Denne artikel beskriver en protokol for manipulation af molekylære mål i hjernebarken ved hjælp af adeno-associerede vira og til overvågning af virkningerne af denne manipulation under vågenhed og søvn ved hjælp af elektrokorttiske optagelser.
Brugen af elektrokortografiske (ECoG) optagelser i gnavere er relevant for søvnforskning og for studiet af en lang række neurologiske tilstande. Adeno-associerede vira (AAV’er) bruges i stigende grad til at forbedre forståelsen af hjernekredsløb og deres funktioner. Den AAV-medierede manipulation af specifikke cellepopulationer og/eller af præcise molekylære komponenter har været uhyre nyttig til at identificere nye søvnregulerende kredsløb/molekyler og nøgleproteiner, der bidrager til de negative virkninger af søvntab. For eksempel forhindrer hæmmende aktivitet af den filamentøse actin-afskærende protein cofilin ved hjælp af AAV søvnmangel-induceret hukommelsesnedsættelse. Her beskrives en protokol, der kombinerer manipulation af cofilin-funktion i et hjernebarkområde med registrering af ECoG-aktivitet for at undersøge, om kortikal cofilin modulerer vågenhed og søvn ECoG-signaler. AAV-injektion udføres under samme kirurgiske procedure som implantationen af ECoG og elektromyografiske (EMG) elektroder hos voksne han- og hunmus. Mus bedøves, og deres hoveder barberes. Efter hudrensning og indsnit bestemmes stereotaxiske koordinater for den motoriske cortex, og kraniet gennembores på dette sted. En kanyle fyldt med en AAV, der udtrykker cofilinS3D, en inaktiv form for cofilin, er langsomt placeret i det kortikale væv. Efter AAV-infusion skrues gulddækkede skruer (ECoG-elektroder) gennem kraniet og cementeres til kraniet med guldtråde indsat i nakkemusklerne (EMG-elektroder). Dyrene får tre uger til at komme sig og sikre tilstrækkeligt udtryk for cofilinS3D. Det inficerede område og celletype verificeres ved hjælp af immunhistokemi, og ECoG analyseres ved hjælp af visuel identifikation af årvågenhedstilstande og spektralanalyse. Sammenfattende gør denne kombinerede metodologiske tilgang det muligt at undersøge det præcise bidrag fra molekylære komponenter, der regulerer neuronal morfologi og forbindelse til reguleringen af synkroniseret hjernebarkaktivitet under vågenhed og søvn.
Elektroencefalografiske (eller generelt elektrokortografiske [ECoG] i gnavere) og elektromyografiske (EMG) optagelser anvendes i vid udstrækning i søvnforskning såvel som mere bredt inden for neurovidenskab, neurologi og psykiatri. Tilsammen giver disse elektrofysiologiske signaler mulighed for identifikation af årvågenhedstilstande og den efterfølgende kvantificering af statens varighed og spektralsammensætning, både hos mennesker og gnavere1,2,3,4. En sådan kvantificering har været nyttig til at forstå, hvordan søvn ændres under patologiske tilstande som neurodegenerative sygdomme og model5,6,7 eller ved genetisk modifikation8,9. For eksempel blev knockout (KO) af forskellige gener forbundet med neuronal kommunikation vist sig at ændre varigheden af vågenhed og søvn i både musen og frugt flyve10,11,12,13. For at tackle den potentielle udviklingskompensation, der følger af undersøgelsen af fuldkrops-KO hos gnavere, og for at muliggøre en finere kontrol med genmanipulation er en effektiv måde at manipulere genekspression på at anvende adeno-associerede vira (AAV’er). En AAV-medieret genmanipulation kan bruges til at nedregulere et givet molekylært mål og til at begrænse manipulationen til en bestemt cellepopulation ved hjælp af forskellige typer initiativtagere14. AAV’er anvendes også i vid udstrækning som leveringsmetode i de grupperede, der regelmæssigt interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-teknologi15,16. Disse metoder giver mulighed for bedre tidsmæssig og rumlig kontrol af genmanipulation, som generelt er forbundet med udtrykket af en reporter, der tillader kvantificering af det inficerede område ved hjælp af immunfluorescens.
AAV’er repræsenterer også hovedvektoren for celletypespecifikke manipulationer af neuronal aktivitet via optogenetics og kemogetik17,18,19, som er blevet udbredt i nyere forskning i neurodegenerative sygdomme, adfærd, kognition og søvn20,21,22. I søvnforskning har anvendelsen af optogenetics til aktivering eller hæmning af visse hjerneregioner, såsom basal forhjernen, hypothalamus og sublaterodorsal tegmentum, været nyttig til at bestemme deres roller i kontrollen af ophidselse, langsom bølge søvn (også kendt som ikke-hurtig øjenbevægelsessøvn), paradoksal søvn (eller hurtig øjenbevægelsessøvn) og katapleksi23, 24,25. Desuden har AAV-medierede manipulationer hjulpet med at belyse vigtige søvnregulerende kredsløb og molekyler , der bidrager til de negative virkninger af søvntab26,27,28. For eksempel, et protein vist sig at være impliceret i søvnmangel-induceret hukommelsesnedsættelse er cofilin29,30. Dette protein er et filamentøst actin-severing protein, der deltager i reorganiseringen af actin filamenter ved fysisk bindende for actin og fremme demontering af filamenter på en dynamisk måde31. Hæmmende cofilinaktivitet ved hjælp af en AAV-medieret tilgang viste sig at forhindre tab af rygsøjlen samt synaptisk plasticitet og hukommelsesunderskud forårsaget af søvnmangel hos mus29. Samlet understreger disse undersøgelser nytten og relevansen af AAV-medierede manipulationer for at forstå søvnregulering og konsekvenserne af søvnmangel hos gnavere.
Her beskrives en protokol, der kombinerer ECoG og EMG elektrodeimplantation og optagelse med manipulation af cofilin-funktion i et hjernebarkområde af vilde mus (WT) ved hjælp af en AAV. Mere præcist injiceres en AAV (serotype 9), der udtrykker kodningssekvensen af en fosformisk form af musens cofilin (cofilinS3D), hvilket gør den inaktiv32,33, injiceret i den motoriske cortex (M1 og M2). En ECoG-elektrode implanteres direkte på injektionsstedet for at sikre registrering af de inficerede cellers synkroniserede kortikale aktivitet. ECoG/EMG-optagelsen udføres i 24 timer under uforstyrrede forhold tre uger efter operationen for at give mulighed for genopretning, tilpasning og høj cofilinS3D-udtryk. Optagelsen bruges derefter til identifikation af årvågenhedstilstande og ECoG-spektralanalyse som beskrevet i tidligere undersøgelser11,34. Denne metode kan specifikt afsløre, hvordan kortikal cofilin modulerer vågenhed og søvn ECoG signaler i mus. Denne kombination af elektrofysiologiske optagelser og AAV-medieret genmanipulation er særlig relevant for at undersøge forskellige molekylære elementers roller i specifikke hjernefunktioner og kan anvendes på kortikale (og subkortikale) hjerneområder af interesse for WT og genetisk modificerede mus af begge køn og endda andre arter.
