Summary
마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.
Abstract
마우스 모델은 부정맥 연구에서 중요한 역할을 하며 변경된 이온 채널 기능 및 칼슘 처리를 포함한 부정맥 생성의 주요 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 이를 위해 고품질의 심방 또는 심실 심근 세포는 패치 클램프 측정을 수행하거나 칼슘 취급 이상을 탐색하는 데 필요합니다. 그러나 현재 격리 프로토콜에 의해 얻어진 고품질 심근 세포의 제한된 수율은 동일한 마우스에서 두 측정을 모두 허용하지 않습니다. 이 기사에서는 역행성 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하여 한 동물에서 칼슘 과도 현상 및 L형 칼슘 전류를 동시에 측정하는 방법을 설명합니다. 마우스 심장을 채취하고, 대동맥을 빠르게 캐뉼라 화하여 혈액을 제거합니다. 그런 다음 심장은 처음에 칼슘이 없는 용액(37°C)으로 관류되어 삽입된 디스크 수준에서 조직을 해리한 다음 세포외 기질(37°C)을 파괴하기 위해 칼슘이 거의 포함되지 않은 효소 용액으로 관류합니다. 소화 된 심장은 이후 심방과 심실로 해부됩니다. 조직 샘플을 작은 조각으로 잘게 썰고 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 용해시킵니다. 효소 소화가 중단되고 세포가 생리적 칼슘 농도로 단계적으로 재도입됩니다. 형광 Ca2+ 지시약으로 로딩 한 후, 칼슘 전류와 과도 현상을 동시에 측정하기 위해 분리 된 심근 세포를 준비합니다. 또한, 분리 함정이 논의되고, 위에서 설명한 바와 같이 분리된 심방 및 심실 쥐 근세포에서 동시 칼슘 과도 측정과 함께 L형 칼슘 전류의 패치 클램프 프로토콜 및 대표적인 흔적이 제공됩니다.
Introduction
심장 부정맥은 흔하며 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치기 때문에 현재 주요 의료 문제 중 하나입니다. 부정맥은 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있으며1,2 대부분의 심장 돌연사3의 근본 원인이다. 최신 치료 옵션은 환자 생존율을 향상시켰지만 여전히 기본 메커니즘을 표적으로 삼기보다는 주로 대증 치료입니다. 따라서, 이러한 치료법은 효능이 제한적이며 종종 심각한 부작용을 일으킬 수 있다 4,5,6. 현재 치료 옵션을 개선하려면 근본적인 병태생리학에 대한 통찰력이 필요하므로 연구에 적합한 모델이 필요합니다. 작은 동물 모델, 특히 마우스 모델은 부정맥 생성의 주요 메커니즘, 예를 들어 세포 전기 생리학, 이온 채널 기능 또는 칼슘 처리에 대한 유전 적 영향을 연구 할 수 있기 때문에 부정맥 연구에서 중요한 역할을합니다 7,8.
이를 위해서는 충분한 양과 생존력을 가진 고립 된 심방 및 심실 심근 세포가 필요합니다. 심방 및 심실 근세포를 얻기 위한 다양한 분리 접근법의 광범위한 스펙트럼이 이전에 설명되었으며9,10,11,12,13 일부 그룹은 심방 14 또는 심실 15에서 L형 전류 및 칼슘 전류 유도 칼슘 과도 현상의 동시 측정 데이터를 제시했습니다 쥐 심근 세포. 그러나 우리가 아는 한 동물의 심방 및 심실 측정에 대한 데이터는 없습니다. 연구자들은 전기생리학에서 단백질체학, 세포 수축성 또는 단백질 상호 작용과 같은 기능 연구, 미토콘드리아 기능 또는 유전학에 이르기까지 다양한 주제에 중점을 두고 있으며, 이 모든 것은 분리된 심근 세포를 필요로 합니다. 따라서 발표된 프로토콜 중 다수는 패치 클램프 연구를 위해 특별히 개발되지 않았기 때문에 패치 클램프 연구를 위한 수율이 제한되고 세포 품질이 불충분했습니다. 따라서 한 동물에서 분리된 심방 및 심실 세포의 동시 패치 클램프 및 칼슘 과도 측정은 확립된 프로토콜로 수행할 수 없습니다.
패치 클램프 실험을 위한 쥐, 특히 심방 근세포의 분리는 여전히 어려운 과제입니다. 이 기사는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 제공하며, 이를 통해 한 동물에서 순 막 전류와 전류 유도 칼슘 과도 현상을 동시에 측정할 수 있습니다. 이 기사는 야생형 마우스와 유전적 돌연변이를 가진 마우스에서 파생된 심방 및 심실 근세포의 분리를 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 수컷과 암컷 마우스 모두에 사용할 수 있습니다. 아래에 기술된 근세포 분리, 이미지 및 대표적인 결과는 6개월(± 1)개월의 야생형 C57Bl/6 마우스에서 얻었습니다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜은 상이한 유전자형을 갖는 2개월에서 24개월에 이르는 다양한 연령의 마우스에 성공적으로 사용되었다. 그림 1 은 효소 관류 중 캐뉼러화된 심장의 분리 설정 및 확대 사진을 보여줍니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 니더작센 동물 검토 위원회(LAVES, AZ-18/2900)의 승인을 받았으며 동물 복지에 대한 모든 제도적, 국가적 및 국제 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 사전 준비
- 1L의 10x 관류 완충액(표 1), 500mL의 1x 관류 완충액(표 2), 50mL의 소화 완충액(표 3), 10mL의 정지 완충액(표 4), 1L의 Tyrode 용액(표 5), 10mL의 각 칼슘 단계 용액(포도당 및 표시된 각 양의 칼슘을 포함하는 Tyrode 용액)을 준비하고, 제공된 레시피에 따라 1L의 4-AP 용액(표 5), 100mL의 피펫 용액(표 6) 및 5mL의 플루론산.
참고: 목욕 용액(Tyrode 및 4-AP 용액)은 미리 준비하여(포도당 없이) +4°C에서 보관할 수 있으며 실험 당일에 포도당을 첨가합니다. 피펫 용액은 -20°C에서 보관할 수 있으며, 칼슘 지시약은 실험 당일에 첨가하고, 용액은 그 후 추가 사용 시까지 얼음 위에 보관한다. 10x 관류 완충액은 실온에서 보관할 수 있으며, 1x 관류 완충액, 소화 완충액 및 정지 완충액은 실험 당일에 새로 준비해야 합니다. - 수조와 롤러 펌프를 켭니다.
- Langendorff 장치를 관류 완충액으로 미리 채우십시오. 공기가 없는지 확인하십시오.
- 대동맥 캐뉼라를 해부 현미경으로 고정하여 준비하고 관류 완충액으로 채워진 1mL 주사기에 연결하고 캐뉼라를 헹구어 공기를 맑게 합니다.
알림: 관류 시스템 내부의 공기는 관상 동맥 관류에 직접적인 영향을 미치므로 소화 효과에 직접적인 영향을 미치므로 피하는 것이 중요합니다. 공기 트래핑을 안전하게 방지하기 위해 필요한 경우 설정에 버블 트랩을 추가할 수 있습니다. - 장기 수집 및 현미경 검사를 위한 충분한 관류 완충액으로 페트리 접시를 준비합니다(완충액은 전체 장기를 단단히 덮어야 하며 사용된 페트리 접시 크기에 따라 몇 밀리리터이면 충분해야 함).
- 조직 해리 및 현미경 검사를 위한 소화 완충액이 있는 3개의 페트리 접시를 준비하고, 완충액은 각 페트리 접시 내에서 현미경으로 해부할 장기를 덮어야 하며, 양은 사용된 페트리 접시 크기에 따라 다릅니다. 해리를 위해 심실 조직의 경우 3mL, 심방 조직의 경우 1.5mL를 사용합니다.
2. 장기 적출
- 27G 캐뉼라가 있는 1mL 주사기를 사용하여 0.1mL의 헤파린(1,000U/mL) i.p.를 마우스에 주입하고 5-10분 동안 기다립니다.
- 마우스를 약 500μL의 이소플루란에 담근 작은 조직과 함께 유도 챔버에 넣습니다. 동물은 조직과 접촉해서는 안됩니다. 이를 피하기 위해 플라스틱 생검 내장 카세트를 사용하여 조직을 덮을 수 있습니다. 동물이 완전히 마취되면 발가락 꼬집음 반사를 확인하고 더 이상 존재하지 않는 즉시 자궁 경부 탈구로 마우스를 신속하게 안락사시킵니다.
- 마우스를 뒤쪽의 플랫폼(예: 종이 타월로 덮인 스티로폼 위)에 놓고 캐뉼라로 발을 고정하여 제자리에 고정합니다.
- 가슴과 복부의 일부를 덮고있는 모피와 피부를 제거하고 jugulum에서 symphysis쪽으로 명확한 절개로 제거하고 가위를 사용하여 장기 구조를 손상시키지 않고 xiphoid 바로 아래에서 복부를 엽니 다. 수술용 집게로 흉골을 들어 올리고 갈비뼈 가장자리를 따라 가위로 횡격막을 자른 다음 내측 겨드랑이 라인에서 갈비뼈를 자르고 흉곽을 제거하여 심장을 노출시킵니다.
- 뭉툭한 집게를 사용하여 심낭을 조심스럽게 제거하고 아래에서 뭉툭한 집게로 들어 올리고 가위를 사용하여 한 번의 절단으로 큰 혈관을 절단하여 심장을 빠르게 제거합니다.
- 심장을 실온 관류 완충액에 넣고 현미경으로 뭉툭한 끝 바늘로 대동맥을 가능한 한 빨리 캐뉼러냅니다.
알림: 장기에 부착된 폐 조직과 지방 조직을 너무 많은 시간을 낭비하지 않고 제거하십시오. 캐뉼러를 삽입하는 동안 바늘 끝이 대동맥 판막을 통해 확장되지 않도록 하면 완충액이 관상 동맥으로 들어가는 것을 방지하여 결과를 손상시킬 수 있습니다. - 봉합 실크 조각으로 심장을 바늘에 단단히 묶고 주사기에서 분리하십시오.
참고: 심장을 채취하는 것(큰 혈관이 절단되는 순간)부터 대동맥을 바늘에 봉합할 때까지의 전체 절차는 가능한 한 적은 시간이 소요됩니다. 관류가 시작될 때까지 심장을 제거하는 데 90-180초 이상 걸리지 않는 것이 좋습니다.
3. 효소 소화
- 대동맥 캐뉼라 삽입 후, 캐뉼러 된 심장을 즉시 Langendorff 장치에 연결하여 공기가 시스템에 유입되지 않도록하십시오.
알림: Langendorff 장치 하단에 관류 완충액 한 방울을 매달고 바늘 상단에 관류 완충액 한 방울을 놓아 시스템에 공기가 유입되는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. - 정확히 37°C의 온도와 정확히 4mL/분의 관류 속도에서 1분 동안 관류 완충액으로 심장을 관류합니다.
참고: 관류 바늘 끝의 온도가 37°C가 되려면 수조 온도를 약 40°C보다 약간 높게 설정해야 합니다. 이것은 관류 팁의 온도를 측정하여 정기적으로 테스트해야 합니다. - 정확히 37°C의 온도와 정확히 4mL/분의 관류 속도에서 정확히 9분 동안 관류를 소화 완충액으로 전환합니다.
- 소화된 심장을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 소화 완충액이 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 현미경으로 심방과 심실을 조심스럽게 해부하십시오.
- 심방을 1.5mL의 소화 완충액이 있는 페트리 접시에 옮기고 심실을 3mL의 소화 완충액이 있는 다른 페트리 접시에 옮깁니다.
- 심방 박리
- 조심스럽게, 그러나 시간을 낭비하지 않고, 뭉툭한 집게를 사용하여 심방을 작은 조각으로 떼어 내십시오.
- 팁 입구를 넓히기 위해 이전에 절단한 1,000μL 피펫 팁을 사용하여 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 조직을 용해합니다.
- 용액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브 측면에서 조심스럽게 피펫팅하여 동일한 양의 정지 완충액(1.5mL)을 추가하여 반응을 종료합니다.
- 3mL의 세포/조직 용액을 모두 200μm 나일론 메쉬에 조심스럽게 통과시켜 완전히 소화되지 않은 나머지 더 큰 조직 조각을 제거합니다.
알림: 소화가 성공하면 단단한 덩어리가 거의 남지 않습니다.
- 심실 박리
- 해부 가위와 피펫을 위아래로 사용하여 심실 조직을 작은 조각으로 빠르게 잘라 용해시킵니다. 위아래로 피펫팅을 위해 다른 1,000μL 피펫 팁을 사용하고, 개구부를 넓히기 위해 단축할 수 있습니다.
- 세포/조직 용액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브 측면에서 조심스럽게 피펫팅하여 동일한 양의 정지 완충액(3mL)을 추가하여 반응을 종료합니다.
- 6mL의 모든 세포/조직 용액을 200μm 나일론 메쉬에 조심스럽게 통과시켜 완전히 소화되지 않은 더 큰 조직 조각을 제거합니다.
알림: 소화가 성공하면 단단한 덩어리가 거의 남지 않습니다.
- 두 튜브(심방 및 심실 세포 현탁액)를 실온에서 6분 동안 벤치에 두어 안정시킵니다.
- 두 15mL 튜브를 5 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
4. 칼슘 재도입
참고: 다음 단계는 심방 및 심실 세포 모두에 대해 동일하며(달리 언급되지 않는 한) 실온에서 수행됩니다.
