Summary
이 문서에서는 아데노 관련 바이러스를 사용하여 대뇌 피질에서 분자 표적을 조작하고 전극 기록을 사용하여 깨어및 수면 중에이 조작의 효과를 모니터링하기위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
설치류에서 전기 코르티코그래피 (ECoG) 기록의 사용은 수면 연구와 광범위한 신경 학적 조건의 연구와 관련이 있습니다. Adeno 관련 바이러스 (AAV) 점점 뇌 회로와 그들의 기능의 이해를 개선 하기 위해 사용 됩니다. 특정 세포 인구 및/또는 정밀 분자 구성 요소의 AAV 매개 조작은 수면 손실의 부작용에 기여하는 새로운 수면 조절 회로/분자 및 주요 단백질을 식별하는 데 대단히 유용했습니다. 예를 들어, AAV를 이용한 필라멘트 액틴 절제 단백질 코필린의 활동을 억제하면 수면 부족유발 기억 장애를 방지할 수 있습니다. 여기서, 피질 코필린이 깨어및 수면 ECoG 신호를 조절하는지 여부를 검사하기 위해 뇌 피질 영역에서 코필린 기능의 조작을 ECoG 활동의 기록과 결합하는 프로토콜이 기재된다. AAV 주사는 성인 남성 및 여성 마우스에서 ECoG 및 전극 (EMG) 전극의 이식과 동일한 수술 시 수행된다. 마우스는 마취되고, 그들의 머리는 면도됩니다. 피부 세척 및 절개 후, 모터 피질의 스테레오탁스 좌표가 결정되고, 두개골은 이 위치에서 관통된다. 코필린의 비활성 형태인 코필린S3D를표현하는 AAV로 미리 채워진 캐뉼러가 피질 조직에 천천히 배치된다. AAV 주입 후, 금으로 덮인 나사(ECoG 전극)는 두개골을 통해 나사로 고정되어 목 근육(EMG 전극)에 삽입된 금 전선으로 두개골에 시멘트됩니다. 동물은 복구하고 코필린S3D의충분한 표현을 보장하기 위해 3 주가 허용됩니다. 감염된 영역 및 세포 유형은 면역 히스트토화학을 사용하여 검증되며, ECoG는 경계 상태 및 스펙트럼 분석의 시각적 식별을 사용하여 분석됩니다. 요약하자면, 이 결합된 방법론적 접근법은 깨어와 수면 중에 동기화된 대뇌 피질 활동의 조절에 대한 신경 형태 및 연결을 조절하는 분자 성분의 정확한 기여에 대한 조사를 가능하게 합니다.
Introduction
뇌전도 (또는 일반적으로 설치류의 전기 신경학 [ECoG]와 전기 (EMG) 기록은 신경 과학, 신경학 및 정신과에서 수면 연구뿐만 아니라 더 광범위하게 사용됩니다. 조합에서, 이러한 전기생리학적 신호는 인간과 설치류1,2,3,4모두에서 경계 상태와 상태 지속 시간 및 스펙트럼 조성물의 후속 정량화를 허용한다. 이러한 정량화는 신경퇴행성 질환 및 모델5,6,7 또는 유전자 변형8,9와같은 병리학적 조건에서 수면이 어떻게 변형되는지 이해하는 데 유용하다. 예를 들어, 신경 통신에 연결된 상이한 유전자의 녹아웃(KO)은 마우스와 과일 플라이10,11,12,13모두에서 절전 및 수면의 지속 시간을 변화시키는 것으로 나타났다. 설치류에서 전신 KO의 연구에서 발생하는 잠재적 인 발달 보상을 해결하고 유전자 조작의 미세한 제어를 허용하기 위해, 유전자 발현을 조작하는 효율적인 방법은 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 사용하는 것입니다. AAV 매개 유전자 조작은 주어진 분자 표적을 다운 또는 상향 조절하고 다양한 유형의발기인(14)을사용하여 특정 세포 집단으로 조작을 제한하는 데 사용될 수 있다. AAV는 또한 정기적으로 클러스터된 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/Cas9기술(15,16)에서전달 방법으로 광범위하게 사용된다. 이러한 방법론은 일반적으로 면역 형광을 사용하여 감염된 영역의 정량화를 허용하는 기자의 발현과 관련된 유전 조작의 더 나은 시간적 및 공간 제어를 허용합니다.
AAV는 또한 광유전학 및 화학유전학을 통한 뉴런 활성의 세포 유형 특이적 조작을 위한 주요 벡터를 나타내며,17,18,19,신경퇴행성 질환, 행동, 인식 및 수면20, 21,22에대한 최근 연구에서 널리 사용되고 있다. 수면 연구에서, 기저 전뇌, 시상하부 및 sublaterodorsal tegmentum과 같은 특정 뇌 영역의 활성화 또는 억제를 위한 광유전학의 적용은 각성, 느린 파도 수면(비급속 눈 운동 수면, 역설적 수면, 자궁 마비,자궁 마비로 알려져 있음)및 catpla의 제어에서 자신의 역할을 결정하는 데 유용했습니다. 24,25. 더욱이, AAV 중재 조작은 중요한 수면 조절 회로 및 수면 손실의 부작용에 기여하는 분자를 해명하는 데 도움이되었다 26,27,28. 예를 들어, 수면 부족 유발 기억 장애에 연루된 것으로 나타난 단백질 1가지는 코필린29,30이다. 본 단백질은 액틴에 물리적으로 결합하여 액틴 필라멘트의 재구성에 참여하는 필라멘트 액틴 분리 단백질로, 필라멘트의 분해를 역동적인 방식으로촉진한다(31). AAV 매개 접근법을 이용한 코필린 활성억제는마우스(29)의수면 부족으로 유도된 시냅스 가소성 및 기억력 결핍뿐만 아니라 척추 손실을 방지하는 것으로 나타났다. 종합적으로, 이 연구 결과는 설치류에 있는 잠 부족의 결과 및 잠 부족의 결과를 이해하기 위하여 AAV 중재한 조작의 유용성과 관련성을 강조합니다.
여기서, AAV를 이용한 야생형(WT) 마우스의 대뇌 피질 영역에서 코필린 기능의 조작과 함께 ECoG 및 EMG 전극 이식 및 레코딩을 결합하는 프로토콜이 기재되어 있다. 보다 정밀하게, 마우스 코필린(cofilinS3D)의인광형태의 코딩 서열을 발현하는 AAV(혈청형 9)는 비활성32,33을렌더링하고, 모터 피질(M1 및 M2)에 주입된다. ECoG 전극은 감염된 세포의 동기화된 피질 활성의 기록을 보장하기 위해 사출 부위에 직접 이식된다. ECoG/EMG 기록은 수술 후 3주 후에 방해받지 않는 조건하에서 24시간 동안 진행되어 회복, 적응 및 높은 코필린 S3D 발현을허용한다. 기록은 그 때 경계 상태 및 ECoG 스펙트럼 분석의 식별을 위해 사용됩니다, 이전 연구에 설명된 바와 같이11,34. 이 방법론은 특히 피질 코필린이 마우스의 깨어 및 수면 ECoG 신호를 조절하는 방법을 구체적으로 밝힐 수 있습니다. 전기 생리적 기록과 AAV 매개 유전자 조작의 이 조합은 특정 두뇌 기능에 있는 각종 분자 요소의 역할을 조사하기 위하여 특히 관련되고 WT와 남녀 및 그밖 종의 유전으로 변형된 마우스에 대한 관심의 피질 (및 subcortical) 두뇌 지역에 적용될 수 있었습니다.
Protocol
모든 방법은 Recherche CIUSSS-NIM의 Comité d'éthique de l'expérimentation 동물에 의해 승인되었으며 캐나다 동물 관리 위원회의 지침에 따라 결정됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 시약, 장비 및 재료에 대한 재료 표를 참조하십시오.
1. 수술 준비
- ECoG 및 EMG 전극 의 준비
- 각 동물에 대해 세 개의 ECoG 전극을 준비하십시오: 납땜 철을 사용하여, 금으로 덮인 나사의 나사 캡에 납없는 납땜의 작은 방울을 놓고, 납무연 솔더(그림 1A)를사용하여 나사 캡의 상단에 4mm 길이, 0.2mm 직경의 금 와이어 (비 절연)를 납땜. 금 와이어가 똑바로 위로 2 전극을 준비하고 수직에서 45 ° 각도로 하나를 준비합니다.
- 각 동물에 대해, 두 개의 EMG 전극을 준비 : 1.5cm의 길이와 두 번째 1 ~ 2cm의 길이에 0.2mm 직경 금 와이어를 잘라. 이들에 대한 두 전선을 곡선하여 두개골의 곡선을 목 근육까지 받아들이고,커넥터(도 1B)로납땜되는 직선 끝을 유지한다.
- 각 동물에 대해 하나의 커넥터를 준비: 6 채널 커넥터 (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm 금속 핀), 6 금속 핀 중 5에 무연 납땜을 추가 (하나의 중간 핀을 생략; 그림 1C). 침입자나 물 침투를 방지하기 위해 테이프로 커넥터 의 상단을 덮습니다.
- AAV 및 주사기 펌프 준비
- 테스트 AAV(여기, AAV9-CaMKIIα0.4-코필린S3D-HA)및/또는 제어 AAV(여기, AAV 9-CaMKIIα0.4-eGFP)를 주식 AAV 믹스(es)를 희석하여 준비합니다(여기, AAV는 비이온 계면활성제[0.001%]를 함유하는 인산염 완충식염의 용액에서 원하는 바이러스 성 티터(일반적으로10 12-13게놈 사본[GC]/mL)를 얻기 위해 멸균식 식염수를 함유하고 있으며, 처리되는 마우스의 수에 필요한 부피이다.
참고: 마우스당 피질 영역당 1μL의 주입된 부피는 2μL의 제조를 필요로 합니다. - 10μL 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 증류수로 채웁니다.
- 1mL 주사기와 21G 바늘을 사용하여 증류수로 약 60cm 길이의 PE50 튜브 1개를 채웁니다. 중요한 것은, 21G 바늘과 주사기를 채운 후 제자리에 둡니다. PE50 튜브를 주사기 펌프와 연결하십시오. PE50 튜브의 한쪽 끝에 21 G 바늘/주사기를 두고 다른 쪽 끝을 10 μL 주사기에 연결합니다.
- 튜브가 10 μL 주사기에 고정되면 다른 쪽 끝에 있는 바늘을 제거하고 10 μL 주사기의 피스톤을 밀어 바늘에 의해 남은 틈새를 물로 채웁니다.
참고: 기포가 없고 튜브가 완전히 물로 채워져 있는지 확인하십시오. - 바늘이 제거된 튜브 끝에 28 G 캐뉼라를 설치합니다. 10 μL 주사기로 캐뉼라에 물을 밀어 넣고 완전히 채웁니다. 캐뉼라를 스테레오탁스 암에 단단히 고정합니다.
- 테스트 AAV(여기, AAV9-CaMKIIα0.4-코필린S3D-HA)및/또는 제어 AAV(여기, AAV 9-CaMKIIα0.4-eGFP)를 주식 AAV 믹스(es)를 희석하여 준비합니다(여기, AAV는 비이온 계면활성제[0.001%]를 함유하는 인산염 완충식염의 용액에서 원하는 바이러스 성 티터(일반적으로10 12-13게놈 사본[GC]/mL)를 얻기 위해 멸균식 식염수를 함유하고 있으며, 처리되는 마우스의 수에 필요한 부피이다.
- 동물의 준비
참고: C57BL6/J 남녀 마우스 ~12주 미만의 마우스는 이전에 개별 케이지의 하우징과 광고 리비툼 음식과 물과 함께 12h 빛:12-h 어두운 주기에 적어도 2주 동안 적응하고 나무 큐브에 접근할 수 있게 되었다.- 조심스럽게 마우스의 무게를 측정하고, 마취를 위해 케타민 / 자일라진 (120/10 mg /kg)의 혼합물을 인트라피톤으로 주입하십시오. 깊은 마취를 위해 약 10 분 기다립니다.
- 머리 트리머를 사용하여 머리 사이의 머리 사이의 머리 의 뒷면에 귀의 뒷면에서 머리를 면도.
참고 : 수염 트리밍은 감각 입력과 ECoG 활동을 수정할 수 있기 때문에 수염을 자르지 않도록주의하십시오 (면도 중에 손가락으로 수염을 보호) 감각 입력 및 ECoG 활동35,36을수정합니다. - 탈수를 방지하기 위해 각 눈에 안연연을 넉넉하게 넣습니다. 뒷발에서 발가락을 꼬집어 시술 중에 정기적으로 마취의 깊이를 확인합니다. 마우스에 0.5-1.5% 이소플루란을 제공하여 발가락 핀치 반사가 나타나는 경우 깊은 마취를 보장합니다.
2. 주사기 펌프가 있는 내피AAV 주입
참고: 멸균 된 기기와 깨끗한 환경에서 다음 단계를 모두 수행하십시오. 70% 에탄올을 사용하여 멸균 된 기기를 더 세척하고 수술을 시작하기 전에 섹션 1.1에 준비 된 전극뿐만 아니라 앵커 나사 (금으로 덮인 나사)를 세척하십시오.
- 귀 막대로 입체 장치에 마우스의 머리를 조심스럽게 고정하십시오.
참고: 머리가 측면으로 움직이지 않는지 확인합니다. - 질식을 피하기 위해 동물의 혀를 입에서 부드럽게 당기고 입체 형 어댑터로 마우스의 코를 고정합니다.
참고: 시술 중에 호흡을 자주 모니터링합니다. - 70% 에탄올로 머리의 면도 부위를 살균하고 뚜미 를 더 미세하게 가진 Graefe 집게로 피부를 잡고, 조직 가위로 눈의 수준으로 피부를 잘라. 4개의 수술 클램프를 사용하여 피부를 스트레칭하고 두개골을 노출시합니다(절개 양쪽에 2개, 도 1D참조).
- 날카로운 가위 팁으로 두개골 표면을 긁어 : 뼈 봉합사를 피하는 동안, periosteum을 제거하고 두 개 이상의 방향으로 겹치는 줄무늬를 만듭니다. 뼈 조각을 제거하고 70 %의 에탄올로 두개골을 건조시십시오.
참고 : 긁힘과 줄무늬는 두개골에 시멘트의 준수를 개선하여 기록 몽타주를 더 강력하게 만드는 데 도움이됩니다 (아래 참조). - 입체 팔에 고정 된 캐뉼라로 bregma의 위치 (즉, 두개골 관상 관상 동맥과 처석 봉합사 사이의 교차점) 도 1D) 람다 (즉, 두개골 좌골 봉합사와 왼쪽과 오른쪽 양두엽 봉합사를 연결하는 직선 사이의 교차점; 도 1D)각 의 스테레오탁스 좌표를 기록합니다. 브레그마와 람다의 z 좌표(수직축)의 차이가 0.3mm 이상인 경우, 브레그마와 람다의 z 위치가 정렬될 때까지 스테레오탁스 어댑터를 사용하여 코의 높이를 조절한다.
- 이 좌표 (모터 피질)에 펜으로 두개골에 캐뉼라의 위치를 표시 : 1.5 중간 라인에 측면 오른쪽과 bregma에 1.5 mm 전방. 조심스럽게 두개골 표면에 수직 방향으로 0.7mm 드릴 비트와 캐뉼라의 위치에 두개골을 관통 (수직 축에 정렬). 10% 프로비도요오드 용액으로 함침된 멸균 면 끝으로 피어싱된 두개골을 씻으셔도 됩니다.
- 1μL 주사기 피스톤을 1μL로 다시 1 μL로 당겨 1 μL 기포로 캐뉼라를 로드합니다. 테스트 AAV(여기 AAV9-CaMKIIα0.4-코필린S3D-HA)또는 제어 AAV(여기 AAV 9-CaMKIIα0.4-eGFP)를 이전에 기포로 로드한 캐뉼라에 적재: 천천히 위아래로 파이프팅하여 AAV를 혼합하고, 멸균 페트리 접시에 1.7 μL, 그리고 10 μL 주사기의 피스톤을 천천히 당겨 캐뉼라에 용액의 1.5 μL을 흡인. 주입의 추적을 허용하기 위해 PE50 튜브에 기포의 위치를 표시합니다.
- 캐뉼라의 수직 위치가 두개골의 위쪽 가장자리에 도달하기 위해 두개골의 구멍과 캐뉼라를 정렬합니다(예: 두개골 표면). 두개골 표면에서 캐뉼라를 1.5mm 천천히 낮춥니다(두개골 표면 아래 1.5mm에 도달하고 모터 피질의 V층에 있음).
참고 : 뇌 조직의 불필요한 병변을 피하기 위해 캐뉼라를 너무 많이 낮추지 않도록주의하십시오. - 주사기 펌프를 시작하여 40분 동안 AAV 1μL을 주입합니다(속도: 0.025 μL/min). 기포의 움직임으로 PE50 튜브의 주입을 추적하고 필요한 경우 조정하십시오.
- 주입이 완료된 후, 충분한 확산을 보장하고 역류를 피하기 위해 5 분 동안 캐뉼라를 제자리에 둡니다. 그런 다음 스테레오탁스 암을 천천히 조심스럽게 들어 올려 피질에서 캐뉼라를 제거합니다.
3. ECoG/EMG 전극 이식
- 직선 켈리 집게를 사용하여 AAV가 주입된 구멍에서 수직 축(구멍이 관통된 것과 동일한 각도)에 ECoG 전극 1개(직선 금와이어)를 천천히 나사로 연결합니다. 두개골 표면에서 1.1mm의 대략적인 깊이에 대한 두라와 대뇌 피질의 손상을 최소화하기 위해 두개골에서 나사의 적어도 2.5 mm를 남겨주세요. 그림 1D).
- 후방 ECoG 전극의 위치와 이러한 좌표에 펜으로 두개골에 기준 전극의 위치를 표시: 후방 전극 (시각 피질) 1.5 mm 측면 오른쪽 중간선및 람다에 1.5 mm 전방, 참조 전극 (somatosensory 피질) 2.6 mm 측면 오른쪽 중간 선및 0.7 mmgma. 또한, 왼쪽 반구에 3개의 유지 보수 나사(두개골과 치과 시멘트 사이의 앵커 역할을 하여 머리 몽타주를 고화시키는 역할을)의 위치를 특정 좌표없이 표시하지만, 서로와 ECoG 전극에서 가능한 한 멀리 떨어져 있습니다.
- 0.7mm 드릴 비트로 다른 전극과 앵커 나사의 표시된 위치에서 두개골을 조심스럽게 관통합니다. 각 나사에 대한 두개골 표면에 수직으로 관통합니다(즉, 후방 전극의 수직 축이지만 다른 사이트의 수직 축에서 각도로). 피어싱 된 두개골을 10 % providone-iodine 솔루션으로 씻고 출혈과 오염을 방지하기 위해 나사를 설치하기 전에 섬세한 작업 와이퍼의 작고 압연 조각으로 구멍을 차단하십시오.
- 직선 켈리 집게를 사용하여 왼쪽 반구의 유지 보수 나사를 나사로 고정한 다음 오른쪽 반구의 마지막 두 전극을 나사로 고정합니다. 구멍이 뚫린 것과 동일한 각도로 나사를 두어 두개골에서 나사를 2.5mm 이상 남겨두십시오(그림1D).
참고: 최종 몽타주의의 견고성과 전기 생리신호의 품질을 극대화하려면 다음 접점 시 나사를 만지지 않도록 주의하십시오. - 나사 내부에 링과 같은 공간의 중앙에 몇 방울의 치과 시멘트를 놓습니다. 두몬트 #5 집게를 사용하여 곡선 단단을 잡고 여분의 미세의 Graefe 집게로 근육 위에 피부를 들어 올려 목 근육에 약 1-2mm의 곡선 단전극(1.1.2 단계에서 제조)의 곡선 끝을 삽입합니다. 그런 다음, 치과 시멘트에 전극의 곡선측과 팔꿈치를 놓는다; 제2 EMG 전극에 대해 반복한다.
참고: 더 긴 EMG 전극의 직선 단말은 전방 ECoG 전극과 후방 ECoG 전극과 더 짧은 EMG 전극의 전극과 일치해야 한다. 두 EMG 전극이 서로 또는 나사를 만지지 않는지 확인합니다. - 마우스의 눈을 가리고, 시멘트 응고를 돕기 위해 3-5 분 동안 빛을 적용합니다. EMG 전극이 단단히 잡히면, ECoG 전극의 기저와 치과 시멘트로 앵커 나사의 베이스를 덮어 크라운 모양의 윤곽을 형성합니다. 마우스의 눈을 가리고, 시멘트 응고를 돕기 위해 3-5 분 동안 빛을 적용합니다.
참고: ECoG 및 EMG 전극 사지(커넥터에 납땜되는 골드 와이어) 또는 피부에 시멘트를 바르지 마십시오. - 몽타주 중심부를 이전에 혼합된 아크릴 시멘트로 채웁니다. 시멘트 고형화 하는 동안, 피부를 들고 4 개의 수술 클램프를 제거 (그리고 섬세한 작업 와이퍼로 즉시 세척).
참고: ECoG 및 EMG 전극 사지(커넥터에 납땜되는 골드 와이어) 또는 피부에 시멘트를 바르지 마십시오. - 봉합봉 바늘 (13mm 3/8 c)과 합성 흡수 성 모노필라멘트를 사용하여 두개골이 노출되지 않도록 몽타주 뒤쪽과 앞쪽의 피부를 봉합합니다 ( 그러나 피부를 너무 많이 스트레칭하지 마십시오).
- 몽타주 위에 곡선 된 집게로 커넥터를 잡고 커넥터 핀과 전극의 금 와이어를 조심스럽게 정렬합니다. 납땜 철로 커넥터 핀에 솔더 전극 사지.
참고: 피질 조직의 과열 및 손상을 피하기 위해 신속하게 진행하십시오. 각 전극이 해당 커넥터 핀과 잘 접촉하고 전극이 서로 연결되지 않았는지 확인합니다. - 스테레오탁스 프레임에서 마우스를 제거합니다. 전극과 커넥터 핀 사이의 모든 연결을 덮어 이전에 혼합 된 아크릴 시멘트로 커넥터와 헤드 사이의 빈 공간을 덮습니다.
참고: 마우스를 머리 위에 커넥터로 붙임으로써 커넥터 내부의 시멘트 침투를 피하십시오(헤드 스트레이트 기울지 않음). - 마우스의 무게를 측정하고 열 패드 (머리 몽타주에 손상을 피하기 위해 개별 하우징)에 깨끗한 케이지 (바람직하게는 비 메쉬 뚜껑장착)에 배치합니다. 동물을 정기적으로 모니터링하고, 각성 시 피하 시 부프레노르핀0.1 mg/kg을 관리하고, 동물이 통증의 징후를 보이면 12시간 후에 (예: 비정상적인 자세, 눈을 가늘게 뜨고).
참고: 수술 전 체중에 비해 체중 증가는 1.5g을 초과해서는 안 됩니다.
4. 녹음
- 하우스 마우스는 개별적으로 머리 몽타주에 손상을 피하기 위해 상호 그루밍뿐만 아니라 레코딩 케이블의 손상및 얽힘의 결과로.
참고: 이 프로토콜의 경우, 마우스는 음식, 물 및 나무 큐브에 대한 광고 리비툼 액세스로 보관되었고, 매일 모니터링이 수행되었다. - 케이블 조건에 적응하기 위해 수술 후 2 주 동안 케이블을 기록하는 마우스를 연결합니다.
- 24시간 동안 ECoG/EMG 신호를 기록합니다(또는 연구 질문에 따라 더 길거나 짧습니다).
참고: ECoG/EMG 신호 녹음은 케이블, 회전 커넥터(케이블 회전 허용), 36채널 웨어러블 박스 및 컴퓨터에 연결된 앰프를 사용하여 수행되었습니다. 신호는 256Hz(또는 연구 질문에 따라 더 많이) 샘플링되고 상용 소프트웨어로 기록됩니다(재료 표참조). 충분한 바이러스 성 발현을 보장하기 위해 이전에 설명 된 바와 같이 AAV 주입 후 적어도 3 주 수행되어야한다29,37. - 기록 후, 자궁 경부 탈구 (또는 면역 염색 프로토콜에 따라 다른 방법)에 의해 마우스를 희생하고 면역 염색을 위해 뇌를 수확하십시오.
Representative Results
전기생리학적 기록 후, 면역형광은 AAV 주사에 감염된 영역을 정의하고 코필린S3D의 발현을 검증하는 데 사용된다(도2). 면역염색은 이전에 설명된 것과 유사한 방법론을 사용하여 수행될 수 있다29,37,38,39. AAV는 항하 항체 및 이차 항체(Alexa Fluor 488)를 사용하여 면역 불광에 의해 검출되는 헤마글루티닌(HA)-Tag(cofilinS3D-HA)와융합된 비활성 형태의 코필린을 표현한다. 감염된 흥분성 뉴런(여기, 칼슘/칼모둘린 의존성 단백질 키나아제 II알파[CamKIIα]프로모터가 AAV에 포함된 트랜스진의 발현을 제어하는 프로모터)는 항하 항체로 염색된다. 성공적인 감염은 주사 부위를 둘러싼 운동 피질에서 뉴런의 염색에 의해 표시된다(도2A,B). 이 대표적인 예에서, 다른 반구의 대뇌 피질은 눈에 띄는 염색을 보여주지 않았다. 그럼에도 불구 하 고, 흥분 신경 먼 뇌 영역에 투영할 수 있습니다 주어진, 반대로 반구에 염색 반드시 실패 한 주입의 표시. 감염된 부위의 배율이 높을수록 세포 체및 투영의 염색이 나타났으며, 표적 피질 영역의 특정 세포만 감염되었음을 확인하였다(도2C).
흥분성 뉴런의 마커와 공동 염색(예를 들어, vesicular 조미료 수송기 1, CaMKIIα)은 세포 유형 특이성을 검증하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로, 억제 뉴런 또는 성상세포의 마커와 공동 염색은 이러한 세포가 다른 프로모터를 사용하여 표적화되는 경우에 수행될 수 있다. 코필린S3D-HA및 CaMKIIα의 공동 염색은 또한 모터 피질에서 항하 염색을 보여 준 주사 부위에 더 후방에 대한 동일한 동물에서 수행되었다(도2D). 영역의 높은 배율 이미지는 코필린S3D-HA(알렉사플루어 488, 도 2E)및 CaMKIIα(알렉사 플루어 568, 도 2F)를명확하게 발현하는 세포를 나타낸다. 코필린S3D-HA및 CaMKIIα 염색의 중첩은 코필린S3D-HA에대해 염색된 대부분의 세포가 CaMKIIα(도2G)에대해서도 양성임을 보여준다. 이 관측은 흥분성 뉴런에 대한 감염의 특이성을 지원합니다.
ECoG 활동에 대한 코필린 조작의 영향을 평가하기 위해 ECoG 및 EMG 신호는 경계 상태 (깨어, 느린 파도 수면, 역설적 수면)의 시각적 식별을 수행하는 데 사용됩니다. 이것은 마우스2의경계 상태의 급격한 변화로 인해 4-s 시대에 수행되며, 여기서 전체 24-h 레코딩을 위해 수행됩니다. 표준 분석에는 다른 데이터집합(11,12, 13,28,34)에 대해 이전에 수행된 수면 아키텍처 및 스펙트럼 분석변수의 계산이포함됩니다. 특히, 상이한 상태의 ECoG 신호의 스펙트럼 분석은 상태 조성 및 품질을 인덱싱할 것이다. 예를 들어, 전극의 상이한 깊이로부터 발생할 수 있는 차이를 제거하기 위해, 스펙트럼 분석 데이터는 주어진 동물의 모든 상태의 총전력(도 3A)에비해 발현될 수 있다. 더 높은 주파수에서 ECoG 활동의 매우 낮은 상대진폭을 감안할 때, 깨어, 느린 파도 수면 및 역설적인 수면에 대한 상대적인 전력 스펙트럼은 저주파수 및 고주파수에서 활동을 보다 적절하게 시각화하고 동시에 비교하도록 로그 변환되었습니다. 이 분석은 코필린 비활성화 조건하에서 스펙트럼 활성의 상태별 차이를나타낸다(도 3B). 보다 정밀하게, 남성과 여성 마우스를 결합하는 이러한 예비 연구 결과는 코필린 불활성화가 역설적인 수면 중 및 느린 주파수(1-4Hz)에서 빠른 주파수(14-30Hz)에서 스펙트럼 전력을 크게 증가시키는 동시에 슬로우 웨이브 수면 중 ECoG 활동을 주로 영향을 받지 않는다고 지적합니다. 또한, 코필린 비활성화는 ECoG 활동에서 마우스 간 변동성을 증가시키는 것으로 나타났다(특히 도 3B의절전 모드에 대한 오류 막대에서 눈에 띄는).
그림 1: ECoG/EMG 몽타주 구성 요소 및 ECoG 전극 배치의 대표적인 예의 제조. (A)ECoG 전극: 납무성 솔더를 사용하여 금으로 덮인 나사(헤드 직경 1.9mm, 1.14mm 실 주지름, 총 길이 3.6mm)의 머리에 4mm 길이, 0.2mm 직경의 금 와이어(비절연)가 융합된다. (B)EMG 전극: 두 개의 금 전선(1.5 및 2cm)이 구부러져 두개골의 곡선을 목 근육까지 받아들이고, 다른 쪽 끝은 커넥터에 납땜될 직구로 유지된다. (C)6채널 커넥터: 납무선솔더는 커넥터(5mm x 8mm x 8mm + 3mm 금속 핀)의 6개의 금속 핀(중간에 생략)의 5개에 추가됩니다. 커넥터의 상단은 쓰레기/ 물 침투를 방지하기 위해 테이프로 덮여 있습니다. (D)왼쪽 반구의 두개골에 3개의 유지보수 나사와 오른쪽 반구에 있는 3개의 ECoG 전극(기준 전극 포함)의 위치 지정의 예. ECoG 전극의 정확한 스테레오탁좌는 2.6및 3.2단계로 표시되며 브레그마와 람다의 위치에 따라 계산되었습니다(이는 노란색 점으로 표시됩니다). 약어: ECoG = 전기 코르티코그래피; EMG = 전동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대표적인 면역염색은 AAV 감염 영역 및 세포 유형을 정의한다. (A)패널 B에 제시된 관상 슬라이스의 주사 부위를 보여주는 회로도 표현. 위치는 브레그마에 1.1 mm 전방이며, 캐뉼라(빨간색으로 도시됨)는 오른쪽 1차 모터 피질(M1)의 층 V를 표적으로 하였다. 프랭클린과 팍시노스(40)에서수정 된 표현 . (B)HA의 면역염색은 전체 뇌의 관상 슬라이스에 도시된 뉴런에서 코필린S3D-HA발현을 검출하여 브레그마에 약 1.1mm 전방에 위치한다. 감염된 영역은 주로 오른쪽 1차 및 이차 모터 코르티체(M1 및 M2)의 층 V 및 VI(적외선 층)로 지역화됩니다. 스케일 바 = 500 μm. 제곱은 C.(C)감염된 세포의 염색을 나타내고 모터 피질의 깊은 층에서 코필린S3D-HA의발현을 확인하는 감염된 영역의 높은 배율을 나타낸다. 스케일 바 = 100 μm.(D)HA 및 CaMKIIα의 공동 면역스테인링은 브레그마에 약 0.5mm 전방에 위치한 오른쪽 반구의 관상 동맥 슬라이스에 대해 도시된 세포 유형 특이성을 평가하기 위해, 주사 부위에 후방(패널 B 및 C와 동일한 마우스). 감염된 부위는 모터 코르티제(M1 및 주로 M2)로 국한됩니다. 스케일 바 = 500 μm. 제곱은 E, F 및 G.(E)감염된 세포의 염색을 나타내고 코필린S3D-HA의발현을 확인하는 감염된 영역의 높은 배율 영역을 나타낸다. 스케일 바 = 100 μm.(F)CaMKIIα 양성 세포의 염색을 나타내는 감염된 영역의 배율이 높다. 스케일 바 = 100 μm.(G)감염된 부위의 높은 배율은 코필린S3D-HA및 CaMKIIα의 공동 라벨링을 나타내며, 감염된 세포가 CaMKIIα-양성임을 확인한다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: AAV = 아데노 관련 바이러스; M1 = 1차 모터 피질; M2 = 이차 모터 피질; CPu = 카우다테 푸타멘 (striatum); LV = 측면 심실; HA = 헤마글루티닌; 캄키이α = 칼슘/칼모둘린 의존성 단백질 키나아제 II 알파. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 코필린 기능의 바이러스 조작 후 얻은 깨어, 느린 파도 수면 및 역설적 수면을위한 대표적인 전력 스펙트럼. 남성(n = 그룹당 5개) 및 암컷(n=2) 마우스를 AAV 9-CaMKIIα0.4-코필린S3D-HA(바이러스성 티터 2.58 × 1013 GC/mL) 또는 대조군 AAV(AAV9-CaMKIIα0.4-eG1FP.20;1FP.25.10× 모터 피질의 층 V에서 이러한 제어 AAV)의 향상된 신호를 제어하는 테스트 티터의 절반은 24h에 대해 기록되었다, 및 전기 검사 신호는 스펙트럼 분석을 거쳤습니다(0.25Hz 해상도로 0.5~30Hz 사이의 스펙트럼 전력을 계산하는 빠른 Fourier Transform). (A)모든 국가의 총 권력에 대해 표현된 세 가지 경계 상태 동안의 전력 스펙트럼. (B)상대 전력 스펙트럼 로그 변환을 보다 적절하게 더 높은 주파수의 그룹 차이를 나타냅니다. AAV 9-CaMKIIα0.4-코필린S3D-HA를사용하여 모터 피질에서 코필린 활성을 억제하면 절발성 시 베타 범위(14-30Hz)에서 전기 코르티코그래피 활성이 크게 증가하고, 및 주사를 제어하는 데 비해 역설적인 수면 중 델타 범위(1-4Hz)에서(x 축 위의 빨간색 선은 Mann-Whitney U-주파수대역 전력 p < 0.05에 대한 테스트)를 나타낸다. 약어: AAV = 아데노 관련 바이러스 GC = 게놈 사본; HA = 헤마글루티닌; 캄키이α = 칼슘/칼모둘린 의존성 단백질 키나아제 II 알파; eGFP = 향상된 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 AAV를 사용하여 분자 표적을 조작하는 동안 ECoG 및 EMG 활동을 모니터링하는 정확하고 간단한 방법을 설명합니다. 적절한 그룹 간 비교를 위해, 항상 테스트 및 제어 동물을 위해 같은 날에 외과 적 수술 (AAV 주사 및 전극 이식)을 계획하고, 동시에 자신의 전기 생리학적 신호를 기록하는 것이 좋습니다. 시험과 대조군 동물 들 사이 유사한 바이러스 성 발현을 얻기 위하여는, 동일한 바이러스 성 티터를 주입하는 것이 바람직하다. 본 인하여, 대조군 AAV의 바이러스 성 티터는 유사한 바이러스 성 발현을 보장하기 위해 테스트 AAV의 절반으로 감소하였다. 실험자는 뇌 영역 /피질 층 타겟팅에서 동물 간 가변성을 낮게 보장하기 위해 스테레오 탁스 좌표의 측정에 매우 주의해야합니다. 또한, 사출 깊이가 두개골 표면에서 계산되고, 두개골 두께가 연령과 성별에 따라 달라진다는 점을 감안할 때, 캐뉼라의 배치는 항상 포스트 프로토콜 조직학 또는 면역 작용(예: 그림 2)을사용하여 검증되어야 하며, 필요한 경우 스테레오탁좌표를 조정해야 한다. 40분 AAV 주입 전반에 걸쳐, 펌프 막힘과 같은 잠재적인 문제를 신속하게 감지하고 수정하기 위해 사출 속도를 모니터링하는 것이 매우 중요합니다. 몇몇 실험단계는 또한 최적 전기 생리신호를 얻기 위하여 중요합니다. 예를 들어, 전극 이식 중에 지나치게 나사를 조이지 마십시오. 나사는 대뇌 피질의 손상과 신경교 흉터의 형성을 최소화하기 위해 적어도 2.5mm의 두개골에서 튀어 나와야합니다. 그 후, i) 전극의 사지에 시멘트를 적용하는 것을 피하는 것도 대단히 중요하며, ii) 커넥터에 전극의 신속한 납땜을 보장하고, iii) 전극 사이에 접촉이 없는지 확인한다.
ECoG 및 EMG 레코딩을 위해 여기에 제시된 절차는 매우 잘 확립되어 간단하며 마우스2,11,13,34에서절전 및 수면을 모니터링하는 데 널리 사용됩니다. 연속 ECoG 및 EMG 기록은 며칠 연속(및 주)에 걸쳐 수행될 수 있으며, 각성 및 수면 량 및 건축2,11,12(예를 들어, 빛 및 암흑 기간당 다른 상태에서 소요되는 시간, 각 상태의 에피소드 수, 각 상태의 여러 주에서 소요되는 시간, 각 상태의 에피소드 수와 관련된 변수를 포함하는 여러 줄의 분석을 수행하는 데 사용할 수 있는 매우 풍부한 데이터 집합을 생성할 수 있습니다. 수면의 24-h 분포), 절전 및 수면 스펙트럼 함량34,41 (예를 들어, 다른 주파수 대역에서의 전력 [그림 3],스케일 프리 활동)과 개별파도42,43,44 (예 : 느린 파 진폭 및 경사)의 특성. AAV 매개 분자 조작과 함께 사용하면 형질 전환 동물에서 발생할 수있는 잠재적 인 발달 보상을 피하는 것이 추가적인 이점이 있습니다. 연습으로, 전체 절차, 40 분 AAV 주입을 포함 하 여, 약 90 분에서 수행 될 수 있다. 수술이 최소 침습이기 때문에 사망률은 (매우) 낮아야합니다.
ECoG/EMG 레코딩 및 AAV의 표적 조작의 동시 사용은 다양한 다른 장점과 응용 프로그램을 제공합니다. 예를 들어, 적당히 수행될 때 스테레오탁틱 타겟팅의 정밀도는 매우 높고 복제성이 높으며 수면 또는 기타 생리적 과정의 조절에서 주어진 뇌 영역(및/또는 지역 내의 세포 유형 또는 분자 원소)의 특정 역할을 결정하는 데 유용합니다. 따라서 여러 가지 피질 영역은 현재 프로토콜의 적응을 사용하여 쉽게 표적으로 삼을 수 있습니다. 또한, AAV를 사용한 표적 조작은 ECoG 기록 사이트와 다른 피질/하위 영역으로 지시될 수 있습니다. 이러한 경우, AAV 주입을 위한 버 구멍은 치과 시멘트(또는 뼈 왁스)를 사용하여 고정된 작은 유리 덮개 슬립으로 덮을 수 있었다. 강화된 특이성을 위해, AAV 구조는 종종 정밀한 세포유형(14)의표적 감염을 허용하는 프로모터를 포함한다. CamKIIα 프로모터는 현재 프로토콜에서 전동 피질의 흥분 피라미드세포(14,29,45)를구체적으로 표적으로 삼는 데 사용하였다. 이러한 전략은 코필린(cofilinS3D사용)32,33의 운동 피질의 흥분성 뉴런및 ECoG 활성의 상태별 변화관찰(도 3)의불활성화를 가능하게 하였다. 감염/트랜스포션 효능을 평가하기 위해 향후 프로토콜 사용자는 제시된 AAV-ECoG 프로토콜을 면역형광에 의한 공동 염색 중 하나와 결합하고, 높은 배율 이미지를 사용하여 대상의 단일 라벨링을 보여주는 총 세포 수중에서 이중 라벨링을 나타내는 세포의 수를 계산할 수 있습니다(여기, CaMKIiα-expressing 뉴런). 최근 연구에서는, 여기에 설명된 것과 유사한 AAV-ECoG 방법은 시냅신 프로모터를 함유하는 AAV를 사용하여 모터 피질의 모든 뉴런에서 연약한 X 정신 지체 증후군 관련 단백질 1(FXR1)을 과발현하는 데 사용되었으며, 경계 상태 분포 및 스펙트럼 함량28에대한 이러한 조작의 효과를 밝혔다. 이 사실 인정은 AAV를 사용하여 표적 두뇌 지구에 있는 주어진 분자를 조작하는 것이 특정 깨어/수면 매개 변수의 규칙에 있는 역할을 드러낼 수 있는 방법을 보여줍니다.
기술된 프로토콜의 제한은 AAV 주입을 수행하기 전에 캐뉼라 배치로 발생하는 뇌 조직의 작은 병변이며, 이는 염증 반응을 동반할 수도 있다. 이것은 피질 영역에서 AAV 주입을 수행 할 때 특히 우려될 수 있으며 항상 적절한 제어를 사용하여 다루어야합니다. 대안적으로, 현재 프로토콜은 반응성 글리오시스 및/또는 미세글리아 활성화(예를 들어, 면역형광을 사용하여)의 정량화로 뒤따를 수 있어 제어 및 테스트 그룹에서 유사한 수준을 보장하고 따라서 ECoG 판독기에 있을 수 있다. 두 번째 제한은 전극과 커넥터 사이의 나쁜 연결의 위험에 관한 것으로, 이는 연속또는 때때로 나쁜 전기 생리학적 신호가 발생할 수 있습니다. 단단히 나사, 납땜 및 시멘트 전극이 문제의 발생률을 최소화합니다. 세 번째 제한은 동물들이 기록 중에 머리 몽타주를 통해 테더링되는 것과 관련이 있으며, 이는 적어도 어느 정도는 운동 및 기타 행동을 제한할 수 있으며 때로는 케이블 손상 및 신호 손실을 초래할 수 있습니다. 마지막으로, 제시된 프로토콜은성인마우스에 더 적합하며, 젊은 동물의 두개골 크기가 이전에 설명된 바와 같이 묘사된 머리 몽타주를 설치하는 데 어려움을 일으킬 수 있음을 감안할 때.
정확한 표적의 결합된 ECoG/EMG 기록 및 AAV 매개 조작은 또한 수면의 신경과학 이외에 연구 분야에도 적용됩니다. 그 중에서도 발작의 동물 모델에서 간질 사건을 연구하고 조작하는 데 사용될 수 있으며 메모리 인코딩 및 통합에 관련된 뇌 진동을 조절하는 강력한도구입니다(46,47). 따라서, 잠재적인 응용 프로그램은 확실히 정신 의학 및 신경학에 있는 근본적인 연구 필드를 포괄합니다, 신경 퇴행성 질병을 포함하여. 분자의 비활성 형태를 발현하는 능력 외에도, AAV는 과발현 또는 다운조절(예를 들어, 소간섭 RNA, CRISPR/Cas9) 또는 전신 KO에서 분자의 발현을 구출하는 데 사용될 수 있고 사용되었다. 중요한 것은, 현재 프로토콜의 이중 방법론은 수면과 신경변성48,49를모두 이해하는 흥미로운 모델을 나타내는 쥐 및 주신경 설치류와 같은 다른 포유류 종에도 적용가능하다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 수면 분자 생리학의 캐나다 연구 위원장에 의해 지원되었습니다. 저자는 기술적인 도움을 청한 끌로에 프로보스트와 캐롤라인 부차드에게 감사한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgery peparation | |||
| 21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
| 6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
| Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
| Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
| Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
| Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
| Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
| Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
| Lead-free solder | AIM | SN100C | |
| Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
| PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
| Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
| Soldering iron | Weller | WES51 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
| Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
| Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
| Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
| 0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
| AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
| AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
| Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
| Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
| Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
| Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
| ECoG/EMG electrode implantation | |||
| Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
| Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
| Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
| Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
| Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
| Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
| Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
| Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
| Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
| Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
| RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
| Immunofluorescence and ECoG recording | |||
| 36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
| CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
| Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
| Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
| Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
| Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
| Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |
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