Summary
Questo articolo descrive un protocollo per la manipolazione di bersagli molecolari nella corteccia cerebrale utilizzando virus adeno-associati e per il monitoraggio degli effetti di questa manipolazione durante la veglia e il sonno utilizzando registrazioni elettrocorticografiche.
Abstract
L'uso di registrazioni elettrocorticografiche (ECoG) nei roditori è rilevante per la ricerca sul sonno e per lo studio di una vasta gamma di condizioni neurologiche. I virus adeno-associati (AAV) sono sempre più utilizzati per migliorare la comprensione dei circuiti cerebrali e delle loro funzioni. La manipolazione mediata dall'AAV di specifiche popolazioni cellulari e/o di precisi componenti molecolari è stata estremamente utile per identificare nuovi circuiti/molecole regolatorie del sonno e proteine chiave che contribuiscono agli effetti avversi della perdita di sonno. Ad esempio, l'inibizione dell'attività della proteina filamentosa che taglia l'actina cofilin utilizzando AAV previene la compromissione della memoria indotta dalla privazione del sonno. Qui, viene descritto un protocollo che combina la manipolazione della funzione della cofilina in un'area della corteccia cerebrale con la registrazione dell'attività ECoG per esaminare se la cofilina corticale modula i segnali ECoG di veglia e sonno. L'iniezione di AAV viene eseguita durante la stessa procedura chirurgica dell'impianto di elettrodi ECoG ed elettromiografici (EMG) in topi adulti maschi e femmine. I topi sono anestetizzati e le loro teste sono rasate. Dopo la pulizia della pelle e l'incisione, vengono determinate le coordinate stereotassessche della corteccia motoria e il cranio viene perforato in questa posizione. Una cannula preriempita con un AAV che esprime cofilinS3D, una forma inattiva di cofilina, viene lentamente posizionata nel tessuto corticale. Dopo l'infusione di AAV, le viti ricoperte d'oro (elettrodi ECoG) vengono avvitate attraverso il cranio e cementate al cranio con fili d'oro inseriti nei muscoli del collo (elettrodi EMG). Agli animali sono concesse tre settimane per recuperare e garantire una sufficiente espressione di cofilinS3D. L'area infetta e il tipo di cellula vengono verificati utilizzando l'immunoistochimica e l'ECoG viene analizzato utilizzando l'identificazione visiva degli stati di vigilanza e l'analisi spettrale. In sintesi, questo approccio metodologico combinato consente di conoscere il contributo preciso delle componenti molecolari che regolano la morfologia neuronale e la connettività alla regolazione dell'attività sincronizzata della corteccia cerebrale durante la veglia e il sonno.
Introduction
Le registrazioni elettroencefalografiche (o generalmente elettrocorticografiche [ECoG] nei roditori) ed elettromiografiche (EMG) sono ampiamente utilizzate nella ricerca sul sonno e più in generale nelle neuroscienze, nella neurologia e nella psichiatria. In combinazione, questi segnali elettrofisiologici consentono l'identificazione degli stati di vigilanza e la successiva quantificazione della durata dello stato e della composizione spettrale, sia nell'uomo che neiroditori 1,2,3,4. Tale quantificazione è stata utile per capire come il sonno viene modificato in condizioni patologiche come le malattie neurodegenerative e i modelli5,6,7 o per modificazione genetica8,9. Ad esempio, il knockout (KO) di diversi geni legati alla comunicazione neuronale ha dimostrato di modificare la durata della veglia e del sonno sia nel topo che nel moscerino della frutta10,11,12,13. Per affrontare la potenziale compensazione dello sviluppo derivante dallo studio del KO di tutto il corpo nei roditori e per consentire un controllo più fine della manipolazione genetica, un modo efficace per manipolare l'espressione genica è utilizzare virus adeno-associati (AAV). Una manipolazione genetica mediata da AAV può essere utilizzata per ridurre o sovraregolare un dato bersaglio molecolare e per limitare la manipolazione a una specifica popolazione cellulare utilizzando diversi tipi di promotori14. Gli AAV sono anche ampiamente utilizzati come metodo di consegna nelle ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR)/Cas9 technology15,16. Queste metodologie consentono un migliore controllo temporale e spaziale della manipolazione genetica, che è generalmente associata all'espressione di un reporter che consente la quantificazione dell'area infetta utilizzando l'immunofluorescenza.
Gli AAV rappresentano anche il principale vettore per le manipolazioni specifiche del tipo cellulare dell'attività neuronale tramite optogenetica e chemiogenetica17,18,19,che sono stati ampiamente utilizzati in recenti ricerche sulle malattie neurodegenerative, il comportamento, la cognizione e il sonno20,21,22. Nella ricerca sul sonno, l'applicazione dell'optogenetica per l'attivazione o l'inibizione di alcune regioni del cervello, come il reencefalo basale, l'ipotalamo e il tegmento sublaterodorsale, è stata utile per determinare i loro ruoli nel controllo dell'eccitazione, del sonno a onde lente (noto anche come sonno del movimento oculare non rapido), del sonno paradossale (o del sonno del movimento rapido degli occhi) e della cataplessia23, 24,25. Inoltre, le manipolazioni mediate da AAV hanno contribuito a chiarire importanti circuiti di regolazione del sonno e molecole che contribuiscono agli effetti avversi della perdita di sonno26,27,28. Ad esempio, una proteina che ha dimostrato di essere implicata nella compromissione della memoria indotta dalla privazione del sonno è la cofilina29,30. Questa proteina è una proteina filamentosa che taglia l'actina che partecipa alla riorganizzazione dei filamenti di actina legandosi fisicamente all'actina e promuovendo lo smontaggio dei filamenti in modo dinamico31. L'inibizione dell'attività della cofilina utilizzando un approccio mediato da AAV ha dimostrato di prevenire la perdita della colonna vertebrale, la plasticità sinaptica e i deficit di memoria indotti dalla privazione del sonno nei topi29. Collettivamente, questi studi sottolineano l'utilità e la rilevanza delle manipolazioni mediate da AAV per comprendere la regolazione del sonno e le conseguenze della privazione del sonno nei roditori.
Qui, viene descritto un protocollo che combina l'impianto e la registrazione di elettrodi ECoG ed EMG con la manipolazione della funzione di cofilina in un'area della corteccia cerebrale di topi wild-type (WT) utilizzando un AAV. Più precisamente, un AAV (sierotipo 9) che esprime la sequenza codificante di una forma fosfomimetica della cofilina di topo (cofilinS3D),rendendola inattiva32,33,viene iniettata nella corteccia motoria (M1 e M2). Un elettrodo ECoG viene impiantato direttamente nel sito di iniezione per garantire la registrazione dell'attività corticale sincronizzata delle cellule infette. La registrazione ECoG / EMG viene condotta per 24 ore in condizioni indisturbate tre settimane dopo l'intervento chirurgico per consentire il recupero, l'adattamento e l'elevata espressione di cofilinS3D. La registrazione viene quindi utilizzata per l'identificazione degli stati di vigilanza e l'analisi spettrale ECoG, come descritto in precedenti studi11,34. Questa metodologia può rivelare in modo specifico come la cofilina corticale modula i segnali ECoG della veglia e del sonno nei topi. Questa combinazione di registrazioni elettrofisiologiche e manipolazione genetica mediata da AAV è particolarmente rilevante per studiare i ruoli di vari elementi molecolari in specifiche funzioni cerebrali e potrebbe essere applicata alle aree cerebrali corticali (e sottocorticali) di interesse per WT e topi geneticamente modificati di entrambi i sessi e persino di altre specie.
Protocol
Tutti i metodi sono stati approvati dal Comité d'éthique de l'expérimentation animale della Recherche CIUSSS-NIM e sono conformi alle linee guida del Canadian Council on Animal Care. Vedere la Tabella dei materiali per i reagenti, le attrezzature e i materiali utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione chirurgica
- Preparazione di elettrodi ECoG ed EMG
- Per ogni animale, preparare tre elettrodi ECoG: usando un saldatore, posizionare una piccola goccia di saldatura senza piombo sul tappo a vite di una vite ricoperta d'oro e saldare un filo d'oro lungo 4 mm e diametro 0,2 mm (non isolato) sulla parte superiore del tappo a vite usando la saldatura senza piombo (Figura 1A). Preparare 2 elettrodi con il filo d'oro dritto verso l'alto e uno con un angolo di 45 ° dalla verticale.
- Per ogni animale, preparare due elettrodi EMG: tagliare un filo d'oro di 0,2 mm di diametro a una lunghezza di 1,5 cm e un secondo a 2 cm. Curva entrambi i fili affinché questi abbraccino la curva del cranio fino ai muscoli del collo, mantenendo un'estremità diritta che verrà saldata al connettore (Figura 1B).
- Per ogni animale, preparare un connettore: utilizzare un connettore a 6 canali (5 mm x 8 mm x 8 mm + pin metallici da 3 mm) e aggiungere saldatura senza piombo a 5 dei 6 pin metallici (omettendo un pin centrale; Figura 1C). Coprire la parte superiore del connettore con del nastro adesivo per evitare rifiuti o infiltrazioni d'acqua.
- Preparazione di AAV e pompa a siringa
- Preparare il test AAV (qui, AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA) e/o il controllo AAV (qui, AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) diluendo il mix AAV di riserva (qui, AAV in una soluzione di soluzione salina tamponata con fosfato contenente tensioattivo non ionico [0,001%]) con soluzione salina sterile per ottenere il titolo virale desiderato (generalmente10 12-13 copie del genoma [GC]/mL) e il volume richiesto per il numero di topi da trattare.
NOTA: Un volume iniettato di 1 μL per area corticale per topo richiede la preparazione di 2 μL. - Fissare una siringa da 10 μL a una pompa a siringa e riempirla con acqua distillata.
- Riempire un tubo di PE50 di circa 60 cm di lunghezza con acqua distillata utilizzando una siringa da 1 mL e un ago da 21 G. È importante sottolineare che lasciare l'ago e la siringa da 21 G in posizione dopo il riempimento. Collegare il tubo PE50 con la pompa a siringa; lasciare l'ago/siringa da 21 G su un'estremità del tubo PE50 e collegare l'altra estremità alla siringa da 10 μL.
- Una volta fissato il tubo alla siringa da 10 μL, rimuovere l'ago all'altra estremità e spingere il pistone della siringa da 10 μL per riempire con acqua lo spazio lasciato dall'ago.
NOTA: Assicurarsi che non vi sia alcuna bolla d'aria e che il tubo sia completamente riempito d'acqua. - Installare una cannula da 28 G all'estremità del tubo in cui è stato rimosso l'ago. Spingere l'acqua nella cannula con la siringa da 10 μL per riempirla completamente. Fissare saldamente la cannula al braccio stereotassico.
- Preparare il test AAV (qui, AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA) e/o il controllo AAV (qui, AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) diluendo il mix AAV di riserva (qui, AAV in una soluzione di soluzione salina tamponata con fosfato contenente tensioattivo non ionico [0,001%]) con soluzione salina sterile per ottenere il titolo virale desiderato (generalmente10 12-13 copie del genoma [GC]/mL) e il volume richiesto per il numero di topi da trattare.
- Preparazione di animali
NOTA: I topi maschi e femmine C57BL6 / J di ~ 12 settimane di età sono stati precedentemente adattati per almeno 2 settimane all'alloggiamento in gabbie individuali e a un ciclo buio di luce di 12 ore: 12 ore con cibo e acqua ad libitum e accesso a un cubo di legno.- Pesare attentamente i topi e iniettare per via intraperitoneale una miscela di ketamina/xilazina (120/10 mg/kg) per anestesia. Attendere circa 10 minuti per l'anestesia profonda.
- Radere i capelli dalla parte posteriore delle orecchie alla parte anteriore della testa tra gli occhi usando un tagliacapelli.
NOTA: Fare molta attenzione a non tagliare i baffi (proteggere i baffi con un dito durante la rasatura) in quanto il taglio dei baffi modificherà gli input sensoriali e l'attività ECoG35,36. - Aggiungi una generosa goccia di unguento oftalmico su ogni occhio per prevenire la disidratazione. Verificare regolarmente la profondità dell'anestesia durante la procedura pizzicando un dito dalla zampa posteriore. Fornire al mouse lo 0,5-1,5% di isoflurano per garantire un'anestesia profonda se appare un riflesso del pizzico della dita.
2. Iniezione intracorticale di AAV con una pompa a siringa
NOTA: Eseguire tutti i seguenti passaggi con strumenti sterilizzati e in un ambiente pulito. Utilizzare etanolo al 70% per lavare ulteriormente gli strumenti sterilizzati e per lavare gli elettrodi preparati nella sezione 1.1 e le viti di ancoraggio (viti non ricoperte d'oro) prima di iniziare l'intervento chirurgico.
- Fissare con cura la testa del mouse sull'apparato stereotassico con le barre auricolari.
NOTA: assicurarsi che la testa non si muova lateralmente. - Estrarre delicatamente la lingua dell'animale dalla bocca per evitare il soffocamento e fissare il naso del mouse con l'adattatore stereotassico.
NOTA: Monitorare frequentemente la respirazione durante la procedura. - Sterilizzare l'area rasata della testa con il 70% di etanolo e tenendo la pelle con una pinza Graefe extra fine, tagliare la pelle dalla base delle orecchie al livello degli occhi con le forbici del tessuto. Utilizzare quattro morsetti chirurgici per allungare la pelle ed esporre il cranio (due su ciascun lato dell'incisione; vedere Figura 1D).
- Gratta la superficie del cranio con una punta a forbice affilata: evitando le suture ossee, rimuovi il periosteo e crea striature sovrapposte in due o più direzioni. Rimuovere i frammenti ossei e asciugare il cranio con il 70% di etanolo.
NOTA: Il graffio e la striatura contribuiranno a rendere il montaggio di registrazione più robusto migliorando l'aderenza del cemento al cranio (vedi sotto). - Con la cannula fissata al braccio stereotassico, identificare la posizione del bregma (cioè l'intersezione tra le suture coronali e sagittali del cranio; Figura 1D) e lambda (cioè l'intersezione tra la sutura sagittale del cranio e una linea retta che collega la sutura lambdoide sinistra e destra; Figura 1D), e notare le coordinate stereotassessiche di ciascuno. Se la differenza tra le coordinate z (asse verticale) del bregma e lambda è maggiore di 0,3 mm, regolare l'altezza del naso utilizzando l'adattatore stereotassico fino a quando la posizione z di bregma e lambda non è allineata.
- Segna la posizione della cannula sul cranio con una penna a queste coordinate (corteccia motoria): 1,5 mm laterale da destra a media e 1,5 mm anteriore a bregma. Perforare con cura il cranio nella posizione della cannula con una punta da trapano da 0,7 mm in una direzione perpendicolare alla superficie del cranio (allineata con l'asse verticale). Lavare il cranio forato con una punta di cotone sterile impregnata di una soluzione di providone-iodio al 10%.
- Caricare la cannula con una bolla d'aria da 1 μL tirando indietro il pistone della siringa da 10 μL di 1 μL. Caricare il test AAV (qui AAV9-CaMKIIα0.4-CofilinS3D-HA) o il controllo AAV (qui AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) nella cannula precedentemente caricata con la bolla d'aria: mescolare l'AAV convogliando lentamente su e giù, pipettare 1,7 μL su una capsula di Petri sterile e aspirare 1,5 μL della soluzione nella cannula tirando lentamente il pistone della siringa da 10 μL. Contrassegnare la posizione della bolla d'aria sul tubo PE50 per consentire il tracciamento dell'iniezione.
- Allineare la cannula con il foro sul cranio per la posizione verticale della cannula per raggiungere il bordo superiore del cranio (cioè la superficie del cranio). Dalla superficie del cranio, abbassare lentamente la cannula di 1,5 mm (per raggiungere 1,5 mm sotto la superficie del cranio e lo strato V della corteccia motoria).
