Summary
此处描述了植物体内核苷酸/核苷酸定量的精确和可重复的方法。此方法采用 HPLC-MS/MS。
Abstract
核苷酸/核苷酸是核酸、糖体和酶、细胞信号分子和能量载体的构建基块，它们参与许多细胞活动。在这里，我们描述了一种快速可靠的方法，在植物核苷酸/核苷酸含量的绝对资格。简言之，用1mL的萃取缓冲液（甲醇、乙酮三酯和水的比例为2：2：1）提取了100毫克的均质植物材料。后来，样品被浓缩在冷冻干燥机中五次，然后注射到HPLC-MS/MS中。 核苷酸在多孔的石墨碳（PGC）柱上分离，核苷酸在C18柱上分离。每个核苷酸和核苷酸的质量转换都由质谱法监测。核苷酸和核苷酸的内容是根据其外部标准（ESTD）进行量化的。因此，使用这种方法，研究人员可以很容易地量化不同植物中的核苷酸/核苷酸。
Introduction
核苷酸/核苷酸是所有生物体中的核心代谢成分，核酸和许多凝血素（如烟酰胺腺苷二聚氰胺）的前体，在磷脂、甘油脂和多糖等大分子的合成中非常重要。从结构上讲，核苷酸包含一个核碱基，它可以是腺苷、瓜宁、尿素、细胞氨酸或胸腺素，以及糖莫伊蒂，它可以是核糖或脱氧核糖酶1，2。核苷酸有多达三个磷酸盐组结合到核苷酸3的糖雾的5碳位置。植物中核苷酸的新陈代谢对种子发芽和叶生长至关重要。为了更好地了解它们在植物发育中的生理作用，应建立体内不同核苷酸/核苷酸的绝对定量方法。
测量核苷酸/核苷酸的最常用方法之一采用高性能液相色谱 （HPLC） 和紫外可见 （UV-VIS） 探测器 4、7、8、9、10、11。2013年，使用HPLC，达恩克和维特量化了几种类型的核苷酸在阿拉伯多普西萨利亚纳7。与野生类植物相比，他们在瓜诺辛脱氨酶基因的T-DNA插入突变体中发现了增强的瓜诺辛含量。另一种丙酰胺核苷，环丙胺，也定量检测在植物使用这种方法，这导致鉴定一个真正的赛迪丁脱氨酶基因4。然而，基于紫外线探测器，这种方法不能轻易区分具有相似光谱和保留时间的核苷，例如瓜诺辛或异种氨酸。HPLC方法的检测极限相对较高，因此，它常用于测量体内核苷含量高，如青氨酸、尿氨酸、瓜诺辛等。
此外，气相色谱与质谱学（GC-MS）相结合，也可用于核苷测量。受益于它，哈克等。在A.thaliana12的种子中成功检测出尿素和尿酸，这是核苷代谢通路的下游代谢物。然而，GC通常用于分离挥发性化合物，但不适合热阴唇物质。因此，液相色谱与质谱学（LC-MS/MS）相结合可能是一种更合适、更准确的分析技术，用于内在识别、分离和定量核苷酸/核苷酸13、14。先前的几项研究报告说，HILIC列可用于核苷酸和核苷酸分离15，16和同位素标记的内部标准被用于化合物定量17。但是，这两个组件都相对昂贵，尤其是商业同位素标记标准。在这里，我们报告一种经济适用的LC-MS/MS方法，用于核苷酸/核苷酸测量。这种方法已经成功地用于不同核苷酸/核苷酸的量定量，包括ATP，N6-甲基-AMP，AMP，GMP，尿丁，青氨酸，和伪尿素1，5，6，18，在植物和德罗索菲拉。此外，我们在这里报告的方法也可以用于其他生物体。
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Protocol
1 植物生长和材料收集
- 确保 阿拉伯多普西斯 种子在70%乙醇中消毒10分钟，并在用半强度的穆拉希格和Skoog营养物质制备的阿加板上播种。
- 在 4 °C 的黑暗下孵育含有 阿拉伯多虫 种子的板，持续 48 小时，然后在 22 °C 和 8 h 20 °C 的 16 h 光下将其转移到受控生长室中， 55 微米-2 s-1 下。
- 收获100毫克2周幼苗（新鲜重量），并冷冻在液氮中，用于代谢物提取。
注意：研究人员应适当佩戴手套、防护眼镜和实验室外套，以避免材料收集过程中的人体组织污染。
2 核苷酸/核苷酸提取
- 在冷前搅拌机磨坊中使用 7-8 个钢珠将 100 毫克冷冻植物组织磨碎 5 分钟，频率为 60 Hz。
- 准备提取溶液，其中含有甲醇，乙酮三酯和水的比例为2：2：1。
- 用1mL的提取溶液补充同质化材料（包括大多数代谢物，但不包括蛋白质）。
- 在 4 °C 下，在 15 分钟内将由此产生的溶液以 12，000 x g 的速度离心。
- 将悬浮液的0.5 mL转移到新的1.5mL管中，并冻结在液氮中。
- 将冷冻样品蒸发在冷冻桶中，在 0.1 mL 中再喷出 5% 的甲基甲基三甲基和 95% 的水。
- 在 40，000 x g 下，在 4°C 下 10 分钟内将由此产生的溶液 （0.1 mL） 离心。 将超自然物装在小瓶中，用于 LC-MS/MS 测量。
3 LC-MS/MS 测量
- 通过在2升双离子水中溶解1.1克醋酸铵（移动A阶段），准备10m醋酸铵缓冲器。将pH到9.5调整10%的铵和醋酸。
- 准备2升超纯100%甲醇（移动阶段B1）进行核苷测量。此外，准备2升超纯100%乙酰胺（移动阶段B2）用于核苷酸测量。
- 将从步骤 2.7 中提取的每个样本的 0.02 mL 预处理代谢物注入带有二进制泵 （LC） 的 HPLC 系统，并配以三重四足质谱仪 （MS）。
注意：HPLC 系统采用 C18 列（50 x 4.6 mm，颗粒大小 5 μm; 在 25 °C）缓冲与移动阶段 A 和 B1 （图 1A）为核苷分离，并使用多孔图形碳 （PGC） 列 （50 x 4.6 毫米， 粒子大小 5 μm; 工作在 25 °C） 与移动阶段 A 和 B2 （图 1B）为核苷酸分离.每个样本被注射三次用于技术复制。 - 为 C18 列的表 1 中显示的方法以及 PGC 列 表 2 中显示的方法进行编程。设定0.65 mLmin-1的流量。
