Summary
Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.
Abstract
Los modelos de ratón desempeñan un papel crucial en la investigación de la arritmia y permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis, incluida la función alterada del canal iónico y el manejo del calcio. Para este propósito, los cardiomiocitos auriculares o ventriculares de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de patch-clamp o para explorar anomalías en el manejo del calcio. Sin embargo, el rendimiento limitado de cardiomiocitos de alta calidad obtenidos por los protocolos de aislamiento actuales no permite ambas mediciones en el mismo ratón. Este artículo describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares murinos de alta calidad mediante perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, para mediciones simultáneas posteriores de transitorios de calcio y corriente de calcio tipo L de un animal. Se obtienen corazones de ratón y la aorta se canula rápidamente para eliminar la sangre. Los corazones se perfunden inicialmente con una solución libre de calcio (37 °C) para disociar el tejido a nivel de discos intercalados y luego con una solución enzimática que contiene poco calcio para alterar la matriz extracelular (37 °C). El corazón digerido se disecciona posteriormente en aurículas y ventrículos. Las muestras de tejido se cortan en trozos pequeños y se disuelven pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo. La digestión enzimática se detiene, y las células se reintroducen gradualmente a las concentraciones fisiológicas de calcio. Después de cargar con un indicador fluorescente de Ca2+, los cardiomiocitos aislados se preparan para la medición simultánea de corrientes y transitorios de calcio. Además, se discuten las trampas de aislamiento y se proporcionan protocolos de patch-clamp y trazas representativas de corrientes de calcio tipo L con mediciones transitorias simultáneas de calcio en miocitos murinos auriculares y ventriculares aislados como se describió anteriormente.
Introduction
Las arritmias cardíacas son comunes y uno de los principales desafíos actuales de atención médica, ya que afectan a millones de personas en todo el mundo. Las arritmias se asocian con alta morbilidad y mortalidad 1,2 y representan la causa subyacente de la mayoría de las muertes súbitas cardíacas3. Las opciones de tratamiento actualizadas han mejorado la supervivencia del paciente, pero siguen siendo principalmente tratamientos sintomáticos en lugar de dirigirse a los mecanismos subyacentes. Por lo tanto, estos tratamientos tienen una eficacia limitada y con frecuencia pueden causar efectos secundarios graves 4,5,6. Una mejora de las opciones de tratamiento actuales requiere una visión de la fisiopatología subyacente, creando la necesidad de modelos adecuados para estudiar. Los modelos de animales pequeños, y específicamente los modelos de ratón, desempeñan un papel crucial en la investigación de arritmias, ya que permiten estudiar mecanismos clave de la arritmogénesis, por ejemplo, el impacto genético en la electrofisiología celular, la función del canal iónico o el manejo del calcio 7,8.
Para ello, se requieren cardiomiocitos auriculares y ventriculares aislados de cantidad y viabilidad suficientes. Se ha descrito previamente un amplio espectro de diferentes enfoques de aislamiento para obtener miocitos auriculares y ventriculares 9,10,11,12,13 y algunos grupos han presentado datos de mediciones simultáneas de corrientes de tipo L y transitorios de calcio inducidos por corriente de calcio de atrial 14 o ventricular 15 Cardiomiocitos murinos. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay datos disponibles de mediciones auriculares y ventriculares de un animal. Los investigadores se centran en una amplia variedad de temas que van desde la electrofisiología hasta la proteómica, estudios funcionales como la contractilidad celular o las interacciones de proteínas, la función mitocondrial o la genética, todos con necesidad de cardiomiocitos aislados. Por lo tanto, muchos de los protocolos publicados no se han desarrollado específicamente para estudios de pinza de parche, lo que lleva a rendimientos limitados y calidad celular insuficiente para estudios de pinza de parche. Por lo tanto, las mediciones simultáneas de pinza de parche y transitorios de calcio de células auriculares y ventriculares aisladas de un animal no se pueden realizar con los protocolos establecidos.
