Summary
I denne undersøgelse præsenterer vi en realtidsbilleddannelsesmetode ved hjælp af konfokal mikroskopi for at observere celler, der bevæger sig mod beskadiget væv ved ex vivo-inkubation med cochlear epitel, der indeholder Cortis organ.
Abstract
For at studere virkningerne af mesenchymale stamceller (MSC) på cellegendannelse og -behandling sporer denne metode MSC-migration og morfologiske ændringer efter co-kultur med cochlear epitel. Corti-organet blev immobiliseret på en plastikovertræk ved at trykke på en del af Reissners membran, der blev genereret under dissektionen. MSC'er, der var begrænset af en glascylinder, migrerede mod cochlear epitel, da cylinderen blev fjernet. Deres dominerende lokalisering blev observeret i modiolus af Cortis organ, justeret i en retning svarende til nervefibrene. Nogle MSC'er var imidlertid lokaliseret i limbusområdet og viste en vandret langstrakt form. Derudover blev migrationen til hårcelleområdet øget, og MSC'ernes morfologi ændrede sig til forskellige former efter kanamycinbehandling. Afslutningsvis tyder resultaterne af denne undersøgelse på, at cokulturen af MSC'er med cochlear epitel vil være nyttig for udviklingen af terapeutiske behandlinger via celletransplantation og for undersøgelser af cellegendannelse, der kan undersøge forskellige tilstande og faktorer.
Introduction
Høretab kan forekomme medfødt eller kan forårsages gradvist af flere faktorer, herunder aldring, medicin og støj. Høretab er ofte vanskeligt at behandle, fordi det er meget udfordrende at genoprette nedsat funktion, når de hårceller, der er ansvarlige for hørelsen, er beskadiget1. Ifølge Verdenssundhedsorganisationen skønnes 461 millioner mennesker verden over at have høretab, som udgør 6,1% af verdens befolkning. Af dem med høretab er 93 % voksne, og 7 % er børn.
En række tilgange er blevet forsøgt at behandle høretab; navnlig har en regenereringsmetode, hvor MSC'er er blevet brugt, vist sig at være en lovende behandling. Når væv er beskadiget, frigives MSC'er naturligt i kredsløbssystemet og migrerer til skadesstedet, hvor de udskiller forskellige molekyler for at danne et mikromiljø, der fremmer regenerering2. Derfor er det vigtigt at udvikle en metode til behandling af beskadigede væv gennem migration af eksternt implanterede MSC'er til at målrette organer og deres efterfølgende sekretion af molekyler, der forårsager potent immunregulering, angiogenese og antiapoptose for at forbedre genoprettelsen af beskadiget cellefunktion3,4,5.
Den homing proces, hvor MSCs migrere til beskadigede væv kan være den vigtigste hindring for at overvinde. MSC'er har en systemisk sporingsmekanisme med sekventielle trin til tøjring/rulning, aktivering, anholdelse, transmigration/diapedesis og migrering6,7,8. I øjeblikket er der bestræbelser i gang for at finde måder at forbedre disse trin på. Forskellige strategier, herunder genmodifikation, celleoverfladeteknik, in vitro priming og magnetisk vejledning, er blevet testet6,7. Desuden er der gjort adskillige forsøg på at fremme beskyttelse og regenerering af auditive hårceller ved at homing MSCs til det sted, hvor beskadiget cochlea. Sporing af MSC'er in vivo er imidlertid tidskrævende og arbejdskrævende og kræver højt specialiserede færdigheder9.
For at løse dette problem blev der udviklet en metode til at observere homing af MSC'er i cochlea gennem time-lapse konfokal mikroskopi, der fotograferer migration af celler over flere timer (Figur 1). Det blev udviklet i begyndelsen af det20. århundrede og er for nylig blevet et kraftfuldt værktøj til at studere migration af specifikke celler.
Figur 1: Grafisk abstrakt. (A) Efter at Cortis dissekerede organ er klæbet på en plastovertræksafløb ved hjælp af tang, placeres coverlipet på en 35 mm glasbundet konfokal mikroskopisk skål, og (B) glascylinderen er placeret. (C) Efter påfyldning af indersiden af glascylinderen med medium tilsættes (D) GFP-mærkede MSC'er med medium forsigtigt uden for cylinderen. (E) Efter inkubation natten over fjernes (F) glascylinderen, og billeder tages med et konfokalt mikroskop. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; MSC = mesenchymale stamceller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forskningsprotokoller med ICR-mus blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Yonsei University ved Wonju College of Medicine. Eksperimenter blev udført i henhold til kodekset for etik i World Medical Association. I denne protokol blev gravide ICR-mus holdt i en 12/12 h lys / mørk cyklus med fri adgang til mad og vand.
