Questo articolo descrive un protocollo per la manipolazione di bersagli molecolari nella corteccia cerebrale utilizzando virus adeno-associati e per il monitoraggio degli effetti di questa manipolazione durante la veglia e il sonno utilizzando registrazioni elettrocorticografiche.
L’uso di registrazioni elettrocorticografiche (ECoG) nei roditori è rilevante per la ricerca sul sonno e per lo studio di una vasta gamma di condizioni neurologiche. I virus adeno-associati (AAV) sono sempre più utilizzati per migliorare la comprensione dei circuiti cerebrali e delle loro funzioni. La manipolazione mediata dall’AAV di specifiche popolazioni cellulari e/o di precisi componenti molecolari è stata estremamente utile per identificare nuovi circuiti/molecole regolatorie del sonno e proteine chiave che contribuiscono agli effetti avversi della perdita di sonno. Ad esempio, l’inibizione dell’attività della proteina filamentosa che taglia l’actina cofilin utilizzando AAV previene la compromissione della memoria indotta dalla privazione del sonno. Qui, viene descritto un protocollo che combina la manipolazione della funzione della cofilina in un’area della corteccia cerebrale con la registrazione dell’attività ECoG per esaminare se la cofilina corticale modula i segnali ECoG di veglia e sonno. L’iniezione di AAV viene eseguita durante la stessa procedura chirurgica dell’impianto di elettrodi ECoG ed elettromiografici (EMG) in topi adulti maschi e femmine. I topi sono anestetizzati e le loro teste sono rasate. Dopo la pulizia della pelle e l’incisione, vengono determinate le coordinate stereotassessche della corteccia motoria e il cranio viene perforato in questa posizione. Una cannula preriempita con un AAV che esprime cofilinS3D, una forma inattiva di cofilina, viene lentamente posizionata nel tessuto corticale. Dopo l’infusione di AAV, le viti ricoperte d’oro (elettrodi ECoG) vengono avvitate attraverso il cranio e cementate al cranio con fili d’oro inseriti nei muscoli del collo (elettrodi EMG). Agli animali sono concesse tre settimane per recuperare e garantire una sufficiente espressione di cofilinS3D. L’area infetta e il tipo di cellula vengono verificati utilizzando l’immunoistochimica e l’ECoG viene analizzato utilizzando l’identificazione visiva degli stati di vigilanza e l’analisi spettrale. In sintesi, questo approccio metodologico combinato consente di conoscere il contributo preciso delle componenti molecolari che regolano la morfologia neuronale e la connettività alla regolazione dell’attività sincronizzata della corteccia cerebrale durante la veglia e il sonno.
Le registrazioni elettroencefalografiche (o generalmente elettrocorticografiche [ECoG] nei roditori) ed elettromiografiche (EMG) sono ampiamente utilizzate nella ricerca sul sonno e più in generale nelle neuroscienze, nella neurologia e nella psichiatria. In combinazione, questi segnali elettrofisiologici consentono l’identificazione degli stati di vigilanza e la successiva quantificazione della durata dello stato e della composizione spettrale, sia nell’uomo che neiroditori 1,2,3,4. Tale quantificazione è stata utile per capire come il sonno viene modificato in condizioni patologiche come le malattie neurodegenerative e i modelli5,6,7 o per modificazione genetica8,9. Ad esempio, il knockout (KO) di diversi geni legati alla comunicazione neuronale ha dimostrato di modificare la durata della veglia e del sonno sia nel topo che nel moscerino della frutta10,11,12,13. Per affrontare la potenziale compensazione dello sviluppo derivante dallo studio del KO di tutto il corpo nei roditori e per consentire un controllo più fine della manipolazione genetica, un modo efficace per manipolare l’espressione genica è utilizzare virus adeno-associati (AAV). Una manipolazione genetica mediata da AAV può essere utilizzata per ridurre o sovraregolare un dato bersaglio molecolare e per limitare la manipolazione a una specifica popolazione cellulare utilizzando diversi tipi di promotori14. Gli AAV sono anche ampiamente utilizzati come metodo di consegna nelle ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR)/Cas9 technology15,16. Queste metodologie consentono un migliore controllo temporale e spaziale della manipolazione genetica, che è generalmente associata all’espressione di un reporter che consente la quantificazione dell’area infetta utilizzando l’immunofluorescenza.