El aislamiento de miocitos murinos, especialmente auriculares, para experimentos de pinza de parche sigue siendo un desafío. Este artículo proporciona un método simple y rápido para el aislamiento de miocitos aurinos y ventriculares murinos de alta calidad a través de la perfusión de Langendorff basada en enzimas retrógradas, que posteriormente permite mediciones simultáneas de la corriente neta de la membrana y los transitorios de calcio inducidos por la corriente de un animal. Este artículo elabora un protocolo para el aislamiento de miocitos auriculares y ventriculares derivados de ratones de tipo salvaje y ratones portadores de mutaciones genéticas. Este protocolo se puede utilizar para ratones machos y hembras por igual. El aislamiento de miocitos, las imágenes y los resultados representativos que se describen a continuación se obtuvieron de ratones salvajes tipo C57Bl / 6 a la edad de 6 (± 1) meses. Sin embargo, este protocolo se ha utilizado con éxito en ratones de varias edades que van de 2 a 24 meses con diferentes genotipos. La figura 1 muestra la configuración de aislamiento y un primer plano de un corazón canulado durante la perfusión enzimática.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por la Junta de Revisión de Animales de Baja Sajonia (LAVES, AZ-18/2900) y se llevaron a cabo de acuerdo con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar animal.
1. Preacuerdos
- Preparar 1 L de tampón de perfusión 10x (Tabla 1), 500 ml de 1x tampón de perfusión (Tabla 2), 50 ml de tampón de digestión (Tabla 3), 10 ml de tampón de parada (Tabla 4), 1 L de solución de Tyrode (Tabla 5), 10 ml de cada solución escalonada de calcio (solución de Tyrode con glucosa y la cantidad respectiva de calcio según se indique), 1 L de solución de 4-AP (Tabla 5), 100 ml de solución de pipeta (Tabla 6) y 5 ml de ácido plurónico según las recetas proporcionadas.
NOTA: Las soluciones de baño (Tyrode y solución 4-AP) se pueden preparar (sin glucosa) por adelantado y almacenar a +4 °C, la glucosa se agrega el día experimental. La solución de pipeta se puede almacenar a -20 °C, el indicador de calcio se añade el día experimental y la solución se almacena en hielo hasta su uso posterior. El tampón de perfusión 10x se puede almacenar a temperatura ambiente, el tampón de perfusión 1x, el tampón de digestión y el tampón de parada deben prepararse recién en el día experimental. - Encienda el baño de agua y la bomba de rodillos.
- Prellenar el aparato de Langendorff con tampón de perfusión; Asegúrese de que esté libre de aire.
- Prepare la cánula aórtica fijándola bajo el microscopio de disección, conéctela con una jeringa de 1 ml llena de tampón de perfusión y limpie el aire enjuagando la cánula.
NOTA: Es crucial evitar cualquier aire dentro del sistema de perfusión, ya que esto afectará directamente la perfusión coronaria y, por lo tanto, la efectividad de la digestión. Se puede agregar una trampa de burbujas a la configuración si es necesario, para evitar de manera segura cualquier atrapamiento de aire. - Prepare placas de Petri con suficiente tampón de perfusión para la recolección de órganos y microscopía (el tampón debe cubrir de forma segura todo el órgano, unos pocos mililitros, dependiendo del tamaño de la placa de Petri utilizado, deberían ser suficientes).
- Prepare 3 placas de Petri con tampón de digestión para disociación de tejidos y microscopía, el tampón debe cubrir el órgano para la disección bajo el microscopio dentro de la placa de Petri respectiva, la cantidad depende del tamaño de la placa de Petri utilizada. Para la disociación use 3 mL para el tejido ventricular y 1.5 mL para el tejido auricular.
2. Sustracción de órganos
- Inyecte al ratón con 0,1 ml de heparina (1.000 U/ml) i.p. usando una jeringa de 1 ml con una cánula de 27 G y espere de 5 a 10 min.
- Coloque el ratón en una cámara de inducción junto con un pequeño tejido empapado en aproximadamente 500 μL de isoflurano. El animal no debe estar en contacto con el tejido. Para evitar eso, uno puede usar un casete de incrustación de biopsia plástica para cubrir el tejido. Una vez que el animal esté completamente anestesiado, verifique el reflejo de pellizco del dedo del pie y tan pronto como ya no esté presente, eutanasia rápidamente al ratón por dislocación cervical.
- Coloque el ratón en una plataforma sobre su espalda (por ejemplo, sobre espuma de poliestireno cubierta con una toalla de papel) y fije las patas hacia abajo con cánulas para mantenerlo en su lugar.
- Retire el pelaje y la piel que cubren el pecho y parte del abdomen con un corte claro desde el yugulo hacia la sínfisis y abra el abdomen justo debajo del xifoide sin dañar ninguna estructura de órgano con tijeras. Levante el esternón con fórceps quirúrgicos y corte el diafragma con tijeras a lo largo del borde de las costillas, luego corte las costillas en línea axilar medial y retire la caja torácica para exponer el corazón.
- Retire con cuidado el pericardio con pinzas romas y retire rápidamente el corazón levantándolo con pinzas romas desde abajo y cortando los vasos grandes con un solo corte con tijeras.
- Coloque el corazón en tampón de perfusión a temperatura ambiente y canule la aorta con una aguja roma bajo el microscopio lo más rápido posible.
NOTA: Retire cualquier tejido pulmonar y tejido graso adherido al órgano sin perder demasiado tiempo en él. Mientras canula, asegúrese de que el extremo de la aguja no se extienda a través de la válvula aórtica, ya que esto perjudicará los resultados al evitar que los amortiguadores entren en las arterias coronarias. - Ate el corazón con un trozo de seda de sutura firmemente a la aguja y desconéctelo de la jeringa.
NOTA: Todo el procedimiento desde la obtención del corazón (el momento en que se cortan los vasos grandes) hasta la sutura de la aorta a la aguja debe tomar el menor tiempo posible. Se recomienda no tomar más de 90-180 s desde la extracción del corazón hasta el inicio de la perfusión.
3. Digestión enzimática
- Después de la canulación aórtica, conecte inmediatamente el corazón canulado al aparato de Langendorff evitando que entre aire en el sistema.
NOTA: Puede ser útil tener una gota colgante de tampón de perfusión en la parte inferior del aparato de Langendorff, así como una gota de tampón de perfusión en la parte superior de la aguja para evitar que entre aire en el sistema. - Perfundir el corazón con tampón de perfusión durante 1 min a una temperatura de exactamente 37 °C y una velocidad de perfusión de exactamente 4 mL/min.
NOTA: Para tener una temperatura de 37 °C en la punta de la aguja de perfusión, la temperatura del baño de agua debe ajustarse ligeramente por encima de aproximadamente 40 °C. Esto debe probarse regularmente midiendo la temperatura en la punta de perfusión. - Cambie la perfusión a tampón de digestión y perfunda durante exactamente 9 minutos a una temperatura de exactamente 37 °C y una velocidad de perfusión de exactamente 4 ml / min.
- Transfiera el corazón digerido a una placa de Petri con suficiente tampón de digestión para mantenerlo completamente cubierto. Luego disecciona cuidadosamente las aurículas y los ventrículos bajo el microscopio.
- Transfiera las aurículas a una placa de Petri con 1,5 ml de tampón de digestión y los ventrículos a otra placa de Petri con 3 ml de tampón de digestión.
- Disección auricular
- Con cuidado, pero sin pérdida de tiempo, separe las aurículas en pedazos pequeños con pinzas romas.
- Disuelva el tejido pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 1.000 μL, que se ha cortado previamente para ensanchar la abertura de la punta.
- Transfiera la solución a un tubo de centrífuga de 15 ml y agregue una cantidad equivalente de tampón de parada (1,5 ml) pipeteando cuidadosamente hacia abajo en el lado del tubo para finalizar la reacción.
- Pase cuidadosamente los 3 ml de soluciones celulares/tisulares a través de una malla de nylon de 200 μm para eliminar los trozos de tejido más grandes restantes que no se hayan digerido completamente.
NOTA: Una digestión exitosa no dejará casi trozos sólidos.
- Disección ventricular
- Pique rápidamente el tejido ventricular en trozos pequeños con tijeras de disección y pipeta hacia arriba y hacia abajo para disolver. Utilice otra punta de pipeta de 1.000 μL para pipetear hacia arriba y hacia abajo, puede acortarse para ensanchar la abertura.
- Transfiera la solución celular/tisular a un tubo de centrífuga de 15 ml y agregue una cantidad equivalente de tampón de parada (3 ml) pipeteando cuidadosamente hacia abajo en el lado del tubo para finalizar la reacción.
- Pase cuidadosamente los 6 ml de solución celular/tisular a través de una malla de nylon de 200 μm para eliminar los trozos de tejido más grandes que no se hayan digerido completamente.
NOTA: Una digestión exitosa no dejará casi trozos sólidos.
- Deje ambos tubos (suspensión de células auriculares y ventriculares) en el banco a temperatura ambiente durante 6 minutos para que se asienten.
- Centrifugar ambos tubos de 15 ml a 5 x g durante 2 min.
4. Reintroducción del calcio
NOTA: Los siguientes pasos son idénticos para las células auriculares y ventriculares (a menos que se indique lo contrario) y se realizan a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante con una pipeta plástica Pasteur y resuspenda cuidadosamente el pellet en 10 ml de solución Tyrode sin calcio.
- Deje las celdas durante 8 minutos para la sedimentación.
- Centrifugar a 5 x g durante 1 min (solo células auriculares, la sedimentación es suficiente para las células ventriculares).
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet en 10 ml de solución de Tyrode con una concentración de calcio de 100 μM.
- Deje las celdas durante 8 minutos para la sedimentación.
- Centrifugar a 5 x g durante 1 min (solo células auriculares, la sedimentación es suficiente para las células ventriculares).
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet en 10 ml de solución de Tyrode con una concentración de calcio de 400 μM.
- Deje las celdas durante 8 minutos para la sedimentación.
- Centrifugar a 5 x g durante 1 min (solo células auriculares, la sedimentación es suficiente para las células ventriculares).
- Deseche el sobrenadante y resuspenda cuidadosamente el pellet en 1 ml (auricular) / 5 ml (ventricular) de solución Tyrode con una concentración de calcio de 1 mM.
5. Carga de miocitos con indicador de calcio fluorescente Fluo-3 AM
NOTA: Debido a la sensibilidad a la luz del indicador de calcio fluorescente, los siguientes pasos deben ejecutarse protegidos de la luz (por ejemplo, cubriendo los tubos con papel de aluminio).
- Preparar la solución madre de Fluo-3 AM añadiendo 44 μL de plurónico F-127 al 20% en DMSO anhidro a 50 μg de Fluo-3AM (puede conservarse a -20 °C protegido de la luz).
- Añadir 10 μL de solución madre de Fluo-3 AM a 1 ml de suspensión celular e incubar durante 10 min a temperatura ambiente protegido de la luz.
- Centrifugar a 5 x g durante 1 min.
- Deseche el sobrenadante con una pipeta plástica Pasteur y vuelva a suspender el pellet en una cantidad razonable de solución de baño para obtener una buena concentración de trabajo (1-5 ml de solución de baño dependiendo de la densidad celular).
- Dejar actuar durante 30 minutos para la desesterificación antes de comenzar con los experimentos.
6. Mediciones simultáneas de patch-clamp y Ca2+-transitorio epifluorescente como se describió anteriormente16
NOTA: Las mediciones de pinzas de parche no son el tema de este artículo, el lector interesado puede ser referido a las principales publicaciones que proporcionan descripciones detalladas de este método 17,18,19,20,21,22. Sin embargo, para una mejor comprensión general, se proporciona un resumen de un protocolo para medir las corrientes de calcio de tipo L junto con los transitorios de calcio inducidos por corriente.
- Transfiera los miocitos a una cámara celular y superfunda con una solución de baño a 37 °C.
- Bloquear las corrientes de potasio añadiendo 4-aminopiridina y cloruro de bario a la solución de baño como se indica en la Tabla 5.
- Asegúrese de que los microelectrodos de borosilicato tengan una resistencia de punta de 2-5 MΩ llena con solución de pipeta (Tabla 6).
- Configure las mediciones para permitir el registro simultáneo de señales eléctricas y epifluorescencia al mismo tiempo. El modo de abrazadera de voltaje se utiliza para medir la corriente Ca2+ de tipo L con un protocolo que mantiene la celda a -80 mV y un pulso de rampa de 600 ms a -40 mV para inactivar la corriente rápida de Na+, seguido de un pulso de prueba de 100 ms a +10 mV a 0.5 Hz (Figura 2).
- Utilice la excitación a 488 nm, emita luz a <520 nm para detectar y convertir a [Ca2+]I suponiendo
Donde kd = constante de disociación de Fluo-3 (864 nM), F = fluorescencia de Fluo-3; Fmax = Ca2+-fluorescencia saturada obtenida al final de cada experimento19.
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Representative Results
El rendimiento de aislamiento se determina después de la reintroducción de calcio mediante el pipeteo de 10 μL de suspensión celular en un portaobjetos de microscopio. Más de 100 células viables, en forma de bastón, no contraídas/10 μL para el aislamiento de células auriculares y más de 1.000 células viables, en forma de bastón, no contraídas/10 μL para el aislamiento de células ventriculares se consideran rendimiento suficiente y se obtienen comúnmente utilizando este protocolo. Las células auriculares obtenidas con este protocolo mostraron una variedad de diferentes tipos de células que contienen células del sistema de conducción cardíaca, especialmente el nódulo sinusal, así como diferentes miocitos de la aurícula derecha e izquierda, así como los apéndices auriculares. Dado que estas regiones no se diseccionan por separado, el resultado son varias morfologías celulares. Todas las células auriculares son pequeñas, con capacitancias celulares que van desde aproximadamente 35 pF – 100 pF, algunas son más filiformes que otras. El panel A de la figura 3 muestra una célula típica del miocardio auricular cargada con colorante sensible al calcio, lista para las mediciones obtenidas con este protocolo. Los miocitos ventriculares son más en forma de bastón y más grandes con capacitancias celulares que van desde 100 a alrededor de 400 pF, el panel B de la Figura 3 muestra una célula ventricular típica del miocardio de trabajo cargada con colorante sensible al calcio, lista para las mediciones obtenidas con este protocolo. La Figura 4 muestra ejemplos representativos de mediciones de corriente de calcio tipo L con transitorios de calcio citosólicos simultáneos de un miócito auricular (panel B y C) y un miógeno ventricular (panel E y F).
Figura 1: Aparato de Langendorff. (A) Fotografía de la configuración de aislamiento con vista del intercambiador de calor diseñado a medida y la cámara cardíaca con camisa. (B) Primer plano de la cámara cardíaca encamisada con el corazón canulado en su lugar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Protocolo de estimulación. Protocolo de pinza de voltaje (0,5 Hz) utilizado para medir la corriente neta total de la membrana (IM), reflejando predominantemente la corriente Ca 2+ tipo L y la corriente Ca 2+ inducida por Ca2+ transitorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cardiomiocitos murinos aislados. (A) Un ejemplo de un cardiomiocitos auriculares cargados con Fluo-3, listo para experimentos de patch-clamp. (B) Un ejemplo de un cardiomiocitos ventriculares cargados con Fluo-3, listo para experimentos de patch-clamp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Grabaciones representativas. (A) Protocolo de abrazadera de voltaje (0,5 Hz). (B) Corriente neta total de membrana (IM), que refleja predominantemente la corriente Ca2+ de tipo L en un miócito auricular murino. (C) La corriente de Ca 2+ tipo L desencadenó Ca2+ transitorio en un miocito auricular murino. (D) Protocolo de abrazadera de voltaje (0,5 Hz). (E) Corriente neta total de membrana (IM), que refleja predominantemente la corriente Ca2+ de tipo L en un miocitos ventriculares murinos. (F) La corriente de Ca 2+ tipo L desencadenó Ca2+ transitorio en un miopito ventricular murino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Concentración final (mM) | |
| NaCl | 120.4 |
| Kcl | 14.7 |
| KH2PO4 | 0.6 |
| Na 2 HPO4 x 2H2O | 0.6 |
| MgSO4 x 7H2O | 1.2 |
| HEPES | 10 |
Tabla 1: Tampón de perfusión 10x (1.000 mL).
| Concentración final (mM) | |
| NaHCO3 | 4.6 |
| Taurin | 30 |
| 2,3-Butanodiona monoxima | 10 |
| Glucosa | 5.5 |
| Tampón de perfusión 10x | 50 ml |
| doble destiladoH2O(18,2 MΩ-cm) | 500 ml |
Tabla 2: 1x tampón de perfusión (500 mL).
| Concentración final | |
| Colagenasa tipo II | ~600 U/ml |
| CaCl2 | 40 μM |
| 1x búfer de perfusión | 50 ml |
Tabla 3: Tampón de digestión (50 mL).
| Concentración final | |
| Suero de ternera bovina | 10% |
| CaCl2 | 12,5 μM |
| 1x búfer de perfusión | 10 ml |
Tabla 4: Stop buffer (10 mL).
| Concentración final (mM) | ||
| Tyrode | 4-AP | |
| NaCl | 140 | 140 |
| HEPES | 10 | 10 |
| Glucosa | 10 | 10 |
| Kcl | 4 | 4 |
| MgCl x 6H2O | 1 | 1 |
| Probenecid | 2 | 2 |
| 4-Aminopiridina | 5 | |
| BaCl2 | 0.1 | |
| CaCl2 | 1 | 1 |
| pH | 7,35 ajustado con NaOH 1 M a temperatura ambiente | 7,35 ajustado con NaOH 1 M a temperatura ambiente |
Tabla 5: Soluciones de baño.
| Concentración final (mM) | |
| DL-aspartato K+-sal | 92 |
| Kcl | 48 |
| Na2ATP | 5 |
| EGTA | 0.02 |
| Guanosina 5′-trifosfato tris sal | 0.1 |
| HEPES | 10 |
| Fluo-3 | 0.1 |
| pH | 7.20 ajustado con 1 M KOH a temperatura ambiente |
Tabla 6: Solución de pipeta.
| Problema observado | Posible razón | Solución |
| Bajo rendimiento celular, trozos de tejido restantes | Infradigestión | Aumentar el tiempo de digestión en incrementos de 15 segundos |
| Bajo rendimiento celular, trozos de tejido restantes | Infradigestión | Aumentar la cantidad de colagenasa en pasos de 50 U/ml |
| mezcla de células sobredigeridas y subdigeridas, trozos de tejido que quedan | Sin perfusión coronaria | Asegúrese de no insertar cánula aórtica en el ventrículo |
| mezcla de células sobredigeridas y subdigeridas, trozos de tejido que quedan | Burbujas de aire | Asegúrese de no insertar aire en el sistema de perfusión |
| Baja calidad general de la célula | Tiempo isquémico demasiado largo | Disminuir el tiempo isquémico, considerar métodos alternativos para mantener la circulación el mayor tiempo posible |
Tabla 7: Problemas comunes y cómo resolverlos.
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Discussion
Este artículo proporciona una manera fácil y funcional de obtener miocitos auriculares y ventriculares de alta calidad del mismo ratón para estudios de parche y pinza con registros transitorios de calcio simultáneos. La calidad de los datos obtenidos depende en gran medida de la calidad del aislamiento celular. Como se mencionó anteriormente, muchos métodos para aislar cardiomiocitos murinos han sido descritos previamente 9,10,11,12. Las células aisladas se utilizan para diversos análisis que van desde experimentos de pinza de parche hasta estudios de contractilidad, estudios morfológicos, proteómica, investigación de la función mitocondrial y muchos más. Cada propósito individual requiere celdas aisladas optimizadas de manera diferente. Debido a esto, ninguno de los protocolos condujo a aislamientos de alta calidad adecuados para experimentos de patch-clamp con medición simultánea de las propiedades de manejo de calcio de miocitos auriculares y ventriculares de un ratón. Para cambiar esto, la adaptación de numerosos protocolos descritos anteriormente resultó en el desarrollo de este protocolo. Algunos pasos son mecánicamente desafiantes, algunos deben hacerse de una manera específica y algunos son simplemente cruciales para la calidad del aislamiento. Estos pasos se discutirán a continuación.
El rendimiento y la calidad del aislamiento celular disminuyen con la edad del animal, posiblemente debido al aumento de la fibrosis tisular 11,23,24 haciendo necesarios ajustes individuales del tiempo de digestión y la cantidad de enzimas. Cuanto más viejo es un animal, más tejido fibrótico se puede esperar. Los tiempos de digestión indicados y las cantidades de enzimas son un buen punto de partida para ratones sanos de tamaño normal a la edad de 6 meses, pero necesitarán adaptación a las necesidades individuales. Se sugiere aplicar más enzimas y tiempos de digestión más largos cuando se utilizan ratones más viejos o ratones transgénicos que favorecen la fibrosis. Como se ha enfatizado en trabajos anteriores, la canulación rápida y sin aire, así como la perfusión inmediata del corazón, son absolutamente críticas para una buena calidad celular11. Se recomienda no tomar más de 90-180 segundos desde la obtención del corazón y ponerlo en el tampón de perfusión a temperatura ambiente para comenzar la perfusión: cuanto más rápido, mejor. Es útil instalar todo el equipo necesario en una habitación para evitar largas distancias. Si se desea un mayor acortamiento del intervalo isquémico, es posible utilizar otro método de narcosis y posterior eutanasia. Anestesiar completamente al animal como se describió anteriormente, aplicar una cantidad suficiente de fentanilo (o un medicamento analgésico equivalente de acuerdo con sus pautas para el bienestar animal) i.p. y mover al animal a una plataforma con un vaporizador de isoflurano y una máscara de anestesia adecuada para ratones, proporcionando un flujo constante de isoflurano y oxígeno. Luego proceda como se describe anteriormente. Dado que el animal tiene una circulación normal hasta que los vasos grandes se desconectan con un solo corte, este método reducirá significativamente el tiempo sin flujo y, por lo tanto, puede mejorar la calidad del aislamiento si es necesario.