1. Cochleae dissektion
- Steriliser laminar flow vævskulturhætten ved at tænde for ultraviolet lys i ~ 30 min, og sprøjt alle overflader med 70% ethanol før brug. Lad overfladerne tørre.
- Placer dissektionsinstrumenter i 70% ethanol i 10 minutter, og tør før brug.
- Brug en driftskniv til at halshugge postnatal 3-4 dage gamle mus (Figur 2A).
- Placer kraniet under et stereomikroskop i laminar flow hætte, og suge vævet i 70% ethanol.
- Iblødsætning af vævet i vævsdissektionsopløsning (1x Hanks afbalancerede saltopløsning, 1 mM HEPES) for at fjerne ethanolen.
- Skær kraniets midterlinje over med et kirurgisk blad (Figur 2B,C).
- Udsæt kraniet ved at trække huden ned foran og skære ørets eksterne auditive kanal (Figur 2D).
- Skåret fra den forreste til den bageste del af kraniet over øjenlinjen (Figur 2E).
- Åbn kraniet og fjern forhjernen, lillehjernen og hjernestammen med stumpe pincet(Figur 2F,G).
- Ved hjælp af mikro pincet, adskille cochlea fra den tidsmæssige knogle (Figur 2H).
- Cochleaen overføres til en petriskål, der indeholder vævsdissektionsopløsning.
- Dissekere omhyggeligt hele cochlear otic kapslen, så kun det indre cochlear blødt væv(Figur 2I,J).
- Hold cochleaes modiolus med pincet og cochlearkanalen med et andet par pincet, og adskil langsomt de to væv (Figur 2K).
- Stria vascularis og tectorial membranen fjernes ved forsigtigt at skrælle dem væk (Figur 2L,M).
- Placer en steriliseret plastovertræk i ny vævsdissektionsopløsning, og placer derefter Cortis organ på en coverlip med en diameter på 9 mm, og sørg for, at basilarmembranen vender nedad (Figur 2N-P).
- Immobilisere vævet ved at trykke Reissner's membran og de resterende modiolus væv på coverlip med pincet (Figur 2N-P).
- Overfør coverlip med det indlejrede væv til midten af en konfokal skål med en diameter på 35 mm.
- Sæt glaskloningscylinderen på fadet, med cochlear-explanten placeret i midten af skålen, og tilsæt 100 μL explantkulturmedium (DMEM/F12, 10% føtal kvægserum (FBS), 1% N2-tillæg, ampicillin (10 μg/mL))10 inde i cylinderen (Figur 2Q).
- Plade 5 × 103 celler af mus knoglemarvsafledt grønt fluorescerende protein (GFP)-mærkede MSC'er i 2 mL kulturmedium (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% N2 supplement, 10 μg/mL ampicillin) uden for glascylinderen(figur 2R).
- Når MSC'erne er 80-90% sammenflydende, skal de passage dem ved at løsne dem med trypsin-ethylendiamine tetraeddikesyre.
- Overfør forsigtigt konfokale skålen til en befugtet inkubator og inkuber natten over ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Indsug alt medium i og uden for cylinderen, og fjern derefter glascylinderen fra konfokale skålen.
- Tilsæt 2 mL frisk kultur medium til konfokale parabol, og inkuber vævskultur parabol i en befugtet inkubator, indtil klar til analyse.
