Summary
Om een succesvolle en hoogwaardige ciliaire functionele analyse voor PCD-diagnose te garanderen, is een nauwkeurige en zorgvuldige methode voor respiratoire epitheelbemonstering en -verwerking essentieel. Om pcd-diagnostische service te blijven bieden tijdens de COVID-19-pandemie, is het ciliaire videomicroscopieprotocol bijgewerkt met passende infectiebeheersingsmaatregelen.
Abstract
Primaire ciliaire dyskinesie (PCD) is een genetische beweeglijke ciliopathie, die leidt tot significante otosinopulmonale ziekte. PCD-diagnose wordt vaak gemist of vertraagd vanwege uitdagingen met verschillende diagnostische modaliteiten. Ciliaire videomicroscopie, met behulp van Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), een van de diagnostische hulpmiddelen voor PCD, wordt beschouwd als de optimale methode om ciliaire functionele analyse (CFA) uit te voeren, bestaande uit ciliaire beatfrequentie (CBF) en beat pattern (CBP) analyse. DHSV mist echter een gestandaardiseerde, gepubliceerde operationele procedure voor het verwerken en analyseren van monsters. Het maakt ook gebruik van levend respiratoir epitheel, een belangrijk probleem met infectiebeheersing tijdens de COVID-19-pandemie. Om tijdens deze gezondheidscrisis een diagnostische dienst te blijven bieden, is het ciliaire videomicroscopieprotocol aangepast om adequate infectiebeheersingsmaatregelen op te nemen.
Hier beschrijven we een herzien protocol voor bemonstering en laboratoriumverwerking van trilhaarmonsters van trilhaar, met de nadruk op aanpassingen die zijn gemaakt om te voldoen aan COVID-19-infectiebeheersingsmaatregelen. Representatieve resultaten van CFA van neusborstelmonsters verkregen van 16 gezonde proefpersonen, verwerkt en geanalyseerd volgens dit protocol, worden beschreven. We illustreren ook het belang van het verkrijgen en verwerken van epitheliale trilhaarstroken van optimale kwaliteit, aangezien monsters die niet voldoen aan de kwaliteitsselectiecriteria nu CFA mogelijk maken, waardoor de diagnostische betrouwbaarheid en de efficiëntie van deze techniek mogelijk afnemen.
Introduction
Primaire ciliaire dyskinesie (PCD) is een erfelijke heterogene beweeglijke ciliopathie, waarbij respiratoire trilharen stationair, langzaam of dyskinetisch zijn, wat leidt tot een verminderde mucociliaire klaring en chronische oto-sino-pulmonale ziekte 1,2,3,4. De klinische manifestaties van PCD zijn chronische natte hoest en chronische verstopte neus vanaf de vroege zuigelingentijd, terugkerende of chronische infecties van de bovenste en onderste luchtwegen die leiden tot bronchiëctasieën en terugkerende of chronische otitis media en sinusitis 5,6,7. Ongeveer de helft van de PCD-patiënten vertoont lateraliteitsdefecten zoals situs inversus of situs ambiguus. Sommige patiënten presenteren zich ook met onvruchtbaarheidsproblemen als gevolg van imbiel sperma bij mannen en immotiale trilharen in de eileiders bij vrouwen 1,2,8. PCD is zeldzaam, maar de prevalentie is moeilijk te definiëren en varieert van 1:10.000 tot 1:20.000 9,10. De werkelijke prevalentie van PCD wordt echter hoger geacht te zijn als gevolg van moeilijkheden bij de diagnose en een gebrek aan klinisch vermoeden. Symptomen van PCD bootsen gemeenschappelijke respiratoire manifestaties van andere acute of chronische respiratoire aandoeningen na, en de diagnostische uitdagingen van het bevestigen van de diagnose zijn bekend, wat leidt tot ontoereikende behandeling en follow-up 2,5,9,11.
Ciliaire videomicroscopie, met behulp van Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), is een van de diagnostische hulpmiddelen voor PCD 4,8,12,13. DHSV wordt beschouwd als de optimale methode om ciliaire functionele analyse (CFA) uit te voeren, bestaande uit ciliaire beatfrequentie (CBF) en beatpatroon (CBP) analyse 2,14,15,16. DHSV maakt gebruik van levend respiratoir epitheel, meestal verkregen uit neusborstelen13.
Met het oog op de huidige COVID-19-uitbraak is bevestiging van een PCD-diagnose nu nog belangrijker, omdat er aanwijzingen zijn dat onderliggende luchtwegaandoeningen kunnen leiden tot slechtere resultaten na COVID-19-infectie17,18. Een veilige en efficiënte pcd-diagnostische dienst tijdens de huidige pandemie zal bevestigde PCD-patiënten ook in staat stellen om te profiteren van aanvullende beschermende maatregelen, vergeleken met de algemene bevolking19.
Overdracht van COVID-19 vindt voornamelijk plaats via druppelverspreiding20. Een hoog potentieel voor overdracht van asymptomatische (of minimaal symptomatische) patiënten wordt gesuggereerd door de hoge virale lading in neusmonster20. Bovendien, als virale deeltjes worden verneveld, blijven ze minstens 3 uur in de lucht21. Daarom worden respiratoire gezondheidswerkers blootgesteld aan een hoog reservoir van virale lading tijdens het uitvoeren van klinische zorg en het verzamelen van monsters voor diagnostische technieken22. Bovendien stelt manipulatie van levende ademhalingsmonsters de technicus bloot aan COVID-19-besmetting. Terwijl best-practice aanbevelingen voor ademhalingsartsen en KNO-chirurgen die voor COVID-19-patiënten zorgen, worden geïmplementeerd23, is er een gebrek aan aanbevelingen voor het uitvoeren van DHSV tijdens de COVID-19-pandemie.
Om een PCD-diagnostische dienst te kunnen blijven leveren en tegelijkertijd de veiligheid van de gezondheidswerker (het uitvoeren van monsterafname) en de technicus (het uitvoeren van monsterverwerking) te waarborgen, moest het ciliaire videomicroscopieprotocol tijdens de COVID-19-pandemie worden aangepast. De techniek van ciliaire videomicroscopie is momenteel beperkt tot onderzoeksdiensten en gespecialiseerde diagnostische centra, omdat CFA uitgebreide training en ervaring vereist. Bovendien is er momenteel een gebrek aan standaardisatie en nauwkeurige werkwijze voor het verwerken en analyseren van monsters met behulp van DHSV 4,13.
Het doel van dit artikel is om standaard operationele procedures voor DHSV te beschrijven, met bijzondere aandacht voor infectiebeheersingsmaatregelen en veiligheid bij het bemonsteren en verwerken van levend neusepitheel. Hierdoor kunnen hoogwaardige PCD-diagnose en -zorg doorgaan, ondanks de huidige COVID-19-uitbraak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De goedkeuring werd verkregen van de ethische commissie van het Luikse ziekenhuis en de universitaire dienst voor hygiëne en gezondheidsbescherming op het werk.
1. Bemonstering van respireir ciliated epitheel
- Zorg ervoor dat proefpersonen gedurende ten minste 4-6 weken vrij zijn van infectie en vrij zijn van nasale en geïnhaleerde medicatie, voordat ze worden bemonsterd.
- Bereid het supplement M199-preparaat: Supplement Cell Culture Medium 199 (M199) (500 ml) met antibiotische oplossing (5 ml streptomycine / penicilline (50 μg / ml)) en antischimmeloplossing (5 ml amfotericine B (2,5 μg / ml)).
- Bereid 2 (één voor elk neusgat) 15 ml conische buizen met deksels en vul elk van hen met 3 ml aangevulde M199.
- Bereid een bronchiale cytologieborstel voor (dikte: 2 mm en lengte: 11 mm). Knip het uiteinde van de draad af om ervoor te zorgen dat de borstel ongeveer 15 cm lang is (figuur 1A,B). Om de borstel vast te houden bij het uitvoeren van de neusborstel, gebruikt u een Weil-Blakesley neustang (figuur 1B).