Después de extraer el corazón, es fundamental colocar la cánula aórtica a la profundidad correcta para asegurar la perfusión coronaria. Por lo tanto, es necesario cortar la aorta en el arco aórtico o en la aorta descendente al extraer el corazón para dejar al menos 5 mm de la aorta para la canulación que permite atar la sutura de seda distal de las arterias coronarias pero antes de las primeras ramas laterales aórticas.
Durante el proceso de aislamiento, son necesarias múltiples transferencias de células y el pipeteo con pequeñas puntas de pipeta causará un alto esfuerzo cortante a las células. Las posibles soluciones para reducir el esfuerzo cortante son el pipeteo lento y cuidadoso, así como el corte de las puntas de pipeta en algunos milímetros en un ángulo de 45° para ensanchar la abertura de la punta. Se puede lograr una mayor reducción del esfuerzo cortante derritiendo las puntas de pipeta cortadas para suavizar los bordes. El rendimiento de aislamiento del aislamiento ventricular generalmente es tan alto que la reducción del esfuerzo cortante no es obligatoria. Dependiendo del objetivo individual, incluso puede ser más útil exponer las células ventriculares al esfuerzo cortante para seleccionar las células "más aptas". Sin embargo, para el aislamiento auricular este procedimiento es crítico, ya que las células auriculares son particularmente vulnerables después de la digestión. Siempre que se agreguen soluciones, se recomienda evitar el pipeteo directamente sobre las células, sino tratar de pipetear lentamente en la pared del tubo.
La elección de la colagenasa afectará significativamente los resultados del aislamiento. Dado que no solo hay diferencias en las preparaciones enzimáticas, sino también una variación relevante de lote a lote en la actividad enzimática, la titulación de la cantidad de colagenasa y el tiempo de digestión son necesarios cuando se comienza a trabajar con un nuevo lote de enzima o una nueva cepa de ratones. Sin embargo, la cantidad y el tiempo indicados en las tablas anteriores marcan un buen punto de partida para la optimización individual9. La mayoría de las empresas proporcionan pequeñas muestras de enzimas para probar lotes individuales, lo que hace que la selección de lotes sea mucho más conveniente.
Se pueden obtener transitorios de calcio con amplitudes típicas y desintegración monofásica normal si las células se aíslan sin el uso de EGTA25 como se describió previamente por Voigt et al.9,16. Este protocolo, por lo tanto, utiliza bajas concentraciones de calcio y evita EGTA durante el proceso de aislamiento. Para proteger las células del fenómeno de la paradoja del Ca 2+ 26, el calcio se reintroduce paso a paso y lentamente hasta una concentración final de 1 mM. Debido a las mayores concentraciones intracelulares de sodio, los cardiomiocitos de roedores son especialmente propensos a la sobrecarga de calcio y la reintroducción lenta y gradual es crucial27. La necesidad de soluciones libres de calcio representa una de las principales limitaciones de todos los aislamientos de cardiomiocitos de roedores basados en Langendorff. La reintroducción del calcio siempre conduce a una pérdida significativa de células viables. Sin embargo, la reintroducción lenta y gradual, como se describe aquí, conduce a un rendimiento suficiente con buena calidad para obtener mediciones de cada animal de manera confiable.
Es importante evaluar el rendimiento y la calidad celular inmediatamente después de la reintroducción del calcio. Aunque la evaluación final se lleva a cabo mientras se parchean las células aisladas, ya se puede juzgar la cantidad y calidad de las células al observar bajo el microscopio antes de cargar las células con tinte sensible al calcio. Las células de buena calidad tienen forma de varilla, tienen una membrana homogénea y no se contraen. La contracción es un signo de baja calidad celular, ya que indica una pérdida de integridad de la membrana y puede ser causada por una digestión excesiva o la aplicación de un alto esfuerzo cortante. Otro signo de sobredigestión es, además de muchas sombras celulares en relación con las células viables, una membrana demasiado agradable que ha sido limpiada de muchas proteínas de superficie y es extremadamente vulnerable cuando uno intenta acercarse a la célula con la punta de la pipeta para la formación de sellos. En la Figura 3 se muestran células ejemplares sanas y de buena calidad. (Panel A: miocitos auriculares, Panel B: miócito ventricular). Los aislamientos con altos rendimientos pueden conducir a células inmunes a la formación de focas y viceversa. Al final, la prueba de calidad definitiva, independientemente del aspecto y el rendimiento de la célula, es la respuesta a una pregunta simple: "¿Es posible realizar las mediciones deseadas con resultados de alta calidad en las celdas aisladas de cada aislamiento?". El protocolo proporcionado anteriormente hace posible una respuesta positiva.
Muchos protocolos de aislamiento utilizan el agente de desacoplamiento Blebbistatin para obtener mayores rendimientos y células de mejor calidad. Este protocolo evita deliberadamente la blebbistatina, teniendo en cuenta la evidencia publicada de su influencia en la electrofisiología cardíaca28,29 en experimentos de mapeo óptico. El uso de agentes de desacoplamiento en estudios electrofisiológicos debe tratarse con precaución y debe limitarse a circunstancias en las que el desacoplamiento es obligatorio.
Las células obtenidas con este protocolo se pueden utilizar durante aproximadamente seis horas después de la carga con Fluo-3 con células auriculares siendo más vulnerables al tiempo. En consecuencia, se recomienda estudiar las células auriculares antes que las células ventriculares si el mismo investigador las procesa.
Una limitación de este protocolo, como ocurre con la mayoría de los protocolos de aislamiento basados en Langendorff, es que es técnicamente difícil. Claramente, los corazones de ratón son pequeños y todos los aspectos técnicos requieren mucho ejercicio. Esto significa que un investigador experimentado obtendrá mejores resultados. Algunos protocolos utilizan una presión constante para perfundir el corazón. Esto tiene la ventaja de que debido a la digestión y la pérdida consecutiva de resistencia tisular la perfusión se acelerará, y esto ayuda a definir el tiempo óptimo de digestión, sin embargo, la aceleración puede dañar el tejido y disminuir significativamente la calidad celular. En un enfoque de flujo constante como el utilizado aquí, no hay puntos de referencia claros para los tiempos de digestión y, a menudo, puede ser difícil detener la digestión en un momento óptimo, lo que marca una limitación relevante. Otra limitación es que en este protocolo las células aisladas solo se probaron para determinar su idoneidad para los experimentos descritos anteriormente. Es probable que estas células también se puedan usar para diferentes análisis, pero esto aún debe probarse. Un primer paso en esa dirección fue el uso de estas células para visualizar potenciales de acción cargándolas con VF2.1CI, un colorante de sensibilidad de voltaje recientemente derivado con una cinética superior a los colorantes sensibles al voltaje utilizados anteriormente de acuerdo con un protocolo publicado por Seibertz et al.30. Para ayudar con la solución de problemas, la Tabla 7 muestra los problemas comunes de aislamiento y cómo abordarlos.
En conjunto, el protocolo de aislamiento descrito ofrece un enfoque de trabajo para el aislamiento simultáneo de cardiomiocitos aurinos y ventriculares, lo que permite al investigador obtener un fenotipo electrofisiológico auricular y ventricular de un solo ratón. Esto elimina los obstáculos estadísticos planteados por los protocolos de aislamiento anteriores que solo aíslan las células auriculares o ventriculares de alta calidad y ayuda a reducir el número de animales necesarios para un estudio específico. Esto puede ser especialmente importante si intervenciones como, por ejemplo, la implantación de minibombas osmóticas llenas de agentes costosos son parte de los experimentos y puede ser un factor vital en las consideraciones de bienestar animal.
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Disclosures
Ninguno
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 a P. Tomsits y D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 y SFB1002 proyecto A13 a N. Voigt), Fundación Alemana de Investigación bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania (EXC 2067/1- 390729940 a N. Voigt), Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss y N. Voigt; 81Z0600206 a S. Kääb), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), la ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss), la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss) y la Fundación Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 a N. Voigt). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
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