Figur 2. Dissektion af en mus cochlea og cokultur af organet af Corti og MSCs. (A) Halshugning af mus , (B) og (C) midterlinjen sagittal dissektion af hovedet , (D) og (E) koronar dissektion af hjernen, (F) og (G) fjernelse af hjernen og tidsbestemte knogler, (H) cochlea, (I) fjernelse af knoklet cochlear væg, (J) isolering af cochlea, (K) adskillelse af cochlear kanalen fra modio (L) adskillelse af striavakularis (SV) og spiralbånd (SL) fra Cortis organ , (M) fjernelse af tectorialmembranen, (N-P) fiksering af cochlea på en plastdækselsseddel , (Q) placering af coverslip og glascylinder i konfokal skålen , (R) podning af MSC' er. Hvid skalastang (A-E) = 1 cm; orange (F, G, P) og gul skalastang (H,I) = 1 mm; grøn skala bjælke (J-O) = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Time-lapse billeddannelse
- Til de eksperimenter, der præsenteres her, skal du bruge et konfokalt mikroskopisystem med et fasetopinkubatorsystem.
- Tænd for konfokalt mikroskop, lysstofrør og computer.
- Betingelserne for den fase-top inkubator, der er placeret på det konfokale mikroskops stadie, indstilles til 37 °C og 5 % CO2-atmosfære.
- Læg prøven på opvaskemaskinen, dæk med skålens fastgørelseslåg, og luk kammeret med det øverste varmelåg.
- Juster zoom og fokus for at lokalisere organet for Corti og MSCs i synsfeltet.
- Åbn billedbehandlingssoftwaren. Vælg en 20x Plan-Apochromat-målsætning (numerisk blænde 0,8) og et 0,5x beskæringsområde under lokaliseringsindstillingen.
- Klik på smart setup under Anskaffelse, og vælg EGFP.
- Åbn kanalfanen under Erhvervelse, og indstil lasereffekten til 0,2 %, pinhole til 44 μm, master gain til 750 Vog den digitale forstærkning til 1.0.
- Klik på ESID under konfiguration af billedbehandling, og indstil ESID-gevinsten til 4 og den digitale forstærkning til 7,5.
- Klik på Fliser og spil for at producere 210 fliser.
- Åbn fokusstrategien , og vælg fokustilstand.
- Under tidsserierskal varigheden angives til 24 timer og intervallet til 10 min.
- Under Erhvervelseskal du indstille rammestørrelsen til 512 x 512 pixel, scanningshastigheden til 8, retningen til tovejs, gennemsnittet til 4xog bit pr. pixel til 16.
- Klik på start eksperimentet for at starte eksperimentet.
3. Ændring af billedfil
- Under behandlingskal du klikke på syning og indstille den minimale overlejring til 5 % og det maksimale skift til 10 %.
- Klik på Filmeksport, angiv ukomprimeret, og angiv hastigheden til 7,5.
4. Immunostaining
- Aspirere mediet forsigtigt, og vask prøven to gange med fosfat-buffered saltvand (PBS) i 5 min.
- Prøven fikseres med 4% formalin i PBS i 15 minutter, og prøven vaskes 3 gange med PBS i 5 min.
- Permeabilize prøven i 0,1% Triton X-100 i PBS i 10 min, og vask 3 gange med PBS i 5 min.
- Der tilsættes 250 μL falloidin-iFluor 647-reagens (1:1000 fortynding i PBS) og prøven inkuberes i 1 time ved stuetemperatur på rysteren.
- Prøven vaskes 3 gange med PBS i 5 min.
- Overfør coverlip på glasrutschebanen, og tilsæt 2 dråber monteringsløsning.
- Placer en coverlip på diaset forsigtigt.
- Dækslet forsegles med klar neglelak og opbevares ved 4 °C i mørke, indtil cellerne er observeret.
- Billede diaset ved hjælp af et konfokalt mikroskop med et passende filter ved excitation/emission (Ex/Em)=650/665 nm for falloidin og ved Ex/Em=488/507 nm for EGFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro-migration af MSC'er i tredimensionel tilstand er blevet vurderet af et Transwell-system eller af den traditionelle sårhelingsmetode for at observere migration i todimensionel (2D) tilstand11. Cortis organ er en kompleks struktur bestående af forskellige celler som Boettcher-celler, Claudius-celler, Deiters-celler, søjleceller, Hensens celler, ydre hårceller, indre hårceller, nervefibre, basilarmembran og retikulær lamina12. Når MSC'er transplanteres i væv, der består af sådanne komplekse celler, er brugen af teknologi til at fastslå, hvor celler rekrutteres og stabiliseres, afgørende for at forstå mekanismen for celleterapi og regenerering ved hjælp af MSC'er. For at bestemme, hvordan MSC'er lokaliseres i nærvær eller fravær af skader, er en 2D-metode, såsom en sårhelingsmetode, mere egnet end et Transwell-system, hvor celler bevæger sig tilfældigt nedad i en retning.
