Summary
En mångsidig mikrofluidisk anordning beskrivs som möjliggör kristallisering av ett enzym med hjälp av motdiffusionsmetoden, införandet av ett substrat i kristallerna genom blötläggning och 3D-strukturbestämningen av enzymet: substratkomplex genom en seriell analys av kristaller inuti chipet vid rumstemperatur.
Abstract
Beredningen av väldriffande kristaller och deras hantering före röntgenanalysen är två kritiska steg i biokristallografiska studier. Vi beskriver ett mångsidigt mikrofluidiskt chip som möjliggör produktion av kristaller med den effektiva metoden för motdiffusion. Den konvektionsfria miljön som tillhandahålls av de mikrofluidiska kanalerna är idealisk för kristalltillväxt och användbar för att sprida ett substrat till det kristallina enzymets aktiva plats. Här tillämpade vi detta tillvägagångssätt på CCA-adderande enzymet av den psykiska bakterien Planococcus halocryophilus i det presenterade exemplet. Efter kristallisering och substrat diffusion/blötläggning bestämdes kristallstrukturen i enzymet: substratkomplexet vid rumstemperatur genom seriell kristallografi och analys av flera kristaller direkt inuti chipet. Hela proceduren bevarar provens äkta diffraktionsegenskaper eftersom det inte kräver någon kristallhantering.
Introduction
Kristallografi är en metod för att dechiffrera 3D-arkitekturen hos biologiska makromolekyler. Det senare är viktigt för att förstå hur ett enzym väljer och bearbetar sina substrat. Bestämningen av en kristallstruktur kräver kristallisering av målmakromolekylen och kristallens konditionering för deras analys genom röntgendiffraktion1. Både kristallberedning och hantering är avgörande men känsliga steg som kan påverka kristallkvalitet och diffraktionsegenskaper, och därmed upplösningen (dvs. noggrannheten) för den resulterande 3D-strukturen. För att underlätta beredningen av högkvalitativa kristaller och eliminera onödig hantering för att bevara deras diffraktionsegenskaper designade vi en användarvänlig och mångsidig mikrofluidisk enhet som heter ChipX2,3,4.
I den här artikeln kommer vi att visa hur man laddar proteinlösningen i ChipX-kanaler med konventionellt laboratoriematerial för att förbereda kristaller genom motdiffusion. Denna kristalliseringsmetod ger en effektiv screening av övermättnad och av potentiella nukleationsförhållanden längs de mikrofluidiska kanalerna som innehåller enzymlösningen på grund av koncentrationsgradienten som genereras av diffusionen av kristalliserande medel5,6.
Chipinställningen är enkel, den använder bara standard laboratorierör och kräver ingen dyr utrustning. När kristaller har vuxit i ChipX kan enzymens ligands introduceras genom diffusion. Diffraktionsdata samlas sedan in vid rumstemperatur på en serie kristaller som finns i chipens kanaler med hjälp av en synkrotronröntgenkälla. Den strukturella studien som beskrivs här ledde till bestämning av strukturer av en tRNA mognad enzym i sin apo form och i komplex med en analog av dess CTP substrat införs genom blötläggning. Detta protein som kallas CCA-tillsatsande enzym polymeriserar CCA-trinukleotidsvansen i 3' änden av tRNAs. Jämförelsen av de två 3D-bilderna som erhållits genom seriell kristallografi avslöjar de lokala konformationsändringarna relaterade till bindningen av ligand under förhållanden som är mer fysiologiska än de som används i kryokristallografi. Protokollet som beskrivs i denna video är allmänt tillämpligt på alla biomolekyler, vare sig det är ett protein, en nukleinsyra eller ett multikomponentkomplex.
Protocol
1. Ställa in kristalliseringsanalyser i ChipX
OBS: ChipX mikrofluidiska enhet kan erhållas från författarna. En beskrivning av chippet ges i figur 1. Lösningar som innehåller kristallint (eller kristalliserande medel) som används för att utlösa kristallisering kan vara av kommersiellt ursprung eller beredda av experimenteraren.
