Summary
Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.
Abstract
Muismodellen spelen een cruciale rol in aritmieonderzoek en maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen, waaronder een veranderde ionkanaalfunctie en calciumbehandeling. Voor dit doel zijn atriale of ventriculaire cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patch-clampmetingen uit te voeren of om calciumbehandelingsafwijkingen te onderzoeken. De beperkte opbrengst van hoogwaardige cardiomyocyten verkregen door de huidige isolatieprotocollen maakt beide metingen in dezelfde muis echter niet mogelijk. Dit artikel beschrijft een methode om hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, voor daaropvolgende gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom van één dier. Muizenharten worden verkregen en de aorta wordt snel gecannuleerd om bloed te verwijderen. Harten worden vervolgens in eerste instantie doordrenkt met een calciumvrije oplossing (37 °C) om het weefsel te dissociëren ter hoogte van geïntercaleerde schijven en daarna met een enzymoplossing die weinig calcium bevat om de extracellulaire matrix (37 °C) te verstoren. Het verteerde hart wordt vervolgens ontleed in boezems en ventrikels. Weefselmonsters worden in kleine stukjes gehakt en opgelost door voorzichtig op en neer te pipetteren. De enzymatische spijsvertering wordt gestopt en cellen worden stapsgewijs opnieuw geïntroduceerd in fysiologische calciumconcentraties. Na het laden met een fluorescerende Ca2+-indicator worden geïsoleerde cardiomyocyten voorbereid voor gelijktijdige meting van calciumstromen en transiënten. Daarnaast worden isolatie-valkuilen besproken en patch-clamp-protocollen en representatieve sporen van L-type calciumstromen met gelijktijdige calciumtransiënte metingen in atriale en ventriculaire murine myocyten geïsoleerd zoals hierboven beschreven.
Introduction
Hartritmestoornissen komen vaak voor en zijn een van de huidige grote uitdagingen in de gezondheidszorg, omdat ze miljoenen mensen wereldwijd treffen. Aritmieën zijn geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2 en vormen de onderliggende oorzaak voor de meerderheid van plotselinge hartdoden3. Up-to-date behandelingsopties hebben de overleving van de patiënt verbeterd, maar zijn nog steeds voornamelijk symptomatische behandelingen in plaats van zich te richten op de onderliggende mechanismen. Deze behandelingen hebben dus een beperkte werkzaamheid en kunnen vaak ernstige bijwerkingen veroorzaken 4,5,6. Een verbetering van de huidige behandelingsopties vereist inzicht in de onderliggende pathofysiologie, waardoor de behoefte ontstaat aan geschikte modellen om te bestuderen. Kleine diermodellen - en met name muismodellen - spelen een cruciale rol in aritmieonderzoek omdat ze het mogelijk maken om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen, bijvoorbeeld de genetische impact op cellulaire elektrofysiologie, ionkanaalfunctie of calciumbehandeling 7,8.
Voor dit doel zijn geïsoleerde atriale en ventriculaire cardiomyocyten van voldoende hoeveelheid en levensvatbaarheid vereist. Een breed spectrum van verschillende isolatiebenaderingen om atriale en ventriculaire myocyten te verkrijgen is eerder beschreven 9,10,11,12,13 en sommige groepen hebben gegevens gepresenteerd van gelijktijdige metingen van L-type stroom en calciumstroom geïnduceerde calciumtransiënten van atrium 14 of ventrikel 15 Muriene cardiomyocyten. Voor zover wij weten zijn er echter geen gegevens beschikbaar van zowel atriale als ventriculaire metingen van één dier. Onderzoekers richten zich op een breed scala aan onderwerpen, variërend van elektrofysiologie tot proteomica, functionele studies zoals celcontractiliteit of eiwitinteracties, mitochondriale functie of genetica - allemaal hebben ze behoefte aan geïsoleerde cardiomyocyten. Veel van de gepubliceerde protocollen zijn dus niet specifiek ontwikkeld voor patchklemstudies, wat leidt tot beperkte opbrengsten en onvoldoende celkwaliteit voor patchklemstudies. Gelijktijdige patchklem- en calciumtransiënte metingen van atriale en ventriculaire cellen geïsoleerd van één dier kunnen dus niet worden uitgevoerd met vastgestelde protocollen.
