul copripazzo premendo la parte rimanente della membrana del Reissner generata durante la dissezione usando le forcelle.
Ciò ha permesso l'attacco stabile dell'organo di Corti al coverslip in modo che un'immagine potesse essere acquisita con successo con microscopia confocale. Sebbene il metodo di coltura tissutale qui presentato sia un risparmio di tempo e poco costoso, lo sviluppo della competenza nella dissezione richiede del tempo. I metodi noti di coltura tissutale comprendono l'attacco del tessuto rivestendo la coverslip con poli-L-ornitina e laminina16; l'applicazione di inserti di coltura cellulare organotipici che non richiedono materiali adesivi o dirivestimento 17 eliminando così la necessità di sostanze adesive, il che riduce i danni all'espianto; e utilizzando un adesivo tissutale composto da proteine estratte dalle cozze marine10. Questo protocollo non richiede né materiali di rivestimento né membrane organotipiche né adesivi tissutali; è sufficiente un copripasto in plastica economico. Immagini migliori possono essere acquisite se viene considerata un'area di 8 mm x 8 mm insieme a una pila Z dello spessore del tessuto dell'organo di Corti. Considerando la grande quantità di dati da archiviare e il tempo appropriato per la perdita di tempo, sono state acquisite immagini di movimento cellulare intero, concentrandosi sugli MSC anziché sull'organo di Corti.
I risultati mostrati nella figura 4 sembrano suggerire che sia l'organo di Corti che gli MSC possono essere visualizzati come immagini video chiare quando le immagini scattate sono lunghe 2 mm e lo Z-stack è combinato con un time lapse. Qui, sebbene sia stato eseguito un esperimento di co-coltura con MSC e un espianto, questa impostazione potrebbe essere applicata a diversi tipi di cellule o condizioni per studi futuri. Ad esempio, aiuterà ad applicare questo protocollo per esaminare gli effetti di droghe o esosomi che proteggono i danni della coclea. Le cellule staminali embrionali (ESC) o le cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) possono rigenerarsi funzionalmente e morfologicamente in cellule simili a cellule ciliate meccanosensibili18. Pertanto, questo protocollo può essere applicato per studiare la differenziazione di iPSC o ESC in cellule ciliate uditivi o cellule di supporto. Questo metodo ex vivo può aiutare nella medicina rigenerativa a ripristinare l'udito.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da borse di ricerca (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) della National Research Foundation (NRF) della Corea e del Fondo di ricerca universitaria Hallym.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
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