- Lastning av biomolekylprovet
OBS: Den provvolym som faktiskt krävs för att utföra en individuell motdiffusionsanalys i den raka delen av varje kanal av ChipX är 300 nL. Men för bekvämlighet föreslår vi att ladda 5 μL för att helt fylla de åtta kanalerna med hänsyn till den varierande längden på deras böjda sektion och inlopp döda volymer.- Rör 5 μL enzymlösningar med standard 10 μL rör och spets.
- För in spetsen vertikalt i provinloppet och injicera lösningen tills de åtta kanalerna fylls upp till sin motsatta ände (inmatning av kristallbehållaren).
- Injicera 1 μL paraffinolja i provinloppet för att koppla bort kanalerna från varandra.
- Återvinn den extra lösningen i kristallnedbehållaren i änden av varje kanal med en standardledning på 10 μL.
- Försegla provinloppet med en tejp på 1 cm x 1 cm.
- Laddar kristalliseringslösningarna
- Rör 5 μL kristalliseringslösning med standard 10 μL rör och spets. Reservoarvolymen är 10 μL, men om du bara lastar hälften av den undviks spill vid tätning med tejp och underlättar ytterligare tillsats av ligand för blötläggningsexperiment. Om initiala kristalliseringsförhållanden erhölls genom ångdiffusion, öka kristallintkoncentrationen med en faktor 1,5 - 2. Lösningar kan vara olika i varje reservoar (i det presenterade fallet användes 1 M diammonium vätefosfat, 100 mM natriumacetat, pH 4,5 hela).
- Orientera rörspetsen mot kanalens ingång i den trattformade delen av behållaren för att undvika bildandet av en luftbubbla vid lösningsdeposition. Det skulle förhindra kontakten mellan de två lösningarna och kristallande diffusion i kanalen.
- Injicera kristallnedlösningen i behållaren.
- Försegla behållarna med en tejp på 2,5 cm x 1 cm.
- Inkubera chipet vid 20 °C (temperaturen kan justeras beroende på målet, vanligtvis mellan 4 och 37 °C 4).
2. Proteinmärkning med karboxyrhodamin för fluorescensdetektering
Obs: Det här steget är valfritt. Det måste utföras före provbelastning för att underlätta detektion av kristaller i chipet med fluorescens. Den detaljerade metoden för spår fluorescerande märkning beskrevs av Pusey och medarbetare7. Alla steg utförs vid rumstemperatur.
- Lös upp 5 mg karboxyrhodaminesterpulver i 1 mL vattenfri dimetylformamid, dela lösningen i 0,6 μL alikvoter som ska förvaras vid -20 °C.
- Förbered en 1 M Na-borate pH 8,75 lagerlösning.
- Späd ut beståndet för att förbereda reaktionsbufferten vid 0,05 M Na-borat pH 8,75.
- Skölj en avsaltningskolonn (7 kDa MWCO, 0,5 ml) med 800 μL reaktionsbuffert.
- Centrifugera kolonnen i 1 min vid 1400 x g, ta bort filtratet.
- Upprepa den här åtgärden två gånger (steg 2.4-2.5) för att tvätta kolonnen.
- Deponera 80 μL protein i sin lagringsbuffert på kolonnen (proteinet kan spädas ner till 1 mg/ml för att öka volymen vid behov).
- Centrifugera kolonnen i 1 min vid 1400 x g. Detta steg är avsett att överföra proteinet från dess lagringsbuffert till reaktionsbufferten.
- Återvinn genomflödet (som innehåller proteinet i reaktionsbufferten) och blanda det med 0,6 μL karboxyrhodaminlösning.
- Inkubera 5 min vid rumstemperatur.
- Skölj under tiden kolonnen 3 x med lagringsbufferten, centrifugera kolonnen i 1 min vid 1400 x g och kassera filtratet.
- Sätt in reaktionslösningen på kolumnen.
- Centrifugera kolonnen i 1 min vid 1400 x g och återställ genomflödet (dvs. lösning av märkt protein i lagringsbufferten).
- Komplettera stamproteinlösningen med 0,1-1 % (w/w) märkt protein.
- Ställ in ChipX kristalliseringsanalyser enligt beskrivningen i avsnitt 1.