- 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 칼슘이 없는 티로드 용액 10mL에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.
- 침전을 위해 세포를 8분 동안 그대로 두십시오.
- 5 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다 (심방 세포 만, 심실 세포에는 침전으로 충분합니다).
- 상층액을 버리고 100μM 칼슘 농도의 Tyrode 용액 10mL에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.
- 침전을 위해 세포를 8분 동안 그대로 두십시오.
- 5 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다 (심방 세포 만, 심실 세포에는 침전으로 충분합니다).
- 상층액을 버리고 400μM 칼슘 농도의 티로드 용액 10mL에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.
- 침전을 위해 세포를 8분 동안 그대로 두십시오.
- 5 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다 (심방 세포 만, 심실 세포에는 침전으로 충분합니다).
- 상층액을 버리고 펠릿을 1mM 칼슘 농도의 티로드 용액 5mL(심방)/1mL(심실)에 조심스럽게 재현탁합니다.
5. 형광 칼슘 지표 Fluo-3 AM으로 근세포 로딩
알림: 형광 칼슘 표시기의 감광성으로 인해 다음 단계는 빛으로부터 보호되어야 합니다(예: 튜브를 알루미늄 호일로 덮음).
- 무수 DMSO에 20% 플루로닉 F-127 44μL를 50μg의 Fluo-3AM에 첨가하여 Fluo-3 AM 원액을 준비합니다(빛으로부터 보호되는 -20°C에서 보관 가능).
- 10 μL의 Fluo-3 AM 원액을 1 mL의 세포 현탁액에 첨가하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 10 분 동안 배양합니다.
- 5 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 상청액을 버리고 펠릿을 적절한 양의 목욕 용액에 재현탁하여 좋은 작업 농도(세포 밀도에 따라 1-5mL의 목욕 용액)를 얻습니다.
- 실험을 시작하기 전에 에스테르 제거를 위해 30분 동안 그대로 두십시오.
6. 앞서 설명한 바와 같이 동시 패치 클램프 및 epifluorescent Ca2+-과도 측정16
알림: 패치 clamp 측정은 이 기사의 주제가 아니며 관심 있는 독자는 이 방법 17,18,19,20,21,22에 대한 자세한 설명을 제공하는 주요 간행물을 참조할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 더 나은 전반적인 이해를 위해, 현재 유도된 칼슘 과도 현상과 함께 L형 칼슘 전류를 측정하기 위한 프로토콜에 대한 요약이 제공된다.
- 근세포를 세포 챔버로 옮기고 37°C에서 수조 용액으로 슈퍼퓨즈합니다.
- 표 5에 표시된 대로 4-아미노피리딘과 염화바륨을 수조 용액에 첨가하여 칼륨 전류를 차단합니다.
- 붕규산 미세 전극의 팁 저항이 피펫 용액으로 채워진 2-5MΩ인지 확인합니다(표 6).
- 전기 신호와 에피형광을 동시에 기록할 수 있도록 측정을 설정합니다. 전압 클램프 모드는 전지를 -80mV로 유지하고 600ms의 램프 펄스를 -40mV로 유지하여 빠른 Na+ 전류를 비활성화한 다음 0.5Hz에서 +10mV까지 100ms 테스트 펄스를 유지하는 프로토콜로 L형 Ca2+ 전류를 측정하는 데 사용됩니다(그림 2).
- 488 nm에서 여기, <520 nm에서 방출된 빛을 사용하여 검출하고 [Ca2+]I 로 변환한다고 가정합니다.
여기서 kd = Fluo-3 (864 nM)의 해리 상수, F = Fluo-3 형광; Fmax =Ca2+-포화 형광은 각 실험종료 시 얻어진다 19.
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Representative Results
분리 수율은 칼슘 재도입 후 10 μL의 세포 현탁액을 현미경 슬라이드에 피펫팅하여 측정합니다. 심방 세포 분리를 위한 100개 이상의 생존 가능한 막대 모양의 비수축 세포/10μL 및 심실 세포 분리를 위한 1,000개 이상의 생존 가능한 막대 모양의 비수축 세포/10μL가 충분한 수율로 간주되며 일반적으로 이 프로토콜을 사용하여 얻습니다. 이 프로토콜로 얻은 심방 세포는 심장 전도 시스템의 세포, 특히 부비동 결절뿐만 아니라 우심방 및 좌심방의 다른 근세포 및 심방 부속기를 포함하는 다양한 세포 유형을 보여주었습니다. 이 영역은 개별적으로 해부되지 않기 때문에 다양한 세포 형태가 생성됩니다. 모든 심방 세포는 작으며 세포 커패시턴스 범위는 약 35 pF-100 pF이며 일부는 다른 것보다 더 줄무늬입니다. 그림 3 패널 A는 이 프로토콜로 얻은 측정에 사용할 준비가 된 칼슘 민감성 염료가 로드된 심방 작동 심근의 일반적인 세포를 보여줍니다. 심실 근세포는 100에서 약 400 pF 범위의 세포 커패시턴스로 더 막대 모양이고 더 크며, 그림 3 패널 B는 칼슘 민감성 염료가 로드된 작동 심근의 전형적인 심실 세포를 보여주며, 이 프로토콜로 얻은 측정에 적합합니다. 그림 4 는 하나의 심방 근세포(패널 B 및 C)와 하나의 심실 근세포(패널 E 및 F)에서 동시 세포질 칼슘 과도 현상을 사용한 L형 칼슘 전류 측정의 대표적인 예를 보여줍니다.
그림 1: Langendorff-장치. (A) 맞춤형으로 설계된 열교환기와 재킷 심장 챔버를 볼 수 있는 격리 설정 사진. (B) 캐뉼러드 심장이 제자리에 있는 재킷 심장 챔버의 클로즈업. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 자극 프로토콜. 총 순 막 전류(IM)를 측정하는 데 사용되는 전압-클램프 프로토콜(0.5Hz)은 주로 L형 Ca2+ 전류 및 Ca2+ 전류 유도Ca2+ 과도를 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 분리된 쥐 심근 세포. (A) 패치 클램프 실험에 사용할 준비가 된 Fluo-3가 탑재된 심방 심근 세포의 예. (B) 패치 클램프 실험에 사용할 준비가 된 Fluo-3가 탑재된 심실 심근 세포의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대표 녹음. (A) 전압 clamp 프로토콜(0.5Hz). (B) 쥐 심방 근세포에서 주로 L형Ca2+ 전류를 반영하는 총 순 막 전류(IM). (C) 쥐 심방 근세포에서 L형Ca2+ 전류가 일시적으로 유발된Ca2+. (D) 전압 클램프 프로토콜(0.5Hz). (E) 총 순 막 전류(IM), 주로 쥐 심실 근세포에서 L형Ca2+ 전류를 반영합니다. (F) L형 Ca2+ 전류는 쥐 심실 근세포에서 일시적인Ca2+ 전류를 유발했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 최종 농도 (mM) | |
| 염화나트륨(NaCl) | 120.4 |
| 케이씨엘 | 14.7 |
| KH2포4 | 0.6 |
| Na2HPO4 x 2H2O | 0.6 |
| 마그네슘4 x 7H2O | 1.2 |
| 헤페스 | 10 |
표 1: 10x 관류 완충액(1,000mL).
| 최종 농도 (mM) | |
| 나코3 | 4.6 |
| 타우린 | 30 |
| 2,3-부탄디온 모노옥심 | 10 |
| 포도당 | 5.5 |
| 10x 관류 버퍼 | 50 밀리리터 |
| 이중 탈착 H2O(18,2 MΩ-cm) | 500 밀리리터 |
표 2: 1x 관류 완충액(500mL).
| 최종 농도 | |
| 콜라게나제 유형 II | ~600 U/밀리리터 |
| CaCl2 | 40 마이크로미터 |
| 1x 관류 버퍼 | 50 밀리리터 |
표 3: 분해 완충액(50mL).
| 최종 농도 | |
| 소 송아지 세럼 | 10% |
| CaCl2 | 12.5 마이크로미터 |
| 1x 관류 버퍼 | 10 밀리리터 |
표 4: 정지 완충액(10 mL).
| 최종 농도 (mM) | ||
| 티로드 | 4-AP | |
| 염화나트륨(NaCl) | 140 | 140 |
| 헤페스 | 10 | 10 |
| 포도당 | 10 | 10 |
| 케이씨엘 | 4 | 4 |
| MgCl x6H2O | 1 | 1 |
| 프로베네시드 | 2 | 2 |
| 4-아미노피리딘 | 5 | |
| BaCl2 | 0.1 | |
| CaCl2 | 1 | 1 |
| 수소 이온 농도 | 실온에서 1M NaOH로 7.35 조정 | 실온에서 1M NaOH로 7.35 조정 |
표 5 : 목욕 용액.
| 최종 농도 (mM) | |
| DL-아스파타트 K+-소금 | 92 |
| 케이씨엘 | 48 |
| Na2ATP | 5 |
| 증권 시세 표시기 | 0.02 |
| 구아노신 5′-트리포스페이트 트리스 염 | 0.1 |
| 헤페스 | 10 |
| 플루오-3 | 0.1 |
| 수소 이온 농도 | 실온에서 1M KOH로 7.20 조정 |
표 6: 피펫 용액.
| 관찰된 문제 | 가능한 이유 | 용액 |
| 낮은 세포 수율, 조직 덩어리 남음 | 소화 불량 | 15초 단위로 소화 시간 증가 |
| 낮은 세포 수율, 조직 덩어리 남음 | 소화 불량 | 콜라게나제 양을 50 U/ml 단위로 늘리십시오. |
| 과소화된 세포와 소화되지 않은 세포의 혼합, 조직 덩어리가 남음 | 관상 동맥 관류 없음 | 대동맥 캐뉼라를 심실에 삽입하지 마십시오 |
| 과소화된 세포와 소화되지 않은 세포의 혼합, 조직 덩어리가 남음 | 기포 | 관류 시스템에 공기를 삽입하지 마십시오 |
| 낮은 전체 세포 품질 | 허혈 시간이 너무 길다. | 허혈 시간을 줄이고 가능한 한 오랫동안 순환을 유지하기위한 대체 방법을 고려하십시오. |
표 7: 일반적인 문제 및 해결 방법
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Discussion
이 기사는 동시 칼슘 과도 기록과 함께 패치 클램프 연구를 위해 동일한 마우스에서 고품질 심방 및 심실 근세포를 얻을 수 있는 쉽고 기능적인 방법을 제공합니다. 얻어진 데이터의 품질은 세포 분리의 품질에 크게 의존한다. 상기 언급한 바와 같이, 쥐 심근세포를 단리하는 많은 방법들이 이전에 기술되었다 9,10,11,12. 분리된 세포는 패치 클램프 실험에서 수축성 연구, 형태학적 연구, 단백질체학, 미토콘드리아 기능 연구 등에 이르기까지 다양한 분석에 사용됩니다. 각각의 개별 목적에는 다르게 최적화된 분리된 셀이 필요합니다. 이로 인해 어떤 프로토콜도 한 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 칼슘 처리 특성을 동시에 측정하는 패치 클램프 실험에 적합한 고품질 분리로 이어지지 않았습니다. 이를 변경하기 위해 앞에서 설명한 수많은 프로토콜의 적용으로 이 프로토콜이 개발되었습니다. 일부 단계는 기계적으로 어렵고, 일부는 특정 방식으로 수행되어야 하며, 일부는 단순히 격리 품질에 중요합니다. 이러한 단계는 아래에서 설명합니다.
세포 분리의 수율과 질은 동물의 나이에 따라 감소하는데, 이는 아마도 조직 섬유증의 증가로 인한 것일 수 있다 11,23,24 소화 시간과 효소 양의 개별적인 조정이 필요하다. 나이가 많은 동물일수록 더 많은 섬유화 조직이 예상됩니다. 표시된 소화 시간과 효소 양은 생후 6개월의 정상 크기의 건강한 생쥐에게 좋은 출발점이지만 개인의 필요에 맞게 조정해야 합니다. 섬유증을 선호하는 나이든 생쥐 또는 형질전환 생쥐를 사용할 때 더 많은 효소와 더 긴 소화 시간을 적용하는 것이 좋습니다. 이전 연구에서 강조했듯이, 신속하고 공기가 없는 캐뉼라 삽입과 심장의 즉각적인 관류는 좋은 세포 품질을 위해 절대적으로 중요하다11. 심장을 채취하여 실온 관류 완충액에 넣어 관류를 시작하는 데 90-180초 이상 걸리지 않는 것이 좋습니다 – 빠를수록 좋습니다. 장거리를 피하기 위해 필요한 모든 장비를 한 방에 설치하는 것이 도움이 됩니다. 허혈 간격의 추가 단축이 필요한 경우, 다른 마취 및 후속 안락사 방법을 사용할 수 있습니다. 위에서 설명한 대로 동물을 완전히 마취하고, 충분한 양의 펜타닐(또는 동물 복지 지침에 따라 이에 상응하는 진통제)을 바르고, 이소플루란 기화기와 생쥐에 적합한 마취 마스크가 있는 플랫폼으로 동물을 옮겨 일정한 이소플루란과 산소 흐름을 제공합니다. 그런 다음 위에서 설명한대로 진행하십시오. 동물은 한 번의 절단으로 큰 용기가 분리될 때까지 정상적인 순환을 하기 때문에 이 방법은 흐름이 없는 시간을 크게 줄여 필요한 경우 격리 품질을 향상시킬 수 있습니다.
심장을 채취한 후에는 관상 동맥 관류를 확보하기 위해 대동맥 캐뉼라를 적절한 깊이에 배치하는 것이 중요합니다. 따라서 심장을 제거 할 때 대동맥 궁 또는 하부 대동맥에서 대동맥을 절단하여 관상 동맥에서 원위부에서 봉합 실크를 묶을 수 있도록 캐뉼라 삽입을 위해 대동맥의 최소 5mm를 남겨 두어야합니다.
분리 공정 중에 여러 번의 세포 이송이 필요하며 작은 피펫 팁으로 피펫팅하면 세포에 높은 전단 응력이 발생합니다. 전단 응력을 줄이기 위한 가능한 해결책은 피펫 팁을 45° 각도로 몇 밀리미터 절단하여 팁 개구부를 넓히는 것뿐만 아니라 천천히 조심스럽게 피펫팅하는 것입니다. 절단된 피펫 팁을 녹여 가장자리를 부드럽게 함으로써 전단 응력을 추가로 줄일 수 있습니다. 심실 격리의 격리 수율은 일반적으로 너무 높아서 전단 응력 감소가 필수는 아닙니다. 개인의 목표에 따라 심실 세포를 전단 응력에 노출시켜 '가장 적합한' 세포를 선택하는 것이 더 유용할 수 있습니다. 그러나 심방 격리의 경우 심방 세포가 소화 후 특히 취약하기 때문에 이 절차가 중요합니다. 용액을 추가할 때마다 세포에 직접 피펫팅을 하지 말고 튜브 벽에서 천천히 피펫팅을 시도하는 것이 좋습니다.
콜라게나제의 선택은 분리 결과에 큰 영향을 미칩니다. 효소 준비의 차이뿐만 아니라 효소 활성의 관련 배치 간 변동이 있기 때문에 새로운 효소 배치 또는 새로운 마우스 균주로 작업을 시작할 때 콜라게나제 양과 소화 시간의 적정이 필요합니다. 그러나 위의 표에 표시된 양과 시간은 개별 최적화9를 위한 좋은 출발점이 된다. 대부분의 회사는 개별 배치를 테스트하기 위해 작은 효소 샘플을 제공하므로 배치 선택이 훨씬 더 편리합니다.
전형적인 진폭 및 정상적인 단상 붕괴를 갖는 칼슘 과도 현상은 이전에 Voigt et al.9,16에 의해 기술된 바와 같이 EGTA25를 사용하지 않고 세포가 분리되는 경우에 얻어질 수 있다. 따라서 이 프로토콜은 낮은 칼슘 농도를 사용하고 분리 과정에서 EGTA를 방지합니다. Ca2+ 역설 현상(26)으로부터 세포를 보호하기 위해, 칼슘은 최종 농도가 1 mM이 될 때까지 단계적으로 그리고 서서히 재도입된다. 설치류 심근 세포는 세포 내 나트륨 농도가 높기 때문에 특히 칼슘 과부하가 발생하기 쉬우며 느리고 단계적으로 재도입하는 것이 중요합니다27. 칼슘이 없는 용액의 필요성은 모든 Langendorff 기반 설치류 심근세포 분리의 주요 한계 중 하나입니다. 칼슘 재 도입은 항상 생존 가능한 세포의 상당한 손실을 초래합니다. 그럼에도 불구하고 여기에 설명된 바와 같이 느리고 단계적인 재도입은 각 동물로부터 안정적으로 측정값을 얻을 수 있는 좋은 품질의 충분한 수율로 이어집니다.
칼슘 재도입 직후 세포 수율과 품질을 평가하는 것이 중요합니다. 최종 평가는 분리된 세포를 패치하는 동안 이루어지지만, 칼슘에 민감한 염료로 세포를 로딩하기 전에 현미경으로 관찰하여 이미 세포의 양과 품질을 판단할 수 있습니다. 양질의 세포는 분명히 막대 모양이며 균질한 막을 가지고 있으며 수축하지 않습니다. 수축은 막 무결성의 손실을 나타내며 과소화 또는 높은 전단 응력의 적용으로 인해 발생할 수 있으므로 세포 품질이 낮다는 신호입니다. 과소화의 또 다른 징후는 생존 가능한 세포와 관련된 많은 세포 그림자 외에도 많은 표면 단백질이 제거되고 밀봉 형성을 위해 피펫 팁으로 세포에 접근하려고 할 때 매우 취약한 지나치게 보기 좋은 막입니다. 예시적인 건강하고 양질의 세포가 도 3에 나타나 있다. (패널 A: 심방 근세포, 패널 B: 심실 근세포). 높은 수율로 분리하면 씰 형성에 면역이 있는 세포가 생성될 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 결국, 셀의 모양과 수율에 관계없이 궁극적인 품질 테스트는 '각 분리된 셀에서 고품질 결과로 원하는 측정을 수행할 수 있는가?'라는 간단한 질문에 대한 답입니다. 위에 제공된 프로토콜은 긍정적인 대답을 가능하게 합니다.
많은 분리 프로토콜은 더 높은 수율과 더 나은 품질의 세포를 얻기 위해 분리제인 Blebbistatin을 사용합니다. 이 프로토콜은 광학 매핑 실험에서 심장 전기 생리학28,29에 미치는 영향에 대한 발표된 증거를 고려하여 Blebbistatin을 의도적으로 피합니다. 전기생리학적 연구에서 분리제의 사용은 주의해서 다루어야 하며 분리가 필수적인 상황으로 제한되어야 합니다.
이 프로토콜로 얻은 세포는 Fluo-3를 로딩한 후 약 6시간 동안 사용할 수 있으며 심방 세포는 시간에 더 취약합니다. 따라서 동일한 연구자가 심실 세포를 처리하는 경우 심실 세포보다 먼저 심방 세포를 연구하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜의 한 가지 한계는 대부분의 Langendorff 기반 격리 프로토콜과 마찬가지로 기술적으로 어렵다는 것입니다. 분명히 쥐의 심장은 작고 모든 기술적 측면에는 많은 운동이 필요합니다. 이것은 숙련 된 연구원이 더 나은 결과를 얻을 수 있음을 의미합니다. 일부 프로토콜은 심장을 관류하기 위해 일정한 압력을 사용합니다. 이것은 소화 및 조직 저항의 연속적인 손실로 인해 관류가 가속화되고 최적의 소화 시간을 정의하는 데 도움이 되지만 가속은 조직에 해를 끼치고 세포 품질을 크게 저하시킬 수 있다는 장점이 있습니다. 여기에 사용된 일정한 흐름 접근 방식에서는 소화 시간에 대한 명확한 기준이 없으며 최적의 시간에 소화를 중지하기 어려울 수 있으며, 이는 관련 한계를 나타냅니다. 또 다른 한계는 이러한 프로토콜에서 분리된 세포가 상기 기술된 실험에 대한 적합성에 대해서만 시험되었다는 것이다. 이 세포들은 다른 분석에도 사용될 수 있지만, 이것은 여전히 입증되어야합니다. 그 방향으로 나아가는 첫 번째 단계는 Seibertz et al.30이 발표한 프로토콜에 따라 이전에 사용된 전압에 민감한 염료보다 우수한 동역학을 가진 최근에 파생된 전압 감도 염료인 VF2.1CI를 로드하여 활동 전위를 시각화하기 위해 이 셀을 사용하는 것이었습니다. 문제점 해결에 도움이 되도록 표 7 에는 일반적인 격리 문제와 이러한 문제에 접근하는 방법이 표시되어 있습니다.
종합하면, 설명된 분리 프로토콜은 쥐 심방 및 심실 심근 세포의 동시 분리에 대한 작업 접근 방식을 제공하여 연구원이 단일 마우스의 심방 및 심실 전기생리학적 표현형을 얻을 수 있도록 합니다. 이는 심방 또는 심실 세포만 고품질로 분리하는 이전 분리 프로토콜에 의해 제기된 통계적 장애물을 제거하고 특정 연구에 필요한 동물의 수를 줄이는 데 도움이 됩니다. 이는 예를 들어 고가의 약제로 채워진 삼투압 미니 펌프의 이식과 같은 개입이 실험의 일부이고 동물 복지 고려 사항에서 중요한 요소가 될 수 있는 경우 특히 중요할 수 있습니다.
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Disclosures
없음
Acknowledgments
이 연구는 독일 연구 재단 (DFG; 혈관 의학의 임상의 과학자 프로그램(PRIME), MA 2186/14-1 to P. Tomsits 및 D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 및 SFB1002 프로젝트 A13 to N. Voigt), 독일 우수 전략(Excellence Strategy)에 따른 독일 연구 재단(EXC 2067/1- 390729940 to N. Voigt), 독일 심혈관 연구 센터(German Centre for Cardiovascular Research, DZHK; 81X2600255 to S. Clauss and N. Voigt; 81Z0600206 to S. Kääb), 코로나 재단(Corona Foundation) (S199/10079/2019 to S. Clauss), 심혈관 질환에 관한 ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910 to S. Clauss), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss에게) 및 Else-Kröner-Fresenius 재단 (EKFS 2016_A20에서 N. Voigt까지). 자금 제공자는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
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