- COVID-19 aanpassing: Vermijd het verwerken van een levend neusepitheelmonster met onbekende status voor COVID-19, test de patiënt op COVID-19 48 tot 72 uur vóór het neuspoetsen voor ciliaire videomicroscopie. Deze COVID-19 test bestaat uit polymerase kettingreactie van een nasofaryngeaal swab monster24,25. Aangezien de status van de patiënt voor COVID-19 op dit moment onbekend is, moeten arts en personeel voldoende worden beschermd23,26, inclusief FFP2-masker, handschoenen, gezichtsscherm of bril en waterbestendige jurk met lange mouwen. In geval van onbeschikbare, onmogelijke of twijfelachtige PCR-testen, maakte alle verwerking van neusborstelen in L2 bio-veiligheidslaboratorium. In het geval van een positieve COVID-19-status, stel pcd-diagnosetests uit en overweeg alternatieve benaderingen om de patiënt te beheren.
VOORZICHTIGHEID: Deze nasofaryngeale swabbemonstering voor COVID-19-testen kan secundaire ciliaire dyskinesie veroorzaken door het beschadigen van nasale respiratoire ciliaire epitheel27,28. Om dit te voorkomen, brengt u een dun wattenstaafje in de neusholte tot aan de nasopharynx onder rigide endoscopische controle, waardoor de turbinaten of het septum niet worden beschadigd. Het monster wordt vervolgens uit de nasopharynx genomen en verwijdert het wattenstaafje onder controle van de stijve endoscoop. Met adequate apparatuur kan een 0° rigide endoscopie eenvoudig worden uitgevoerd bij volwassenen en kinderen zonder trauma.
2. Het verkrijgen van respiratieve ciliated epitheelmonsters
COVID-19-aanpassing: Zelfs als de COVID-19-status van de patiënt negatief is, wordt de patiënt vanwege het vals-negatieve percentage gevraagd om tijdens de procedure een chirurgisch masker op zijn / haar mond te houden en worden handschoenen, FFP2-masker en gezichtsscherm gedragen door de arts.
- Voorbereiding neusborstelen
- Vraag de patiënt om zijn/haar neus te snuiten.
- Voer neusborstelen uit onder nasale endoscopie of geblindeerd. Als u een neusendoscopie gebruikt, onderzoek dan de 2 neusgaten voorafgaand aan het neusborstelen (herhaal niet als u 48-72 eerder hebt gedaan voor COVID-19 neusuitstrijkje). Onderzoek maakt het mogelijk om de toestand van het slijmvlies te verifiëren (een hoge mate van ontsteking kan bloedingen veroorzaken wanneer neusborstelen wordt uitgevoerd, ...), de toestand van inferieur turbinaat (om bijvoorbeeld de aanwezigheid van teleangiëctasieën uit te sluiten) en of het septum nasaal recht is (figuur 1C).
- Vraag de patiënt om te gaan liggen, of om comfortabel te zitten, het hoofd achterstevoren rustend op de stoel (omdat het neusborstelen een reflex veroorzaakt om het hoofd naar achteren te bewegen). Een tweede verzorger houdt het hoofd vast tijdens het neuspoetsen, vooral bij kinderen.
- Schud de borstel in de aangevulde M199 voorafgaand aan het neusborstelen (het bevochtigen van de borstel vermindert irritatie door het poetsen).
OPMERKING: De borstel kan worden bevochtigd in de aangevulde M199; Als de patiënt allergisch is voor antibiotica (penicilline en streptomycine zijn aanwezig in het aangevulde celkweekmedium), bevochtig de borstel dan in zoutoplossing.
- Neusborstelen
- Breng de neusborstel voorzichtig in zonder lokale of algemene anesthesie13. Als u nasale endoscopie gebruikt, plaatst u de endoscoop bij de ingang van de neus om het inferieure neusturbinaat te visualiseren en plaatst u vervolgens de cytologieborstel in de neus. Als u een "geblindeerde" neusborsteling uitvoert, steekt u de borstel in de neus en volgt u de neusbodem (figuur 1D).
OPMERKING: Sommige diagnostische centra gebruiken lokale anesthesie met een tampon van naphazoline om neusborstelen uit te voeren. - Beweeg de borstel posterieur en anterieur meerdere keren over het achterste deel van het inferieure neusturbinaat en trek je dan terug. De operator moet voelen dat de borstel over het epitheel wrijft en de patiënt kan eenzijdig waterig oog aan de zijkant van het poetsen voelen.
OPMERKING: Als het neusborstelen te anterieur wordt uitgevoerd, worden er geen trilhaarcellen verkregen, omdat de voorste neusholte is bekleed met een overgangsepitheel zonder trilhaar. - Plaats na de bemonstering onmiddellijk neusborstelmonsters in het kweekmedium. De verkregen respiratoire epitheelstrips worden losgemaakt door de borstel in de buis met de aangevulde M199 te roeren en vervolgens de buis te sluiten (figuur 1E).
- COVID-19 aanpassing: Maak epitheelstrips niet los door de borstel onmiddellijk na de bemonstering in de aangevulde M199 te roeren. Plaats de borstel in de buis, knip de draad door zodat deze volledig in de buis past en sluit de buis onmiddellijk. Doe het monster in een luchtdichte dubbele zak.
- Breng de neusborstel voorzichtig in zonder lokale of algemene anesthesie13. Als u nasale endoscopie gebruikt, plaatst u de endoscoop bij de ingang van de neus om het inferieure neusturbinaat te visualiseren en plaatst u vervolgens de cytologieborstel in de neus. Als u een "geblindeerde" neusborsteling uitvoert, steekt u de borstel in de neus en volgt u de neusbodem (figuur 1D).
Figuur 1: Neusborsteltechniek. (A) Volledige bronchiale cytologieborstel (B) Klaar om te borstelen: het borsteluiteinde van de draad wordt doorgesneden (ongeveer 15 cm lang) en vastgehouden door een Weil-Blakesley neustang(C) Endoscopisch beeld van de neusholte: septum (1) inferieur turbinaat (2) en middelste turbinaat (3) (D) Neusborstelen wordt uitgevoerd op het achterste deel van het inferieure turbinaat (2). Neustussenschot (1) Midden-turbinaat (3). (E) De respiratoire epitheelstrips worden losgemaakt door de borstel in het aangevulde M199-celkweekmedium te schudden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Verwerking van repiratoir trilhaarepitheel
- Analyseer neusborstelmonsters onder de microscoop binnen 9 uur na de bemonstering, omdat zowel CBF als CBP stabiel zijn binnen dit tijdsbestek (ongepubliceerde gegevens).
- Gebruik een rechtopstaande of een omgekeerd lichtmicroscoop, met een x100 olie-immersie fase-contrast of een interferentie contrast lens. Plaats de microscoop idealiter op een antitrillingstafel, omdat ciliaire kloppen onderhevig kan zijn aan artefacten als gevolg van externe trillingen (bijvoorbeeld van de laboratoriumbank)13.
COVID-19 aanpassing: De operator gebruikt persoonlijke beschermingsmiddelen om neusverwerking uit te voeren, waaronder een FFP2-masker, handschoenen en een waterbestendige jas met lange mouwen.
- Bereid de visualisatiekamer voor.
- Hang de trilhaarstrips op in een in het laboratorium gebouwde open visualisatiekamer, waardoor trilharen vrij kunnen kloppen terwijl ze onder de microscoop worden geanalyseerd. Deze kamer wordt gecreëerd door de scheiding van een afdekplaat (22 mm x 40 mm) en een glasplaat door twee aangrenzende vierkante afdekstroken (20 mm x 20 mm), gescheiden door een afstand van 15 mm, en gelijmd op de glasplaat12 (figuur 2, figuur 4A).
COVID-19 aanpassing: De hierboven beschreven in het laboratorium gebouwde kamer is open en maakt gas- en vochtuitwisseling tussen het monster en de omgeving mogelijk13. In het kader van de COVID-19-pandemie is het mogelijk om een gesloten visualisatiekamer te gebruiken met behulp van een dubbelzijdige vastzittende afstandhouder van 0,25 mm diepte (figuur 3, figuur 4B). De afstandhouder wordt op de glasplaat geplakt en vervolgens wordt een afdekplaat (22 mm x 40 mm) bovenop de afstandhouder geplakt.