Gli AAV rappresentano anche il principale vettore per le manipolazioni specifiche del tipo cellulare dell’attività neuronale tramite optogenetica e chemiogenetica17,18,19,che sono stati ampiamente utilizzati in recenti ricerche sulle malattie neurodegenerative, il comportamento, la cognizione e il sonno20,21,22. Nella ricerca sul sonno, l’applicazione dell’optogenetica per l’attivazione o l’inibizione di alcune regioni del cervello, come il reencefalo basale, l’ipotalamo e il tegmento sublaterodorsale, è stata utile per determinare i loro ruoli nel controllo dell’eccitazione, del sonno a onde lente (noto anche come sonno del movimento oculare non rapido), del sonno paradossale (o del sonno del movimento rapido degli occhi) e della cataplessia23, 24,25. Inoltre, le manipolazioni mediate da AAV hanno contribuito a chiarire importanti circuiti di regolazione del sonno e molecole che contribuiscono agli effetti avversi della perdita di sonno26,27,28. Ad esempio, una proteina che ha dimostrato di essere implicata nella compromissione della memoria indotta dalla privazione del sonno è la cofilina29,30. Questa proteina è una proteina filamentosa che taglia l’actina che partecipa alla riorganizzazione dei filamenti di actina legandosi fisicamente all’actina e promuovendo lo smontaggio dei filamenti in modo dinamico31. L’inibizione dell’attività della cofilina utilizzando un approccio mediato da AAV ha dimostrato di prevenire la perdita della colonna vertebrale, la plasticità sinaptica e i deficit di memoria indotti dalla privazione del sonno nei topi29. Collettivamente, questi studi sottolineano l’utilità e la rilevanza delle manipolazioni mediate da AAV per comprendere la regolazione del sonno e le conseguenze della privazione del sonno nei roditori.
Qui, viene descritto un protocollo che combina l’impianto e la registrazione di elettrodi ECoG ed EMG con la manipolazione della funzione di cofilina in un’area della corteccia cerebrale di topi wild-type (WT) utilizzando un AAV. Più precisamente, un AAV (sierotipo 9) che esprime la sequenza codificante di una forma fosfomimetica della cofilina di topo (cofilinS3D),rendendola inattiva32,33,viene iniettata nella corteccia motoria (M1 e M2). Un elettrodo ECoG viene impiantato direttamente nel sito di iniezione per garantire la registrazione dell’attività corticale sincronizzata delle cellule infette. La registrazione ECoG / EMG viene condotta per 24 ore in condizioni indisturbate tre settimane dopo l’intervento chirurgico per consentire il recupero, l’adattamento e l’elevata espressione di cofilinS3D. La registrazione viene quindi utilizzata per l’identificazione degli stati di vigilanza e l’analisi spettrale ECoG, come descritto in precedenti studi11,34. Questa metodologia può rivelare in modo specifico come la cofilina corticale modula i segnali ECoG della veglia e del sonno nei topi. Questa combinazione di registrazioni elettrofisiologiche e manipolazione genetica mediata da AAV è particolarmente rilevante per studiare i ruoli di vari elementi molecolari in specifiche funzioni cerebrali e potrebbe essere applicata alle aree cerebrali corticali (e sottocorticali) di interesse per WT e topi geneticamente modificati di entrambi i sessi e persino di altre specie.