Denne protokol beskriver en præcis og ligetil metode til at overvåge ECoG- og EMG-aktivitet under manipulation af molekylære mål ved hjælp af AAV’er. For at sikre en passende sammenligning mellem grupperne anbefales det på det kraftigste altid at planlægge kirurgiske procedurer (AAV-injektion og elektrodeimplantation) samme dag for forsøgs- og kontroldyr og at registrere deres elektrofysiologiske signaler samtidigt. For at opnå et lignende viralt udtryk mellem forsøgs- og kontroldyrene er det ønskeligt at injicere den samme virale titer. I det foreliggende tilfælde var den virale kontroltitre AAV blevet reduceret til halvdelen af testenS AAV for at sikre et lignende viralt udtryk. Forsøgsfolk bør være meget forsigtige med målinger af stereotaxiske koordinater for at sikre lav variation mellem dyr i hjernens område/ kortikale lagmålretning. Da injektionsdybden beregnes ud fra kraniets overflade, og kraniets tykkelse varierer efter alder og køn, bør kanylens placering altid kontrolleres ved hjælp af histologi efter protokollen eller immunohistochemisteri (f.eks. figur 2) for at sikre tilstrækkelig positionering/dybde af injektionen, og de stereotaxiske koordinater bør om nødvendigt justeres. I løbet af 40-minutters AAV-injektionen er det meget vigtigt at overvåge injektionshastigheden for hurtigt at opdage og rette potentielle problemer såsom pumpeblokering. Nogle eksperimentelle trin er også afgørende for at opnå optimale elektrofysiologiske signaler. For eksempel må du ikke overscrew under elektrodeimplantation; skruer skal stikke ud af kraniet med mindst 2,5 mm for at minimere skader på hjernebarken og dannelsen af et glial ar. Bagefter er det også uhyre vigtigt at i) undgå at påføre cement til elektrodernes ekstremiteter, ii) sikre en hurtig lodning af elektroderne til stikket, og iii) sørg for, at der ikke er nogen kontakt mellem elektroderne.
Den procedure, der præsenteres her for ECoG- og EMG-optagelse, er ekstremt veletableret, enkel og meget udbredt til at overvåge vågenhed og søvn hos mus2,11,13,34. Kontinuerlige ECoG- og EMG-optagelser kan udføres i flere på hinanden følgende dage (og endda uger) og generere et meget rigt datasæt, der kan bruges til at udføre flere analyselinjer, der omfatter variabler relateret til vågenhed og søvnmængde og arkitektur2,11,12 (f.eks. tid brugt i forskellige tilstande pr. lys og mørke perioder, antal episoder i hver stat, 24-timers fordeling af søvn), vågenhed og søvnspektralindhold34,41 (f.eks. effekt i forskellige frekvensbånd [svarendetil figur 3 ], skalafri aktivitet) og karakteristika for individuelle bølger42,43,44 (f.eks. langsom bølge amplitude og hældning). Når det anvendes i kombination med AAV-medierede molekylære manipulationer, er en yderligere fordel at undgå potentiel udviklingskompensation, der kan forekomme hos transgene dyr. Med øvelse kan hele proceduren, herunder 40-minutters AAV-injektionen, udføres på ca. 90 minutter. Dødeligheden bør være (meget) lav, da operationen er minimalt invasiv.
Samtidig brug af ECoG/ EMG-optagelse og målrettet manipulation med AAV tilbyder en række andre fordele og applikationer. For eksempel er præcisionen af stereotaxisk målretning, når den udføres tilstrækkeligt, meget høj og replikerbar og er nyttig til at bestemme den specifikke rolle, som en given hjerneregion (og / eller en celletype eller et molekylært element i regionen) spiller i reguleringen af søvn eller andre fysiologiske processer. Flere forskellige kortikale områder kan således let målrettes ved hjælp af tilpasninger af den nuværende protokol. Desuden kan målmanipulationer ved hjælp af AAV’er rettes mod et kortikalt/subkortikalt område, der er forskelligt fra ECoG-registreringsstederne. I sådanne tilfælde kan burrhullet til AAV-injektion dækkes af en lille glasovertræksdækning, der er fastgjort ved hjælp af dentalcement (eller knoglevoks). For øget specificitet indeholder AAV-konstruktionen ofte en promotor, der tillader målrettet infektion af en præcis celletype14. En CamKIIα promotor blev brugt i denne protokol til specifikt at målrette excitatoriske pyramideceller14,29,45af den motoriske cortex. Denne strategi har gjort det muligt at inaktivere cofilin (ved hjælp af cofilinS3D)32,33 i excitatoriske neuroner af den motoriske cortex og observation af statsspecifikke ændringer i ECoG-aktivitet ( Figur3). For at vurdere infektions-/transduktionseffektiviteten kunne fremtidige protokolbrugere kombinere den præsenterede AAV-ECoG-protokol med en co-farvning ved immunfluorescens og bruge billeder med høj forstørrelse til at beregne antallet af celler, der viser dobbeltmærkning ud af det samlede antal celler, der viser enkeltmærkning af målet (her CaMKIIα-udtrykkende neuroner). I en nylig undersøgelse blev en AAV-ECoG-metode svarende til den, der er beskrevet her, brugt til at overekspressere skrøbelig X mental retardering syndrom-relateret protein 1 (FXR1) i alle neuroner af den motoriske cortex ved hjælp af en AAV, der indeholder en synapsinpromotor og afslørede en effekt af denne manipulation på årvågenhedstilstandsfordeling og spektralindhold28. Disse fund illustrerer, hvordan manipulering af et givet molekyle i en målhjerneregion ved hjælp af AAV’er kan afsløre roller i reguleringen af specifikke vågenheds- / søvnparametre.
En begrænsning af den beskrevne protokol er den lille læsion af hjernevæv, der forekommer med kanyleplacering, før AAV-injektionen udføres, hvilket også kan ledsages af en inflammatorisk reaktion. Dette kan give anledning til særlig bekymring, når der foretages AAV-injektion i subkortikale områder, og bør altid tackles ved hjælp af passende kontroller. Alternativt kan den nuværende protokol efterfølges af kvantificering af reaktiv gliose og/eller mikroglial aktivering (f.eks. ved hjælp af immunfluorescens) for at sikre lignende niveauer i kontrol- og testgrupper og dermed på ECoG-udlæsningen. En anden begrænsning vedrører risikoen for dårlig forbindelse mellem en elektrode og stikket, hvilket kan resultere i et kontinuerligt eller lejlighedsvis dårligt elektrofysiologisk signal. Solidt skruet, loddet og cementeret elektroder vil minimere forekomsten af dette problem. En tredje begrænsning er relateret til dyr, der bindes via hovedmontage under optagelsen, hvilket kan begrænse bevægelse og anden adfærd, i det mindste til en vis grad, og lejlighedsvis resultere i kablerskader og signaltab. Endelig er den præsenterede protokol mere egnet til voksne mus, da kraniestørrelsen af yngre dyr kan forårsage vanskeligheder med at installere den afbildede hovedmontage, som beskrevet tidligere2.
Kombineret ECoG/ EMG-optagelse og AAV-medieret manipulation af et præcist mål gælder også for andre forskningsområder end neurovidenskab af søvn. Blandt andet kan det bruges til at studere og manipulere epileptiske begivenheder i dyremodeller af beslaglæggelse og er et kraftfuldt værktøj til at modulere hjernesvingninger, der er involveret i hukommelseskodning og konsolidering46,47. Derfor omfatter potentielle anvendelser helt sikkert områderne grundforskning inden for psykiatri og neurologi, herunder neurodegenerative sygdomme. Ud over evnen til at udtrykke en inaktiv form af et molekyle kan og er AAV’er blevet brugt til at overekspressere eller nedregulere (f.eks. små forstyrrende RNA, CRISPR/Cas9) eller til at redde ekspressionen af et molekyle i en helkrops KO. Det er vigtigt, at den dobbelte metode i den nuværende protokol også gælder for andre pattedyrarter som rotter og døgn gnavere, der repræsenterer interessante modeller til at forstå både søvn og neurodegeneration48,49.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev finansieret af Canada Research Chair i Sleep Molecular Fysiologi. Forfatterne er taknemmelige for Chloé Provost og Caroline Bouchard for teknisk hjælp.
Surgery peparation | |||
21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
Lead-free solder | AIM | SN100C | |
Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
Soldering iron | Weller | WES51 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
ECoG/EMG electrode implantation | |||
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
Immunofluorescence and ECoG recording | |||
36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |