Summary
Musmodeller gør det muligt at studere nøglemekanismer for arytmogenese. Til dette formål er kardiomyocytter af høj kvalitet nødvendige for at udføre patch-clamp-målinger. Her beskrives en metode til isolering af murine atriale og ventrikulære myocytter via retrograd enzymbaseret Langendorff-perfusion, som muliggør samtidige målinger af calciumtransienter og L-type calciumstrøm.
Abstract
Musemodeller spiller en afgørende rolle i arytmiforskning og gør det muligt at studere nøglemekanismer for arytmogenese, herunder ændret ionkanalfunktion og calciumhåndtering. Til dette formål er atriale eller ventrikulære kardiomyocytter af høj kvalitet nødvendige for at udføre patch-clamp-målinger eller for at undersøge calciumhåndteringsabnormiteter. Det begrænsede udbytte af kardiomyocytter af høj kvalitet opnået ved nuværende isolationsprotokoller tillader imidlertid ikke begge målinger i samme mus. Denne artikel beskriver en metode til at isolere højkvalitets murin atriale og ventrikulære myocytter via retrograd enzymbaseret Langendorff-perfusion til efterfølgende samtidige målinger af calciumtransienter og L-type calciumstrøm fra et dyr. Mushjerter opnås, og aorta kanyleres hurtigt for at fjerne blod. Hjerter perfuseres derefter først med en calciumfri opløsning (37 °C) for at dissociere vævet i niveauet af interkalerede skiver og derefter med en enzymopløsning indeholdende lidt calcium for at forstyrre ekstracellulær matrix (37 °C). Det fordøjede hjerte dissekeres efterfølgende i atria og ventrikler. Vævsprøver hakkes i små stykker og opløses ved omhyggelig pipettering op og ned. Den enzymatiske fordøjelse stoppes, og cellerne genindføres trinvist til fysiologiske calciumkoncentrationer. Efter belastning med en fluorescerende Ca2+-indikator fremstilles isolerede kardiomyocytter til samtidig måling af calciumstrømme og transienter. Derudover diskuteres isolationsfaldgruber, og patch-clamp-protokoller og repræsentative spor af L-type calciumstrømme med samtidige calciumtransiente målinger i atriale og ventrikulære murine myocytter isoleret som beskrevet ovenfor tilvejebringes.
Introduction
Hjertearytmier er almindelige og en af de nuværende store sundhedsudfordringer, da de påvirker millioner af mennesker verden over. Arytmier er forbundet med høj sygelighed og dødelighed 1,2 og repræsenterer den underliggende årsag til størstedelen af pludselige hjertedødsfald3. Opdaterede behandlingsmuligheder har forbedret patientens overlevelse, men er stadig hovedsageligt symptomatiske behandlinger snarere end at målrette de underliggende mekanismer. Disse behandlinger har således begrænset effekt og kan ofte forårsage alvorlige bivirkninger 4,5,6. En forbedring af de nuværende behandlingsmuligheder kræver indsigt i den underliggende patofysiologi, hvilket skaber behov for egnede modeller at studere. Små dyremodeller - og specifikt musemodeller - spiller en afgørende rolle i arytmiforskning, da de giver mulighed for at studere nøglemekanismer for arytmogenese, for eksempel den genetiske indvirkning på cellulær elektrofysiologi, ionkanalfunktion eller calciumhåndtering 7,8.
Til dette formål kræves isolerede atriale og ventrikulære kardiomyocytter af tilstrækkelig mængde og levedygtighed. Et bredt spektrum af forskellige isolationsmetoder til opnåelse af atriale og ventrikulære myocytter er tidligere blevet beskrevet 9,10,11,12,13, og nogle grupper har præsenteret data fra samtidige målinger af L-type strøm og calciumstrøm induceret calciumtransienter fra enten atriel 14 eller ventrikulær 15 murin kardiomyocytter. Men så vidt vi ved, er der ingen tilgængelige data om atriale såvel som ventrikulære målinger fra et dyr. Forskere fokuserer på en bred vifte af emner lige fra elektrofysiologi til proteomics, funktionelle undersøgelser som cellekontraktilitet eller proteininteraktioner, mitokondriefunktion eller genetik - alle med behov for isolerede kardiomyocytter. Mange af de offentliggjorte protokoller er således ikke specifikt udviklet til patch clamp studier, hvilket fører til begrænsede udbytter og utilstrækkelig cellekvalitet til patch clamp studies. Således kan samtidige patch clamp og calcium transiente målinger af atriale og ventrikulære celler isoleret fra et dyr ikke udføres med etablerede protokoller.
Isolering af murin - især atriale - myocytter til patch clamp eksperimenter forbliver udfordrende. Denne artikel giver en enkel og hurtig metode til isolering af højkvalitets murin atriale og ventrikulære myocytter via retrograd enzymbaseret Langendorff-perfusion, som efterfølgende muliggør samtidige målinger af både nettomembranstrøm og strøminducerede calciumtransienter fra et dyr. Denne artikel uddyber en protokol til isolering af atriale og ventrikulære myocytter afledt af vildtypemus og mus, der bærer genetiske mutationer. Denne protokol kan bruges til både han- og hunmus. Myocytisolationen, billederne og de repræsentative resultater, der er beskrevet nedenfor, blev opnået fra vildtype C57Bl/6-mus i en alder af 6 (± 1) måneder. Ikke desto mindre er denne protokol med succes blevet brugt til mus i forskellige aldre fra 2 til 24 måneder med forskellige genotyper. Figur 1 viser isolationsopsætningen og et nærbillede af et kanyleret hjerte under enzymperfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Niedersachsen Animal Review Board (LAVES, AZ-18/2900) og blev udført i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for dyrevelfærd.
1. Forudgående aftaler
- Der fremstilles 1 liter 10x perfusionsbuffer (tabel 1), 500 ml 1x perfusionsbuffer (tabel 2), 50 ml fordøjelsesbuffer (tabel 3), 10 ml stopbuffer (tabel 4), 1 liter tyrodeopløsning (tabel 5), 10 ml af hver calciumtrinopløsning (tyrodopløsning med glucose og respektive mængde calcium som angivet), 1 liter 4-AP-opløsning (tabel 5), 100 ml pipetteopløsning (tabel 6) og 5 ml pluronsyre ifølge de medfølgende opskrifter.
BEMÆRK: Badeopløsninger (Tyrode og 4-AP-opløsning) kan fremstilles (uden glukose) på forhånd og opbevares ved +4 °C, glukose tilsættes på forsøgsdagen. Pipetteopløsningen kan opbevares ved -20 °C, calciumindikatoren tilsættes på forsøgsdagen og opløsningen opbevares derefter på is indtil videre anvendelse. 10x perfusionsbuffer kan opbevares ved stuetemperatur, 1x perfusionsbuffer, fordøjelsesbuffer og stopbuffer skal tilberedes frisklavet på forsøgsdagen. - Tænd for vandbadet og rullepumpen.
- Forfyld Langendorff-apparatet med perfusionsbuffer; Sørg for, at den er luftfri.
- Forbered aortakanylen ved at fastgøre den under dissektionsmikroskopet, tilslut med en 1 ml sprøjte fyldt med perfusionsbuffer og klar luft ved at skylle kanylen.
BEMÆRK: Det er afgørende at undgå luft inde i perfusionssystemet, da dette direkte vil påvirke koronar perfusion og dermed fordøjelseseffektivitet. En boblefælde kan tilføjes til opsætningen, hvis det er nødvendigt, for sikkert at undgå luftfangst. - Tilbered petriskåle med tilstrækkelig perfusionsbuffer til organopsamling og mikroskopi (buffer skal dække hele orglet sikkert, et par milliliter – afhængigt af den anvendte petriskålstørrelse – burde være nok).
- Forbered 3 petriskåle med fordøjelsesbuffer til vævsdissociation og mikroskopi, buffer skal dække organet til dissektion under mikroskopet inden for den respektive petriskål, mængden afhænger af den anvendte petriskålstørrelse. Til dissociation anvendes 3 ml til ventrikulært væv og 1,5 ml til atrievæv.
2. Orgelhøst
- Injicer musen med 0,1 ml heparin (1.000 E/ml) i.p. ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 27 G kanyle og vent i 5-10 minutter.
- Musen anbringes i et induktionskammer sammen med et lille væv, der er gennemvædet med ca. 500 μL isofluran. Dyret bør ikke være i kontakt med vævet. For at undgå det kan man bruge en plastikbiopsi-indlejringskassette til at dække vævet. Når dyret er fuldt bedøvet, skal du kontrollere for tåklemmerefleks, og så snart det ikke længere er til stede, skal du hurtigt aflive musen ved cervikal dislokation.
- Placer musen på en platform på ryggen (f.eks. På isopor dækket med et papirhåndklæde) og fastgør poterne ned med kanyler for at holde den på plads.
- Fjern pels og hud, der dækker brystet og en del af maven med et klart snit fra jugulum mod symfyse, og åbn maven lige under xiphoiden uden at skade nogen organstruktur ved hjælp af en saks. Løft brystbenet med kirurgiske tang og skær membranen med en saks langs kanten af ribbenene, skær derefter ribbenene i medial aksillær linje og fjern ribbenburet for at udsætte hjertet.
- Fjern forsigtigt hjertesækken ved hjælp af stump tang og fjern hjertet hurtigt ved at løfte det med stump tang nedenfra og ved at skære de store kar med et enkelt snit ved hjælp af en saks.
- Sæt hjertet i stuetemperatur perfusionsbuffer og cannulate aorta med en stump endenål under mikroskopet så hurtigt som muligt.
BEMÆRK: Fjern lungevæv og fedtvæv, der er fastgjort til organet uden at miste for meget tid på det. Under kanylering skal du sørge for, at nålens ende ikke strækker sig gennem aortaklappen, da dette vil forringe resultaterne ved at forhindre buffere i at komme ind i koronararterierne. - Bind hjertet med et stykke suturerende silke fast til nålen og frakobl sprøjten.
BEMÆRK: Hele proceduren fra opnåelse af hjertet (det øjeblik, hvor de store kar skæres), indtil aorta sys til nålen, skal tage så lidt tid som muligt. Det anbefales ikke at tage længere tid end 90-180 s fra at fjerne hjertet indtil starten af perfusion.
3. Enzymatisk fordøjelse
- Efter aortakanylering skal det kanylerede hjerte straks tilsluttes Langendorff-apparatet, så der ikke kommer luft ind i systemet.
BEMÆRK: Det kan hjælpe at have en hængende dråbe perfusionsbuffer i bunden af Langendorff-apparatet samt en dråbe perfusionsbuffer siddende på toppen af nålen for at undgå, at luft trænger ind i systemet. - Perfus hjertet med perfusionsbuffer i 1 min ved en temperatur på præcis 37 °C og en perfusionshastighed på præcis 4 ml/min.
BEMÆRK: For at have en temperatur på 37 °C ved spidsen af perfusionsnålen skal vandbadstemperaturen indstilles lidt over ca. 40 °C. Dette bør testes regelmæssigt ved at måle temperaturen ved perfusionsspidsen. - Skift perfusion til fordøjelsesbuffer og perfus i præcis 9 minutter ved en temperatur på nøjagtigt 37 °C og en perfusionshastighed på nøjagtigt 4 ml/min.
- Overfør det fordøjede hjerte til en petriskål med tilstrækkelig fordøjelsesbuffer til at holde det helt dækket. Derefter dissekeres atrierne og ventriklerne forsigtigt under mikroskopet.
- Overfør atrierne til en petriskål med 1,5 ml fordøjelsesbuffer og ventriklerne til en anden petriskål med 3 ml fordøjelsesbuffer.
- Atriel dissektion
- Træk forsigtigt atrierne fra hinanden i små stykker ved hjælp af stumpe tang.
- Opløs vævet ved forsigtigt pipettering op og ned med en 1.000 μL pipettespids, som tidligere er blevet skåret for at udvide spidsåbningen.
- Opløsningen overføres til et 15 ml centrifugeglas, og der tilsættes en tilsvarende mængde stopbuffer (1,5 ml) ved forsigtigt pipettering ned på siden af røret for at afslutte reaktionen.
- Alle 3 ml celle-/vævsopløsninger ledes forsigtigt gennem et 200 μm nylonnet for at fjerne resterende større vævsstykker, der ikke er fordøjet helt.
BEMÆRK: En vellykket fordøjelse efterlader næsten ingen faste bidder.
- Ventrikulær dissektion
- Hak hurtigt ventrikelvævet i små stykker ved hjælp af dissektionssaks og pipette op og ned for at opløse. Brug en anden 1.000 μL pipettespids til pipettering op og ned, den kan afkortes for at udvide åbningen.
- Celle/vævsopløsning overføres til et 15 ml centrifugeglas, og der tilsættes en tilsvarende mængde stopbuffer (3 ml) ved forsigtigt pipettering ned ved siden af røret for at afslutte reaktionen.
- Alle 6 ml celle/vævsopløsning ledes forsigtigt gennem et 200 μm nylonnet for at fjerne større vævsstykker, der ikke er fordøjet helt.
BEMÆRK: En vellykket fordøjelse efterlader næsten ingen faste bidder.
- Lad begge rør (atriel og ventrikulær cellesuspension) stå på bænken ved stuetemperatur i 6 minutter for at bundfælde sig.
- Begge 15 ml glas centrifugeres ved 5 x g i 2 min.
4. Genindførelse af calcium
BEMÆRK: Følgende trin er identiske for både atriale og ventrikulære celler (medmindre andet er nævnt) og udføres ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres med en Pasteur-pipette af plast, og pellet resuspenderes forsigtigt i 10 ml calciumfri Tyrode-opløsning.
- Lad cellerne stå i 8 minutter til sedimentering.
- Centrifuger ved 5 x g i 1 min (kun atriale celler, sedimentering er nok til ventrikulære celler).
- Supernatant kasseres, og pellet resuspenderes forsigtigt i 10 ml Tyrodeopløsning med 100 μM calciumkoncentration.
- Lad cellerne stå i 8 minutter til sedimentering.
- Centrifuger ved 5 x g i 1 min (kun atriale celler, sedimentering er nok til ventrikulære celler).
- Supernatanten kasseres, og pellet resuspenderes forsigtigt i 10 ml Tyrodeopløsning med en calciumkoncentration på 400 μM.
- Lad cellerne stå i 8 minutter til sedimentering.
- Centrifuger ved 5 x g i 1 min (kun atriale celler, sedimentering er nok til ventrikulære celler).
- Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes forsigtigt i 1 ml (atriel)/5 ml (ventrikulær) Tyrodopløsning med 1 mM calciumkoncentration.
5. Indlæsning af myocytter med fluorescerende calciumindikator Fluo-3 AM
BEMÆRK: På grund af lysfølsomheden af indikatoren for fluorescerende calcium skal følgende trin udføres beskyttet mod lys (f.eks. ved at dække rør med aluminiumsfolie).
- Forbered Fluo-3 AM stamopløsning ved at tilsætte 44 μL 20% pluronisk F-127 i vandfri DMSO til 50 μg Fluo-3AM (kan opbevares ved -20 °C beskyttet mod lys).
- Tilsæt 10 μL Fluo-3 AM stamopløsning til 1 ml cellesuspension og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
- Centrifuger ved 5 x g i 1 min.
- Supernatanten kasseres med en Pasteur-pipette af plast, og pelletpen resuspenderes i en rimelig mængde badopløsning for at opnå en god arbejdskoncentration (1-5 ml badopløsning afhængigt af celletætheden).
- Lad stå i 30 minutter til de-esterificering, før du starter med eksperimenter.
6. Samtidig patch-clamp og epifluorescerende Ca2+-transiente målinger som tidligere beskrevet16
BEMÆRK: Patch clamp målinger er ikke emnet for denne artikel, den interesserede læser kan henvises til større publikationer, der giver dybtgående beskrivelser af denne metode 17,18,19,20,21,22. Ikke desto mindre gives der for en bedre samlet forståelse et resumé af en protokol til måling af L-type calciumstrømme sammen med strøminducerede calciumtransienter.
- Myocytter overføres til et cellekammer og oversmeltes med badeopløsning ved 37 °C.
- Bloker kaliumstrømme ved at tilsætte 4-aminopyridin og bariumchlorid til badopløsningen som angivet i tabel 5.
- Sørg for, at borosilikatmikroelektroder har en spidsmodstand på 2-5 MΩ fyldt med pipetteopløsning (tabel 6).
- Opsæt målinger for at muliggøre samtidig optagelse af både elektriske signaler og epifluorescens på samme tid. Spændingsklemmetilstand bruges til at måle L-type Ca2+-strøm med en protokol, der holder cellen ved -80 mV og en 600 ms rampepuls til -40 mV for at inaktivere den hurtige Na+-strøm, efterfulgt af en 100 ms testpuls til +10 mV ved 0,5 Hz (figur 2).
- Brug excitation ved 488 nm, udsendt lys ved <520 nm til at detektere og konvertere til [Ca2+]I forudsat
Hvor kd = dissociationskonstant for Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescens; Fmax =Ca2+-mættet fluorescens opnået ved afslutningen af hvert forsøg19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolationsudbyttet bestemmes efter calciumgentilførsel ved pipettering af 10 μL cellesuspension på et mikroskopglas. Mere end 100 levedygtige, stavformede, ikke-kontraherende celler/10 μL til atriecelleisolering og mere end 1.000 levedygtige, stavformede, ikke-kontraherende celler/10 μL til ventrikulær celleisolering betragtes som tilstrækkeligt udbytte og opnås almindeligvis ved anvendelse af denne protokol. Atrieceller opnået med denne protokol viste en række forskellige celletyper indeholdende celler i hjerteledningssystemet, især sinusknuden, såvel som forskellige myocytter fra højre og venstre atrium samt atriale vedhæng. Da disse regioner ikke dissekeres separat, er forskellige cellemorfologier resultatet. Alle atriale celler er små, med cellekapacitanser fra ca. 35 pF-100 pF, nogle er mere filiforme end andre. Figur 3 panel A viser en typisk celle fra det atriale arbejdende myokardium fyldt med calciumfølsomt farvestof, klar til målinger opnået med denne protokol. Ventrikulære myocytter er mere stangformede og større med cellekapacitanser fra 100 til omkring 400 pF, figur 3 panel B viser en typisk ventrikulær celle fra det arbejdende myokardium fyldt med calciumfølsomt farvestof, klar til målinger opnået med denne protokol. Figur 4 viser repræsentative eksempler på L-type calciumstrømmålinger med samtidige cytosoliske calciumtransienter fra en atriel myocyt (panel B og C) og en ventrikulær myocyt (panel E og F).
Figur 1: Langendorff-apparatet. (A) Fotografi af isolationsopsætningen med udsigt til den specialdesignede varmeveksler og kappede hjertekammer. (B) Nærbillede af kappet hjertekammer med kanyleret hjerte på plads. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Stimuleringsprotokol. Spændingsklemmeprotokol (0,5 Hz), der anvendes til måling af total nettomembranstrøm (IM), overvejende reflekterende L-type Ca 2+ strøm og Ca 2+ strøm induceret Ca 2+ forbigående. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Isolerede murine kardiomyocytter. (A) Et eksempel på en atriel kardiomyocyt fyldt med Fluo-3, klar til patch-clamp eksperimenter. (B) Et eksempel på en ventrikulær kardiomyocyt fyldt med Fluo-3, klar til patch-clamp eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative optagelser. (A) Spændingsklemmeprotokol (0,5 Hz). (B) Total netto membranstrøm (IM), overvejende reflekterende L-type Ca2+ strøm i en murin atriel myocyt. (C) L-type Ca 2+ strøm udløst Ca2+ forbigående i en murin atriel myocyt. D) spændingsklemmeprotokol (0,5 Hz). (E) Total netto membranstrøm (IM), overvejende reflekterende L-type Ca2+ strøm i en murine ventrikulær myocyt. (F) L-type Ca 2+ strøm udløst Ca2+ forbigående i en murine ventrikulær myocyt. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Endelig koncentration (mM) | |
| NaCl | 120.4 |
| KCl | 14.7 |
| KH2PO4 | 0.6 |
| Na 2 HPO4 x 2H2O | 0.6 |
| MgSO4 x 7H2O | 1.2 |
| HEPES | 10 |
Tabel 1: 10x perfusionsbuffer (1.000 ml).
| Endelig koncentration (mM) | |
| NaHCO3 | 4.6 |
| Taurin | 30 |
| 2,3-Butandionmonoxim | 10 |
| Glukose | 5.5 |
| 10x perfusionsbuffer | 50 ml |
| dobbeltdestilleret H 2O (18,2 MΩ-cm) | 500 ml |
Tabel 2: 1x perfusionsbuffer (500 ml).
| Endelig koncentration | |
| Collagenase Type II | ~600 E/ml |
| CaCl2 Annoncer | 40 μM |
| 1x perfusionsbuffer | 50 ml |
Tabel 3: Fordøjelsesbuffer (50 ml).
| Endelig koncentration | |
| Bovin kalve serum | 10% |
| CaCl2 Annoncer | 12,5 μM |
| 1x perfusionsbuffer | 10 ml |
Tabel 4: Stop buffer (10 ml).
| Endelig koncentration (mM) | ||
| Tyrode | 4-AP | |
| NaCl | 140 | 140 |
| HEPES | 10 | 10 |
| Glukose | 10 | 10 |
| KCl | 4 | 4 |
| MgCl x 6H2O | 1 | 1 |
| Probenecid | 2 | 2 |
| 4-aminopyridin | 5 | |
| BaCl2 | 0.1 | |
| CaCl2 Annoncer | 1 | 1 |
| ph | 7,35 justeret med 1 M NaOH ved stuetemperatur | 7,35 justeret med 1 M NaOH ved stuetemperatur |
Tabel 5: Bad løsninger.
| Endelig koncentration (mM) | |
| DL-aspartat K+-salt | 92 |
| KCl | 48 |
| Na2ATP | 5 |
| EGTA | 0.02 |
| Guanosin 5′-trifosfat tris salt | 0.1 |
| HEPES | 10 |
| Fluo-3 | 0.1 |
| ph | 7,20 justeret med 1 M KOH ved stuetemperatur |
Tabel 6: Pipetteopløsning.
| Problem observeret | Mulig årsag | Opløsning |
| Lavt celleudbytte, vævsbidder tilbage | Underfordøjelse | Forøg fordøjelsestiden i trin på 15 sekunder |
| Lavt celleudbytte, vævsbidder tilbage | Underfordøjelse | Forøg kollagenasemængden i trin på 50 E/ml |
| blanding af over- og underfordøjede celler, vævsstykker tilbage | Ingen koronar perfusion | Sørg for ikke at indsætte aortakanyle i ventriklen |
| blanding af over- og underfordøjede celler, vævsstykker tilbage | Luftbobler | Sørg for ikke at indsætte luft i perfusionssystemet |
| Lav samlet cellekvalitet | Iskæmisk tid for lang | Reducer iskæmisk tid, overvej alternative metoder til at opretholde cirkulation så længe som muligt |
Tabel 7: Almindelige problemer og hvordan man løser dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel giver en nem og funktionel måde at opnå atriale og ventrikulære myocytter af høj kvalitet fra den samme mus til patch-clamp-undersøgelser med samtidige calciumtransiente optagelser. Kvaliteten af de opnåede data afhænger stærkt af kvaliteten af celleisoleringen. Som nævnt ovenfor er mange metoder til isolering af murine kardiomyocytter tidligere beskrevet 9,10,11,12. De isolerede celler bruges til forskellige analyser lige fra patch clamp eksperimenter til kontraktilitetsundersøgelser, morfologiske undersøgelser, proteomics, mitokondriefunktionsforskning og mange flere. Hvert enkelt formål kræver isolerede celler, der er optimeret forskelligt. På grund af dette førte ingen af protokollerne til isolationer af høj kvalitet, der var egnede til patch-clamp-eksperimenter med samtidig måling af calciumhåndteringsegenskaber af atriale og ventrikulære myocytter fra en mus. For at ændre dette resulterede tilpasningen af adskillige protokoller, der er beskrevet før, i udviklingen af denne protokol. Nogle trin er mekanisk udfordrende, nogle skal udføres på en bestemt måde, og nogle er simpelthen afgørende for isoleringskvaliteten. Disse trin vil blive diskuteret nedenfor.
Udbyttet og kvaliteten af celleisolering falder med dyrets alder, muligvis på grund af øget vævsfibrose 11,23,24, hvilket gør individuelle justeringer af fordøjelsestid og enzymmængde nødvendig. Jo ældre et dyr er, desto mere fibrotisk væv kan forventes. De angivne fordøjelsestider og enzymmængder er et godt udgangspunkt for normale størrelser, sunde mus i en alder af 6 måneder, men skal tilpasses individuelle behov. Det anbefales at anvende flere enzymer og længere fordøjelsestider, når du bruger ældre mus eller transgene mus, der favoriserer fibrose. Som tidligere arbejde har understreget, er hurtig og luftfri kanylering samt øjeblikkelig perfusion af hjertet helt afgørende for god cellekvalitet11. Det anbefales ikke at tage længere tid end 90-180 sekunder fra at få hjertet og sætte det i stuetemperatur perfusionsbuffer til start af perfusion - jo hurtigere, jo bedre. Det er nyttigt at oprette alt det nødvendige udstyr i ét rum for at undgå lange afstande. Hvis der ønskes yderligere forkortelse af det iskæmiske interval, er det muligt at anvende en anden metode til narkose og efterfølgende eutanisering. Bedøm dyret fuldstændigt som beskrevet ovenfor, påfør en tilstrækkelig mængde fentanyl (eller en tilsvarende smertestillende medicin i overensstemmelse med dine retningslinjer for dyrevelfærd) i.p. og flyt dyret til en platform med en isofluranfordamper og en anæstesimaske, der er egnet til mus, hvilket giver konstant isofluran og iltstrøm. Fortsæt derefter som beskrevet ovenfor. Da dyret har en normal cirkulation, indtil de store kar er frakoblet med et enkelt snit, vil denne metode reducere no-flow-tiden betydeligt og kan dermed forbedre isolationskvaliteten, hvis det er nødvendigt.
Efter høst af hjertet er det afgørende at placere aortakanylen i den rigtige dybde for at sikre koronar perfusion. Det er derfor nødvendigt at skære aorta ved aortabuen eller ved den nedadgående aorta, når hjertet fjernes for at efterlade mindst 5 mm af aorta til kanylering, hvilket gør det muligt at binde sutureringssilke distalt fra koronararterierne, men før de første aorta sidegrene.
Under isolationsprocessen er flere celleoverførsler nødvendige, og pipettering med små pipettespidser vil forårsage høj forskydningsspænding til cellerne. Mulige løsninger til at reducere forskydningsspændingen er pipettering langsomt og forsigtigt samt at skære pipettespidserne med nogle millimeter i en vinkel på 45° for at udvide spidsåbningen. Yderligere reduktion af forskydningsspænding kan opnås ved at smelte de afskårne pipettespidser for at blødgøre kanterne. Isolationsudbyttet af ventrikulær isolering er normalt så højt, at forskydningsspændingsreduktion ikke er obligatorisk. Afhængigt af ens individuelle mål kan det endda være mere nyttigt at udsætte ventrikelceller for forskydningsstress for at vælge de 'stærkeste' celler. For atrieisolering er denne procedure imidlertid kritisk, da atrieceller er særligt sårbare efter fordøjelsen. Når der tilsættes opløsninger, anbefales det at undgå pipettering direkte på cellerne, men snarere forsøge at pipet langsomt ved rørvæggen.
Valget af kollagenase vil påvirke isolationsresultaterne betydeligt. Da der ikke kun er forskelle i enzympræparater, men også en relevant batch-til-batch-variation i enzymaktivitet, er titrering af kollagenasemængde og fordøjelsestid nødvendig, når man begynder at arbejde med et nyt parti enzym eller en ny stamme af mus. Den mængde og tid, der er angivet i tabellerne ovenfor, markerer dog et godt udgangspunkt for individuel optimering9. De fleste virksomheder leverer små enzymprøver til at teste individuelle batcher, hvilket gør batchvalg meget mere praktisk.
Calciumtransienter med typiske amplituder og normalt monofasisk henfald kan opnås, hvis celler isoleres uden brug af EGTA25 som tidligere beskrevet af Voigt et al.9,16. Denne protokol bruger derfor lave calciumkoncentrationer og undgår EGTA under isolationsprocessen. For at beskytte celler mod Ca 2+ paradoksfænomenet26 genindføres calcium trinvist og langsomt indtil en endelig koncentration på 1 mM. På grund af højere intracellulære natriumkoncentrationer er gnaverkardiomyocytter særligt tilbøjelige til calciumoverbelastning, og langsom og trinvis genindførelse er afgørende27. Behovet for calciumfrie opløsninger repræsenterer en af de største begrænsninger ved alle Langendorff-baserede gnaverkardiomyocytisolationer. Genindførelse af calcium fører altid til et betydeligt tab af levedygtige celler. Langsom og trinvis genindførelse som beskrevet her fører ikke desto mindre til tilstrækkeligt udbytte med god kvalitet til at opnå målinger fra hvert dyr pålideligt.
Det er vigtigt at vurdere celleudbytte og kvalitet lige efter calciumgenindførelse. Selvom den endelige evaluering finder sted, mens de isolerede celler lappes, kan man allerede bedømme cellemængde og kvalitet ved at kigge under mikroskopet, inden man lægger celler med calciumfølsomt farvestof. Celler af god kvalitet er tydeligt stangformede, har en homogen membran og trækker sig ikke sammen. Sammentrækning er et tegn på lav cellekvalitet, da det indikerer et tab af membranintegritet og kan være forårsaget af overfordøjelse eller anvendelse af høj forskydningsspænding. Et andet tegn på overfordøjelse er – udover mange celleskygger i forhold til levedygtige celler – en alt for flot membran, der er blevet renset for mange overfladeproteiner og er ekstremt sårbar, når man forsøger at nærme sig cellen med pipettespidsen for tætningsdannelse. Eksempler på sunde celler af god kvalitet er vist i figur 3. (Panel A: atriel myocyt, Panel B: ventrikulær myocyt). Isolationer med høje udbytter kan føre til, at celler er immune over for tætningsdannelse og omvendt. I sidste ende er den ultimative kvalitetstest uanset celleudseende og udbytte svaret på et simpelt spørgsmål: 'Er det muligt at udføre de ønskede målinger med resultater af høj kvalitet i de isolerede celler i hver isolation?'. Protokollen ovenfor gør et positivt svar muligt.
Mange isolationsprotokoller bruger afkoblingsmidlet Blebbistatin til at opnå højere udbytter og celler af bedre kvalitet. Denne protokol undgår med vilje Blebbistatin under hensyntagen til de offentliggjorte beviser for dets indflydelse på hjerteelektrofysiologi28,29 i optiske kortlægningseksperimenter. Anvendelse af afkoblingsmidler i elektrofysiologiske undersøgelser skal behandles med forsigtighed og bør begrænses til omstændigheder, hvor afkobling er obligatorisk.
Celler opnået med denne protokol kan anvendes i cirka seks timer efter belastning med Fluo-3, hvor atrieceller er mere sårbare over for tiden. Derfor anbefales det at studere atrieceller før ventrikelceller, hvis den samme forsker behandler dem.
En begrænsning ved denne protokol - som gælder for de fleste Langendorff-baserede isolationsprotokoller - er, at den er teknisk vanskelig. Det er klart, at musehjerter er små, og alle tekniske aspekter kræver meget motion. Det betyder, at en erfaren forsker vil opnå bedre resultater. Nogle protokoller bruger et konstant tryk til at perfusere hjertet. Dette har den fordel, at perfusionen på grund af fordøjelse og fortløbende tab af vævsresistens vil accelerere, og dette hjælper med at definere den optimale fordøjelsestid, men accelerationen kan skade vævet og reducere cellekvaliteten betydeligt. I en konstant flow-tilgang, som anvendes her, er der ingen klare benchmarks for fordøjelsestider, og det kan ofte være svært at stoppe fordøjelsen på et optimalt tidspunkt, hvilket markerer en relevant begrænsning. En anden begrænsning er, at isolerede celler i denne protokol kun blev testet for egnethed til de ovenfor beskrevne eksperimenter. Det er sandsynligt, at disse celler også kan bruges til forskellige analyser, men dette skal stadig bevises. Et første skridt i den retning var brugen af disse celler til at visualisere handlingspotentialer ved at indlæse dem med VF2.1CI, et nyligt afledt spændingsfølsomhedsfarvestof med overlegen kinetik til tidligere anvendte spændingsfølsomme farvestoffer ifølge en protokol offentliggjort af Seibertz et al.30. For at hjælpe med fejlfinding viser tabel 7 almindelige isolationsproblemer, og hvordan man griber dem an.
Samlet set tilbyder den beskrevne isolationsprotokol en arbejdsmetode til samtidig isolering af murine atriale og ventrikulære kardiomyocytter, hvilket gør det muligt for forskeren at opnå en atriel og ventrikulær elektrofysiologisk fænotype af en enkelt mus. Dette fjerner statistiske hindringer fra tidligere isolationsprotokoller, der kun isolerer enten atriale eller ventrikulære celler i høj kvalitet, og hjælper med at reducere antallet af dyr, der er nødvendige for en bestemt undersøgelse. Dette kan især være vigtigt, hvis indgreb som f.eks. implantation af osmotiske minipumper fyldt med dyre midler indgår i forsøgene, og det kan være en afgørende faktor i dyrevelfærdshensyn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af German Research Foundation (DFG; Klinikerforskerprogram i vaskulær medicin (PRIME), MA 2186/14-1 til P. Tomsits og D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 og SFB1002 projekt A13 til N. Voigt), German Research Foundation under Tysklands Excellence Strategy (EXC 2067/1- 390729940 til N. Voigt), German Centre for Cardiovascular Research (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss og N. Voigt; 81Z0600206 til S. Kääb), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss), Heinrich-og-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss) og Else-Kröner-Fresenius Foundation (EKFS 2016_A20 til N. Voigt). Bidragyderne havde ingen rolle i udarbejdelsen af manuskripter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 27G cannula | Servoprax | L10220 | |
| 4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
| disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
| Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
| Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
| Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
| surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
| suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
| syringe | Merck | Z683531-100EA | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
References
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al. Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).
- Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death. Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).
- Kirchhof, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).
- Dobrev, D., Nattel, S. New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation. Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).
- Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D.
- Schüttler, D., et al.
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of atrial myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).
- Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).
- Köhncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Brandenburg, S., et al. Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species. Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).
- Hofhuis, J., et al. Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system. Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart. Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).
- Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , (2020).
- Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).
- Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).