Figuur 2: Montage van de in het lab gebouwde open kamer. (A) De 2 vierkante afdekplaten (20 mm x 20 mm) worden op de glasplaat geplaatst. (B) De vierkante afdekstroken worden gescheiden door een afstand van ongeveer 15 mm en op de glasplaat gelijmd. (C) De kamer wordt tussen de twee aangrenzende vierkante afdekstroken gevuld met een klein monster (ongeveer 60 μL) trilhaarepitheel in aangevuld M199. (D) Een lange rechthoekige dekplaat (22 mm x 40 mm) wordt op de twee aangrenzende vierkante afdekstroken geplaatst en bedekt de kamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Montage van de gesloten kamer met behulp van een dubbelzijdige vastzittende afstandhouder. (A) De glasschuif en de dubbelzijdige vastzittende afstandhouder. (B) De bescherming wordt aan één kant van de afstandhouder verwijderd en de afstandhouder wordt vervolgens op de glazen schuif geplakt. (C) De bescherming wordt verwijderd van de andere kant van de dubbelzijdig vastzittende afstandhouder en vervolgens wordt de afstandhouder gevuld met een klein monster (ongeveer 60 μL) trilhaarepitheel in aangevuld M199. (D) Een lange rechthoekige afdekplaat (22 mm x 40 mm) wordt op de afstandhouder geplakt en sluit de kamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schematisch diagram met de belangrijkste visualisatiekamers die worden gebruikt om ciliaire videomicroscopie uit te voeren met behulp van digitale hogesnelheidsvideomicroscopie (DHSV). A) De techniek van de open hangende val: het trilhaarmonster wordt gesuspendeerd in een druppel celkweekmedium in een open kamer die ontstaat door de scheiding van een dekplaat en een glasplaat door twee aangrenzende dekplaten. B) De techniek van de gesloten hangende druppel: het trilhaarmonster wordt gesuspendeerd in een druppel celkweekmedium in een gesloten kamer die wordt gecreëerd door een afstandhouder die is ingeklemd tussen een glazen zijde en een afdekslip. De afstandhouder plakt stevig op zowel de glasplaat als de afdekslip. Gereproduceerd en gemodificeerd uit Kempeneers et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Controle van de temperatuur
- Omring de microscoop met noppenfolie (figuur 5A,B).
- Bevestig de lensverwarming rond het objectief met behulp van een klittenbandband (figuur 5C)
- Schakel de lensverwarmingsregelaar 1 uur voordat u de temperatuurcontrole uitvoert in.
- Zet de microscoop aan en controleer of de microscoopopstelling is voltooid, omdat de hoeveelheid licht door het monster de temperatuur op de dia kan veranderen.
- Schakel de verwarmde boxcontroller in (figuur 5D).
- Controleer of de referentiesonde goed functioneert voordat u begint. Houd de punt van de referentiesonde tussen de vingers; Het moet de lichaamstemperatuur meten.
- Plaats vrije media in het midden van de dia, tussen de twee aangrenzende vierkante afdekstroken (20 mm x 20 mm) die erop zijn gelijmd.
- Plaats de punt van de referentiesonde in de aangevulde M199. Deksel met een rechthoekige afdekplaat (22 mm x 40 mm). Zorg ervoor dat de sonde volledig is omgeven door media (anders kan de temperatuur dalen).
- COVID-19 aanpassing: Om de temperatuurregeling in de gesloten kamer uit te voeren met behulp van een afstandhouder, snijdt u één kant van de afstandhouder (dit gat moet dezelfde grootte hebben als de referentiesonde). Plak de afstandhouder op de glazen dia, plaats vrije media in het midden van de afstandhouder. Plaats de punt van de referentiesonde in de oplossing, door het gat van de afstandhouder, en plak vervolgens een rechthoekige afdekplaat (22 mm x 40 mm) op de afstandhouder.
- Plaats de dia in de plaat van de verwarmde doos. Sluit de verwarmde doos met het deksel.
- Voeg olie toe aan het olie-onderdompelingsobject.
- Plaats de verwarmde doos op het microscooppodium.
- Pas de temperatuur van de plaat en het deksel aan (de temperatuur van het deksel moet 2 °C hoger zijn dan de temperatuur van de plaat om condensatie te voorkomen) om 37 °C te meten met de referentiesonde in het medium.
- Wacht 5 minuten (tijd nodig om de temperatuur van het monster te verhogen tot 37 °C).
- Pas het objectief aan en beweeg het dichter bij de dia totdat u de coverslip met de punt van de lens aanraakt.
- Beweeg het objectief om het midden van de sonde in de microscoop te zien.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de sonde op het computerscherm te zien is (om te controleren of het camerasysteem werkt voordat u naar het trilhaarmonster kijkt). Bij het bekijken van het midden van de sonde is het scherm volledig zwart. - Pas de temperatuur van de lensverwarmer aan (om het temperatuurverlies te compenseren wanneer de olie-dompellens in contact komt met de coverslip). Zorg ervoor dat u 37 °C meet met de referentiesonde in het medium wanneer het objectief de afdeklaag raakt.
OPMERKING: Werk idealiter in een ruimte met een gecontroleerde temperatuur, zodat deze ingestelde temperaturen niet veranderen. Als de temperatuur van de kamer niet wordt gecontroleerd, moet u deze temperatuurcontrolecontrole elke dag uitvoeren voordat u ciliaire videomicroscopie uitvoert. - Nadat u de temperatuur hebt gecontroleerd, verwijdert u de dia uit de verwarmde doos.
- Maak de dia en de punt van de referentiesonde schoon met alcohol en leg ze weg.
- Reinig de lens met isopropanol en lensreinigingsdoekjes met cirkelvormige bewegingen.
Figuur 5: Apparatuur gebruikt in het DHSV-laboratorium. (A) De microscoop uitgerust met een 100x olie-onderdompeling fase-contrast lens, wordt geplaatst op een anti-vibratie tafel om te voorkomen dat externe trillingen artefacten veroorzaken voor ciliaire functionele analyse (B) De microscoop is omgeven door noppenfolie om warmteverlies uit de omgevingslucht te voorkomen. (C) Het olie-onderdompelingsdoel creëert warmteverlies. Dit kan worden voorkomen met behulp van een lensverwarming (pijlen). D) Het monster wordt verwarmd met behulp van een verwarmingskast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Bereiding van de respiratieve triliated epitheliale monsters
- Schud de buis voorzichtig om trilharen door de buis te laten verspreiden (om te voorkomen dat trilharen vastzitten op andere trilhaarstrips, slijm of vuil, waardoor ze niet vrij kunnen kloppen).
OPMERKING: Deze stap is essentieel om "optimale randen" van trilhaarepitheel te verkrijgen (figuur 12). - Trek ongeveer 50 μL trilhaarepitheel op in aangevuld M199 in het midden van de buis met een pipet.
- Plaats het monster op de in het laboratorium gebouwde kamer (tussen de twee aangrenzende vierkante afdekstroken (20 mm x 20 mm)) en dek af met een rechthoekige afdekplaat (22 mm x 40 mm). Pas op dat u geen bubbels toevoegt.
- COVID-19 aanpassing: Voer de stappen 4.1-4.3 uit in een microbiologische veiligheidskast. Procedure in de microbiologische veiligheidskast.
- Schakel de microbiologische veiligheidskast 10 minuten voor het bereiden van het monster in (om ervoor te zorgen dat de omgeving steriel is).
- Desinfecteer voor elke hantering de hele microbiologische veiligheidskast met 70% ethanol.
- Desinfecteer al het benodigde materiaal met 70% ethanol voordat u het in de microbiologische veiligheidskast plaatst.
- Open de 15 ml conische buisjes met de monsters slechts eenmaal onder de microbiologische veiligheidskast en maak vervolgens epitheelstrips los door de borstel (met behulp van Weil-Blakesley neustang) in aangevulde M199 te roeren.
- Plak de afstandhouder op de glasplaat en verwijder de bescherming van de dubbelzijdig vastzittende afstandhouder.
- Schud de buis voorzichtig om de trilharen door de buis te laten verspreiden.
- Trek een klein monster trilhaarepitheel in aangevuld M199 uit het midden van de buis met een pipet (ongeveer 60 μL) en vul de afstandhouder.