Questo protocollo descrive un metodo preciso e diretto per monitorare l’attività di ECoG ed EMG durante la manipolazione di bersagli molecolari utilizzando AAV. Per un adeguato confronto tra i gruppi, si raccomanda vivamente di pianificare sempre le procedure chirurgiche (iniezione AAV e impianto di elettrodi) lo stesso giorno per gli animali di prova e di controllo e di registrare contemporaneamente i loro segnali elettrofisiologici. Per ottenere un’espressione virale simile tra gli animali di prova e di controllo, è auspicabile iniettare lo stesso titolo virale. Nel caso di specie, il titolo virale dell’AAV di controllo era stato ridotto alla metà dell’AAV di prova per garantire un’espressione virale simile. Gli sperimentatori dovrebbero essere molto attenti con le misurazioni delle coordinate stereotassche per garantire una bassa variabilità tra gli animali nel targeting dell’area del cervello / strato corticale. Inoltre, dato che la profondità di iniezione è calcolata dalla superficie del cranio e che lo spessore del cranio varia con l’età e il sesso, il posizionamento della cannula deve sempre essere verificato utilizzando l’istologia post-protocollo o l’immunoistochimica (ad esempio, Figura 2) per garantire un posizionamento / profondità di iniezione adeguati e le coordinate stereotassessche devono essere regolate se necessario. Durante l’iniezione AAV di 40 minuti, è molto importante monitorare la velocità di iniezione per rilevare e correggere rapidamente potenziali problemi come il blocco della pompa. Alcune fasi sperimentali sono anche cruciali per ottenere segnali elettrofisiologici ottimali. Ad esempio, non sovraccaricare durante l’impianto dell’elettrodo; le viti dovrebbero sporgere dal cranio di almeno 2,5 mm per ridurre al minimo i danni alla corteccia cerebrale e la formazione di una cicatrice gliale. Successivamente, è anche estremamente importante i) evitare di applicare cemento alle estremità degli elettrodi, ii) garantire una rapida saldatura degli elettrodi al connettore e iii) assicurarsi che non vi sia alcun contatto tra gli elettrodi.
La procedura qui presentata per la registrazione ECoG ed EMG è estremamente consolidata, semplice e ampiamente utilizzata per monitorare la veglia e il sonno nei topi2,11,13,34. Le registrazioni continue ECoG ed EMG possono essere eseguite per diversi giorni consecutivi (e persino settimane) e generare un set di dati molto ricco che può essere utilizzato per eseguire diverse linee di analisi comprendenti variabili relative alla veglia e alla quantità di sonno e all’architettura2,11, 12 (ad esempio, tempo trascorso in diversi stati per periodi di luce e buio, numero di episodi di ogni stato, Distribuzione 24 ore del sonno), veglia e contenuto spettrale del sonno34,41 (ad esempio, potenza in diverse bande di frequenza [simile alla Figura 3], attività senza scala) e caratteristiche delle singole onde42,43,44 (ad esempio, ampiezza e pendenza delle onde lente). Se usato in combinazione con manipolazioni molecolari mediate da AAV, un ulteriore vantaggio è l’evitamento della potenziale compensazione dello sviluppo che può verificarsi negli animali transgenici. Con la pratica, l’intera procedura, compresa l’iniezione AAV di 40 minuti, può essere eseguita in circa 90 minuti. Il tasso di mortalità dovrebbe essere (molto) basso in quanto l’intervento chirurgico è minimamente invasivo.
L’uso simultaneo della registrazione ECoG/EMG e la manipolazione mirata con AAV offre una varietà di altri vantaggi e applicazioni. Ad esempio, la precisione del targeting stereotassico, se adeguatamente eseguita, è molto elevata e replicabile ed è utile per determinare il ruolo specifico di una data regione del cervello (e/o di un tipo di cellula o di un elemento molecolare all’interno della regione) nella regolazione del sonno o di altri processi fisiologici. Diverse aree corticali possono quindi essere facilmente mirate utilizzando adattamenti del protocollo corrente. Inoltre, le manipolazioni target che utilizzano AAV potrebbero essere indirizzate a un’area corticale/sottocorticale diversa dai siti di registrazione ECoG. In questi casi, il foro della bava per l’iniezione di AAV potrebbe essere coperto da un piccolo coperchio di vetro fissato utilizzando cemento dentale (o cera ossea). Per una maggiore specificità, la costruzione AAV spesso include un promotore che consente l’infezione mirata di un preciso tipo di cellula14. Un promotore di CamKIIα è stato utilizzato nel presente protocollo per colpire specificamente le cellule piramidali eccitatorie14,29,45della corteccia motoria. Questa strategia ha permesso l’inattivazione della cofilina (utilizzando cofilinS3D)32, 33nei neuroni eccitatori dellacorteccia motoria e l’osservazione di cambiamenti specifici dello stato nell’attività di ECoG(Figura 3). Per valutare l’efficacia dell’infezione / trasduzione, i futuri utenti del protocollo potrebbero combinare il protocollo AAV-ECoG presentato con uno di co-colorazione mediante immunofluorescenza e utilizzare immagini ad alto ingrandimento per calcolare il numero di cellule che mostrano la doppia etichettatura sul numero totale di cellule che mostrano una singola etichettatura del bersaglio (qui, neuroni che esprimono CaMKIIα). In un recente studio, un metodo AAV-ECoG simile a quello qui descritto è stato utilizzato per sovraesprimere la proteina 1 correlata alla sindrome da ritardo mentale dell’X fragile (FXR1) in tutti i neuroni della corteccia motoria utilizzando un AAV contenente un promotore della sinapsina e ha rivelato un effetto di questa manipolazione sulla distribuzione dello stato di vigilanza e sul contenuto spettrale28. Questi risultati illustrano come la manipolazione di una determinata molecola in una regione del cervello bersaglio utilizzando AAV può rivelare ruoli nella regolazione di specifici parametri di veglia / sonno.
Una limitazione del protocollo descritto è la piccola lesione del tessuto cerebrale che si verifica con il posizionamento della cannula prima di eseguire l’iniezione di AAV, che potrebbe anche essere accompagnata da una risposta infiammatoria. Ciò potrebbe essere particolarmente preoccupante quando si esegue l’iniezione di AAV in aree sottocorticali e dovrebbe sempre essere affrontato utilizzando controlli adeguati. In alternativa, l’attuale protocollo potrebbe essere seguito dalla quantificazione della gliosi reattiva e/o dell’attivazione microgliale (ad esempio, utilizzando l’immunofluorescenza) per garantire livelli simili nei gruppi di controllo e di test e, quindi, sulla lettura ECoG. Una seconda limitazione riguarda il rischio di una cattiva connessione tra un elettrodo e il connettore, che potrebbe comportare un segnale elettrofisiologico continuamente o occasionalmente cattivo. Gli elettrodi avvitati, saldati e cementati solidamente ridurranno al minimo l’incidenza di questo problema. Una terza limitazione è legata agli animali legati tramite il montaggio della testa durante la registrazione, che potrebbe limitare la locomozione e altri comportamenti, almeno in una certa misura, e occasionalmente causare danni al cablaggio e perdita di segnale. Infine, il protocollo presentato è più adatto per i topi adulti, dato che le dimensioni del cranio degli animali più giovani possono causare difficoltà nell’installazione del montaggio della testa raffigurata, come descritto in precedenza2.
La registrazione combinata ECoG/EMG e la manipolazione mediata da AAV di un bersaglio preciso sono applicabili anche a campi di ricerca diversi dalle neuroscienze del sonno. Tra gli altri, potrebbe essere utilizzato per studiare e manipolare eventi epilettici in modelli animali di convulsioni ed è un potente strumento per modulare le oscillazioni cerebrali coinvolte nella codifica e nel consolidamento della memoria46,47. Di conseguenza, le potenziali applicazioni comprendono certamente i campi della ricerca fondamentale in psichiatria e neurologia, comprese le malattie neurodegenerative. Oltre alla capacità di esprimere una forma inattiva di una molecola, gli AAV possono e sono stati utilizzati per sovraesprimere o sottoregolare (ad esempio, RNA a interferenza di piccole dimensioni, CRISPR / Cas9) o per salvare l’espressione di una molecola in un KO di tutto il corpo. È importante sottolineare che la duplice metodologia dell’attuale protocollo è applicabile anche ad altre specie di mammiferi come ratti e roditori diurni che rappresentano modelli interessanti per comprendere sia il sonno che la neurodegenerazione48,49.
The authors have nothing to disclose.
Il lavoro è stato finanziato dalla Canada Research Chair in Sleep Molecular Physiology. Gli autori sono grati a Chloé Provost e Caroline Bouchard per l’aiuto tecnico.
Surgery peparation | |||
21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
Lead-free solder | AIM | SN100C | |
Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
Soldering iron | Weller | WES51 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
ECoG/EMG electrode implantation | |||
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
Immunofluorescence and ECoG recording | |||
36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |