מאמר זה מתאר פרוטוקול למניפולציה של מטרות מולקולריות בקליפת המוח באמצעות וירוסים הקשורים אדנו לניטור ההשפעות של מניפולציה זו במהלך ערנות ושינה באמצעות הקלטות אלקטרוקורטיקוגרפיות.
השימוש בהקלטות אלקטרוקורטיקוגרפיות (ECoG) במכרסמים רלוונטי למחקר שינה ולחקר מגוון רחב של מצבים נוירולוגיים. וירוסים הקשורים אדנו (AAVs) משמשים יותר ויותר כדי לשפר את ההבנה של מעגלי המוח ואת הפונקציות שלהם. המניפולציה בתיווך AAV של אוכלוסיות תאים ספציפיות ו/או של רכיבים מולקולריים מדויקים הייתה שימושית מאוד לזיהוי מעגלים/מולקולות רגולטוריות שינה חדשים וחלבונים מרכזיים התורמים להשפעות השליליות של אובדן שינה. לדוגמה, עיכוב הפעילות של קופילין חלבון ניתוק אקטין חוטי באמצעות AAV מונע ליקוי זיכרון הנגרמת מחוסר שינה. כאן, פרוטוקול מתואר המשלב את המניפולציה של תפקוד cofilin באזור קליפת המוח עם הקלטה של פעילות ECoG כדי לבחון אם cofilin קליפת המוח מווסת את האותות ערות ושינה ECoG. הזרקת AAV מבוצעת במהלך אותו הליך כירורגי כמו השתלת אלקטרודות ECoG ואלקטרומיוגרפיה (EMG) בעכברים זכר ונקבה בוגרים. עכברים הם מרדים, וראשיהם מגולחים. לאחר ניקוי העור וחבטה, נקבעים קואורדינטות סטריאוטקסיות של קליפת המוח המוטורית, והגולגולת מנוקבת במיקום זה. צינורית ממולאת מראש עם AAV מבטא cofilinS3D, צורה לא פעילה של cofilin, ממוקם לאט ברקמת קליפת המוח. לאחר עירוי AAV, ברגים מצופים זהב (אלקטרודות ECoG) מוברגים דרך הגולגולת ומחזקים לגולגולת עם חוטי זהב המוחדרים לשרירי הצוואר (אלקטרודות EMG). בעלי החיים מורשים שלושה שבועות להתאושש ולהבטיח ביטוי מספיק של cofilinS3D. האזור הנגוע וסוג התא מאומתים באמצעות אימונוהיסטוכימיה, וה- ECoG מנותח באמצעות זיהוי חזותי של מצבי דריכות וניתוח ספקטרלי. לסיכום, גישה מתודולוגית משולבת זו מאפשרת לחקור את התרומה המדויקת של רכיבים מולקולריים המסדירים את המורפולוגיה העצבית ואת הקישוריות לוויסות פעילות קליפת המוח המסונכרנת במהלך ערנות ושינה.
הקלטות אלקטרואנצפלוגרפיות (או בדרך כלל אלקטרוקורטיקוגרפיות [ECoG] במכרסמים) והקלטות אלקטרומיוגרפיות (EMG) נמצאות בשימוש נרחב במחקר שינה, כמו גם באופן רחב יותר במדעי המוח, הנוירולוגיה והפסיכיאטריה. בשילוב, אותות אלקטרופיזיולוגיים אלה מאפשרים זיהוי של מצבי דריכות וכימות לאחר מכן של משך המדינה והרכב ספקטרלי, הן בבני אדם והן מכרסמים1,2,3,4. כימות כזה היה שימושי כדי להבין כיצד שינה משתנה בתנאים פתולוגיים כגון מחלות ניווניות ומודלים5,6,7 או על ידי שינוי גנטי8,9. לדוגמה, הנוקאאוט (KO) של גנים שונים הקשורים לתקשורת עצבית הוכח כמשתנה את משך הערנות והשינה הן בעכבר והן בזבוב הפירות10,11,12,13. כדי להתמודד עם פיצוי התפתחותי פוטנציאלי הנובע ממחקר של KO גוף מלא במכרסמים ולאפשר שליטה עדינה יותר של מניפולציה גנטית, דרך יעילה לתפעל ביטוי גנים היא להשתמש בווירוסים הקשורים אדנו (AAVs). מניפולציה גנטית בתיווך AAV יכולה לשמש כדי למטה – או upregulate יעד מולקולרי נתון ולהגביל את המניפולציה לאוכלוסיית תאים מסוימת באמצעות סוגים שונים של מקדמים14. AAVs משמשים גם באופן נרחב כשיטת מסירה בחזרות פלינדרומיות קצרות משולבות באופן קבוע (CRISPR)/Cas9טכנולוגיית 15,16. מתודולוגיות אלה מאפשרות שליטה זמנית ומרחבית טובה יותר במניפולציה גנטית, הקשורה בדרך כלל לביטוי של כתב המאפשר כימות של האזור הנגוע באמצעות אימונופלואורסצנטיות.