- Kontrollera förekomsten av proteinkristaller i analyserna genom att spännande fluorescerande sonden med en 520 nm våglängdsljuskälla.
3. Kristallobservation
OBS: ChipX-enheten kan hanteras utan särskild försiktighet, även med kristaller inuti, förutom om temperaturen behöver kontrolleras.
- Använd stereomikroskop för att kontrollera resultatet av kristalliseringsanalyser i ChipX. Dess fotavtryck har standardmåtten på mikroskopbilder och är kompatibelt med alla system och glidhållare.
- Kontrollera innehållet i mikrofluidkanaler som börjar från behållaren där kristallnedhalten är högst till provinloppet där kristallhalten är den lägsta. ChipX-materialet är transparent för synligt ljus, kompatibelt med användning av polarisatorer, samt med UV-belysning för proteinkristallidentifiering genom inneboende tryptofanfluorescens8.
- Registrera kristallpositioner med hjälp av etiketterna som är präglade längs kanalerna eller markera kristallplatser med en permanent markör genom att rita färgpunkter bredvid dem på spånytan.
4. Kristall blötläggning med ligands
OBS: Den här proceduren är valfri. Det används för att introducera ligands, enzymsubstrat eller tunga atomer i kristallerna och bör utföras minst 24-48 h före röntgenanalys för att tillåta den sammansatta diffusionen längs kanalerna och in i kristallerna.
- Ta försiktigt bort tätningstejpen från reservoarerna.
- Lägg till upp till 5 μL ligandlösning i en eller flera reservoarer med en 10 μL mikropipet (i exemplet tillsattes 3 μL 10 mM cytidin-5'-[(α,β)-methyleno] triphosphate (CMPcPP) lösning för att uppnå en slutlig koncentration på 3,75 mM). CMPcPP är en icke-hydrolizable analog av CTP, ett naturligt substrat av enzymet.
- Försegla behållarna med en tejp på 2,5 cm x 1 cm.
- Inkubera chipet under kontrollerad temperatur i 24-48 h för att möjliggöra ligand diffusion längs chipens kanaler.
5. Kristallanalys genom seriell kristallografi
OBS: Denna del av protokollet måste anpassas beroende på strållinjens inställning och kristallens diffraktionsegenskaper. Endast allmänna indikationer ges för den kristallografiska analysen baserad på experiment utförda vid X06DA beamline (SLS, Villigen, Schweiz).
- ChipX montering på beamline goniometern
OBS: Filen för 3D-utskrift av ChipX-hållaren finns i ref4.- Stäng av strållinens kryostråle. Analysen här utförs vid rumstemperatur.
- Montera ChipX på en dedikerad hållare med kanalen som innehåller kristallerna som ska analyseras placerade i mitten av hållaren. ChipX-hållaren 4 kräver ingen skruv eller ytterligare del, eftersom den är utformad för att ge en perfekt passform för ChipX.
- Fäst hållaren på goniometern.
- Datainsamling
- Orientera det tjockaste lagret (översta skiktet, figur 1) av ChipX (i denna orientering är etiketter längs kanalerna direkt läsbara med hjälp av strållinjens centrerande kamera), mot direktstrålen och det tunnaste ansiktet bakom kristallen för att minimera diffractedsignalens diffractedsignal enligt beskrivningen i ref3.
- För att undvika kollision mellan ChipX och det omgivande materialet (beamstop, collimator), begränsa goniometerrörelserna i intervallet ±30° (0° vilket motsvarar kanalerna som är vinkelräta mot röntgenstrålen).
- Hitta kristaller position med hjälp av etiketterna präglade längs kanalerna.
- Välj en kristallposition.
- Centrera kristallen antingen genom standard screening med låg dos grid/raster eller 1-klicksprocedur (videon visar ett exempel på rutnätsscreening).
- Samla in diffraktionsdata inom intervallet -30° / +30°.
- Starta om proceduren i steg 5.2.4-5.2.6 på en annan kristall i samma kanal efter översättning av chippet.
- Justera manuellt en annan ChipX-kanal i mitten av hållaren och fortsätt datainsamlingen på kristaller som finns i denna kanal.