- Plak de rechthoekige afdekplaat (22 mm x 40 mm) op de afstandhouder om de kamer te sluiten.
- Desinfecteer de glijbaan voordat u uit de microbiologische veiligheidskast stapt.
- Verwijder het glaasje uit de microbiologische veiligheidskast.
- Vervang handschoenen bij het verlaten van de microbiologische veiligheidskast.
- Wacht 10 minuten voordat u de microbiologische veiligheidskast na gebruik uitschakelt (om ervoor te zorgen dat de omgeving van de microbiologische veiligheidskast steriel is voordat u de deur sluit).
- Plaats de dia in de plaat van de verwarmde doos. Sluit de verwarmde doos met het deksel.
- Voeg olie toe aan het olie-onderdompelingsobject.
- Plaats de verwarmde doos op het podium van de microscoop.
- Zet de verwarmde box en de lensverwarming aan.
OPMERKING: De lensverwarming moet 1 uur voor gebruik worden ingeschakeld. - Pas de temperatuurinstellingen van de verwarmde box en de lensverwarmingsregelaars aan volgens de waarden die zijn verkregen bij stap 3.4.
- Wacht 5 minuten (tijd die nodig is om de temperatuur van het monster tot 37 °C te verhogen bij gebruik van vooraf bepaalde instellingen voor zowel de verwarmde doos als de objectiefverwarming).
- Benader het objectief naar de dia totdat u de coverslip aanraakt met de punt van de lens.
5. Visualiseren van ademhalingsranden
- Bevestig de high-speed videocamera op de microscoop, sluit de camera aan op de computer en schakel de camera in.
- Schakel de computer in.
- Sluit de digitale high speed videomicroscopie camera aan op de computer (zodat het beeld bekeken door de oculaire lenzen wordt geprojecteerd op de monitor) via de software.
- Open de software en vervolgens wordt het hoofdmenu automatisch geopend (afbeelding 6A).
OPMERKING: De software is het programma dat in het laboratorium wordt gebruikt voor beeldacquisitie en -verwerking. Het systeem maakt het mogelijk om videosequenties op te nemen en af te spelen met een lagere framesnelheid of frame voor frame. Het kan gratis worden gedownload. - Open camera (figuur 6A).
- Wanneer het camera-inventarisatiefilter wordt weergegeven, kiest u OK (afbeelding 6B).
- Selecteer Lijst vernieuwen; selecteer de naam van de camera; kies de interface Interface: Expert en selecteer vervolgens Openen (afbeelding 6C).
- Selecteer op de bedieningsregel van de camera boven aan het gekoppelde dialoogvenster Live (Figuur 6D).
- Kies Afspelen om de afbeelding te bekijken en Stoppen om het bekijken te voltooien (Afbeelding 6D).
- Open de software en vervolgens wordt het hoofdmenu automatisch geopend (afbeelding 6A).
Figuur 6: Beschrijving van het gebruik van de software: visualisatie van ademhalingsranden op de monitor. (A) Het hoofdmenu verschijnt direct bij het openen van de software. (b) Sluit het camera-inventarisatiefilter. (C) Kies de camera en selecteer Interface: Expert. (D) De live-modus maakt het mogelijk om op de monitor het beeld te visualiseren dat door de microscoop wordt gezien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Pas de instelling voor camera-acquisitie aan (in de rechterbovenhoek) (afbeelding 7).
- Kies bij Acquisitie-instellingen de optie Camera en pas vervolgens de framesnelheid aan: Snelheid (Hz): 500 (zie hieronder) (Figuur 7A).
- Kies bij Acquisitie-instellingen de optie Camera en pas vervolgens de interesseregio (ROI) aan (afbeelding 7A).
OPMERKING: De ROI wordt berekend met behulp van een schaalverdeling die wordt bekeken met het x100-oliedompelobjectief en op de monitor wordt geprojecteerd om het aantal pixels te definiëren dat overeenkomt met 50 μm (omdat u trilhaarranden van ongeveer 50 μm wilt opnemen (zie hieronder)). - Kies bij Acquisitie-instellingen de optie Opnemen en pas vervolgens de duur van de video en het totale aantal opgenomen frames aan (een duur van 2 seconden, komt overeen met 1000 frames als de gekozen framesnelheid 5OO Hz is) (Figuur 7B).
OPMERKING: In onze ervaring is een videolengte van minimaal 2 seconden nodig om een volledige analyse van zowel CBF als CBP mogelijk te maken. - Kies Bestand en vervolgens Camera Cfg opslaan om de nieuwe acquisitie-instelling op te slaan (voer een naam in en indien nodig een opmerking voor deze nieuwe configuratie) (Figuur 7C,D).
- Als u deze nieuwe cameraconfiguratie wilt openen, opent u File and Load Camera Cfg (Afbeelding 7C).
Figuur 7: Beschrijving van het gebruik van de software: aanpassing van de camera-acquisitie-instellingen voor video-opname van de kloppende trilranden. (A) Pas op de acquisitie-instelling Camera de interesseregio (ROI) en framesnelheid voor video-opname (Rate) aan. (B) Pas in de acquisitie-instelling Record de duur van de video-opname aan (aantal frames dat nodig is voor de gekozen opnameduur, afhankelijk van de eerder gekozen framesnelheid). (C) Deze nieuwe cameraconfiguratie-instellingen kunnen worden opgeslagen met behulp van de functie Camera Cfg opslaan . Load Camera Cfg maakt het mogelijk om de opgeslagen configuratie-instellingen opnieuw te openen voor verder gebruik. (D) De nieuwe cameraconfiguratie-instellingen kunnen een naam krijgen en indien nodig kan een opmerking worden toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bekijk door oculaire lenzen en zoek naar cellen of puin in het monster en stel vervolgens scherp.
- Controleer of het beeld zichtbaar is op de monitor en verbeter de kwaliteit van het beeld door de condensor (en het DIC-prisma bij gebruik van een interferentiecontrastlens) aan te passen en pas indien nodig de scherpstelling aan.
- Zoek naar stroken trilhaarepitheel.
6. Selectie van ademhalingsranden
OPMERKING: Het experimentele systeem maakt het mogelijk om kloppende trilharen in drie verschillende vlakken te bekijken: een zijwaarts profiel, direct naar de waarnemer toeslaand, en van direct boven (figuur 8).
Figuur 8: Met de DHSV-techniek kunnen kloppende trilharen in drie verschillende vlakken worden bekeken. A) in het zijwaartse profiel. (B) rechtstreeks op de waarnemer afslaan en (C) van direct bovenaf. Gereproduceerd uit Kempeneers et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Noteer alleen intacte ongestoorde trilhaarranden die ten minste 50 μm lang zijn.
- Bepaal voor records gemaakt op het zijwaartse profiel de kwaliteit van de rand volgens het scoresysteem van Thomas et al.29 (figuur 9). Gebruik alleen normale randen (figuur 9A) of randen met kleine projecties (figuur 9B) voor ciliaire functionele analyse. Geïsoleerde cellen uitsluiten (figuur 9E).
Figuur 9: Representatief beeld van het scoresysteem door Thomas et al29 voor de verschillende kwaliteit van trilhaarepitheelranden. (A) Normale rand: gedefinieerd als een intacte uniforme trilhaarstrip met een lengte > 50 μm (B) Ciliated edge with minor stuions: gedefinieerd als een rand >50 μm lang, met cellen die uit de epitheliale randlijn steken, maar zonder punt van het apicale celmembraan dat boven de uiteinden van de trilharen op de aangrenzende cellen uitsteekt (C) Ciliated edge with major projections: gedefinieerd als een rand >50 μm lang, met cellen die uit de epitheliale randlijn steken, waarbij ten minste één punt van het apicale celmembraan boven de uiteinden van de trilharen op de aangrenzende cellen uitsteekt (D) Geïsoleerde trilhaarcel: gedefinieerd als de enige trilhaarcel op een epitheelrand >50 μm lang (E) Enkele cellen: gedefinieerd als trilhaarcellen die geen contact hebben tussen zichzelf of een ander celtype. Schaalbalk: 5,5 μm. Gereproduceerd uit Thomas et al.29Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voer CFA uit met alleen trilharen die vrij zijn van slijm en vuil en klop in het profiel dat is gekozen voor de opgenomen rand. Selecteer alleen trilhaarranden die een minimum van 2 CBF- en CBP-evaluaties (zie hieronder) langs de rand mogelijk maken.