AAVs מייצגים גם את הווקטור העיקרי עבור מניפולציות ספציפיות לסוג התא של פעילות עצבית באמצעות אופטוגנטיקה וכימוגנטיקה17,18,19, אשר היו בשימוש נרחב במחקר האחרון על מחלות ניווניות, התנהגות, קוגניציה, ושינה20,21,22. במחקר שינה, היישום של אופטוגנטיקה להפעלה או עיכוב של אזורי מוח מסוימים, כגון המוח המבסאלי, ההיפותלמוס, ו tegmentum sublaterodorsal, היה שימושי כדי לקבוע את תפקידם בשליטה על עוררות, שינה בגל איטי (הידוע גם בשם שינה תנועות עיניים לא מהירה), שינה פרדוקסלית (או שינה תנועת עיניים מהירה), ו cataplexy23, 24,25. יתר על כן, מניפולציות בתיווך AAV עזרו לברוח מעגלי שינה חשובים רגולטוריים ומולקולות התורמות להשפעות השליליות של אובדן שינה26,27,28. לדוגמה, חלבון אחד שהוכח כמי ש מעורב בפגיעה בזיכרון הנגרמת מחוסר שינה הוא cofilin29,30. חלבון זה הוא חלבון ניתוק אקטין חוטי המשתתף בארגון מחדש של חוטי actin על ידי מחייב פיזית לפעול ולקדם את פירוק הסיבים באופן דינמי31. עיכוב פעילות cofilin באמצעות גישה בתיווך AAV הוכח כדי למנוע אובדן עמוד השדרה, כמו גם פלסטיות סינפטית ליקויי זיכרון הנגרמים על ידי מניעת שינה בעכברים29. באופן קולקטיבי, מחקרים אלה מדגישים את התועלת והרלוונטיות של מניפולציות בתיווך AAV כדי להבין את ויסות השינה ואת ההשלכות של מניעת שינה במכרסמים.
כאן, פרוטוקול מתואר המשלב ECoG ו EMG אלקטרודה השתלה והקלטה עם מניפולציה של תפקוד cofilin באזור קליפת המוח של עכברים מסוג בר (WT) באמצעות AAV. ליתר דיוק, AAV (serotype 9) מבטא את רצף הקידוד של צורה phosphomimetic של cofilin העכבר (cofilinS3D), עיבוד זה לא פעיל32,33, מוזרק בקליפת המוח המוטורית (M1 ו- M2). אלקטרודה ECoG מושתל ישירות באתר ההזרקה כדי להבטיח הקלטה של הפעילות הקליפתית המסונכרנת של התאים הנגועים. הקלטת ECoG/EMG נערכת במשך 24 שעות בתנאים ללא הפרעה שלושה שבועות לאחר הניתוח כדי לאפשר התאוששות, הסתגלות וביטויS3D קופלין גבוה. ההקלטה משמשת לאחר מכן לזיהוי מצבי דריכות וניתוח ספקטרלי ECoG, כפי שתואר במחקרים קודמים11,34. מתודולוגיה זו יכולה לחשוף באופן ספציפי כיצד cofilin קליפת המוח מווסת ערנות לישון אותות ECoG בעכברים. שילוב זה של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ומניפולציה גנטית בתיווך AAV רלוונטי במיוחד כדי לחקור את התפקידים של אלמנטים מולקולריים שונים בתפקודי מוח ספציפיים וניתן להחיל אותו על אזורי מוח קליפת המוח (ותת-קורטיקלי) של עניין WT ועכברים מהונדסים גנטית משני המינים ואפילו מינים אחרים.
פרוטוקול זה מתאר שיטה מדויקת ופשוטה לניטור פעילות ECoG ו- EMG במהלך מניפולציה של מטרות מולקולריות באמצעות AAVs. לשם השוואה מספקת בין קבוצות, מומלץ מאוד לתכנן תמיד הליכים כירורגיים (הזרקת AAV והשתלת אלקטרודה) באותו יום עבור חיות בדיקה ובקרה, ולתעד את האותות האלקטרופיזיולוגיים שלהם בו זמנית. כדי להשיג ביטוי ויראלי דומה בין בעלי החיים בדיקה ושליטה, הזרקת אותו טיטר ויראלי רצוי. במקרה הנוכחי, טיטר ויראלי של שליטה AAV צומצם למחצית הבדיקה AAV כדי להבטיח ביטוי ויראלי דומה. הנסיינים צריכים להיות זהירים מאוד עם מדידות של קואורדינטות סטריאוטקזמיות כדי להבטיח שונות נמוכה בין בעלי חיים באזור המוח / פילוח שכבה קליפת המוח. בנוסף, בהתחשב בכך שעומק ההזרקה מחושב מפני השטח של הגולגולת, וכי עובי הגולגולת משתנה בהתאם לגיל ולמין, יש תמיד לאמת את מיקום הצינורית באמצעות היסטולוגיה פוסט-פרוטוקולית או אימונוהיסטוכימיה (למשל, איור 2) כדי להבטיח מיקום נאות / עומק הזרקה, ויש להתאים את הקואורדינטות הסטריאוטקזיות במידת הצורך. במהלך הזרקת AAV של 40 דקות, חשוב מאוד לעקוב אחר מהירות ההזרקה כדי לזהות ולתקן במהירות בעיות פוטנציאליות כגון חסימת משאבה. כמה צעדים ניסיוניים חיוניים גם כדי להשיג אותות אלקטרופיזיולוגיים אופטימליים. לדוגמה, לא לצווח יתר במהלך השתלת אלקטרודה; ברגים צריכים לבלוט מתוך הגולגולת על ידי לפחות 2.5 מ”מ כדי למזער את הנזק קליפת המוח ואת היווצרות של צלקת גליה. לאחר מכן, זה גם מאוד חשוב i) להימנע החלת מלט על הגפיים של האלקטרודות, ii) להבטיח הלחמה מהירה של האלקטרודות למחבר, ו- iii) לוודא כי אין מגע בין האלקטרודות.
ההליך המוצג כאן להקלטת ECoG ו- EMG מבוסס היטב, פשוט, בשימוש נרחב לניטור ערנות ושינה בעכברים2,11,13,34. הקלטות רציפות של ECoG ו- EMG יכולות להתבצע במשך מספר ימים רצופים (ואפילו שבועות) וליצור ערכת נתונים עשירה מאוד שניתן להשתמש בה כדי לבצע מספר שורות של ניתוח הכוללות משתנים הקשורים להתעוררות וכמות שינה וארכיטקטורה2,11,12 (למשל, זמן שהושקע במצבים שונים לכל תקופות אור וחושך, מספר פרקים של כל מדינה, התפלגות של שינה של 24 שעות), ערנות ותוכן ספקטרלי לשינה34,41 (למשל, כוח ברצועות תדרים שונות [בדומה לאיור 3], פעילות ללא קנה מידה), ומאפיינים של גלים בודדים42,43,44 (למשל, משרעת גל איטי ושיפוע). כאשר נעשה שימוש בשילוב עם מניפולציות מולקולריות בתיווך AAV, יתרון נוסף הוא הימנעות של פיצוי התפתחותי פוטנציאלי שיכול להתרחש בבעלי חיים מהונדסים. עם תרגול, ההליך כולו, כולל הזרקת AAV 40 דקות, יכול להתבצע בכ 90 דקות. שיעור התמותה צריך להיות (מאוד) נמוך כמו הניתוח הוא זעיר פולשני.
השימוש בו זמנית בהקלטת ECoG/EMG ומניפולציה ממוקדת עם AAV מציע מגוון יתרונות ויישומים אחרים. לדוגמה, הדיוק של פילוח סטריאוטקסי, כאשר מבוצע כראוי, הוא גבוה מאוד וניתן לשכפול והוא שימושי כדי לקבוע את התפקיד הספציפי של אזור מוח נתון (ו / או סוג תא או אלמנט מולקולרי בתוך האזור) בוויסות השינה או תהליכים פיזיולוגיים אחרים. לפיכך, ניתן למקד בקלות מספר אזורים קליפתיים באמצעות התאמות של הפרוטוקול הנוכחי. יתר על כן, מניפולציות יעד באמצעות AAVs יכול להיות מופנה לאזור קליפת המוח / subcortical שונה מאתרי ההקלטה ECoG. במקרים כאלה, חור בר להזרקת AAV יכול להיות מכוסה על ידי כיסוי זכוכית קטן קבוע באמצעות מלט שיניים (או שעוות עצם). עבור ספציפיות משופרת, בניית AAV כוללת לעתים קרובות מקדם המאפשר זיהום ממוקד של סוג תא מדויק14. מקדם CamKIIα שימש בפרוטוקול הנוכחי במיוחד למקד במיוחד תאים פירמידלייםמעוררים 14,29,45של קליפת המוח המוטורית. אסטרטגיה זו אפשרה את ההנטרלה של cofilin (באמצעות cofilinS3D)32,33 בנוירונים מעוררים של קליפת המוח המוטורית והתבוננות בשינויים ספציפיים למצב בפעילות ECoG ( איור3). כדי להעריך את יעילות הזיהום/טרנסדוקציה, משתמשי פרוטוקול עתידיים יכולים לשלב את פרוטוקול AAV-ECoG שהוצג עם אחד של כתמים משותפים על ידי immunofluorescence, ולהשתמש בתמונות הגדלה גבוהה כדי לחשב את מספר התאים המציגים תיוג כפול מתוך המספר הכולל של תאים המציגים תיוג יחיד של היעד (כאן, נוירונים מבטאים CaMKIIα). במחקר שנערך לאחרונה, שיטת AAV-ECoG דומה לזו המתוארת כאן שימשה לביטוי יתר של חלבון שברירי X הקשור לתסמונת פיגור שכלי 1 (FXR1) בכל הנוירונים של קליפת המוח המוטורית באמצעות AAV המכיל מקדם סינפסין וחשף השפעה של מניפולציה זו על הפצת מצב ערנות ותוכן ספקטרלי28. ממצאים אלה ממחישים כיצד מניפולציה של מולקולה נתונה באזור מוח היעד באמצעות AAVs יכולה לחשוף תפקידים בוויסות של פרמטרים ספציפיים של ערנות/שינה.