Isolatie van murine - vooral atriale - myocyten voor patchklemexperimenten blijft een uitdaging. Dit artikel biedt een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die vervolgens gelijktijdige metingen van zowel netvliesstroom als stroomgeïnduceerde calciumtransiënten van één dier mogelijk maakt. Dit artikel werkt een protocol uit voor de isolatie van atriale en ventriculaire myocyten afgeleid van wild type muizen en muizen met genetische mutaties. Dit protocol kan worden gebruikt voor zowel mannelijke als vrouwelijke muizen. De myocytenisolatie, afbeeldingen en representatieve resultaten die hieronder worden beschreven, werden verkregen van wilde type C57Bl / 6-muizen op de leeftijd van 6 (± 1) maanden. Niettemin is dit protocol met succes gebruikt voor muizen op verschillende leeftijden, variërend van 2 tot 24 maanden met verschillende genotypen. Figuur 1 toont de isolatieopstelling en een close-up van een gecannuleerd hart tijdens enzymperfusie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Nedersaksische Animal Review Board (LAVES, AZ-18/2900) en werden uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor dierenwelzijn.
1. Voorregelingen
- Bereid 1 l 10x perfusiebuffer (tabel 1), 500 ml 1x perfusiebuffer (tabel 2), 50 ml verteringsbuffer (tabel 3), 10 ml stopbuffer (tabel 4), 1 l Tyrode-oplossing (tabel 5), 10 ml van elke calciumstapoplossing (Tyrode-oplossing met glucose en respectieve hoeveelheid calcium zoals aangegeven), 1 l 4-AP-oplossing (tabel 5), 100 ml pipetoplossing (tabel 6) en 5 ml pluronzuur volgens de verstrekte recepten.
OPMERKING: Badoplossingen (Tyrode en 4-AP-oplossing) kunnen van tevoren worden bereid (zonder glucose) en worden bewaard bij +4 °C, glucose wordt toegevoegd op de experimentele dag. Pipetoplossing kan worden bewaard bij -20 °C, calciumindicator wordt toegevoegd op de experimentele dag en oplossing wordt vervolgens op ijs bewaard tot verder gebruik. 10x perfusiebuffer kan bij kamertemperatuur worden bewaard, 1x perfusiebuffer, digestiebuffer en stopbuffer moeten op experimentele dag vers worden bereid. - Zet het waterbad en de rollenpomp aan.
- Voorvulling Langendorff apparaat met perfusiebuffer; Zorg ervoor dat het luchtvrij is.
- Bereid de aortacanule voor door deze onder de dissectiemicroscoop te fixeren, maak verbinding met een spuit van 1 ml gevuld met perfusiebuffer en heldere lucht door de canule te spoelen.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om lucht in het perfusiesysteem te vermijden, omdat dit direct van invloed is op de coronaire perfusie en dus de effectiviteit van de spijsvertering. Indien nodig kan een bellenvanger aan de opstelling worden toegevoegd om veilig luchtinsluiting te voorkomen. - Bereid petrischalen met voldoende perfusiebuffer voor orgaanverzameling en microscopie (buffer moet het hele orgaan stevig bedekken, een paar milliliter - afhankelijk van de gebruikte petrischaalgrootte - zou voldoende moeten zijn).
- Bereid 3 petrischalen met spijsverteringsbuffer voor weefseldissociatie en microscopie, buffer moet het orgaan bedekken voor dissectie onder de microscoop in de respectieve petrischaal, hoeveelheid is afhankelijk van de gebruikte petrischaalgrootte. Gebruik voor de dissociatie 3 ml voor ventrikelweefsel en 1,5 ml voor boezemweefsel.
2. Orgaanoogst
- Injecteer de muis met 0,1 ml heparine (1.000 E/ml) i.p. met behulp van een spuit van 1 ml met een canule van 27 G en wacht 5-10 min.
- Plaats de muis in een inductiekamer samen met een klein weefsel gedrenkt in ongeveer 500 μL isofluraan. Het dier mag niet in contact komen met het weefsel. Om dat te voorkomen, kan men een plastic biopsie-inbeddingscassette gebruiken om het weefsel te bedekken. Zodra het dier volledig is verdoofd, controleert u op teenknijpreflex en zodra het niet meer aanwezig is, euthanaseert u de muis snel door cervicale dislocatie.
- Plaats de muis op een platform op zijn rug (bijvoorbeeld op piepschuim bedekt met een papieren handdoek) en bevestig de poten met canules om hem op zijn plaats te houden.
- Verwijder vacht en huid die de borst en een deel van de buik bedekken met een duidelijke snee van jugulum naar symfyse en open de buik direct onder de xiphoid zonder de orgaanstructuur te verwonden met een schaar. Til het borstbeen op met een chirurgische tang en knip het diafragma met een schaar langs de rand van de ribben, knip vervolgens de ribben in de mediale oksellijn en verwijder de ribbenkast om het hart bloot te leggen.
- Verwijder het hartzakje voorzichtig met een stompe tang en verwijder snel het hart door het met een stompe tang van onderaf op te tillen en door de grote vaten met één enkele snede met een schaar te knippen.
- Breng het hart in de perfusiebuffer op kamertemperatuur en kannuleer de aorta met een stompe eindnaald zo snel mogelijk onder de microscoop.
OPMERKING: Verwijder al het longweefsel en vetweefsel dat aan het orgaan is bevestigd zonder er te veel tijd aan te verliezen. Zorg er tijdens het cannuleren voor dat het uiteinde van de naald niet door de aortaklep loopt, omdat dit de resultaten zal schaden door te voorkomen dat buffers de kransslagaders binnendringen. - Bind het hart met een stuk hechtzijde stevig vast aan de naald en maak de verbinding los van de spuit.
OPMERKING: De hele procedure vanaf het verkrijgen van het hart (het moment waarop de grote bloedvaten worden doorgesneden) tot het hechten van de aorta aan de naald moet zo min mogelijk tijd in beslag nemen. Het wordt aanbevolen om niet langer dan 90-180 s te nemen vanaf het verwijderen van het hart tot het begin van de perfusie.
3. Enzymatische spijsvertering
- Sluit na aortacannulatie onmiddellijk het gecannuleerde hart aan op het Langendorff-apparaat, zodat er geen lucht in het systeem komt.
OPMERKING: Het kan helpen om een hangende druppel perfusiebuffer aan de onderkant van het Langendorff-apparaat te hebben, evenals een druppel perfusiebuffer op de bovenkant van de naald om te voorkomen dat er lucht in het systeem komt. - Perfuseer het hart met perfusiebuffer gedurende 1 min bij een temperatuur van precies 37 °C en een perfusiesnelheid van precies 4 ml/min.
OPMERKING: Om een temperatuur van 37 °C aan de punt van de perfusienaald te hebben, moet de temperatuur van het waterbad iets hoger worden ingesteld op ongeveer 40 °C. Dit moet regelmatig worden getest door de temperatuur aan de perfusiepunt te meten. - Schakel perfusie over naar verteringsbuffer en perfuseer gedurende precies 9 minuten bij een temperatuur van precies 37 °C en een perfusiesnelheid van precies 4 ml / min.
- Breng het verteerde hart over in een petrischaaltje met voldoende verteringsbuffer om het volledig bedekt te houden. Ontleed vervolgens voorzichtig de boezems en ventrikels onder de microscoop.
- Breng de boezems over in een petrischaaltje met 1,5 ml verteringsbuffer en de ventrikels in een andere petrischaal met 3 ml verteringsbuffer.
- Atriumdissectie
- Trek voorzichtig, maar zonder tijdverlies, de boezems uit elkaar in kleine stukjes met behulp van een stompe tang.
- Los het weefsel op door voorzichtig op en neer te pipetteren met behulp van een pipetpunt van 1.000 μL, die eerder is gesneden om de tipopening te verbreden.
- Breng de oplossing over in een centrifugebuis van 15 ml en voeg een equivalente hoeveelheid stopbuffer (1,5 ml) toe door voorzichtig aan de zijkant van de buis naar beneden te pipetten om de reactie te beëindigen.
- Laat alle 3 ml cel-/weefseloplossingen voorzichtig door een nylon gaas van 200 μm lopen om resterende grotere weefselstukken te verwijderen die niet volledig zijn verteerd.
OPMERKING: Een succesvolle spijsvertering laat bijna geen vaste brokken achter.
- Ventriculaire dissectie
- Hak het ventriculaire weefsel snel in kleine stukjes met behulp van een dissectieschaar en pipet op en neer om op te lossen. Gebruik nog een pipetpunt van 1.000 μL voor het op en neer pipetteren, deze kan worden ingekort om de opening te verbreden.
- Breng cel/weefseloplossing over in een centrifugebuis van 15 ml en voeg een equivalente hoeveelheid stopbuffer (3 ml) toe door voorzichtig aan de zijkant van de buis te pipetten om de reactie te beëindigen.
- Laat voorzichtig alle 6 ml cel/weefsel-oplossing door een 200 μm nylon gaas lopen om grotere weefselstukken te verwijderen die niet volledig zijn verteerd.
OPMERKING: Een succesvolle spijsvertering laat bijna geen vaste brokken achter.
- Laat beide buizen (atriale en ventriculaire celsuspensie) op de bank bij kamertemperatuur gedurende 6 minuten bezinken.
- Centrifugeer beide buizen van 15 ml op 5 x g gedurende 2 min.
4. Herintroductie van calcium
OPMERKING: De volgende stappen zijn identiek voor zowel atriale als ventriculaire cellen (tenzij anders vermeld) en worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg met een plastic Pasteurpipet en resuspensie pellet voorzichtig in 10 ml calciumvrije Tyrode-oplossing.
- Laat de cellen 8 minuten staan voor bezinking.
- Centrifugeer op 5 x g gedurende 1 min (alleen atriale cellen, sedimentatie is voldoende voor ventriculaire cellen).
- Gooi supernatant weg en resuspendeerde de pellet voorzichtig in 10 ml Tyrode-oplossing met een calciumconcentratie van 100 μM.
- Laat de cellen 8 minuten staan voor bezinking.
- Centrifugeer op 5 x g gedurende 1 min (alleen atriale cellen, sedimentatie is voldoende voor ventriculaire cellen).
- Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet voorzichtig in 10 ml Tyrode-oplossing met een calciumconcentratie van 400 μM.
- Laat de cellen 8 minuten staan voor bezinking.
- Centrifugeer op 5 x g gedurende 1 min (alleen atriale cellen, sedimentatie is voldoende voor ventriculaire cellen).
- Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet voorzichtig in 1 ml (atrial) / 5 ml (ventrikel) Tyrode-oplossing met een calciumconcentratie van 1 mM.
5. Laden van myocyten met fluorescerende calcium-indicator Fluo-3 AM
OPMERKING: Vanwege de lichtgevoeligheid van de fluorescerende calciumindicator moeten de volgende stappen worden uitgevoerd om beschermd te zijn tegen licht (bijvoorbeeld door buizen af te dekken met aluminiumfolie).
- Bereid Fluo-3 AM stamoplossing door 44 μL 20% pluronic F-127 in watervrij DMSO toe te voegen aan 50 μg Fluo-3AM (kan worden bewaard bij -20 °C beschermd tegen licht).
- Voeg 10 μL Fluo-3 AM stockoplossing toe aan 1 ml celsuspensie en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
- Centrifugeer op 5 x g gedurende 1 min.
- Gooi het supernatant weg met behulp van een plastic Pasteurpipet en resuspensie van de pellet in een redelijke hoeveelheid badoplossing om een goede werkconcentratie te verkrijgen (1-5 ml badoplossing afhankelijk van de celdichtheid).
- Laat 30 minuten staan voor de-esterificatie voordat u begint met experimenten.
6. Gelijktijdige patch-clamp en epifluorescente Ca2+-transiënte metingen zoals eerder beschreven16
OPMERKING: Patchklemmetingen zijn niet het onderwerp van dit artikel, de geïnteresseerde lezer kan worden verwezen naar belangrijke publicaties met diepgaande beschrijvingen van deze methode 17,18,19,20,21,22. Niettemin, voor een beter algemeen begrip, wordt een samenvatting gegeven van een protocol om L-type calciumstromen samen met de huidige geïnduceerde calciumtransiënten te meten.
- Breng myocyten over in een celkamer en superfuse met badoplossing bij 37 °C.
- Blokkeer kaliumstromen door 4-aminopyridine en bariumchloride aan de badoplossing toe te voegen zoals aangegeven in tabel 5.
- Zorg ervoor dat borosilicaatmicro-elektroden een tipweerstand van 2-5 MΩ hebben, gevuld met pipetoplossing (tabel 6).
- Stel metingen in om gelijktijdige registratie van zowel elektrische signalen als epifluorescentie tegelijkertijd mogelijk te maken. De spanningsklemmodus wordt gebruikt om L-type Ca2+-stroom te meten met een protocol dat de cel op -80 mV houdt en een 600 ms ramp-pulse tot -40 mV om de snelle Na+-stroom te inactiveren, gevolgd door een 100 ms testpuls tot +10 mV bij 0,5 Hz (figuur 2).
- Gebruik excitatie bij 488 nm, uitgezonden licht bij <520 nm om te detecteren en om te zetten naar [Ca2+]I uitgaande van
Waarbij kd = dissociatieconstante van Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescentie; Fmax = Ca2+-verzadigde fluorescentie verkregen aan het einde van elk experiment19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De isolatieopbrengst wordt bepaald na herintroductie van calcium door 10 μL celsuspensie op een microscoopglaasje te pipetteren. Meer dan 100 levensvatbare, staafvormige, niet-contracterende cellen/10 μL voor atriale celisolatie en meer dan 1.000 levensvatbare, staafvormige, niet-contracterende cellen/10 μL voor ventriculaire celisolatie worden beschouwd als voldoende opbrengst en worden gewoonlijk verkregen met behulp van dit protocol. Atriale cellen verkregen met dit protocol toonden een verscheidenheid aan verschillende celtypen die cellen van het hartgeleidingssysteem bevatten, met name de sinusknoop, evenals verschillende myocyten uit het rechter- en linkeratrium en de atriale aanhangsels. Omdat deze gebieden niet afzonderlijk worden ontleed, zijn verschillende celmorfologieën het resultaat. Alle boezemcellen zijn klein, met celcapaciteiten variërend van ongeveer 35 pF- 100 pF, sommige zijn meer draadvormig dan andere. Figuur 3 paneel A toont een typische cel uit het atriale werkende myocard geladen met calciumgevoelige kleurstof, klaar voor metingen verkregen met dit protocol. Ventriculaire myocyten zijn meer staafvormig en groter met celcapaciteiten variërend van 100 tot ongeveer 400 pF, Figuur 3 paneel B toont een typische ventriculaire cel uit het werkende myocard geladen met calciumgevoelige kleurstof, klaar voor metingen verkregen met dit protocol. Figuur 4 toont representatieve voorbeelden van L-type calciumstroommetingen met gelijktijdige cytosolische calciumtransiënten van één atriale myocyt (paneel B en C) en één ventriculaire myocyt (paneel E en F).
Figuur 1: Langendorff-apparaat. (A) Foto van de isolatie-opstelling met het oog op de speciaal ontworpen warmtewisselaar en de ommantelde hartkamer. (B) Close-up van omhulde hartkamer met gecannuleerd hart op zijn plaats. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stimulatieprotocol. Spanningsklemprotocol (0,5 Hz) dat wordt gebruikt om de totale netto membraanstroom (IM) te meten, voornamelijk als gevolg van L-type Ca 2+ stroom en Ca 2+ stroom geïnduceerd Ca 2+ transiënt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Geïsoleerde muriene cardiomyocyten. (A) Een voorbeeld van een atriale cardiomyocyt geladen met Fluo-3, klaar voor patch-clamp experimenten. (B) Een voorbeeld van een ventriculaire cardiomyocyt geladen met Fluo-3, klaar voor patch-clamp experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve opnames. (A) Spanningsklemprotocol (0,5 Hz). (B) Totale netto membraanstroom (IM), voornamelijk als gevolg van L-type Ca2+ stroom in een muriene atriale myocyt. (C) L-type Ca 2+ stroom veroorzaakt Ca2+ van voorbijgaande aard in een muriene atriale myocyt. (D) spanningsklemprotocol (0,5 Hz). (E) Totale netto membraanstroom (IM), voornamelijk als gevolg van L-type Ca2+ stroom in een muriene ventriculaire myocyt. (F) L-type Ca 2+ stroom geactiveerd Ca2+ van voorbijgaande aard in een muriene ventriculaire myocyt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Eindconcentratie (mM) | |
| NaCl | 120.4 |
| Kcl | 14.7 |
| KH2PO4 | 0.6 |
| Na 2 HPO4 x 2H2O | 0.6 |
| MgSO4 x 7H2O | 1.2 |
| HEPES | 10 |
Tabel 1: 10x perfusiebuffer (1.000 ml).
| Eindconcentratie (mM) | |
| NaHCO3 | 4.6 |
| Taurin | 30 |
| 2,3-butaandionemonoxiem | 10 |
| Glucose | 5.5 |
| 10x perfusiebuffer | 50 ml |
| dubbel gedestilleerd H2 O (18,2 MΩ-cm) | 500 ml |
Tabel 2: 1x perfusiebuffer (500 ml).
| Eindconcentratie | |
| Collagenase Type II | ~600 U/ml |
| CaCl2 | 40 μM |
| 1x perfusiebuffer | 50 ml |
Tabel 3: Digestiebuffer (50 ml).
| Eindconcentratie | |
| Runderkalfserum | 10% |
| CaCl2 | 12,5 μM |
| 1x perfusiebuffer | 10 ml |
Tabel 4: Stopbuffer (10 ml).
| Eindconcentratie (mM) | ||
| Tyrode | 4-AP | |
| NaCl | 140 | 140 |
| HEPES | 10 | 10 |
| Glucose | 10 | 10 |
| Kcl | 4 | 4 |
| MgCl x 6H2O | 1 | 1 |
| Probenecide | 2 | 2 |
| 4-Aminopyridine | 5 | |
| BaCl2 | 0.1 | |
| CaCl2 | 1 | 1 |
| Ph | 7.35 afgesteld met 1 M NaOH bij kamertemperatuur | 7.35 afgesteld met 1 M NaOH bij kamertemperatuur |
Tabel 5: Badoplossingen.
| Eindconcentratie (mM) | |
| DL-aspartat K+-zout | 92 |
| Kcl | 48 |
| Na2ATP | 5 |
| EGTA | 0.02 |
| Guanosine 5′-trifosfaat tris zout | 0.1 |
| HEPES | 10 |
| Fluo-3 | 0.1 |
| Ph | 7.20 aangepast met 1 M KOH bij kamertemperatuur |
Tabel 6: Pipetoplossing.
| Waargenomen probleem | Mogelijke reden | Oplossing |
| Lage celopbrengst, weefselbrokken links | Onderdigestie | Verhoog de verteringstijd in stappen van 15 seconden |
| Lage celopbrengst, weefselbrokken links | Onderdigestie | Verhoog de hoeveelheid collagenase in stappen van 50 E/ml |
| mix van over- en onderverteerde cellen, weefselbrokken over | Geen coronaire perfusie | Zorg ervoor dat u geen aortacanule in de ventrikel inbrengt |
| mix van over- en onderverteerde cellen, weefselbrokken over | Luchtbellen | Zorg ervoor dat u geen lucht in het perfusiesysteem inbrengt |
| Lage algehele celkwaliteit | Ischemische tijd te lang | Verminder de ischemische tijd, overweeg alternatieve methoden om de circulatie zo lang mogelijk te behouden |
Tabel 7: Veelvoorkomende problemen en hoe deze op te lossen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel biedt een eenvoudige en functionele manier om hoogwaardige atriale en ventriculaire myocyten van dezelfde muis te verkrijgen voor patch-clamp studies met gelijktijdige calcium transiënte opnames. De kwaliteit van de verkregen gegevens is sterk afhankelijk van de kwaliteit van de celisolatie. Zoals hierboven vermeld, zijn veel methoden om muizencardiomyocyten te isoleren eerder beschreven 9,10,11,12. De geïsoleerde cellen worden gebruikt voor verschillende analyses, variërend van patchklemexperimenten tot contractiliteitsstudies, morfologische studies, proteomics, mitochondriaal functieonderzoek en nog veel meer. Elk individueel doel vereist geïsoleerde cellen die anders zijn geoptimaliseerd. Hierdoor leidde geen van de protocollen tot hoogwaardige isolaties die geschikt waren voor patch-clamp-experimenten met gelijktijdige meting van calciumbehandelingseigenschappen van atriale en ventriculaire myocyten van één muis. Om hier verandering in te brengen, heeft de aanpassing van tal van eerder beschreven protocollen geresulteerd in de ontwikkeling van dit protocol. Sommige stappen zijn mechanisch uitdagend, sommige moeten op een specifieke manier worden uitgevoerd en sommige zijn gewoon cruciaal voor de isolatiekwaliteit. Deze stappen worden hieronder besproken.
Opbrengst en kwaliteit van celisolatie nemen af met de leeftijd van het dier, mogelijk als gevolg van verhoogde weefselfibrose 11,23,24 waardoor individuele aanpassingen van de verteringstijd en enzymhoeveelheid noodzakelijk zijn. Hoe ouder een dier, hoe meer fibrotisch weefsel te verwachten is. De aangegeven verteringstijden en enzymhoeveelheden zijn een goed startpunt voor normale grootte, gezonde muizen op de leeftijd van 6 maanden, maar moeten worden aangepast aan individuele behoeften. Er wordt voorgesteld om meer enzym en langere verteringstijden toe te passen bij het gebruik van oudere muizen of transgene muizen die fibrose bevorderen. Zoals eerder werk heeft benadrukt, zijn snelle en luchtvrije cannulatie en onmiddellijke perfusie van het hart absoluut cruciaal voor een goede celkwaliteit11. Het wordt aanbevolen om niet langer dan 90-180 seconden te nemen vanaf het verkrijgen van het hart en het in de perfusiebuffer op kamertemperatuur te plaatsen om de perfusie te starten - hoe sneller, hoe beter. Het is handig om alle benodigde apparatuur in één ruimte op te zetten om lange afstanden te voorkomen. Als verdere verkorting van het ischemische interval gewenst is, is het mogelijk om een andere methode van narcose en daaropvolgende euthanasie te gebruiken. Verdoof het dier volledig zoals hierboven beschreven, breng een voldoende hoeveelheid fentanyl (of een gelijkwaardig pijnstillend medicijn aan in overeenstemming met uw richtlijnen voor dierenwelzijn) i.p. en verplaats het dier naar een platform met een isofluraan verdamper en een anesthesiemasker geschikt voor muizen, dat zorgt voor een constante isofluraan en zuurstofstroom. Ga daarna verder zoals hierboven beschreven. Omdat het dier een normale circulatie heeft totdat de grote vaten met een enkele snede zijn losgekoppeld, zal deze methode de no-flow-tijd aanzienlijk verkorten en zo de isolatiekwaliteit indien nodig verbeteren.
Na het oogsten van het hart is het van cruciaal belang om de aortacanule op de juiste diepte te plaatsen om coronaire perfusie veilig te stellen. Het is daarom noodzakelijk om de aorta bij de aortaboog of bij de afdalende aorta te snijden bij het verwijderen van het hart om ten minste 5 mm van de aorta over te laten voor cannulatie, waardoor de hechtende zijde distaal van de kransslagaders kan worden gebonden, maar vóór de eerste aorta-zijtakken.
Tijdens het isolatieproces zijn meerdere celtransfers nodig en pipetteren met kleine pipetpunten zal een hoge schuifspanning op de cellen veroorzaken. Mogelijke oplossingen om de schuifspanning te verminderen zijn langzaam en voorzichtig pipetteren, evenals het snijden van pipetpunten met enkele millimeters in een hoek van 45 ° om de tipopening te verbreden. Verdere vermindering van de schuifspanning kan worden bereikt door de gesneden pipetpunten te smelten om de randen zachter te maken. Het isolatierendement van de ventriculaire isolatie is meestal zo hoog dat afschuifspanningsreductie niet verplicht is. Afhankelijk van iemands individuele doel kan het zelfs nuttiger zijn om ventriculaire cellen bloot te stellen aan schuifspanning om te selecteren voor de 'fitste' cellen. Voor de atriale isolatie is deze procedure echter van cruciaal belang, omdat atriale cellen bijzonder kwetsbaar zijn na de spijsvertering. Wanneer u oplossingen toevoegt, wordt aanbevolen om pipetteren rechtstreeks op de cellen te vermijden, maar eerder te proberen langzaam op de buiswand te pipetten.
De keuze van collagenase zal de isolatieresultaten aanzienlijk beïnvloeden. Omdat er niet alleen verschillen zijn in enzympreparaten, maar ook een relevante batch-tot-batchvariatie in enzymactiviteit, zijn titratie van collagenasehoeveelheid en verteringstijd noodzakelijk wanneer u begint te werken met een nieuwe batch enzym of een nieuwe muizenstam. De hoeveelheid en tijd die in de bovenstaande tabellen worden aangegeven, vormen echter een goed startpunt voor individuele optimalisatie9. De meeste bedrijven bieden kleine enzymmonsters om individuele batches te testen, wat batchselectie veel gemakkelijker maakt.
Calciumtransiënten met typische amplitudes en normaal monofasisch verval kunnen worden verkregen als cellen worden geïsoleerd zonder het gebruik van EGTA25 zoals eerder beschreven door Voigt et al.9,16. Dit protocol maakt daarom gebruik van lage calciumconcentraties en vermijdt EGTA tijdens het isolatieproces. Om cellen te beschermen tegen het Ca 2+ paradoxfenomeen26, wordt calcium stapsgewijs en langzaam opnieuw geïntroduceerd tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM. Vanwege hogere intracellulaire natriumconcentraties zijn cardiomyocyten van knaagdieren bijzonder gevoelig voor calciumoverbelasting en langzame en stapsgewijze herintroductie is cruciaal27. De behoefte aan calciumvrije oplossingen is een van de belangrijkste beperkingen van alle op Langendorff gebaseerde cardiomyocytenisolatie van knaagdieren. Herintroductie van calcium leidt altijd tot een aanzienlijk verlies van levensvatbare cellen. Langzame en stapsgewijze herintroductie zoals hier beschreven, leidt niettemin tot voldoende opbrengst met een goede kwaliteit om op betrouwbare wijze metingen van elk dier te verkrijgen.
Het is belangrijk om de celopbrengst en -kwaliteit direct na de herintroductie van calcium te beoordelen. Hoewel de eindevaluatie plaatsvindt tijdens het patchen van de geïsoleerde cellen, kan men de celkwantiteit en -kwaliteit al beoordelen door onder de microscoop te kijken voordat cellen met calciumgevoelige kleurstof worden geladen. Cellen van goede kwaliteit zijn duidelijk staafvormig, hebben een homogeen membraan en zijn niet-contracterend. Contractie is een teken van lage celkwaliteit omdat het wijst op een verlies van membraanintegriteit en kan worden veroorzaakt door overdigestie of toepassing van hoge schuifspanning. Een ander teken van oververgisting is – naast veel celschaduwen in relatie tot levensvatbare cellen – een te mooi uitziend membraan dat is ontdaan van veel oppervlakte-eiwitten en extreem kwetsbaar is wanneer men de cel probeert te benaderen met de pipetpunt voor afdichtingsvorming. Voorbeeldige gezonde cellen van goede kwaliteit zijn weergegeven in figuur 3. (Paneel A: atriale myocyt, Paneel B: ventriculaire myocyt). Isolaties met hoge opbrengsten kunnen ertoe leiden dat cellen immuun zijn voor zeehondenvorming en vice versa. Uiteindelijk is de ultieme kwaliteitstest, ongeacht het uiterlijk en de opbrengst van de cel, het antwoord op een eenvoudige vraag: 'Is het mogelijk om de gewenste metingen uit te voeren met resultaten van hoge kwaliteit in de geïsoleerde cellen van elke isolatie?'. Het bovenstaande protocol maakt een positief antwoord mogelijk.
Veel isolatieprotocollen gebruiken het ontkoppelingsmiddel Blebbistatine om hogere opbrengsten en cellen van betere kwaliteit te verkrijgen. Dit protocol vermijdt opzettelijk Blebbistatine, rekening houdend met het gepubliceerde bewijs van zijn invloed op cardiale elektrofysiologie28,29 in optische mappingexperimenten. Het gebruik van ontkoppelmiddelen in elektrofysiologisch onderzoek moet met voorzichtigheid worden behandeld en moet worden beperkt tot omstandigheden waarin ontkoppeling verplicht is.
Cellen verkregen met dit protocol kunnen ongeveer zes uur na het laden met Fluo-3 worden gebruikt, waarbij atriale cellen kwetsbaarder zijn voor tijd. Daarom wordt aanbevolen om atriale cellen vóór ventriculaire cellen te bestuderen als dezelfde onderzoeker ze verwerkt.
Een beperking van dit protocol – zoals geldt voor de meeste op Langendorff gebaseerde isolatieprotocollen – is dat het technisch moeilijk is. Het is duidelijk dat muizenharten klein zijn en dat alle technische aspecten veel oefening vereisen. Dit betekent dat een ervaren onderzoeker betere resultaten zal behalen. Sommige protocollen gebruiken een constante druk om het hart te doordrenken. Dit heeft het voordeel dat als gevolg van de spijsvertering en het opeenvolgende verlies van weefselweerstand de perfusie zal versnellen, en dit helpt om de optimale verteringstijd te definiëren, maar de versnelling kan het weefsel schaden en de celkwaliteit aanzienlijk verminderen. In een constante stroombenadering zoals hier gebruikt, zijn er geen duidelijke benchmarks voor de verteringstijden en kan het vaak moeilijk zijn om de spijsvertering op een optimaal moment te stoppen, wat een relevante beperking markeert. Een andere beperking is dat in dit protocol geïsoleerde cellen alleen werden getest op geschiktheid voor de hierboven beschreven experimenten. Het is waarschijnlijk dat deze cellen ook voor verschillende analyses kunnen worden gebruikt, maar dit moet nog steeds worden bewezen. Een eerste stap in die richting was het gebruik van deze cellen om actiepotentialen te visualiseren door ze te laden met VF2.1CI, een recent afgeleide spanningsgevoeligheidskleurstof met superieure kinetiek ten opzichte van eerder gebruikte spanningsgevoelige kleurstoffen volgens een protocol gepubliceerd door Seibertz et al.30. Om te helpen bij het oplossen van problemen, toont tabel 7 veelvoorkomende isolatieproblemen en hoe deze moeten worden aangepakt.
Alles bij elkaar biedt het beschreven isolatieprotocol een werkende benadering van de gelijktijdige isolatie van muriene atriale en ventriculaire cardiomyocyten, waardoor de onderzoeker een atrium- en ventrikelelektrofysiologisch fenotype van een enkele muis kan verkrijgen. Dit verwijdert statistische obstakels die worden opgeworpen door eerdere isolatieprotocollen die alleen atriale of ventriculaire cellen van hoge kwaliteit isoleren en helpt het aantal dieren dat nodig is voor een specifiek onderzoek te verminderen. Dit kan vooral belangrijk zijn als interventies zoals bijvoorbeeld de implantatie van osmotische minipompen gevuld met dure middelen deel uitmaken van de experimenten en het kan een vitale factor zijn in dierenwelzijnsoverwegingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de German Research Foundation (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 aan P. Tomsits en D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 en SFB1002 project A13 tot N. Voigt), German Research Foundation under Germany's Excellence Strategy (EXC 2067/1- 390729940 to N. Voigt), German Centre for Cardiovascular Research (DZHK; 81X2600255 to S. Clauss and N. Voigt; 81Z0600206 to S. Kääb), the Corona Foundation (S199/10079/2019 to S. Clauss), the ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 to S. Clauss), de Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (naar S. Clauss) en de Else-Kröner-Fresenius Stichting (EKFS 2016_A20 naar N. Voigt). De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D.
- Schüttler, D., et al.
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