- Använd standardkristallografiska paket och procedurer för att bearbeta och sammanfoga data och sedan lösa och förfina strukturen.
Representative Results
Det mikrofluidiska chipet som beskrivs här var utformat för att möjliggöra enkel installation av kristalliseringsanalyser och kristallanalys vid rumstemperatur. Förfarandet som beskrivs ovan och i videon tillämpades inom ramen för den strukturella karakteriseringen av CCA-adderande enzym från den kall-anpassade bakterien Planococcus halocryophilus. Detta enzym tillhör en essentiell polymerasfamilj som katalyserar den sekventiella tillsatsen av 3' CCA-sekvensen på tRNAs med CTP och ATP9,10.
Chipet användes först för att förbereda kristaller av enzymet för strukturell analys med hjälp av metoden för motdiffusion. För detta ändamål laddades enzymlösningen i de åtta mikrofluidkanalerna (kristalliseringskammare) genom en enda injektion i chipens provinlopp (se figur 1). Enzymet användes vid 5,5 mg/ml i sin lagringsbuffert som innehöll 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl och 5 mM MgCl2. Detta steg utfördes manuellt med en standard 10 μL mikropipet. Kristalliseringslösningar (100 mM natriumacetat pH 4,5,1 M diammonium vätefosfat) deponerades sedan i reservoarerna vid den andra änden av kanalerna.
Lastningsförfarandet är enkelt och tar inte längre tid än fem minuter (figur 2). Kristallintet sprider sig sedan in i kanalerna, skapar en gradient av koncentration som utlöser kristallkärna och tillväxt. Denna gradient utvecklas dynamiskt och utforskar ett kontinuum av övermättnad tillstånd5,6 tills man når en jämvikt av kristallned koncentration mellan kanalerna och reservoaren. Kristalliseringsanalyser kontrolleras vanligtvis under mikoscopet under en period av 2- 4 veckor för att spåra tillväxten av kristaller. Bipyramidala kristaller av CCA-tillsatsande enzym uppträdde i kanalerna efter några dagars inkubation vid 20 °C (figur 3). Den valfria fluorescerandemärkningen 7 av proteinet underlättar i hög grad identifieringen av proteinkristaller och deras diskriminering från saltkristaller (figur 4).
Vi utnyttjade den diffusa miljön i spånkanaler för att leverera ett substrat till enzymet som bygger upp kristallerna. I det aktuella fallet tillsattes CMPcPP, en CTP-analog, till reservoarlösningarna vid en slutlig koncentration på 3,75 mM (figur 5). Detta tillägg utfördes två dagar före den kristallografiska analysen för att cmpcpp ska kunna nå och uppta enzymets katalytiska plats, vilket senare bekräftades av kristallstrukturen (se nedan).
Vi tillverkade en spånhållare (figur 6) i polylaktisk syra med hjälp av en 3D-skrivare. Hållaren möjliggör spånmontering på gonimetrar med hjälp av vanliga magnetiska huvuden. Därför kan chipet enkelt placeras och översättas i röntgenstrålen för att föra kristallerna i diffraktionsläge. Datainsamlingsstrategin måste anpassas beroende på strållinjeegenskaper och kristallegenskaper. När det gäller CCA-adderande enzym samlades data in vid röntgen- och X10SA-strållinjer, swiss light source (SLS), med en röntgenvåglängd på 1,0 Å respektive Pilatus 2M-F respektive 6M pixeldetektorer. 30-60° rotation samlades in på varje kristall vid rumstemperatur med bilder på 0,1° eller 0, 2° och 0, 1 s exponering (se tabell 1). Partiella datamängder bearbetades individuellt och klipptes när upplösningen av diffraktionsmönster började förfalla på grund av strålningsskador (detekterades av minskningen av signal-till-brusförhållandet 
och CC1/2, och en ökning avR-meas i det högupplösta skalet). Fullständiga datamängder rekonstruerades genom sammanslagning av data från 5 kristaller (tabell 1). Kristallstrukturer härleddes genom molekylär ersättning med hjälp av kristallografiska standardförpackningar och procedurer för databehandling11 och förfining12. Jämförelsen av enzymens strukturer och dess komplex med CMPcPP avslöjar den lokala konformationsanpassningen som åtföljer substratbindning på det aktiva området för CCA-adderande enzym (figur 7).
Bild 1: ChipX-design. Chippet består av ett toppskikt av COC (tjocklek: 1 mm) där åtta mikrofluidiska kanaler och reservoarer är inpräntade. Hela chipet är förseglat med ett lager COC (tjocklek: 0,1 mm). Alla kanaler är anslutna till ett enda inlopp på vänster sida för samtidig provinjektion och till enskilda reservoarer på höger sida där kristalliseringslösningar deponeras. Kanalerna, som utgör chipets faktiska kristalliseringskammare, är 4 cm långa och har ett tvärsnitt på 80 μm x 80 μm. Etiketter (A1, A2, A3 osv.) präglade längs kanalerna underlättar kristallpositionering under mikroskopet och upprättande av en provlista för datainsamling. ChipX har storleken på en standardmikroskopbild (7,5 cm x 2,5 cm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Ställa in kristalliseringsanalyser i ChipX. 1) Deponera 5-6 μL enzymlösningar med standard 10 μL rör och spets. 2) För in spetsen vertikalt i provinloppet och injicera lösningen i de åtta kanalerna. 3) Rör 1 μL paraffinolja. 4) För in spetsen vertikalt i provinloppet och injicera oljan för att koppla bort kanalerna från varandra. 5) Försegla inloppet med en bit tejp. 6) Rör 5 μL kristalliseringslösning med standard 10 μL rör och spets. Lösningar kan vara olika i varje reservoar (t.ex. från ett screeningkit). 7) Orientera rörspetsen mot kanalens ingång i behållarens trattformade del (för att undvika bildandet av en luftbubbla vid lösningsdeposition) och injicera kristalllösningen i behållaren. 8) Försegla reservoarerna med en bit tejp och inkubera chipet vid kontrollerad temperatur. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Kristaller av CCA-tillsatsande enzym som odlas genom motdiffusion i ChipX mikrofluidiska kanaler. Skalstrecket är 0,1 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4:Kristall blötläggningsprocedur. 1) Ta försiktigt bort tejpen från reservoarerna. 2) Deponera upp till 5 μL ligandlösning med en 10 μL mikropipet. 3) Tillsätt ligand i en eller flera reservoarer. 4) Försegla reservoarerna igen med en tejpbit och inkubera chipet under kontrollerad temperatur i 24-48 timmar före datainsamling. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Spår fluorescerande märkning diskriminerar protein (vänster) från salt (höger) kristaller. Den CCA-tillsatsande enzymlösningen innehöll 0,4 % (w/w) protein märkt med karboxyrhodamin. Till höger belyses kristaller med en 520 nm våglängdsljuskälla och bilden är tagen med ett lågpassfilter vid 550 nm (LP550); (inset) struktur av carboxyrhodamine-succinimidyl ester. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 6: (Vänster) Ritning av ChipX-hållaren och (höger) ChipX monterad på goniometern för beamline X06DA vid SLS (Villigen, Schweiz) för seriell kristallanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Jämförelse av CCA-tillsatsande enzym aktivt ställe i apoform (i rosa) och i komplexet med en CTP-analog (i grönt). Även om den övergripande konformationen av enzymet inte påverkas, åtföljs bindningen av CMPcPP ligand av en liten omorganisation av sidokedjor på den aktiva platsen. 2Fo-Fc elektrontäthetskarta (i blått) är konturerad vid 1,2 sigma. Skillnaden elektrontäthetskarta konturerad vid 4 sigma (i grönt) bekräftar närvaron av ligand på den aktiva platsen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Kristalliserat prov | CCA-tillsatsande enzym | CCA-adderande enzym + CMPcPP |
| Kristallanalys | ||
| Röntgenstrålelinje | SLS – X06DA | SLS – X10SA |
| Våglängd (Å) | 1.000 | 1.000 |
| Temperatur (K) | 293 | 293 |
| Detektor | Pilatus 2M-F | Pilatus 6M |
| Kristalldetektoravstånd (mm) | 300 | 400 |
| Kristaller insamlade | 6 | 14 |
| Kristaller markerade | 5 | 5 |
| Rotationsområde per bild (°) | 0.1 | 0.2 |
| Exponeringstid per bild (er) | 0.1 | 0.1 |
| Nej. av markerade bilder | 1000 | 540 |
| Totalt rotationsområde (°) | 100 | 108 |
| Rymdgrupp | P43212 | P43212 |
| a, c (Å) | 71.5, 293.8 | 71.4, 293.6 |
| Genomsnittlig mosaikitet (°) | 0.04 | 0.04 |
| Upplösningsområde (Å) | 46 – 2.54 (2.6 – 2.54) | 48 – 2.3 (2.4 – 2.3) |
| Totalt antal. av reflektioner | 176105 (9374) | 232642 (32937) |
| Nej. av unika reflektioner | 23922 (1598) | 34862 (4066) |
| Fullständighet (%) | 90.6 (84.6) | 99.5 (100.0) |
| Redundans | 7.5 (6.0) | 6.7 (8.1) |
|
8.1 (1.3) | 6.9 (0.7) |
| Rmeas (%) § | 18.6 (126.0) | 18.0 (231.2) |
| CC1/2 (%) £ | 98.7 (55.0) | 98.7 (46.9) |
| Total B-faktor från Wilson plot (Å2) | 57.4 | 60.6 |
| Kristallografisk förfining | ||
| Nej. reflektioner, arbetsset /testuppsättning | 23583 / 1180 | 34840 / 3405 |
| Slutlig Rcryst (%) /R-fri (%) | 18.8 / 21.4 | 20.0 / 22.9 |
| Nej. av icke-H-atomer: totalt / protein / ligand / lösningsmedel | 2998 / 2989 / 0 / 9 | 3057 / 2989 / 29 / 10 |
| R.m.s. avvikelser för obligationer (Å) / vinklar (°) | 0.009 / 1.23 | 0.010 / 1.22 |
| Genomsnittliga B-faktorer (Å2): totalt / protein / ligand / lösningsmedel | 60.1 / 60.1 / 0 / 52.7 | 62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5 |
| Ramachandran plot: mest gynnad (%) / tillåten (%) | 98.1 / 1.9 | 97.2 / 2.8 |
| PDB-ID | 6IBP (på 6IBP) | 6Q52 (på 6Q52) |
Tabell 1: Statistik över insamling och förfining av uppgifter
§ Redundansoberoende Rmeas = Σhkl(N/N-1)1/2Σi | Ii(hkl)-
£ Data med låg i yttre skal (<2.0) inkluderades baserat på CC1/2-kriterium (korrelation mellan två slumpmässiga halvor av datauppsättningen > 50%) enligt Karplus & Diederichs 18.
Discussion
Nuvarande protokoll inom biokristallografi innebär beredning av kristaller med metoder som ångdiffusion eller sats13,14, och deras överföring till en mikroloop för kryokylning15,16 innan diffraktionsanalysen utförs i en kvävestråle vid kryogena förhållanden. Däremot är direkt kristall cryo-kylning inte möjligt i ChipX3 och kristaller kan inte extraheras från deras mikrofluidiska kanal, vilket kan ses som begränsningar för denna installation. Det protokoll som beskrivs i artikeln ger dock en helt integrerad rörledning för bestämning av kristallstrukturer vid rumstemperatur (dvs. under mer fysiologiska förhållanden). Även om datainsamling vid rumstemperatur orsakar en ökning avstrålningsskador 19, uppvägs denna effekt av snabb datainsamlingstid (högst 60° rotation samlas in på varje kristall) och genom sammanslagning av flera partiella datamängder. Både ChipX design och material optimerades för att minska bakgrundsspridning och diffraktionssignaldämpning3, och datainsamling kan utföras på kristaller med dimensioner motsvarande hälften av kanalerna (40 μm)4.
Sammanfattningsvis är de viktigaste fördelarna med protokollet följande. Kristallerna produceras i en konvektionsfri miljö (mikrofluidiska kanaler), vilket är mycket gynnsamt för tillväxten av högkvalitativa kristaller. Den motdiffusionsmetod som implementeras i ChipX är mycket effektiv vid screening av övermättnadslandskapet; diffusionen av kristallaner i spånkanalen skapar en koncentrations- och övermättnadsvåg som hjälper till att bestämma lämpliga nukleations- och tillväxtförhållanden5. Kristaller hanteras aldrig direkt, men analyseras på plats, inuti chipet, som bevarar deras äkta diffraktionsegenskaper (dvs. förändrar inte kristallmosaik genom fysisk interaktion eller kryokylning)20. Diffraktionsanalysen utförs på en serie kristaller som distribueras längs chipkanalerna med låg dosexponering för att minimera strålningsskador, och en fullständig datauppsättning monteras genom sammanslagning av partiella data från serien. ChipX standardavtryck och enkla design kommer i framtiden att möjliggöra en fullständig automatisering av in situ-datainsamling med hjälp av synkrotron- eller XFEL-anläggningar. Alla steg i protokollet utförs i ChipX. Från experimenterarsynpunkt är spåninställningen enkel och enkel att utföra med standardrör och kräver ingen extra utrustning. Den trädliknande kanalanslutningen vid provinloppet minimerar döda volymer i systemet, vilket är viktigt när du arbetar med prover som är svåra att rena eller som endast är tillgängliga i begränsad mängd.
Sammanfattningsvis förenklar och miniatyriserar lab-on-a-chip-metoden som implementeras i ChipX och miniatyriserar effektivt kristalliseringsprocessen genom kontradiffusion och kristallstrukturbestämning, vilket gör det möjligt att gå från provet till dess 3D-struktur i en enda enhet. Det är allmänt tillämpligt och erbjuder en användarvänlig, kostnadseffektiv lösning för rutinmässiga seriella biokristallografiundersökningar vid rumstemperatur.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner swiss light source (Villigen, Schweiz) för beamtime tilldelning till projektet på beamlines X10SA (PXII) och X06DA (PXIII), Alexandra Bluhm för hennes bidrag till strukturförfining, Clarissa Worsdale för inspelning av voiceover och François Schnell (Université de Strasbourg) för hans hjälp i videoredigering och SFX. Detta arbete stöddes av det franska centret National de la Recherche Scientifique (CNRS), universitetet i Strasbourg. LabEx-konsortiet "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), en doktorandfinansiering till R.dW från Excellence-initiativet (IdEx) vid universitetet i Strasbourg inom ramen för det franska nationella programmet "Investissements d'Avenir", en doktorandfinansiering till K.R. från det fransk-tyska universitetet (UFA-DFH, beviljar nej. CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (bidrag nr. Mo 634/10-1). Författarna drog nytta av samarbetsprogrammet PROCOPE Hubert Curien (franska utrikesdepartementet och Deutscher Akademischer Austauschdienst).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axioscope A1 stereomicroscope | Zeiss | Crystal observation (step 3) | |
| Carboxyrhodamine succinimidyl ester | Invitrogen | C-6157 | Protein labeling (step 2) |
| CMPcPP | Jena Bioscience | NU-438 | Crystal soaking (step 4) |
| Crystal clear sealing tape | Hampton research | HR3-511 | ChipX sealing (step 1) |
| Parafin oil | Hampton research | HR3-411 | ChipX loading (step 1) |
| Ultimaker 2 extended+ | Ultimaker | 3D printer - Representative results | |
| UV light source | Xtal Concepts Gmbh | XtalLight100c | Crystal observation (step 3) |
| Zeba spin desalting column 7K MWCO | ThermoFisher Scientific | 89882 | Protein labeling (step 2) |
References
- Giegé, R., Sauter, C.
- Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).
- Pinker, F., et al. ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature. Crystal Growth & Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).
- de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).
- García-Ruiz, J. M.
- Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
- Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. Trace fluorescent labeling for protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).
- Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).
- Betat, H., Rammelt, C., Mörl, M. tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).
- Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., Jühling, F., Betat, H., Mörl, M. Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity. RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).
- Kabsch, W.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
- Dessau, M. A., Modis, Y.
- Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Giegé, R. Crystallization - General Methods. International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. , 99-120 (2012).
- Garman, E. "Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage. Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).
- Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -P., Weik, M. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).
- Nave, C. A.