注：质量转换（表3）由质谱仪监测。包含规范核苷酸和改性核苷酸的8个核苷酸和5个核苷酸的质量谱分析条件列在 表3中。 - 记录每个目标化合物的峰值区域（图 1）。
4 代标准校准曲线
- 将六个样本萃取汇集在一起，这些样本是按照第 2 节的描述产生的，并漩涡。然后，再次引用它到六个提取（相同的音量），以获得每个背景。
- 分别在这六个提取物中加入六种不同浓度的每个标准，并在步骤 3.3 之后逐一注入。
- 通过步骤 3.4 和 3.5 中描述的质量转换，以不同浓度记录每个标准的峰值区域。
- 绘制峰值区域与每个标准的名义浓度，以生成六点曲线。
注：步骤 3.5 中记录的核苷酸/核苷酸的峰值区域应落在标准校准曲线范围内。 - 计算每个标准化合物的直线方程：Y =aX + b
5 代谢物的定量
- 使用步骤 3.5 记录的峰值区域和步骤 4.5 中的方程计算代谢物的内容。
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Representative Results
在这里，我们展示了N1-甲基叶氨酸的识别和定量，一种已知的改性核苷，在2周大的阿拉伯多 普西斯 野生类型（Col-0）幼苗为例。质谱剖面图表明，N1-甲基甲基诺辛标准产生的产品离子为150m/z和133m/z（图2A），在Coll-0提取（图2B）中也观察到相同的轮廓。由于产品离子的丰度高达150米/z，因此选择282.1至150（m/z）的质量过渡进行N1-甲基叶氨酸定量。此外，目标峰值（图3B）的保留时间（RT）为7.05分钟，与N1-甲基甲基诺辛标准（图3A）的RT相同。考虑到上述数据，我们证明野生型幼苗包含在体内N1-甲基甲基诺辛池中。
在分别按照步骤4.1 和 4.2（图 4A） 之后产生的六个样本提取中，添加了 N 1 - 甲基叶氨酸标准（0、1、2.5、5、10 和50ng/ mL）的浓度系列。每个标准样品的0.02毫升被注射到LC-MS/MS中，并根据N1-甲基亚甲基二甲酸素的名义浓度绘制了增加的N1-甲基甲基甲酸素峰值区域。直线的方程为 Y = 0.0004X - 0.163 （图 4B）。
提取了三株 Col-0 幼苗的复制品，并按上述情况进行了预处理。这三个样本中N1-甲基叶氨酸的峰值区域记录为8，659、12，147和12，711。考虑到提取过程中的五倍浓缩（见步骤 2.5 和 2.6），并使用方程 Y = 0.0004X - 0.163，N1- 甲基甲基诺辛浓度分别在三个野生类型行中计算为 0.66、0.94 和 0.98 ng/mL。因此，每个野生类型的幼苗100毫克用于提取和在1mL提取缓冲器中再补种。因此，8.6±1.7 ng的N1-甲基亚地氨酸被量化在1克的2周大的 阿拉伯 野生型幼苗。
| 时间 | 流速 （mL 最小-1） | 移动阶段 A （%） | 移动阶段 B （甲醇%） |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
表1：C18列的方法。 C18 列均衡溶剂变化的示意图表示。移动阶段 A = 10 mM 醋酸铵，pH 9.5。移动阶段 B = 100% 甲醇。
| 时间 | 流速 （mL 最小-1） | 移动阶段 A （%） | 移动阶段 B （乙二甲基三甲基） |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
表2：PGC列的方法。 PGC 列均衡溶剂变化的示意图表示。移动阶段 A = 10m 铵醋酸铵，pH 9.5。移动阶段 B = 100% 乙酮三甲基。
| 核苷酸/核苷酸 | 质量转换（m/z） | 极性 | 碎片 | 碰撞能量（eV） | 电池加速器电压 | 保留时间（分钟） | 保留窗口（分钟） | 监控模式 | |
| 前体离子 | 产品离子 | ||||||||
| 腺苷 | 268.1 | 136 | 阳性 | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | 先生 |
| N1- 甲基甲基诺辛 | 282.12 | 150 | 阳性 | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | 先生 |
| 鸟苷 | 284.1 | 135 | 阳性 | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | 先生 |
| O6-甲基瓜诺辛 | 298.12 | 166 | 阳性 | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | 先生 |
| 肌苷 | 269.1 | 136.9 | 阳性 | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | 先生 |
| 尿苷 | 245.21 | 133 | 阳性 | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | 先生 |
| 伪乌里丁 | 245.21 | 125 | 阳性 | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | 先生 |