I denne undersøgelse blev msc'ernes todimensionelle vej sporet i en sårhelingsmetode ved blot at bruge en glascylinder som en barriere mellem MSC'erne og Cortis organ og fjerne cylinderen, når MSC'erne er fastgjort. Når organet af Corti blev dyrket, fibroblaster voksede meget hurtigt udad fra de ydre hårceller til stede i det yderste lag (Figur 3, Video 1). Derfor syntes de fleste GFP-mærkede MSC'er at blive skubbet ud af hurtigt voksende fibroblaster (Video 1). Ikke desto mindre trængte nogle GFP-mærkede MSC'er ind i laget af fibroblaster og migrerede med succes til corti-organet (Figur 3, Video 1).
Figur 3. Confocal billede af orgel corti og GFP-mærket MSCs. Efter fjernelse af glascylinderen og yderligere 4 timers inkubation blev der udført fiksering og farvning. Skalabjælke =100 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; MSC'er: mesenchymale stamceller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Time-lapse confocal mikroskopi af organet af Corti og GFP-mærkede MSC'er. Efter fjernelse af glascylinderen og yderligere 4 timers inkubation blev der udført fiksering og farvning. Skalabjælke =100 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; MSC'er: mesenchymale stamceller. Klik her for at downloade denne video.
Resultaterne fra 72 timers inkubation viste, at MSC'er migrerede til Cortis organ og hovedsageligt var lokaliseret i modiolus og det område, hvor cochlear nervefibre adskilt fra modiolus blev indsamlet; MSC'ernes morfologi blev ændret til en radial form svarende til nervefibre(Figur 4B). Spændende, celler blev omdannet til en lineær form langs limbus linje i stedet for hår celle område(Figur 4E, se pil). Selv om de apikale og basale ender af organet i Corti blev kombineret for at forhindre MSC'erne i at flytte til den mediale side af basilarmembranen, var MSC'er i stand til at migrere og vokse i nervefiberopsamlingsområdet ved at trænge ind i de forskellige cellelag og fysiske barrierer (Figur 4E). Når skader på hårceller blev forårsaget af behandling med 1 mM kanamycin i 16 timer, og celler blev dyrket i yderligere 72 timer efter fjernelse af kanamycin, MSCs blev lokaliseret ikke kun i modiolus, men også i de ydre hårceller(Figur 4C,D).
Figur 4. Konfokale billeder af organet af Corti og GFP-mærkede MSC'er. (A)Efter fjernelse af glascylinderen og yderligere 16 timers inkubation blev der taget et billede efter fiksering og farvning. Skalastang =200 μm. (B) MSC'er blev overvejende fordelt i modiolus-området, skalastang =20 μm. Efter fjernelsen af glascylinderen fra skålen blev cellerne yderligere inkuberet med 1,0 mM kanamycin i 16 timer, dyrket med kanamycinfrit medium i 72 timer og derefter fastgjort og farvet. Billeder af(C)ydre hårcelleregion, skala bar= 20 μm; d) modiolusregion, skala bar= 50 μm; og (E) hele cochlea, skala bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Disse resultater tyder på, at det eksperimentelle system, der påvises i denne undersøgelse, ville være et nyttigt testværktøj til udvikling af celleterapeutiske strategier ved hjælp af MSC'er og kan anvendes specifikt til at studere høretab forårsaget af forskellige faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transplantation af MSC'er til beskadigede steder for at fremme regenerering af beskadigede celler er blevet grundigt undersøgt, og den terapeutiske effekt er tydelig. Transplantation og efterfølgende differentiering af MSC'er er blevet rapporteret for at genoprette hørelsen hos rotter med høretab fremkaldt af 3-nitropropionsyre13. Selv om Lee et al. anvendt MSCs til mennesker trans-venøst, de ikke opnå nogen væsentlig forbedring i retsmødet14. Indtil for nylig blev der udført næsten 12 eksperimenter for at genoprette hørelsen i gnavermodellen ved MSC-transplantation. Selv om resultatet er noget uklart på grund af heterogenitet, er der tegn på, at MSC'er kan fremme hørelsen.
Forskellige vækstfaktorer og kemokser relateret til kemoattraction er involveret i migrationen af transplanterede stamceller til beskadigede områder, uanset heterogenitet eller homogenitet15. Kemokiner er centrale regulatorer af celle migration for væv homeostase, immunrespons, og sårheling. Kemokin-induceret kemoattraktion in vivo fungerer måske ikke på samme måde som in vitro på grund af forskellene mellem in vivo- og in vitro-forsøgsbetingelser. Selv om in vitro eksperimentelle forhold har deres egne begrænsninger, er det meget vanskeligt at gennemføre in vivo-undersøgelser for at fremme effektiv migration, rekruttering og regenerering af celler16.
Selv om sporing af MSC'er, der transplanteres til høregenopretning, er vigtig i forskning i regenerativ medicin, er in vivo-eksperimenter, især dem, der involverer hørelse, i de fleste tilfælde arbejdskrævende og er derfor yderst vanskelige at udføre med store prøvestørrelser. Derfor er homogeniteten af resultaterne lav, og bias er alvorlig. Det ville derfor være effektivt først at undersøge sådanne migrationsbaserede begivenheder under in vitro-forhold. De fleste in vitro-undersøgelser af cellemigration er blevet udført ved hjælp af Transwell eller sårhelingsmetoder.
Der blev indført en metode til udjævning af cochleae med MSC'er for at spore de migrerende stamceller, som genkender skadessteder og bevæger sig mod dem. De fleste undersøgelser har anvendt en metode til at fastgøre et organ af Corti på glas coverslips belagt med β-mercaptoethanol efter explantation. Selv om den samme metode blev brugt her, var det vanskeligt at undersøge væv, fordi de ofte løsrevet eller rullet op fra coverslip. Derfor blev der udført et nyt forsøg for at gøre det lettere at overvåge vævet. Først blev et organ af Corti placeret på en plastik coverlip, og derefter blev vævet immobiliseret på coverlip ved at trykke på den resterende del af Reissner's membran genereret under dissektionen ved hjælp af pincet.
Dette gjorde det muligt at fastgøre Det Cortis organ i coverlipet, således at et billede kunne erhverves med succes ved konfokal mikroskopi. Selv om vævskulturmetoden, der præsenteres her, er en billig og tidsbesparende, tager udviklingen af færdigheder i dissektion lidt tid. Kendte vævskulturmetoder omfatter fastgørelse af vævet ved at belægge coverlip'en med poly-L-ornitin og laminin16; anvendelse af organiske cellekulturindsatser, der ikke kræver klæbe- eller overfladebehandlingsmaterialer17, hvilket eliminerer behovet for klæbemidler, hvilket reducerer explantskader og ved hjælp af et vævslim bestående af proteiner udvundet af havmuslinger10. Denne protokol kræver hverken overfladebehandlingsmaterialer, organotypiske membraner eller vævslim; en billig plast coverlip er tilstrækkelig. Bedre billeder kan erhverves, hvis et areal på 8 mm x 8 mm betragtes sammen med en Z-stak af vævstykkelsen på Cortis organ. I betragtning af den enorme mængde data, der skal lagres, og den rette tid til tidsforskydning, blev der erhvervet billeder af hele cellebevægelser med fokus på MSC'erne i stedet for Cortis organ.
Resultaterne i figur 4 synes at antyde, at både organet for Corti og MSC'er kan visualiseres som klare videobilleder, når de billeder, der tages, er 2 mm lange, og Z-stakken kombineres med en tidsforskydning. Her, selv om en co-kultur eksperiment blev udført med MSCs og en explant, denne indstilling kunne anvendes til forskellige celletyper eller betingelser for fremtidige undersøgelser. For eksempel vil det hjælpe med at anvende denne protokol til at undersøge virkningerne af stoffer eller exosomer, der beskytter cochlea-skaden. Embryonale stamceller (ESC' er) eller inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) kan funktionelt og morfologisk regenerere til mekanosensitive hårcellelignende celler18. Derfor kan denne protokol anvendes til at studere differentieringen af iPSC'er eller ESC'er i auditive hårceller eller støtteceller. Denne ex vivo-metode kan hjælpe med regenerativ medicin til at genoprette hørelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskningsstipendier (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) fra National Research Foundation (NRF) i Korea og Hallym University Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L.
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
- Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
- Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
- Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
- Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