NOTA: Fare molta attenzione a non abbassare troppo la cannula per evitare inutili lesioni del tessuto cerebrale. - Avviare la pompa della siringa per iniettare 1 μL di AAV nel corso di 40 minuti (velocità: 0,025 μL/min per ridurre al minimo il danno tissutale). Tenere traccia dell'iniezione sul tubo PE50 con il movimento della bolla d'aria e apportare le regolazioni, se necessario.
- Al termine dell'iniezione, lasciare la cannula in posizione per 5 minuti per garantire una diffusione sufficiente ed evitare il riflusso. Quindi, sollevare lentamente e con attenzione il braccio stereotassico per rimuovere la cannula dalla corteccia.
3. Impianto di elettrodi ECoG/EMG
- Usando una pinzetta Kelly diritta, avvitare lentamente un elettrodo ECoG (con filo d'oro dritto) nell'asse verticale (stesso angolo in cui è stato forato il foro) nel foro in cui è stato iniettato l'AAV. Lasciare almeno 2,5 mm della vite fuori dal cranio per ridurre al minimo i danni alla dura e alla corteccia cerebrale (cioè, per una profondità approssimativa di 1,1 mm dalla superficie del cranio; Figura 1D).
- Contrassegnare la posizione dell'elettrodo ECoG posteriore e dell'elettrodo di riferimento sul cranio con una penna a queste coordinate: elettrodo posteriore (corteccia visiva) 1,5 mm laterale da destra a media e 1,5 mm anteriore a lambda, elettrodo di riferimento (corteccia somatosensoriale) 2,6 mm laterale a destra alla linea mediana e 0,7 mm posteriore a bregma. Inoltre, segnare la posizione di tre viti di manutenzione (che fungono da ancoraggi tra il cranio e il cemento dentale per solidificare il montaggio della testa) sull'emisfero sinistro senza coordinate specifiche, ma il più distanti possibile l'una dall'altra e dagli elettrodi ECoG.
- Perforare con cura il cranio nella posizione marcata degli altri elettrodi e delle viti di ancoraggio con la punta da trapano da 0,7 mm. Forare in una direzione perpendicolare alla superficie del cranio per ogni vite (cioè asse verticale per l'elettrodo posteriore ma con un angolo dall'asse verticale per altri siti). Lavare il cranio forato con una soluzione di providone-iodio al 10% e bloccare i fori con piccoli pezzi arrotolati di tergicristalli delicati prima di installare le viti per prevenire sanguinamento e contaminazione.
- Utilizzando la pinci Kelly diritta, avvitare le viti di manutenzione nell'emisfero sinistro e quindi avvitare gli ultimi due elettrodi nell'emisfero destro. Assicurarsi di avvitare con lo stesso angolo in cui sono stati forati i fori e di lasciare almeno 2,5 mm di ogni vite fuori dal cranio (Figura 1D).
NOTA: Per massimizzare la solidità del montaggio finale e la qualità dei segnali elettrofisiologici, fare attenzione a non toccare alcuna vite durante l'installazione di quella successiva. - Posizionare alcune piccole gocce di cemento dentale al centro dello spazio ad anello all'interno delle viti. Inserire l'estremità curva di un elettrodo EMG (preparato al punto 1.1.2) di circa 1-2 mm nei muscoli del collo tenendo l'estremità curva usando dumont #5 pinza e sollevando la pelle sopra i muscoli con pinza Graefe extra-fine. Quindi, posizionare il lato curvo e il gomito dell'elettrodo nel cemento dentale; ripetere per il secondo elettrodo EMG.
NOTA: L'estremità diritta dell'elettrodo EMG più lungo deve essere allineata con l'elettrodo ECoG anteriore e quella dell'elettrodo EMG più corto con l'elettrodo ECoG posteriore. Assicurarsi che i due elettrodi EMG non si tocchino l'un l'altro o nessuna delle viti. - Coprire gli occhi dei topi e applicare la luce per 3-5 minuti per aiutare la solidificazione del cemento. Una volta che gli elettrodi EMG sono saldamente trattenuti, coprire la base degli elettrodi ECoG e la base delle viti di ancoraggio con cemento dentale per formare un contorno a forma di corona. Coprire gli occhi dei topi e applicare la luce per 3-5 minuti per aiutare la solidificazione del cemento.
NOTA: Non applicare cemento sulle estremità degli elettrodi ECoG ed EMG (filo d'oro che verrà saldato al connettore) o sulla pelle. - Riempire il centro del montaggio con cemento acrilico precedentemente miscelato. Durante la solidificazione del cemento, rimuovere i quattro morsetti chirurgici che trattengono la pelle (e lavarli immediatamente con tergicristalli delicati).
NOTA: Non applicare cemento sulle estremità degli elettrodi ECoG ed EMG (filo d'oro che verrà saldato al connettore) o sulla pelle. - Suturare la pelle nella parte posteriore e anteriore del montaggio in modo che il cranio non sia esposto (ma evitare di allungare troppo la pelle) utilizzando un ago di sutura (13 mm 3/8 c) e monofilamento sintetico assorbibile.
- Tenere il connettore sopra il montaggio con pinca curva e allineare attentamente il filo dorato degli elettrodi con i pin del connettore. Estremità dell'elettrodo di saldatura ai pin del connettore con il saldatore.
NOTA: Procedere rapidamente per evitare il surriscaldamento e danni al tessuto corticale. Assicurarsi che ogni elettrodo abbia un buon contatto con il pin del connettore corrispondente e che gli elettrodi non siano collegati tra loro. - Rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica. Coprire lo spazio vuoto tra il connettore e la testa con cemento acrilico precedentemente miscelato coprendo tutte le connessioni tra elettrodi e pin del connettore.
NOTA: Evitare infiltrazioni di cemento all'interno del connettore tenendo il mouse con il connettore sopra la testa (testa dritta non inclinata). - Pesare il mouse e metterlo in una gabbia pulita (preferibilmente dotata di un coperchio non a rete) su un termoforo (alloggiamento individuale per evitare danni al montaggio della testa). Monitorare regolarmente l'animale e somministrare 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea al risveglio e 12 ore dopo se l'animale mostra segni di dolore (ad esempio, postura anormale, occhi socchiusi).
NOTA: l'aumento di peso rispetto al peso pre-operatorio non deve superare 1,5 g.
4. Registrazioni
- Ospita i topi individualmente per evitare danni al montaggio della testa a causa della cura reciproca, nonché danni e impigliamento dei cavi di registrazione.
NOTA: Per questo protocollo, i topi sono stati alloggiati con accesso ad libitum a cibo, acqua e un cubo di legno, ed è stato condotto un monitoraggio giornaliero. - Collegare i mouse ai cavi di registrazione 2 settimane dopo l'intervento chirurgico per l'adattamento alle condizioni di cablaggio.
- Registra i segnali ECoG / EMG per 24 ore (o più lunghi / più brevi a seconda delle domande di ricerca).
NOTA: la registrazione del segnale ECoG/EMG è stata effettuata utilizzando un cavo, un connettore girevole (per consentire la rotazione del cavo), una scatola indossabile a 36 canali e un amplificatore, che è stato collegato a un computer. I segnali vengono campionati a 256 Hz (o più a seconda delle domande di ricerca) e registrati con software commerciali (vedi la Tabella dei materiali). Per garantire una sufficiente espressione virale, gli esperimenti devono essere fatti almeno 3 settimane dopo l'iniezione di AAV, come descritto in precedenza29,37. - Dopo la registrazione, sacrificare i topi per lussazione cervicale (o altri metodi a seconda del protocollo di immuno colorazione) e raccogliere il cervello per l'immunostaining.
Representative Results
Dopo le registrazioni elettrofisiologiche, l'immunofluorescenza viene utilizzata per definire l'area infettata dall'iniezione di AAV e per convalidare l'espressione di cofilinaS3D (Figura 2). L'immunostaining può essere eseguita utilizzando una metodologia simile a quella descritta in precedenza29,37,38,39. L'AAV esprime una forma inattiva di cofilina fusa con un tag emoagglutinina (HA)-Tag (cofilinS3D-HA), che viene rilevata mediante immunofluorescenza utilizzando un anticorpo anti-HA e un anticorpo secondario (Alexa Fluor 488). I neuroni eccitatori infetti (qui, mirati con un promotore della proteina chinasi II alfa [CamKIIα] calcio/calmodulina-dipendente che controlla l'espressione del transgene contenuto nell'AAV) sono colorati con l'anticorpo anti-HA. Un'infezione di successo è indicata dalla colorazione dei neuroni nella corteccia motoria che circonda il sito di iniezione (Figura 2A,B). In questo esempio rappresentativo, la corteccia cerebrale dell'altro emisfero non ha mostrato alcuna colorazione evidente. Tuttavia, dato che i neuroni eccitatori possono proiettare in aree cerebrali distanti, la colorazione nell'emisfero controlaterale non è necessariamente un'indicazione di iniezione non riuscita. Un maggiore ingrandimento dell'area infetta ha mostrato una colorazione dei corpi cellulari e proiezioni, confermando che solo cellule specifiche dell'area corticale mirata sono state infettate (Figura 2C).
La co-colorazione con marcatori di neuroni eccitatori (ad esempio, trasportatore vescicolare di glutammato 1, CaMKIIα) può anche essere eseguita per convalidare la specificità del tipo cellulare. In alternativa, la co-colorazione con marcatori di neuroni inibitori o astrociti può essere eseguita nel caso in cui queste cellule siano mirate utilizzando promotori diversi. La co-colorazione di cofilinaS3D-HA e CaMKIIα è stata eseguita anche nello stesso animale per un'area più posteriore al sito di iniezione che mostrava ancora una colorazione anti-HA nella corteccia motoria (Figura 2D). L'immagine a maggiore ingrandimento dell'area mostra le celle che esprimono chiaramente cofilinS3D-HA (Alexa Fluor 488, Figura 2E) e CaMKIIα (Alexa Fluor 568, Figura 2F). La sovrapposizione della colorazione cofilinS3D-HA e CaMKIIα rivela che la maggior parte (se non tutte) le cellule colorate per cofilinS3D-HA sono positive anche per CaMKIIα (Figura 2G). Questa osservazione supporta la specificità dell'infezione per i neuroni eccitatori.
Per valutare l'impatto della manipolazione della cofilina sull'attività ECoG, i segnali ECoG ed EMG vengono utilizzati per eseguire un'identificazione visiva degli stati di vigilanza (veglia, sonno a onde lente, sonno paradossale). Questo viene fatto su epoche 4-s a causa del rapido cambiamento nello stato di vigilanza nel mouse2e qui, per una registrazione completa di 24 ore. Le analisi standard includono il calcolo dell'architettura del sonno e delle variabili di analisi spettrale, come condotto in precedenza per diversi set di dati11,12,13,28,34. In particolare, l'analisi spettrale del segnale ECoG dei diversi stati indicizzerà la composizione e la qualità dello stato. Per rimuovere le differenze che potrebbero derivare, ad esempio, da diverse profondità degli elettrodi, i dati dell'analisi spettrale possono essere espressi rispetto alla potenza totale di tutti gli stati di un dato animale (Figura 3A). Data l'ampiezza relativa molto bassa dell'attività ECoG nelle frequenze più alte, gli spettri di potenza relativa per la veglia, il sonno a onde lente e il sonno paradossale sono stati trasformati in log per visualizzare in modo più adeguato e contemporaneamente confrontare l'attività nelle basse e alte frequenze. Questa analisi indica differenze specifiche dello stato nell'attività spettrale in condizioni di inattivazione della cofilina (Figura 3B). Più precisamente, questi risultati preliminari che combinano topi maschi e femmine sottolineano che l'inattivazione della cofilina aumenta significativamente la potenza spettrale nelle frequenze veloci (14-30 Hz) durante la veglia e nelle frequenze lente (1-4 Hz) durante il sonno paradossale, lasciando l'attività ECoG durante il sonno a onde lente principalmente inalterata. Inoltre, l'inattivazione della cofilina sembra aumentare la variabilità tra i topi nell'attività ECoG (particolarmente evidente dalle barre di errore per la veglia nella Figura 3B).
Figura 1: Preparazione di componenti di montaggio ECoG/EMG ed esempio rappresentativo di posizionamento dell'elettrodo ECoG. (A) Un elettrodo ECoG: un filo d'oro lungo 4 mm e diametro 0,2 mm (non isolato) viene fuso sulla testa di una vite rivestita d'oro (diametro della testa di 1,9 mm, diametro maggiore filettatura 1,14 mm, lunghezza totale 3,6 mm) utilizzando saldature senza piombo. (B) Elettrodi EMG: due fili d'oro (1,5 e 2 cm) sono curvi per abbracciare la curva del cranio fino al muscolo del collo, e l'altra estremità è mantenuta dritta per essere saldata al connettore. (C) Un connettore a 6 canali: la saldatura senza piombo viene aggiunta a 5 dei 6 pin metallici (omettendone uno al centro) del connettore (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm pin metallici). La parte superiore del connettore è coperta con nastro adesivo per evitare infiltrazioni di rifiuti / acqua. (D) Esempio del posizionamento delle tre viti di manutenzione sul cranio dell'emisfero sinistro e dei tre elettrodi ECoG (incluso un elettrodo di riferimento) sull'emisfero destro. Le coordinate stereotassessche precise degli elettrodi ECoG sono indicate nei passaggi 2.6 e 3.2 e sono state calcolate in base alla posizione del bregma e del lambda (che sono indicati dai punti gialli). Abbreviazioni: ECoG = elettrocorticografico; EMG = elettromiografica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immunostaining rappresentativo per definire l'area infetta da AAV e il tipo di cellula. (A) Rappresentazione schematica che mostra il sito di iniezione della fetta coronale presentata nel pannello B. La posizione è di 1,1 mm anteriore al bregma e la cannula (mostrata in rosso) era mirata agli strati V della corteccia motoria primaria destra (M1). Rappresentazione modificata da Franklin e Paxinos40. (B)Immunostaining di HA per rilevare l'espressione di cofilinaS3D-HA nei neuroni mostrati per una fetta coronale del cervello intero situata a circa 1,1 mm anteriormente al bregma. L'area infetta si localizza principalmente agli strati V e VI (strati infragranulari) delle cortecce motorie primarie e secondarie destre (M1 e M2). Barra della scala = 500 μm. Il quadrato rappresenta l'area mostrata in C. (C) Ingrandimento più elevato dell'area infetta che mostra la colorazione delle cellule infette e conferma l'espressione di cofilinaS3D-HA negli strati più profondi della corteccia motoria. Barra di scala = 100 μm. (D) Co-immunostaining di HA e CaMKIIα per valutare la specificità del tipo cellulare mostrata per una fetta coronale dell'emisfero destro situata a circa 0,5 mm anteriormente al bregma e quindi posteriore al sito di iniezione (stesso topo dei pannelli B e C). L'area infetta si localizza in cortecce motorie (M1 e principalmente M2). Barra della scala = 500 μm. Il quadrato rappresenta l'area mostrata in E, F e G. (E) Ingrandimento più elevato dell'area infetta che mostra la colorazione delle cellule infette e conferma l'espressione di cofilinS3D-HA. Barra della scala = 100 μm. (F) Ingrandimento più elevato dell'area infetta che mostra la colorazione delle cellule CaMKIIα-positive. Barra della scala = 100 μm. (G) Maggiore ingrandimento dell'area infetta che mostra la co-etichettatura di cofilinS3D-HA e CaMKIIα, confermando che le cellule infette sono CaMKIIα-positive. Barra della scala = 100 μm. Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; M1 = corteccia motoria primaria; M2 = corteccia motoria secondaria; CPu = caudato putamen (striato); LV = ventricolo laterale; HA= emoagglutinina; CamKIIα = calcio/calmodulina-dipendente proteina chinasi II alfa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Spettri di potenza rappresentativi per la veglia, il sonno a onde lente e il sonno paradossale ottenuti dopo la manipolazione virale della funzione di cofilin. Topi maschi (n = 5 per gruppo) e femmine (n = 2 per gruppo) iniettati con AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA (titolo virale 2,58 × 1013 GC/mL) o con un controllo AAV (AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP 1,25 × 1013 GC/mL; metà del titolo di prova per controllare il segnale potenziato di questo controllo AAV) nello strato V della corteccia motoria sono stati registrati per 24 ore, e il segnale elettrocorticografico è stato sottoposto ad analisi spettrale (trasformata di Fourier veloce per calcolare la potenza spettrale tra 0,5 e 30 Hz con una risoluzione di 0,25 Hz). (A) Spettri di potenza durante i tre stati di vigilanza espressi rispetto al potere totale di tutti gli stati. (B) Spettri di potenza relativa trasformati in log per rappresentare più adeguatamente le differenze di gruppo nelle frequenze più alte. La soppressione dell'attività della cofilina nellacortecciamotoria utilizzando AAV 9 -CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA aumenta significativamente l'attività elettrocorticografica nell'intervallo beta (14-30 Hz) durante la veglia e nell'intervallo delta (1-4 Hz) durante il sonno paradossale rispetto alle iniezioni di controllo (linee rosse sopra gli assi x indicano Mann-Whitney U-test sulla banda di frequenza p < 0,05). Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato GC = copie del genoma; HA= emoagglutinina; CamKIIα = proteina chinasi II alfa calcio/calmodulina-dipendente; eGFP = proteina fluorescente verde potenziata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo preciso e diretto per monitorare l'attività di ECoG ed EMG durante la manipolazione di bersagli molecolari utilizzando AAV. Per un adeguato confronto tra i gruppi, si raccomanda vivamente di pianificare sempre le procedure chirurgiche (iniezione AAV e impianto di elettrodi) lo stesso giorno per gli animali di prova e di controllo e di registrare contemporaneamente i loro segnali elettrofisiologici. Per ottenere un'espressione virale simile tra gli animali di prova e di controllo, è auspicabile iniettare lo stesso titolo virale. Nel caso di specie, il titolo virale dell'AAV di controllo era stato ridotto alla metà dell'AAV di prova per garantire un'espressione virale simile. Gli sperimentatori dovrebbero essere molto attenti con le misurazioni delle coordinate stereotassche per garantire una bassa variabilità tra gli animali nel targeting dell'area del cervello / strato corticale. Inoltre, dato che la profondità di iniezione è calcolata dalla superficie del cranio e che lo spessore del cranio varia con l'età e il sesso, il posizionamento della cannula deve sempre essere verificato utilizzando l'istologia post-protocollo o l'immunoistochimica (ad esempio, Figura 2) per garantire un posizionamento / profondità di iniezione adeguati e le coordinate stereotassessche devono essere regolate se necessario. Durante l'iniezione AAV di 40 minuti, è molto importante monitorare la velocità di iniezione per rilevare e correggere rapidamente potenziali problemi come il blocco della pompa. Alcune fasi sperimentali sono anche cruciali per ottenere segnali elettrofisiologici ottimali. Ad esempio, non sovraccaricare durante l'impianto dell'elettrodo; le viti dovrebbero sporgere dal cranio di almeno 2,5 mm per ridurre al minimo i danni alla corteccia cerebrale e la formazione di una cicatrice gliale. Successivamente, è anche estremamente importante i) evitare di applicare cemento alle estremità degli elettrodi, ii) garantire una rapida saldatura degli elettrodi al connettore e iii) assicurarsi che non vi sia alcun contatto tra gli elettrodi.
La procedura qui presentata per la registrazione ECoG ed EMG è estremamente consolidata, semplice e ampiamente utilizzata per monitorare la veglia e il sonno nei topi2,11,13,34. Le registrazioni continue ECoG ed EMG possono essere eseguite per diversi giorni consecutivi (e persino settimane) e generare un set di dati molto ricco che può essere utilizzato per eseguire diverse linee di analisi comprendenti variabili relative alla veglia e alla quantità di sonno e all'architettura2,11, 12 (ad esempio, tempo trascorso in diversi stati per periodi di luce e buio, numero di episodi di ogni stato, Distribuzione 24 ore del sonno), veglia e contenuto spettrale del sonno34,41 (ad esempio, potenza in diverse bande di frequenza [simile alla Figura 3], attività senza scala) e caratteristiche delle singole onde42,43,44 (ad esempio, ampiezza e pendenza delle onde lente). Se usato in combinazione con manipolazioni molecolari mediate da AAV, un ulteriore vantaggio è l'evitamento della potenziale compensazione dello sviluppo che può verificarsi negli animali transgenici. Con la pratica, l'intera procedura, compresa l'iniezione AAV di 40 minuti, può essere eseguita in circa 90 minuti. Il tasso di mortalità dovrebbe essere (molto) basso in quanto l'intervento chirurgico è minimamente invasivo.
L'uso simultaneo della registrazione ECoG/EMG e la manipolazione mirata con AAV offre una varietà di altri vantaggi e applicazioni. Ad esempio, la precisione del targeting stereotassico, se adeguatamente eseguita, è molto elevata e replicabile ed è utile per determinare il ruolo specifico di una data regione del cervello (e/o di un tipo di cellula o di un elemento molecolare all'interno della regione) nella regolazione del sonno o di altri processi fisiologici. Diverse aree corticali possono quindi essere facilmente mirate utilizzando adattamenti del protocollo corrente. Inoltre, le manipolazioni target che utilizzano AAV potrebbero essere indirizzate a un'area corticale/sottocorticale diversa dai siti di registrazione ECoG. In questi casi, il foro della bava per l'iniezione di AAV potrebbe essere coperto da un piccolo coperchio di vetro fissato utilizzando cemento dentale (o cera ossea). Per una maggiore specificità, la costruzione AAV spesso include un promotore che consente l'infezione mirata di un preciso tipo di cellula14. Un promotore di CamKIIα è stato utilizzato nel presente protocollo per colpire specificamente le cellule piramidali eccitatorie14,29,45della corteccia motoria. Questa strategia ha permesso l'inattivazione della cofilina (utilizzando cofilinS3D)32, 33nei neuroni eccitatori dellacorteccia motoria e l'osservazione di cambiamenti specifici dello stato nell'attività di ECoG(Figura 3). Per valutare l'efficacia dell'infezione / trasduzione, i futuri utenti del protocollo potrebbero combinare il protocollo AAV-ECoG presentato con uno di co-colorazione mediante immunofluorescenza e utilizzare immagini ad alto ingrandimento per calcolare il numero di cellule che mostrano la doppia etichettatura sul numero totale di cellule che mostrano una singola etichettatura del bersaglio (qui, neuroni che esprimono CaMKIIα). In un recente studio, un metodo AAV-ECoG simile a quello qui descritto è stato utilizzato per sovraesprimere la proteina 1 correlata alla sindrome da ritardo mentale dell'X fragile (FXR1) in tutti i neuroni della corteccia motoria utilizzando un AAV contenente un promotore della sinapsina e ha rivelato un effetto di questa manipolazione sulla distribuzione dello stato di vigilanza e sul contenuto spettrale28. Questi risultati illustrano come la manipolazione di una determinata molecola in una regione del cervello bersaglio utilizzando AAV può rivelare ruoli nella regolazione di specifici parametri di veglia / sonno.
Una limitazione del protocollo descritto è la piccola lesione del tessuto cerebrale che si verifica con il posizionamento della cannula prima di eseguire l'iniezione di AAV, che potrebbe anche essere accompagnata da una risposta infiammatoria. Ciò potrebbe essere particolarmente preoccupante quando si esegue l'iniezione di AAV in aree sottocorticali e dovrebbe sempre essere affrontato utilizzando controlli adeguati. In alternativa, l'attuale protocollo potrebbe essere seguito dalla quantificazione della gliosi reattiva e/o dell'attivazione microgliale (ad esempio, utilizzando l'immunofluorescenza) per garantire livelli simili nei gruppi di controllo e di test e, quindi, sulla lettura ECoG. Una seconda limitazione riguarda il rischio di una cattiva connessione tra un elettrodo e il connettore, che potrebbe comportare un segnale elettrofisiologico continuamente o occasionalmente cattivo. Gli elettrodi avvitati, saldati e cementati solidamente ridurranno al minimo l'incidenza di questo problema. Una terza limitazione è legata agli animali legati tramite il montaggio della testa durante la registrazione, che potrebbe limitare la locomozione e altri comportamenti, almeno in una certa misura, e occasionalmente causare danni al cablaggio e perdita di segnale. Infine, il protocollo presentato è più adatto per i topi adulti, dato che le dimensioni del cranio degli animali più giovani possono causare difficoltà nell'installazione del montaggio della testa raffigurata, come descritto in precedenza2.
La registrazione combinata ECoG/EMG e la manipolazione mediata da AAV di un bersaglio preciso sono applicabili anche a campi di ricerca diversi dalle neuroscienze del sonno. Tra gli altri, potrebbe essere utilizzato per studiare e manipolare eventi epilettici in modelli animali di convulsioni ed è un potente strumento per modulare le oscillazioni cerebrali coinvolte nella codifica e nel consolidamento della memoria46,47. Di conseguenza, le potenziali applicazioni comprendono certamente i campi della ricerca fondamentale in psichiatria e neurologia, comprese le malattie neurodegenerative. Oltre alla capacità di esprimere una forma inattiva di una molecola, gli AAV possono e sono stati utilizzati per sovraesprimere o sottoregolare (ad esempio, RNA a interferenza di piccole dimensioni, CRISPR / Cas9) o per salvare l'espressione di una molecola in un KO di tutto il corpo. È importante sottolineare che la duplice metodologia dell'attuale protocollo è applicabile anche ad altre specie di mammiferi come ratti e roditori diurni che rappresentano modelli interessanti per comprendere sia il sonno che la neurodegenerazione48,49.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato finanziato dalla Canada Research Chair in Sleep Molecular Physiology. Gli autori sono grati a Chloé Provost e Caroline Bouchard per l'aiuto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgery peparation | |||
| 21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
| 6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
| Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
| Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
| Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
| Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
| Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
| Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
| Lead-free solder | AIM | SN100C | |
| Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
| PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
| Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
| Soldering iron | Weller | WES51 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
| Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
| Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
| Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
| 0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
| AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
| AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
| Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
| Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
| Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
| Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
| ECoG/EMG electrode implantation | |||
| Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
| Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
| Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
| Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
| Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
| Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
| Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
| Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
| Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
| Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
| RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
| Immunofluorescence and ECoG recording | |||
| 36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
| CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
| Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
| Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
| Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
| Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
| Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |
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