- Gebruik voor CFA alleen monsters die minimaal 6 randen opleveren die in het zijwaartse profiel kloppen en aan de bovenstaande criteria voldoen; Analyseer maximaal 20 randen in het zijwaartse profiel.
- Gebruik minimaal 1 extra rand trilharen die van boven het waarnemersprofiel kloppen om het CBP te karakteriseren.
7. Opname trilhaarrand
- Neem de kloppende trilharen op met een cameraframesnelheid van 500 frames per seconde en projecteer deze op een monitor met hoge resolutie. Een minimale framesnelheid van 400 Hz is vereist om de analyse van zowel CBF als CBP13 mogelijk te maken. Neem één rand op met een framesnelheid van 30 frames per seconde om de efficiëntie van de deeltjesklaring te evalueren.
- Selecteer Live op de bedieningslijn van de camera boven aan het gekoppelde dialoogvenstermenu (Afbeelding 6D)
- Kies Afspelen om de afbeelding te bekijken en Stoppen om de weergave te voltooien (Afbeelding 6D)
- Als u een rand wilt opnemen, drukt u op Record (Figuur 6D). Als u de opname wilt bekijken voordat u deze opslaat, gaat u naar de bedieningslijn van de camera boven aan het gekoppelde dialoogvenster en selecteert u Afspelen. Kies Afspelen om de opgenomen video te bekijken en Stoppen om het bekijken te voltooien (Afbeelding 10A).
OPMERKING: Stop met het bekijken van de opgenomen rand voordat u deze opslaat.
Figuur 10: Beschrijving van het gebruik van de software. (A) afspeelmodus. Als u een opgenomen videoreeks van kloppende trilharige rand wilt bekijken, kiest u de afspeelmodus. Kies Afspelen om de afbeelding weer te geven en Stoppen om de weergave te voltooien. Het roempercentage kan worden aangepast om de analyse van de ciliaire functie te verbeteren (B, C) De video-opnamen van kloppende trilhaarranden opslaan (B) Als u de video wilt opslaan, kiest u Bestand en vervolgens Acquisities opslaan. (C) Voer de naam van de opgenomen video in en kies de plaats waar de video is opgenomen. Zorg ervoor dat de opname is opgeslagen als een . RAW-bestand (D) keuze van een opname van kloppende trilharen die moeten worden geanalyseerd: Als u een video-opname wilt openen, kiest u Bestand, vervolgens Openen en vervolgens Afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Sla de video op in de database (Figuur 10B,C).
- Open Bestand in de linkerbovenhoek en sla acquisities op (afbeelding 10B).
- Voer bij Acquisities opslaan de naam van de opgenomen video in en zorg ervoor dat de opname is opgeslagen als een RAW-bestandstype-indeling (afbeelding 10C).
- Wanneer de video is opgeslagen, keert u terug naar de live-modus (ga terug naar de camerabedieningslijn bovenaan het gekoppelde dialoogvenstermenu en selecteer live) (Figuur 6D).
- Herhaal de procedure om het aantal randen vast te leggen dat voldoet aan de selectiecriteria die vereist zijn voor CFA.
OPMERKING: Het is mogelijk om meerdere kloppende trilhaarranden die voldoen aan de selectiecriteria van één dia op te nemen, binnen maximaal 20 minuten na de voorbereiding van de dia (om uitdroging te voorkomen). Als het na 20 minuten niet mogelijk is om voldoende randen te krijgen die aan de selectiecriteria voldoen, bereidt u een nieuwe dia voor. - Verwijder de dia uit de verwarmde doos.
- Verwijder de rechthoekige afdekplaat en gooi deze in de specifieke container voor gevaarlijk medisch afval.
- Reinig de dia (met de twee vierkante afdekstroken erop gelijmd) met 70% ethanol en absorberend papier. Zodra de glijbaan schoon is, kan deze opnieuw worden gebruikt.
- COVID-19 aanpassing: Plaats de glijbaan met de coverslip en spacer in een luchtdichte zak, verwijder handschoenen en masker en plaats ze in de luchtdichte zak. Plaats de luchtdichte zak in de specifieke container voor gevaarlijk medisch afval.
8. Ciliaire functionele analyse
- Voorbereidende voorbereiding voor het uitvoeren van de handmatige CBF- en CBP-evaluatie
- Open de software.
- Open Bestand in de linkerbovenhoek, vervolgens Openen en vervolgens Afbeeldingen (Afbeelding 10D).
- Kies de video die u wilt analyseren.
- Ga naar de bedieningslijn van de camera boven aan het gekoppelde dialoogvenstermenu en selecteer Afspelen (Afbeelding 10A). Kies Afspelen om de opgenomen video te bekijken en Stop om het bekijken te voltooien.
- Handmatige ciliaire beat frequentie (CBF) analyse
- Voer de evaluatie van CBF alleen uit met behulp van de zijwaartse randen.
- Verdeel de trilhaarranden in ongeveer 5 aangrenzende gebieden, die elk ongeveer 10 μm meten (figuur 11).
- Identificeer en visualiseer trilharen of groepen trilharen met een lagere framesnelheid en er worden maximaal 2 CBF-metingen uitgevoerd in elk gebied, wat resulteert in maximaal 10 CBF-metingen langs elke rand (figuur 11).
- Noteer het aantal frames dat nodig is voor een groep trilharen om 5 slagcycli te voltooien.
- Converteer naar CBF door een eenvoudige berekening: (CBF= opname frame rate (Hz)/(aantal frames voor 5 beats) x 5)13,16,30. Immotiale trilharen hebben naar verluidt een CBF van 0 Hz13.
OPMERKING: Pas de framesnelheid aan bij het afspelen van de opgenomen video's (figuur 10A). Dit is vooral handig wanneer de geanalyseerde trilharen heel langzaam kloppen. Het verhogen van de framesnelheid helpt om te bepalen of de trilharen heel langzaam kloppen of onimmotief zijn. - Bereken voor elk monster het gemiddelde CBF als het gemiddelde (SD) of (95% BI) van alle CBF die in het zijwaartse profiel zijn geregistreerd, inclusief statische trilharen.
Figuur 11: Representatief beeld van een optimale kwaliteitsrand, en de indeling in 5 gebieden om CFA-analyse mogelijk te maken. Een optimale kwaliteit trilhaarrand is gefragmenteerd in 5 aangrenzende gebieden van elk 10 μm. In elk gebied worden maximaal 2 CBF-metingen (en 2 CBP-evaluaties) uitgevoerd, wat resulteert in maximaal 10 CBF-metingen (en CBP-evaluaties) langs elke rand. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Handmatige ciliaire beat pattern (CBP) analyse
- Om de markers van dyskinesie te evalueren, gebruikt u alleen het zijwaartse profiel; gebruik de vlakken naar de waarnemer en van bovenaf om het type CBP13 te karakteriseren. Er bestaan verschillende methoden en scores voor CBP-evaluatie. Hieronder wordt de methode beschreven die in het laboratorium wordt gebruikt met de definitie van de markers van dyskinesie.
- Het percentage van elk afzonderlijk CBP binnen de steekproef
- Voer voor elke trilharen of groep trilharen die worden geïdentificeerd en gebruikt voor een CBF-meting (figuur 11) een CBP-analyse uit met een lagere framesnelheid: vergelijk het precieze pad dat de trilharen tijdens een volledige beatcyclus hebben afgelegd met het normale CBP dat is waargenomen op de DHSV-analyse12,30.
- Schrijf een afzonderlijke CBP (normaal, immotiel, stijf, cirkelvormig, asynchroon (ongecoördineerd ciliair kloppen) of dyskinetisch13) toe aan elke geanalyseerde trilharen of groep trilharen.
- Bereken voor elk monster het percentage van elk afzonderlijk CBP in de steekproef; het CBP dat aan de steekproef wordt toegeschreven, is het overheersende CBP dat is waargenomen.
- Bereken de 3 markers van dyskinesie.
- Bereken de immotiliteitsindex (IMI): het percentage immotiale trilharen in de steekproef (aantal CBF=0/totaal aantal CBF-metingen in de steekproef X 100). Druk de IMI uit als gemiddelde (SD) of (95% BI)1,16,31.
- Bereken de dyskinesiescore (DKS). Verdeel elke trilhaarrand in kwadranten en het aantal kwadranten met dyskinetische (of abnormaal kloppende) trilharen wordt bepaald. Hiermee kan een DKS tussen 0 en 4 worden berekend (0: normaal CBP over de hele rand; 1: abnormaal CBP in ≤ 25% van de trilharen; 2: abnormaal CBP in ≤ 50% van de trilharen; 3: abnormaal ritmepatroon in ≤ 75% van de trilharen; en 4: abnormaal CBP in alle trilharen). De mediane DKS (interkwartielbereik) wordt berekend voor het monster16,29.
- Bereken het percentage normale kloppen: gedefinieerd als het percentage trilharen met een normaal CBP in de steekproef (aantal normale CBP-metingen/totaal aantal CBP-metingen voor het monster x100).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de efficiëntie van de techniek te illustreren, presenteren we de resultaten van de CFA in een reeks van 16 gezonde volwassen vrijwilligers (5 mannen, leeftijdscategorie 22-54 jaar).
Neusborstelmonsters van 14 (4 mannen, leeftijdscategorie 24-54 jaar) van de in totaal 16 vrijwilligers leverden voldoende geschikte epitheliale randen op die voldeden aan de selectiecriteria die nodig zijn om CFA uit te voeren. Van deze 14 neusborstelmonsters werden in totaal 242 trilhaarranden geregistreerd en 212 randen voldeden aan de gedefinieerde inclusiecriteria en werden geanalyseerd. Al deze randen werden vastgelegd in het zijwaartse profiel (trilharen die van boven de waarnemer sloegen, werden geregistreerd en geanalyseerd voor elke vrijwilliger om te beoordelen of een cirkelvormig CBP werd waargenomen13, maar deze randen werden niet opgenomen voor de CFA). In totaal werden 807 CBF-metingen en CBP-evaluatie verkregen uit de geanalyseerde trilharen of groepen trilharen (tabel 1). De gedetailleerde resultaten van CFA voor elke gezonde proefpersoon zijn weergegeven in tabel 1.
De gemiddelde CBF (± standaarddeviatie) voor de 14 proefpersonen van wie de monsters aan de inclusiecriteria voldeden, was 14,79 (± 2,17) Hz. Dit komt overeen met eerder gepubliceerde referentiegegevens in laboratoria die DHSV uitvoeren bij een gecontroleerde temperatuur van 37 °C 16,29,30, terwijl CBF-metingen in laboratoria die DHSV bij kamertemperatuur uitvoeren lager zijn15,32,33. Het gemiddelde (± standaarddeviatie) percentage van normale CBP voor de gezonde proefpersonen was 78,82 (± 14,73) %, en voor elk van deze gezonde proefpersonen was het overheersende ritmepatroon normaal. Bij de gezonde proefpersonen bleken geen trilhaartjes te kloppen in een cirkelvormig ritmepatroon, zoals eerder gemeld16,34.
De gemiddelde IMI (± standaardafwijking) was 2,27 (± 2,3) % en de mediane DSK (interkwartielbereik) was 0 (0-1). Deze waarden waren vergelijkbaar met eerdere publicatie over gezonde voluten16,29. Het is interessant op te merken dat de DSK en de CBF vergelijkbaar waren met de waarden die door Thomas et al. werden gerapporteerd uit de analyse die werd verkregen bij het selecteren van alleen normale randen of randen met kleine projectie (figuur 9), wat het belang weerspiegelt om alleen randen te analyseren die voldoen aan de inclusiecriteria29. Als ze randen van lage kwaliteit gebruikten, rapporteerden ze een lagere CBF en een hogere DKS29. Dit illustreert dat het gebruik van epitheliale randen die niet aan de selectiecriteria voldoen, ten onrechte kan leiden tot een PCD-diagnose.
Daarom moet, om te worden gebruikt als een PCD-diagnostisch hulpmiddel, CFA van neusborstelmonsters worden uitgevoerd met behulp van epitheliale strips van optimale kwaliteit (figuur 12A), verkregen door een optimale verwerking van neusborstelmonsters en een optimale randselectie. Zoals gemeld in het protocol, mogen alleen intacte ongestoorde trilhaarranden met een lengte van ten minste 50 μm worden gebruikt en moet CFA worden uitgevoerd met alleen trilharen die vrij zijn van slijm en puin. In het zijwaartse profiel moeten kloppende randen die minder dan 2 evaluaties van CBF en CBP mogelijk maken, worden uitgesloten.
Bovendien kunnen rode bloedcellen en slijm het kloppen van vrije trilharen blokkeren of trilharen verbergen voor de waarnemer (figuur 12B). De hoeveelheid slijm kan worden beperkt door de patiënt te vragen zijn / haar neus te snuiten voor het neusborstelen en om te voorkomen dat neusborstelen wordt uitgevoerd tijdens acute neusontsteking (ontsteking verhoogt de hoeveelheid slijm en het risico op bloedingen tijdens het poetsen van de neus). Bovendien moet neusborstelen zacht zijn om lichte bloedingen en dus de hoeveelheid rode bloedcellen te beperken. Maar aan de andere kant, als de borstel niet stevig tegen het inferieure neusturbinaat drukt, bevat het neusborstelmonster mogelijk niet genoeg hoogwaardige trilhaarepitheelstrips (figuur 12C, D).
Ten slotte, als het neusborstelen wordt uitgevoerd op het voorste deel van de neusholte, zullen er geen trilhaarcellen worden verkregen, omdat dit deel van de neus is bekleed met een overgangsepitheel zonder trilhaarzuur (figuur 12E). Daarom is de kwaliteit van het neusborstelmonster belangrijk om minimaal 6 randen trilharen op te leveren die in het zijwaartse profiel kloppen (en 1 rand van trilharen die van bovenaf kloppen) die voldoen aan de inclusiecriteria.
Van de 16 gezonde vrijwilligers werden 2 neusborstelmonsters uitgesloten voor CFA. Eén proefpersoon werd uitgesloten omdat de steekproef niet het vereiste aantal trilhaarranden kon leveren die aan de inclusiecriteria voldeden, met voornamelijk geïsoleerde cellen in de steekproef (figuur 12D). De tweede proefpersoon werd uitgesloten omdat alle geregistreerde epitheelranden (n = 7) niet-trilhaarvormig waren (figuur 12E), wat suggereert dat het neusborstelen te anterieur was en niet goed werd uitgevoerd op het inferieure turbinaat. Deze conclusie werd getrokken omdat de proefpersoon een gezonde vrijwilliger was. Herhaalde neusborstelmonsters die alleen niet-trilhaarranden opleveren bij een patiënt met een vermoeden van PCD, kunnen leiden tot een diagnose van een verminderde generatie van meervoudige beweeglijke trilharen (RGMC), een mucociliaire klaringsstoornis veroorzaakt door falen in ciliogenese 3,35,36.
Door de COVID-19-pandemie moest het diagnostisch centrum van de Universiteit van Luik het ciliaire videomicroscopieprotocol aanpassen. Vóór de pandemie gebruikten we een open visualisatiekamer die gas- en vochtigheidsuitwisseling tussen het monster en de omgeving mogelijk maakte. Omdat dit mogelijk zou kunnen leiden tot vervuiling van de operator en/of de omgeving, zijn we overgestapt op een gesloten visualisatiekamer en is de hermeticiteit van deze kamer voor gas en vloeistof getest. Figuur 13 toont de afdichtingstest van de gesloten visualisatiekamer met behulp van een dubbelzijdig vastzittende afstandhouder. De hermeticiteit werd getest door de kamer te vullen met 60 μL Trypan-blauw en lucht en vervolgens de kamer gedurende 4 uur onder te dompelen in water. Omdat we gedurende 4 uur geen Trypan-blauw lek of luchtbellen in het water hebben waargenomen, concludeerden we dat de kamer hermetisch was afgesloten voor zowel vloeistof als gas. Het gebruik van deze gesloten visualisatiekamer voor het uitvoeren van ciliaire videomicroscopie tijdens de pandemie is goedgekeurd door de Dienst Hygiëne en Gezondheidsbescherming op het Werk van de Universiteit van Luik.
| Gezonde vrijwilliger | Nee. van Edge opgenomen | Nee. van de geanalyseerde randen | Aantal CBF-metingen | CBF (Hz) (Gemiddelde ± SD) |
Normaal CBP (%) (Gemiddelde ± SD) |
IMI (%) (Gemiddelde ± SD) |
DSK Mediaan (Interkwartiel bereik) |
| 1 | 21 | 16 | 52 | 16,59 ± 3,83 | 82.7 | 0 | 0 (0-2) |
| 2 | 11 | 7 | 34 | 18,4 ± 5,32 | 97.1 | 0 | 0 (0-1) |
| 3 | 12 | 11 | 48 | 12.12 ± 1.87 | 91.7 | 0 | 0 (0-2) |
| 4 | 20 | 20 | 60 | 15.18 ± 3.29 | 86.7 | 1.67 | 0 (0-1) |
| 5 | 18 | 14 | 54 | 11,82 ± 3,97 | 87 | 3.7 | 0 (0-1) |
| 6 | 15 | 11 | 51 | 16.23 ± 5.5 | 76.5 | 5.9 | 1 (1-2) |
| 7 | 21 | 18 | 60 | 14.37 ± 4.12 | 68.3 | 3.3 | 1 (0-2) |
| 8 | 19 | 18 | 51 | 14.12 ± 4.79 | 74.5 | 5.9 | 1 (0-2) |
| 9 | 17 | 17 | 37 | 16,77 ± 4,74 | 89.2 | 0 | 0 (0-2) |
| 10 | 15 | 15 | 69 | 16.49 ± 4.44 | 75.4 | 2.9 | 1 (1-2) |
| 11 | 15 | 14 | 77 | 14.53 ± 2.42 | 81.8 | 0 | 0 (0-2) |
| 12 | 16 | 11 | 48 | 15.27 ± 2.38 | 81.3 | 0 | 0 (0-2) |
| 13 | 24 | 22 | 72 | 14,8 ± 4,07 | 86.1 | 4.17 | 0 (0-2) |
| 14 | 18 | 18 | 94 | 10,4 ± 3,43 | 79.8 | 4.26 | 1 (0-1) |
| Totaal: | 242 | 212 | 807 | 14.79 ± 2.17 | 82,72 ± 7,62 | 2,27 ± 2,3 | 0 (0-1) |
Tabel 1: Representatieve resultaten van het aantal geregistreerde en geanalyseerde randen, het aantal verkregen CBF-metingen en de waarden van CBF, percentage van normale CBP, IMI, DSK bij 14 gezonde proefpersonen, volgens dit protocol. CBF = ciliaire slagfrequentie, CBP = ciliair slagpatroon, IMI = immotiliteitsindex en DSK = dyskinesiescore.
Figuur 12: Figuur die de complexiteit van neusborstelen illustreert. (A) "Epitheelstrip van optimale kwaliteit": intacte uniforme trilhaarstrip > 50 μm lang, waardoor meer dan 2 trilharen of een groep trilharen kunnen worden gebruikt voor CBF- en CBP-evaluatie (d.w.z. trilharen die vrij in het zijwaartse profiel kloppen, zonder vast te zitten in slijm of puin). (B) Afbeelding van een grote hoeveelheid cellen en slijm die boven een trilhaarachtige epitheelstrook zijn geplakt, waardoor trilharen niet vrij kunnen kloppen en trilharen voor de waarnemer worden verborgen. (C) De kwaliteit van de opgenomen rand is onvoldoende, omdat het een rand is met grote projectie29. D) Enkele trilhaarcel, die niet kan worden gebruikt voor ciliaire functionele analyse. (E) De neusborsteling is uitgevoerd op het voorste deel van de neusholte, bekleed met een overgangsepitheel zonder trilhaar. Daarom werden geen trilhaarcellen verkregen. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 13: Afdichtingstest van afstandhouder met gas en Trypan Blue-oplossing. De hermeticiteit van spacer werd getest door de kamer te vullen met 60 μL trypan blauw en lucht en vervolgens de kamer gedurende 4 uur onder te dompelen in water. Omdat we gedurende de 4 uur geen trypan blue lek of luchtbellen in het water hebben waargenomen, concludeerden we dat de kamer hermetisch was voor zowel gas als vloeistof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel is bedoeld om een standaard operationele procedure voor CFA te bieden met behulp van neusborstelmonsters, met aanpassingen voor passende infectiebeheersingsoverwegingen tijdens de COVID-19-pandemie. PCD-diagnose is een uitdaging en vereist momenteel een panel van verschillende diagnostische tests, volgens internationale aanbeveling, waaronder nasale stikstofmonoxidemeting, CFA met behulp van DHSV, ciliaire ultrastructurele analyse met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), etikettering van ciliaire eiwitten met behulp van immunofluorescentie en genetische tests voor PCD-veroorzakende genen 4,37. Momenteel zal geen enkele test elke patiënt met PCD 4,37 diagnosticeren. Volgens de richtlijnen van de European Respiratory Society kunnen alleen kenmerkende ultrastructurele defecten door TEM en bi-allelische mutaties in PCD-veroorzakende genen een PCD-diagnose bevestigen. Helaas hebben deze tests een percentage van 15-30% van de fout-negatieve resultaten 4,37,38,39. DHSV heeft het voordeel dat het een hogere sensitiviteit en specificiteit heeft voor PCD-diagnose (respectievelijk 0,95-1,00 en 0,91-0,96) 31,38,40,41, maar recente internationale aanbevelingen verklaarden dat DHSV momenteel niet voldoende gestandaardiseerd is om een PCD-diagnose te bevestigen 4,37. Er is inderdaad een gebrek aan een nauwkeurige werkwijze voor de bereiding en verwerking van trilhaarmonsters, een gebrek aan gestandaardiseerde CFA-methode en normatieve functionele analysegegevens voor de interpretatie van ciliaire functie 4,8,13,16,34,38,40. Dit artikel stelt een protocol voor dat in het centrum wordt gebruikt voor het verkrijgen en verwerken van respiratoire ciliated epitheliale monsters en voor ciliaire functionele evaluatie. Omdat er momenteel geen internationale consensus is voor een DHSV-protocol, kunnen sommige stappen van het proces variëren tussen centra. Variatie in factoren zoals temperatuur tijdens ciliaire videomicroscopie, gebruikt medium en kwaliteit van geanalyseerde epitheelranden kunnen allemaal van invloed zijn op de ciliaire functie13.
Variatie in de temperatuuropstelling tijdens DHSV-analyse bestaat tussen centra, waarbij sommigen pleiten voor DHSV bij kamertemperatuur13. Wij pleiten voor monsteranalyse bij 37 °C. Dit verhoogt de complexiteit van de opstelling, maar een PCD-diagnose kan worden gemist als CBP-analyse wordt uitgevoerd onder 37 °C. Jackson et al. rapporteerden een temperatuurgevoelige variant van PCD, die zich presenteerde met een normaal gecoördineerd ritmepatroon wanneer trilharen werden waargenomen bij kamertemperatuur, maar een abnormaal hyperfrequent en dyskinetisch patroon bij 37 °C42. Verder is goed beschreven dat CBF varieert met de temperatuur, met een sigmoïdale relatie43,44, zodat CBF-referentiegegevens verschillen afhankelijk van de temperatuur die wordt gebruikt om DHSV uit te voeren.
Bovendien is er momenteel een gebrek aan standaardisatie in de handmatige en/of computerondersteunde methode voor CBF- en CBP-evaluatie13. In dit artikel stellen we de handmatige CBF- en CBP-evaluatietechniek voor die in ons laboratorium wordt gebruikt.
Omdat handmatige verwerking van DHSV-gegevens enige subjectiviteit met zich meebrengt en tijdrovend is, zijn er verschillende softwaretoepassingen ontwikkeld voor CBF- en CBP-beoordeling, met behulp van verschillende semi-geautomatiseerde (waarbij specifieke interessegebieden (ROIs) worden geselecteerd om te onderzoeken) of volledig geautomatiseerde programma's 34,45,46 (het analyseren van het volledige vastgelegde beeld). Alle programma's gebruiken de variatie in lichtintensiteit in de pixels van de opgenomen videobeelden in de loop van de tijd om CBF te berekenen. De meeste programma's omvatten echter de handmatige of geautomatiseerde uitsluiting van specifieke gegevens om ruis te verminderen: gebieden met stasis, gebieden waar CBF of ciliaire beat amplitude (CBA) onder de specifieke drempelwaarden vallen. Een vergelijking tussen de handmatige en geautomatiseerde CBF-evaluatie is slechts voor één programma45 gepubliceerd en toonde geen significant verschil (gepaarde t-test, p = 0,64). Recente resultaten bij 75 PCD-patiënten toonden geen significant verschil tussen CBF-evaluatie verkregen door Fast Fourier-transformatie (FFT) en kymografie47. Verschillende computerondersteunde software voor CBP-analyse zijn ontwikkeld 48,49,50, meestal met betrekking tot de evaluatie van CBP in beperkte ROIs, maar momenteel is er geen commercieel beschikbaar 48.
Voor zover wij weten, is dit de eerste gepubliceerde standaard operationele procedure voor CFA met behulp van DHSV. CFA met behulp van verse neusborstelmonsters heeft enkele beperkingen; de meeste daarvan kunnen worden overwonnen door een heranalyse van de ciliaire functie uit te voeren na het kweken van respiratoire ciliated cellen. Ten eerste kan infectie, ontsteking of schade tijdens de bemonstering leiden tot secundaire ciliaire functionele afwijkingen. De kweek van respiratoire ciliated cellen kan de nauwkeurigheid van DHSV verbeteren, met name om vals-positieve resultaten uit te sluiten27. Ten tweede, omdat PCD-patiënten zich presenteren met chronische luchtwegontsteking en infectie, kan het kweken van trilhaarepitheel nodig zijn, omdat het vinden van een gat van 4-6 weken zonder infectie om een neusborstelprocedure uit te voeren moeilijk kan zijn. Ten derde is de kwaliteit van het neusborstelmonster mogelijk niet voldoende om het vereiste aantal hoogwaardige randen te bieden, vooral bij jonge kinderen. Het kweken van de monsters kan helpen om dit probleem op te lossen. Ten slotte kan CFA moeilijk zijn als het monster veel celresten of een hoge belasting slijm bevat; dit kan ook worden opgelost als CFA wordt uitgevoerd na celkweek. Bovendien is uitgebreide personeelstraining in ervaren centra van cruciaal belang, omdat detectie van CBP-afwijkingen sterk afhankelijk blijft van de ervaring van de onderzoeker 4,13. De ontwikkeling en validatie van geautomatiseerde CBP-evaluatiesoftware zal deze gebruikersafhankelijke variabiliteit mogelijk verbeteren en het gebruik van DHSV voor PCD-diagnostische doeleinden verbreden.
De resultaten tonen ook het belang aan van de neusborsteltechniek om effectieve CFA mogelijk te maken. Zorgvuldige nasale borsteltechniek verhoogt het vermogen om epitheliale trilhaarstrips van optimale kwaliteit te verkrijgen. In het bijzonder beperkt het snuiten van de neus vóór de procedure het slijm, het uitvoeren van zacht borstelen vermindert rode bloedcellen en de juiste plaatsing van de borstel verhoogt het slagingspercentage van het verkrijgen van trilhaarepitheel, omdat het borstelen van het voorste deel van de neusholte niet-trilhaarepitheel terugbrengt.
Vanwege de COVID-19-pandemie hebben overwegingen met betrekking tot infectiebeheersing ertoe geleid dat we veel aspecten van de ciliaire videomicroscopieprotocollen hebben aangepast. Vóór de pandemie gebruikten we een open lab-gebouwde kamer. Voordelen van deze kamer zijn het gemak en de snelheid om voor te bereiden en te gebruiken, kosten en de mogelijkheid om opnieuw te gebruiken na reiniging. Er zijn echter enkele belangrijke kanttekeningen. De hoeveelheid medium is belangrijk: trilhaarstrips moeten goed gehydrateerd zijn om goed te kloppen, maar te veel media zullen uit de open kamer morsen en zich mengen met de olie, waardoor een goed beeld wordt voorkomen. Bovendien moeten de monsters binnen maximaal 20 minuten worden geobserveerd om uitdroging te voorkomen. Dit kan mogelijk worden ondervangen als extra M199-medium wordt toegevoegd met behulp van een spuit direct onder de dekslip. In de context van de COVID-19-pandemie is het grote probleem van de open kamer dat deze gas- en vochtigheidsuitwisseling tussen het preparaat en de omgeving mogelijk maakt13. Er is een potentieel risico op laboratorium- en operatorbesmetting als het monster is geïnfecteerd met COVID-19. We identificeerden een gesloten visualisatiekamer met behulp van een afstandhouder en toonden de effectiviteit ervan aan. We hebben het protocol aangepast, van neusborstelen tot diavoorbereiding en -analyse, om rekening te houden met strenge infectiebeheersingsmaatregelen die gericht zijn op het voorkomen van COVID-19-overdracht. Deze aanpassingen hebben ons in staat gesteld om een PCD-diagnostische service te blijven bieden, zonder gebruik te maken van een bioveilig laboratorium van niveau 2. Gezien de onzekere duur van deze huidige gezondheidscrisis en het belang van het blijven leveren van essentiële PCD-diagnostische diensten zoals DHSV, maken de aanpassingen die in dit artikel worden voorgesteld het mogelijk om CFA uit te voeren zonder gebruik te maken van L2 bioveiligheidslaboratoriummiddelen, verplicht voor andere essentiële activiteiten tijdens deze gezondheidscrisis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Deze auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier en alle teamleden van het PCD-diagnostisch centrum van Paris-Est bedanken voor hun beschikbaarheid en hartelijke ontvangst tijdens het bezoek aan hun PCD-diagnostisch centrum en de vele uitwisselingen. We bedanken ook Robert Hirst en alle teamleden van het PCD-centrum van Leicester voor hun welkom en tijd, advies en expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | FisherScientific | 352096 | 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid |
| Amphotericin B | LONZA | 17-836E | Antifungal solution |
| Blakesley-weil nasal forceps | NOVO SURGICAL | E7739-12 | Used to hold the brush to perform the nasal brushing |
| Bronchial cytology brush | CONMED | 129 | Used for nasal brushing |
| Cotton swab | NUOVA APTACA | 2150/SG | Used for COVID-19 testing |
| Digitial high-speed videomicroscopy camera | IDTeu Innovation in motion | CrashCam Mini 1510 | |
| Glass slide | ThermoScientific | 12372098 | Microscope slides used to create the visualization chamber |
| Heated Box | IBIDI cells in focus | 10918 | Used to heat the sample |
| Inverted Light microscope | Zeiss | AXIO Vert.A1 | |
| Lens Heater | TOKAI HIT | TPiE-LH | Used to heat the oil immersion lens |
| Medium 199 (M199), HEPES | TermoFisher Scientific | 12340030 | Cell Culture Medium |
| Motion Studio X64 | IDT Motion | version 2.14.01 | Software |
| Oil | FischerScientific, Carl Zeiss | 11825153 | |
| Rectangular cover slip | VWR | 631-0145 | Used to cover the visualization chamber |
| Spacer (Ispacer) 0.25 mm | Sunjinlab | IS203 | Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber |
| Square cover slip | VWR | 631-0122 | Used for the creation of lab-built open visualization chamber |
| Streptomycin/Penicillin | FisherScientific, Gibco | 11548876 | Antiobiotics solution |
References
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , Supplement 1 1-9 (2015).
- Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
- Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M.
- Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
- Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
- Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
- Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
- Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
- Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
- Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
- Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
- Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
- Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics - The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
- Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
- van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
- Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
- Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
- Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
- Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
- George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O'Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
- Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
- Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, Suppl 1 15 (2015).
- Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
- Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
- Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
- Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
- Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. a, Ammons, B. a, Wyatt, T. a All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, Pt 2 103-111 (2003).
- Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
- Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
- Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W.
- Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).