| 胞苷 | 244.2 | 112 | 阳性 | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | 先生 |
| 放大 器 | 348.07 | 136 | 阳性 | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | 先生 |
| GMP | 364.07 | 152 | 阳性 | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | 先生 |
| 小鬼 | 348.9 | 137 | 阳性 | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | 先生 |
| UMP | 325.01 | 212.9 | 阳性 | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | 先生 |
| CMP | 324 | 112 | 阳性 | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | 先生 |
表3：质谱仪检测到的核苷酸和核苷酸的MS分析条件。 此处列出了八核苷酸和六核苷酸的前体离子和产品离子，由 MS 进行复合识别和定量监测。
图1：八核苷酸和五核苷酸的色谱峰值。 C18列（A）和PGC列（B）的8个核苷酸的分离剖面。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：按质量过渡识别N1- 甲基甲基诺辛。 从 N1- 甲基淀氨酸标准（A）和 Col-0 样品（B）检测到前体离子 m/z 282.1 和产品离子 m/z 150 和 m/z 133 的 MS/MS 光谱。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：N1- 甲基亚地氨酸的色谱峰值。 监测了N 1-甲基甲基诺辛定量的282.1至150的质量过渡。标准和样品测量中 N1- 甲基亚地诺辛峰值的保留时间相似。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：N1-甲基亚地诺辛标准曲线的生成。 （A） 六种不同浓度的N1-甲基二甲基诺辛分别被添加到六个样本提取基质中。并记录了由此产生的增加峰值区域。（B） N1- 甲基甲基诺辛的校准曲线。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
生物体含有各种核苷酸/核苷酸，包括规范和异常核苷酸。然而，它们的起源和代谢端点，特别是经过修改的核苷酸，仍然模糊不清。此外，目前对核苷酸/核苷酸代谢功能和平衡的理解还有待探索和扩展。为了调查它们，需要采用精确和金标准的方法来识别和量化这些代谢物。在这里，我们描述了一个使用质量谱进行核苷酸/核苷酸检测的协议。以N1-甲基甲基诺辛为例，该方法可检测低至0.02 ng标准，校准曲线的精度相当高（R2 = 0.999： 图4B）。与 HPLC 方法相比，基于 MS 的协议提供了更好的检测限制和准确性。更重要的是，这种方法可以很容易地由研究人员在生物实验室，有一个LC-MS/MS。此外，它还可以用于鉴定植物中已知代谢物的其他结构。
对于核苷酸/核苷酸含量的体内绝对定量，需要商业标准化学品。它们产生直线标准曲线，允许通过质谱记录的峰值区域计算样品中的目标代谢物。标准校准曲线中的峰值区域范围应覆盖 MS 中读取的目标代谢物的峰值区域，这一点很重要。此外，在样品提取中应加入一系列浓度标准，但不应溶解在水中以进行校准曲线生成。这是因为它将避免矩阵效应，这对量化精度具有极其重要的意义。
此处描述的方法为核苷酸/核苷酸定量提供了强大的工具。它的应用可以扩展到所有的植物，甚至其他生物体。样品预处理的整个过程需要保持寒冷和快速，以避免代谢物降解，虽然提取缓冲液中含有80%的有机化学物质，这可能沉淀出大部分蛋白质（酶）。但是，此方法不适合未知目标识别。这种方法中目标化学品的鉴定和量化在很大程度上取决于商业化学标准。这种方法的另一个局限性是，核苷酸和核苷酸的测量必须分别使用C18列和PCC列。这是因为C18列的性能虽然比PGC列更稳定、更可重复，但后者特别能更好地区分核苷酸（图1B）。
总之，提出的方法允许在体内量化植物中的核苷酸/核苷酸。从幼苗生长到获得最终结果，实验可在3周内完成。完整的样品预处理和LC-MS/MS分析大约需要2天的时间，一组10至20个样本。
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Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了中央大学基础研究基金（KJQN202060）、中国国家自然科学基金（31900907）、江苏省自然科学基金（BK20190528）、国际遗传工程和生物技术中心（CRP/CHN20-04_EC）和M.C的财政支持。 中央大学基础研究基金（LGZD202004）至X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
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