מגבלה של הפרוטוקול המתואר היא הנגע הקטן של רקמת המוח המתרחשת עם מיקום צינורית לפני ביצוע הזרקת AAV, אשר יכול להיות מלווה גם בתגובה דלקתית. זה יכול להיות דאגה מיוחדת בעת ביצוע הזרקת AAV באזורים subcortical ותמיד צריך להיות מטופל באמצעות פקדים נאותים. לחלופין, הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מלווה בכימות של גליוזיס תגובתי ו / או של הפעלה microglial (למשל, באמצעות immunofluorescence) כדי להבטיח רמות דומות בקבוצות בקרה ובדיקה ולכן, על קריאת ECoG. מגבלה שנייה מתייחסת לסיכון של חיבור רע בין אלקטרודה למחבר, אשר עלול לגרום לאות אלקטרופיזיולוגי רע ברציפות או מדי פעם רע. אלקטרודות מוברגות, מולחימות ובמלט מוצקות ימזערו את שכיחותה של בעיה זו. מגבלה שלישית קשורה לבעלי חיים שנקשרים דרך מונטאז’ הראש במהלך ההקלטה, מה שעלול להגביל את הקטר והתנהגויות אחרות, לפחות במידה מסוימת, ולעיתים לגרום לנזק לכבלים ולאובדן אותות. לבסוף, הפרוטוקול המוצג מתאים יותר לעכברים בוגרים, בהתחשב בכך שגודל הגולגולת של בעלי חיים צעירים עלול לגרום לקשיים בהתקנת מונטאז ‘הראש המתואר, כפי שתואר קודם לכן2.
הקלטה משולבת של ECoG/EMG ומניפולציה בתיווך AAV של מטרה מדויקת חלה גם על תחומי מחקר שאינם מדעי המוח של השינה. בין היתר, זה יכול לשמש כדי ללמוד ולתפעל אירועים אפילפטיים במודלים בעלי חיים של התקף והוא כלי רב עוצמה כדי לווסת תנודות המוח המעורבות קידוד זיכרון ואיחוד46,47. בהתאם, יישומים פוטנציאליים בהחלט מקיפים את תחומי המחקר הבסיסי בפסיכיאטריה ונוירולוגיה, כולל מחלות ניווניות. בנוסף ליכולת לבטא צורה לא פעילה של מולקולה, AAVs יכול לשמש כדי להגזים או downregulate (למשל, RNA קטן מפריע, CRISPR / Cas9) או כדי להציל את הביטוי של מולקולה ב KO גוף מלא. חשוב לציין, המתודולוגיה הכפולה של הפרוטוקול הנוכחי חלה גם על מינים יונקים אחרים כגון חולדות ומכרסמים יומיים המייצגים מודלים מעניינים כדי להבין הן שינה נוירודגנרציה48,49.
The authors have nothing to disclose.
העבודה מומנה על ידי יו”ר המחקר הקנדי בפיזיולוגיה מולקולרית של שינה. המחברים מודים לקלואה פרובוסט ולקרוליין בושארד על העזרה הטכנית.
Surgery peparation | |||
21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
Lead-free solder | AIM | SN100C | |
Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
Soldering iron | Weller | WES51 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
ECoG/EMG electrode implantation | |||
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
Immunofluorescence and ECoG recording | |||
36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |