Summary
نقدم بروتوكولًا لإعداد شرائح حادة من قرن آمون الظهر الوسيط للفئران. نحن نقارن هذا الإعداد عرضية مع تشريح التاجي من حيث جودة التسجيلات والحفاظ على الميزات المورفولوجية للخلايا العصبية المسجلة.
Abstract
على الرغم من أن العمارة العامة لحصان آمون مماثلة على طول محورها الطولي، فقد كشفت الدراسات الحديثة عن اختلافات بارزة في المعايير الجزيئية والتشريحية والوظيفية التي تشير إلى انقسام إلى دوائر فرعية مختلفة على طول مدىها الوردي- الcaudal. ونظراً لتباين الاتصال والوظيفة، فإن التمييز الأساسي هو التمييز بين الحصين الظهري وحصين البطني، اللذين يشتركان بشكل تفضيلي في المعالجة المكانية والعاطفية، على التوالي. وبناء على ذلك، في العمل الجسم الحي فيما يتعلق تشكيل الذاكرة المكانية قد ركزت على الحصين الظهرية.
وعلى النقيض من ذلك، تم إجراء التسجيلات الكهروفسية في المختبر بشكل تفضيلي على قرن آمون متوسط البطني، مدفوعًا إلى حد كبير بعوامل مثل قابلية الشريحة للحياة وسلامة الدوائر. للسماح للارتباط المباشر من البيانات في الجسم الحي على المعالجة المكانية مع البيانات في المختبر قمنا بتكييف أساليب اقسام سابقة للحصول على شرائح الدماغ العرضية قابلة للحياة للغاية من الحصين الظهري الوسيط للتسجيلات طويلة الأجل للخلايا الرئيسية والدراجات في gyrus دنت. كما يتم تحليل السلوك المكاني بشكل روتيني في الفئران البالغة، قمنا بدمج هذا الإجراء تشريح عرضية مع استخدام حلول وقائية لتعزيز صلاحية أنسجة الدماغ من الحيوانات الناضجة. نحن نستخدم هذا النهج للفئران من حوالي 3 أشهر من العمر. طريقة يوفر بديلا جيدا لإعداد التاجية التي تستخدم في كثير من الأحيان للدراسات في المختبر على الحصين الظهرية. نحن نقارن بين هذين الاستعدادين من حيث جودة التسجيلات والحفاظ على الميزات المورفولوجية للخلايا العصبية المسجلة.
Introduction
وقد درس الحصين على نطاق واسع لدوره المحوري في جوانب مختلفة من التعلم والذاكرة، والملاحة المكانية، فضلا عن العاطفة. إن الدوائر الأساسية في الحصين، والتي تسمى عادة "الدائرة الثلاثية" هي شبكة من اللاميكار في المحور العرضي، والتي يتم الحفاظ عليها إلى حد كبير على طول المحور الطولي1. من المحتمل أن تنشأ مساهمات قرن آمون في مختلف السلوكيات المعرفية والعاطفية من الاتصالات المتنوعة التي تقوم بها هذه الدوائر الأساسية على طول محور دورسوفينرال مع العديد من مناطق الدماغ الأخرى2,3. ولكن إلى جانب الاتصال المُتَوَّر والمُرَكَّر، يشير عدد متزايد من الدراسات إلى مزيد من الاختلافات على طول المحور الزمني الحاجز في الحصين. هذه الاختلافات تتعلق العمارة الداخلية والاتصال وكذلك الاختلافات في أنماط التعبير الجيني ومورفولوجيا الخلايا العصبية4،5،6،7،8.
وبالنظر إلى وجود هذه الاختلافات في الدوائر الأساسية، فمن المعقول أن تختار الدائرة الفرعية الخاصة بحصان النهر التي سيتم التحقيق فيها وفقاً للأسئلة التي يتم تناولها. إذا كان على سبيل المثال مسألة تتعلق آليات الخلايا العصبية المشاركة في المعالجة المكانية, دورسال بدلا من الحصين البطني هو من الفائدة, على الرغم من أن اثنين لا تعمل بشكل مستقل في الجسم الحي بسبب اتصال طولي داخل فرس النهر9,10,11. وعلى هذا المنوال، لا يتعين النظر في الاختلافات على طول المحور الطولي فحسب، بل يلزم أيضاً توخي العناية للحفاظ على الدوائر المحلية والبعيدة المدى بقدر الإمكان. للحفاظ على مسارات الألياف والاتصال الزاوية التي سيتم تقسيم الدماغ أمر ضروري.
الطريقة الأولى التي ذكرت في الأدب لتشمل الدائرة trysinaptic أولا عزل الحصين من الدماغ ثم جعل شرائح عرضية (عمودي على المحاور الطولية) باستخدام المروحية الأنسجة12 وهزاز13. في وقت لاحق فضلت علم وظائف الأعضاء للحصول على شرائح من كتلة الدماغ بأكمله للحفاظ أيضا على هياكل الدماغ المجاورة المتصلة قرن آمون. لهذه الاستعدادات كتلة، وقد وضعت زوايا اقسام مختلفة فيما يتعلق قرن آمون، مثل إعداد شريحة الإكلال14 أو إعداد شريحة أفقية اسمه شريحة HEC للحفاظ على اتصالات قشرة فرس النهر entorhinal15،16،17.
في إعداد الأخير يتم قطع الفص الجداري بزاوية 0 درجة أو 12 درجة فيما يتعلق بالطائرة الأفقية على طول محور rostro-caudal لتشكيل قاعدة الكتلة. ثم يتم جمع شرائح بدءا من السطح البطني للدماغ، مما يسمح أساسا الحصاد من منطقة فرس النهر المتوسط البطني. وقد أصبح هذا الأسلوب الخيار الأكثر شعبية للدراسات الفسيولوجية ويمكن القيام به بشكل موثوق بعد عدة بروتوكولات منشورة18,19,20.
ومع ذلك، إذا كانت الاهتمامات البحثية تتعلق بجوانب محددة من التعلم المكاني، قد يكون الحصين الظهري منطقة أكثر ملاءمة للتحقيق وسيكون من المفيد العثور على إجراء تشريح من نوعية مماثلة لهذه المنطقة فرس النهر. وقد تم تطوير بروتوكولات قليلة، والتي تركز على القطب التاجي جدا، التي يمكن أن تلبي هذا الطلب 21،22.
في هذا البروتوكول ، بدلا من ذلك ، ونحن وصف نهج للحصول على شرائح عرضية قابلة للتطبيق من الحصين الظهر المتوسطة التي تستخدم زاوية القسم التي سبق وصفها للتحضيرات الأفقية18،19 ( الشكل1A& B). نحن نبرهن على جودة هذا البروتوكول من خلال مقارنة التسجيلات الكهربائية والفيزيولوجية وإعادة البناء المورفولوجية في هذا الإعداد لتلك التي تم الحصول عليها في شرائح الإكل. هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للدمج مع التجارب التشريحية والسلوكية في الفئران البالغة (عمرها ثلاثة أشهر في حالتنا).
Protocol
وكانت جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات التجريبية وفقا لقانون رعاية الحيوان الألماني ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في جامعة كييل. Parvalbumin-Cre (Pvalb-IRES-Cre) الفئران23 (مختبرات جاكسون، مستودع رقم 008069) تم الاحتفاظ بها كمستعمرات heterozygous أو عبرت مع Ai9 Cre مراسل الفئران24 (مختبرات جاكسون، رقم مستودع 007909). واستخدمت الفئران الإناث والذكور بين P40-P90. تم الحفاظ على الفئران في دورة 12 ساعة فاتحة داكنة في ظل ظروف الإسكان الجماعي القياسية وتم تزويدها بالطعام والماء الإعلانية libitum.
1- إعداد الحلول
ملاحظة: إعداد حلول جديدة لكل يوم تجريبي باستخدام المياه فائقة الخطورة (UPW) (مقاومة في 25 درجة مئوية 18.2 MΩcm). قد يتم تخزين الحلول عند 4 درجة مئوية لمدة أقصاها يوم واحد. يمكن تخزين حلول المغنيسيوم والكالسيوم بشكل منفصل كحلول مخزون 1 M. يجب أن تكون مشبعة جميع حلول العمل مع كاربوجين (95٪ O2:5٪ CO2) للحصول على الأمثل الأوكسجين وصيانة درجة الهيدروجين قبل وأثناء الاستخدام.
- إعداد الحل القطع (500 مل لكل فأرة) (في mM): 92 NMDG، 2.5 KCl، 1.25 NaH2PO4،30 NaHCO3، 20 HEPES، 25 الجلوكوز, 5 نا أسكوربات, 4 نا بيروفات, 0.5 CaCl2·2H2O, و 10 MgSO4·7H2O. تيسترات إلى pH 7.4 تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية مع 4-5 مل من حمض الهيدروكلوريك 16٪ قبل إضافة الكاتيونات divalent. وهذا سوف تجنب هطول الأمطار من MgSO4.
ملاحظة: يمكن تخزين KCl و NaH2PO4 كحلول 10x عند 4 درجات مئوية. نحن جعل دفعتين الفردية من حل القطع. واحد في اليوم السابق للتسجيل (المخزنة في الثلاجة خلال الليل لإنتاج الثلج سحقت) واحد في يوم التسجيل. - إعداد حل التخزين (250 مل لكل ماوس) (في mM): 92 NaCl، 2.5 كيلو كلول، 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES , 25 جلوكوز , 5 Na-ascorbate , 4 Na-pyruvate , 2 CaCl2·2H2O , و 2 MgSO4·7H2O. Titrate إلى pH 7.3-7.4 مع 1 N NaOH.
ملاحظة: يمكن تخزين NaCl و KCl و NaH2PO4 كحل 10x عند 4 درجة مئوية. - إعداد ACSF للتسجيل (في mM): 122 NaCl، 2.5 KCl، 1.25 NaH2PO4،24 NaHCO3،12.5 الجلوكوز، 2 CaCl2·2H2O، و 2 MgSO4·7H2O، 2 Na-ascorbate، 4 Na-pyrte. معدل الاتتاح إلى 7.3-7.4 مع 1 N NaOH.
ملاحظة: يمكن دمج NaCl و KCl و NaH2PO4 في حل 10x للأسهم عند 4 درجات مئوية.
2. إعداد مقاعد البدلاء لشرائح
- إعداد على الجليد كوب (150 مل) واثنين من الأطباق بيتري الزجاج (10 سم قطر) وملء لهم مع حل القطع الطازجة. الحفاظ على حل أكسجين مع جهاز محتدما كاربوجين (أنبوب مثقب أو حجر الهواء المتصلة نظام كاربوجين).
ملاحظة: سيتم استخدام الحل في القارص للضخ بينما سيتم استخدام أطباق بيتري أثناء إجراء القطع. - تجهيز مقعد الجراحة مع شفرة الفولاذ المقاوم للصدأ، وملاقط تلميح مدورة، وملاقط تلميح غرامة، مقص كبير، مقص صغير، ملعقة معدنية كبيرة، ملعقة معدنية رقيقة، فرشاة، لوحة هزاز والغراء سيانوكريلات أو أقل سمية ن-ثينسيل-استر سيانوكراكيل لاصق. Immerge شفرة الفولاذ المقاوم للصدأ وقطعة من ورقة تصفية في واحدة من الأطباق بيتري الزجاج على الجليد. هذا (بيتري) سيستخدم لقطع الدماغ رسم ثلاثة خطوط متوازية على الجزء السفلي من طبق بيتري البلاستيك ووضع هذا الطبق على مقربة من الأدوات الجراحية.
- إعداد إعداد لل perfusion عبر كارديال وفقا للبروتوكولات المنشورة25.
- إعداد هزاز، وتركيب شفرة جديدة على حامل شفرة وتعيين المعلمات لقطع (زاوية من شفرة من الطائرة الأفقية 17 درجة، شفرة ذبذبة السعة 1.5 مم، شفرة سرعة الحركة إلى الأمام في حوالي 2 مم دقيقة-1،تردد التذبذب 90 هرتز، سمك القسم 350 ميكرومتر). املأ صينية الاهتزاز بمحلول القطع البارد الثلجي وأبقيه تحت الأكسجين المستمر.
ملاحظة: نضيف الجليد المسحوق المصنوع من الدفعة الأولى من محلول القطع إلى محلول القطع الطازج المبرد للحفاظ على درجة الحرارة منخفضة. انتبه للحفاظ على الجليد من النصل أثناء تقطيعه. - إعداد غرفة حضانة مليئة حل القطع تحت الأوكسجين المستمر. ضع الغرفة في حمام مائي مُدفأ قبل ذلك (35 درجة مئوية).
ملاحظة: يمكن العثور على مثال لغرفة الحضانة في إدواردز وكونريث (1992)26. - إعداد غرفة تخزين شريحة مليئة حل التخزين والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة وتحت الأوكسجين المستمر. في حالة تعبير الأنسجة عن بروتين فلوري أو opsin خفيف تنشيط ، فمن المستحسن الحفاظ على الغرفة في الظلام ، على سبيل المثال ، داخل مربع.
ملاحظة: غرفة تخزين مع آبار مستقلة متعددة مفيد للتمييز بين مستوى الشرائح على طول محور دورسوفينرال من الحصين. يمكن بناء غرفة مصنوعة خصيصا(الشكل 1D). اتخاذ قطعة من شبكة قارورة سفاح من مربع تخزين قارورة 81x المبردة والغراء الجزء السفلي على شبكة النايلون. إدراج الثلث العلوي من 5mL ماصة تلميح البلاستيك في وسط هذه الشبكة، بحيث العصي من حوالي 3 سم في الجزء السفلي. هذا تلميح من البلاستيك بمثابة موقف للشبكة ويحمل في وقت لاحق أنابيب الهواء للأكسجين. أدخل الشبكة مع موقفها في صندوق بلاستيكي أسطواني (على سبيل المثال، تعبئة مرشحات الحقنة) بحيث لا يمكن أن ينميل أو تمايل. هذا الخزان سوف تعقد 250 مل من حل التخزين.
3. إعداد شرائح فرس النهر
- تخدير الماوس في غرفة مربع باستخدام ايزوفلوران (حوالي 0.5 مل) تحت غطاء محرك السيارة. اترك الماوس يستريح حتى يكون التنفس بطيئًا ومنتظمًا (حوالي 2-3 دقائق). اختبار لعدم وجود استجابات الألم مع قرصات إصبع الوطأة.
- أداء ال perfusion عبر كارديال باستخدام 25 مل من حل قطع الغازية من القارص على الجليد بعد نشر بروتوكولات25,27. ويوصى هذه الخطوة لتبريد الدماغ بسرعة لإبطاء عملية التمثيل الغذائي العصبي بسرعة.
- قطع رأس الحيوان باستخدام مقص كبير ووضع الرأس في طبق بيتري المبردة على الجليد التي تحتوي على حل القطع.
- افتح الجلد مع المقص الناعم لفضح الجمجمة. جعل شقوق جانبية صغيرة في قاعدة الجمجمة على جانبي ماغنوم الهدّان. ثم قطع على طول خياطة القوس بدءا من ماغنوم الحصنة حتى الوصول إلى خياطة الأنف الأمامية فوق لمبة الشم. سحب ما يصل مقص خلال قطع القوس لتجنب تلف أنسجة الدماغ الكامنة.
ملاحظة: يساعد إبقاء الرأس مغمورًا في محلول القطع على إزالة هُو من الدم ويبقي درجة الحرارة منخفضة. - استخدم ملاقطة طرف مقربة لسحب ما يصل العظام الجدارية لفضح الدماغ. إيلاء الاهتمام للحصول على عقد من وإزالة السحايات جدا. إذا تركت، فإنها يمكن أن تلحق الضرر الدماغ أثناء الاستخراج.
- استخدام ملعقة صغيرة لمجرف بلطف خارج الدماغ في طبق بيتري الثاني.
- قطع الدماغ في النصفين على طول الشق الطولي باستخدام شفرة ما قبل المبردة.
- استخدام ملعقة كبيرة لرفع نصف الكرة الأرضية واحد من الحل القطع وعلى طبق بيتري البلاستيك. مع نصف الكرة الأرضية ملقاة على سطحها الوسيط، محاذاة القشرة الجدارية مع واحد من الخطوط المتوازية أن يكون لها مرجع لقطع الثاني كما هو مبين في الشكل 1B.
- تنفيذ القطع الثاني في الجزء البطني من نصف الكرة الأرضية وضع النصل بالتوازي مع خطوط للحصول على السطح، والذي يستخدم في وقت لاحق لالتصاق الدماغ على حامل العينة (انظر الخطوة التالية)، كما هو مبين في الشكل 1B. العودة إلى نصف الكرة الأرضية في حل قطع الأوكسيجين من طبق بتري الزجاج وتنفيذ نفس الإجراء في نصف الكرة الثاني.
- الغراء نصفي الكرة الأرضية مع الجانب البطني قطع حديثا على حامل عينة هزاز باستخدام لاصقة. وضع بضع قطرات من حل القطع على نصفي الكرة الأرضية لترسيخ الغراء ونقل حامل العينة في علبة هزاز. بهذه الطريقة سوف تمضي عملية التقطيع من الظهر إلى الحصين البطني.
- إزالة شريحة واحدة أو اثنين غير عرضية الأولية (الشكل 1C، الثاني - الثالث) حتى تصبح المنطقة ذات الاهتمام مرئية ومن ثم البدء في جمع الشرائح.
ملاحظة: غير مُنْقَد ولكن قابل للاستخدام، يمكن الحصول على شرائح صحية من الحصين الظهري في بداية الإجراء التقطيع(الشكل 1C،ii-iii). جمع كل شريحة يتطلب حوالي 3-4 دقيقة. من خلال بدء القطع من الظهر بدلا من الحصين البطني نحن حفظ حوالي 10 دقيقة، مما يحسن من صلاحية شرائح الظهر. - مع ماصة بلاستيكية (قطع بعيدا الطرف الضيق من طرف) نقل كل شريحة في غرفة الحضانة (التي تحتوي على حل قطع في 35 درجة مئوية) والسماح لها بقية لمدة 12 دقيقة. فترة النقاهة قصيرة في حل قطع الحارة يقلل كثيرا تورم الخلايا العصبية الأولية, كما ذكرت في تينغ وآخرون (2014)28. ثم استخدام فرشاة نقل شريحة في غرفة التخزين (التي تحتوي على حل التخزين في RT) والسماح لها بقية حتى بداية التجربة.
4. تسجيل الخلية الكاملة وملء biocytin
ملاحظة: يتم تقليل وصف تسجيل المشبك التصحيح الخلية الكاملة هنا فقط إلى الخطوات الرئيسية التي تساعد على الحصول على تعبئة cytin الحيوية جيدة وقابلة للتطبيق بشكل عام على الخلايا العصبية في ACSF. للحصول على تفاصيل حول إجراءات التسجيلات الكهربائية الفيزيولوجية، يمكن الرجوع إلى عدة بروتوكولات أخرى29،30.
- اختر حلًا مناسبًا داخل الخلايا وفقًا للبارامترات التي سيتم تسجيلها. على سبيل المثال، لقياسات المشبك الحالية، يمكن استخدام محلول قائم على غلوكونات البوتاسيوم (في mM): 135 K-Gluconate، 3 KCl، 10 HEPES، 0.2 EGTA، 10 فوسفوكرياتين-نا2،4 MgATP، 0.3 Na2-GTP. ضبط درجة اله إلى 7.3 مع 1 M كوه. وينبغي أن يكون في جميع أنحاء osmolity 285-290 ملليزولول / كغ مرة واحدة 3-5 ملغ / مل تتم إضافة biocytin.
ملاحظة: لمراقبة شكل الخلايا العصبية أثناء التسجيل، يمكن إضافة 0.3-0.5 ميكرولتر/مل من 1 مل اليكسا فلور هايدرازيد إلى الحل داخل الخلايا. في هذه الحالة، تذكر للوحي biocytin، لتتناسب مع لون صبغة اليكسا مع مسبار الفلورسنت إلى جانب streptavidin. - إعداد الأقطاب التصحيح المشبك من ≤1 μm طرف القطر و3-5 MΩ المقاومة من الشعيرات الدموية البورسليكات سميكة الجدران.
- بدء نظام الضخ من الإعداد التصحيح المشبك مع سرعة 2.5-3 مل / دقيقة في RT أو 35-37 درجة مئوية وتأمين شريحة في الغرفة مع مرساة على شكل حرف U.
- تحديد منطقة الدماغ من الفائدة واختيار الخلايا العصبية صحية مع سوما ما لا يقل عن 30-50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة.
ملاحظة: سوما من الخلايا العصبية صحية له سطح أملس، والحدود الغشاء هي المتناقضة قليلا. سوما من الخلايا العصبية غير الصحية يبدو تقلصت ومتناقضة للغاية أو منتفخة وشبه شفافة. - قم بتحميل ماصة زجاجية مع الحل داخل الخلايا حتى يتم تغطية طرف قطب AgCl. نقل ماصة في حل غرفة التسجيل، وتطبيق ضغط إيجابي خفيف للحفاظ على واضحة غيض من القطب الزجاجي.
ملاحظة: إذا كان الحل يحتوي على صبغة أليكسا، يمكن التحكم في الضغط بصريا ضبط كمية حل الفلورسنت صدر من طرف. الحد الأدنى من الضغط من شأنه تجنب تلطيخ الأنسجة حول الخلية. - الاقتراب من الخلية من زاوية مائلة وإقامة اتصال داخل الثلث الأول من سطح سوما عند تشكيل جيجا ختم. الافراج عن الضغط، ببطء تحريك عقد المحتملة إلى-65 mV وتطبيق شفط لطيف عن طريق الفم لتسهيل تشكيل جيجا ختم.
- لإنشاء تكوين الخلية بالكامل، تطبيق شفط قوي وجيز لكسر الغشاء. تجاهل التسجيل إذا كان لدى الخلايا العصبية احتمالية غشاء أكثر depolarized من-50 mV, إذا كان التيار عقد يتزايد بعد 100 pA أو إذا زادت المقاومة الوصول إلى ما بعد 30 MΩ.
- بعد التسجيل (لملء كافية من سوماتا وdendrites ينصح على الأقل 15 دقيقة; لملء محاور عصبية معقدة تصل إلى ساعة واحدة ربماالمطلوبة 31) إزالة القطب بعناية. لهذا الغرض تعيين عقد المحتملة إلى 0 mV ومحاولة لإعادة تشكيل جيجا ختم عن طريق سحب ببطء الماصات في الاتجاه المعاكس من النهج، مثل الحصول على تكوين التصحيح خارج.
ملاحظة: وجود صبغة اليكسا في الحلول داخل الخلايا يساعد على إزالة موجهة بصريا من الماصات من سطح الخلايا العصبية. إذا كانت نواة الخلية ليست على اتصال مع طرف ماصة، طريقة سريعة لإصلاح الختم هو سحب ماصة من الأنسجة قطريا وصعودا بسرعة عالية. إذا كانت نواة أو جزء من الغشاء موجود داخل الطرف ، فهناك خطر كسر غشاء البلازما. في هذه الحالة، يمكن أن يساعد تطبيق الضغط الإيجابي الطفيف والحركة الجانبي. - لاحظ موضع الخلية واتجاه الشريحة. بعد التثبيت يمكن التحقق من التوجه الدقيق للشريحة وسلامة الخلية المعبأة تحت مجهر الفلورسنت.
5- الكبت المناعي، واكتساب الصور، وإعادة البناء المورفولوجي
- بعد التسجيل، قم بنقل الشرائح إلى لوحة 24 بئرًا لإصلاحها في paraformaldehyde (PFA) بنسبة 4٪ في محلول ملحي 0.1 M من الفوسفات (PBS). احتضان لمدة 60 دقيقة في RT أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، وفقا لحساسية الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. ويمكن تخزين شرائح في 0.1 M PBS و 0.02٪ NaN3.
تنبيه: PFA سامة. استخدم تحت غطاء محرك السيارة. - أداء المثبطة للمناعة والكشف biocytin في غضون أسبوع واحد من تسجيل وفقا للبروتوكولات المعمول بها32,33.
ملاحظة: نستخدم إجراءً يتجنب إعادة مقطع الشريحة للحفاظ على تكامل عمليات التسخين ومحورية التهوية. ومع ذلك، يتطلب هذا الإجراء أوقات حضانة أطول كما الأجسام المضادة تحتاج إلى اختراق في الأنسجة. نقترح اختبار الوقت لتحقيق الاختراق الأمثل للأجسام المضادة في الأنسجة قبل إجراء التجربة. - الحصول على الصور باستخدام المجهر confocal مع Z المكدس و بلاط المسح وظيفة.
- أداء إعادة البناء المورفولوجية باستخدام فيجي imageJ34.
ملاحظة: يمكن استيراد عدة تنسيقات ملفات الصور إلى البرنامج باستخدام المكون الإضافي بتنسيق Bio. نوصي باستخدام بسيط نيوريت المقزر (STN) المساعد35 لإعادة بناء dendrites والمحاور. يتوفر برنامج تعليمي بسيط وواضح في https://imagej.net/SNT http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/. يمكن تحويل الملف الذي يحتوي على بيانات التتبع (.traces) إذا تم حفظه بدون ضغط إلى ملف نصي وفتحه باستخدام Matlab أو برامج أخرى لمعالجة البيانات النصية.
Representative Results
في هذا البروتوكول نحن وصف كيفية إعداد شرائح قرن آمون حادة من الجزء الظهري الوسيط من قرن آمون (الشكل 1A). البروتوكول هو مناسبة خاصة للتجارب التي تحقق في الآليات المشاركة في التعلم المكاني ويمكن الجمع بين العمل السلوكي أو وضع العلامات الفيروسية أو استراتيجيات التلاعب في الحصين الظهرية35. تطبيق إجراء اقسام الموصوف هنا للحيوانات حقن مع العقيد تعتمد GFP التعبير عن الفيروس المرتبطة adeno (AAV-FLEX-GFP) في الحصين الظهري من الفئران Pvalb-IRES-Cre في مختلف إحداثيات AP-1.94 مم، ML ± 0.5-2 مم، عمق 1.25-2.25 ملم لاستهداف مناطق مختلفة من تشكيل فرس النهر36 تمكنا من الحصول على ما لا يقل عن ثلاث شرائح عرضية تحتوي على المناطق المصابة(الشكل 1A تلوين أخضر فاتح على النموذج ثلاثي الأبعاد من قرن آمون). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على شرائح غير مُنْعَدة ولكن صحية من الأجزاء الأكثر روعة من الحصين الظهري (الشكل 1C).
لإثبات جودة وحيوية شرائح لدينا قمنا بتسجيل المعلمات الأساسية الكهربائية الفسيولوجية والمورفولوجية من الخلايا الحبيبية و tdTomato المسمى Parvalbumin-positive (PV +) interneurons في الجيروسكوبات في الزاويات من Pvalb-IRES-Cre؛ Ai9 الفئران المعدلة وراثيا (7-12 أسبوعا من العمر) وقارنت هذه التسجيلات إلى تسجيلات من شرائح الإكليل من نفس المنطقة التي تم الحصول عليها مع بروتوكول قياسي.
عند الفحص البصري تحت المجهر على تباين التداخل التفاضلي تحت الحمراء (IR-DIC)، لاحظنا بالفعل اختلافات واضحة بين شريحة عرضية وشريحة الإكلال. في حين أن الخلايا العصبية من طبقة الخلية الرئيسية في شرائح الإكليل غالبا ما ظهرت الخشنة وعرض الخطوط العريضة المتناقضة بقوة، وأظهرت الخلايا العصبية في شريحة عرضية في الغالب الأسطح الملساء والحدود المتناقضة طفيفة فقط، مما يدل على حيوية الخلوية أفضل(الشكل 2A). قد يكمن سبب هذه الاختلافات في قابلية الخلية للحياة بين الشرائح التاجية وشرائح عرضية في اتجاه الطائرة المقطع فيما يتعلق بمساحات الألياف. وبما أن هذه ليست متوازية في الأجزاء التاجية ، سيتم قطع المحاور والتشعبات. وتمشيا مع هذا الافتراض، وجدنا أن داخل شرائح المستويات السطحية من طبقة الخلية الحبيبية و hilus أظهرت انقطاع أكبر في التاجية من شريحة عرضية (حجم الخطوة في المستويات السطحية: 41.40 ± 3.28 ميكرومتر مقابل 25.60 ± 2.94 ميكرومتر، متوسط ± SEM، غير مسدد t-test P = 0.023)، مما يشير إلى درجة أكبر من انفصال الأنسجة في شريحة الإكليل(الشكل 2B). وهذا يعني أن الخلايا المناسبة للتسجيلات رقعة رقعة سيتم العثور عليها فقط في مستويات أعمق من طبقة الخلايا الحبيبية لشرائح الإكليل، والتي بدورها قد تقلل من إنتاجية التسجيلات التصحيح المشبك. في الواقع، كان متوسط الوقت لختم تشكيل في شريحة عرضية لدينا أكثر سرعة من لشرائح الإكليل (الخلايا الحبيبية: 12.64± 1.50 s، n=11 في الإكليلي مقابل 8.40 ± 0.75 s, n=14 في شرائح عرضية, متوسط ± SEM, P = 0.0335 اختبار مان-ويتني؛ PV+ interneurons: 31.11 ± 2.60 s, n= 9 في الإكلال مقابل 22.00 ± 2.18, n=7 في شرائح عرضية, متوسط ± SEM, P = 0.0283 اختبار مان - ويتني )الشكل 2C). وكيلا لسلامة الخلايا والصحة ثم سجلنا إمكانات غشاء يستريح (RMP) من الخلايا الحبيبية وDydeurons PV + ، والتي كانت أكثر بكثير depolarized في كل من الخلايا الحبيبية وDd interneurons PV + في الإكلال مقابل. شرائح عرضية (خلايا الحبيبية:-62.55 ± 3.54 mV، n = 11 في الإكلالي مقابل-71.06 ± 2.31 mV، n= 14 في شرائح عرضية، متوسط ± SEM، P = 0.0455 اختبار مان-ويتني؛ PV+ interneurons:-52.75 ± 1.66 mV، n= 7 في الإكلالي vs.-59.36 ± 2.25 mV، n =6 في شرائح عرضية متوسط ± SEM،، P = 0.0271 اختبار مان-ويتني )(الشكل 2D). تشير هذه البيانات إلى وجود عدد أكبر من الخلايا العصبية الصحية في إعداد شريحة الإكلينيلية مقابل. في الواقع، أدى إدخال قطع لRMP مقبولة (-55 mV للخلايا الحبيبية؛-45 mV لـ PV + interneurons) في نسبة أعلى من الخلايا المستبعدة في الإكليلية من في شرائح عرضية (39.67 ± 8.37٪، ن = 3 جلسات تجريبية مقابل. 23.00 ± 3.85 ٪، ن = 4 جلسات تجريبية) (الشكل 2E). وعلاوة على ذلك، فإن إعادة بناء مورفولوجيا الخلايا العصبية من الخلايا الحبيبية المسجلة أشارت إلى أنه كما كان من المتوقع أن تكون الفرص أفضل بكثير لاسترداد ال arborization كاملة لخلايا الحبيبية في شريحة عرضية(الشكل 3A،B). وبالإضافة إلى ذلك، فإن إعادة البناء المورفولوجية للضانع الضوئية + في شرائح عرضية سمح تصوير مناطق البور واسعة المحورة والتجريد بما في ذلك التصور من التفاصيل الصغيرة مثل العمود الفقري التشعب35(الشكل 3C).
الشكل 1: توضيح لإجراء اقسام للحصول على شرائح من الحصين الظهري الوسيط. (أ) تمثيل ثلاثي الأبعاد لتكوين قرن آمون يظهر اتجاهه المكاني في الدماغ (معدلة من مستكشف الدماغ، معهد ألن)37. 18- يشار إلى الانقسامات الظهرية والوسيطة والبينيترالية في قرن آمون (dHPC, iHPC, vHPC) وفقاً لدونغ وآخرون (2009)7. يشار إلى الجزء من الحصين الظهري الوسيط الذي سيتم شرائح باللون الأخضر الفاتح. يظهر الداخلي على اليمين اتجاه محاور المرجع. (ب) الرسوم المتحركة لنصف الكرة الدماغ يصور محاذاة القشرة الجدارية مع خطوط متوازية على طبق بيتري. يشير الخط الأحمر المنقط إلى مكان إجراء قطع التشذيب (النقطة 3.9 في البروتوكول) لإنشاء السطح لإلتصاق نصف الكرة الأرضية على حامل العينة. تشير الخطوط المنقطة السوداء إلى مكان تجميع الشرائح. (C) مشرق سلسلة صور الميدان من شرائح فرس النهر التي تم الحصول عليها بعد هذا الإجراء. من سطح البسال، الظهر إلى البطن: '1' 0.70 ملم، '2' 1.05 ملم، '3' 1.40 ملم، '4' 1.75 ملم، '5' 2.10 ملم، '6' 2.45 ملم '7' 2.80 ملم، '8' 3.15 ملم. شريط مقياس = 1 مم (D) صورة غرفة التخزين والمواد اللازمة لتجميعها. 1. فيال شبكة المسافة من مربع تخزين قارورة 81x المبردة، 2. علبة بلاستيكية من السيليندريك. 3. شبكة النايلون، 4. تلميح الماصة. الداخلي. عرض الجانبي للشبكة و أنبوب حامل لإدراجها في مربع أسطواني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تظهر شريحة عرضية تعزيز صلاحية شريحة بالمقارنة مع شريحة الإكليل. (أ) DIC-IR micrographs تظهر صحية (السهام السوداء) وغير صحية (السهام البيضاء) أمثلة من سوماتا الخلايا العصبية في شرائح عرضية والإكليلية. Hil = hilus، gcl = طبقة الخلايا الحبيبية، مل = طبقة الجزيئية. شريط مقياس = 50 ميكرومتر (B) كلا إجراءات القطاعات تنتج خطوة بين سطح طبقة الخلية الحبيبية وهلوس (المشار إليها من قبل رؤوس الأسهم). ارتفاع الخطوة يدل على مدى انقطاع الأنسجة وأقل بكثير في المقاطع العرضية مما كانت عليه في الإكلال (n = 5 عرضية و n = 5 شرائح الإكل، Mean±SEM، P = 0.0238 اختبار مان ويتني). (C) وقت تشكيل الختم giga-ohm في الخلايا الحبيبية (n = 14 خلية في عرضية، ن = 11 خلايا إكلية؛ Mean±SEM، P= 0.0355، اختبار مان-ويتني) و PV+ INs (n= 7 خلايا في عرضية، n= 9 خلايا في شرائح الإكل، متوسط±SEM، P = 0.0283 اختبار مان-ويتني). (D) إمكانية الراحة غشاء (RMP) من الخلايا مصححة (على التوالي، ن = 14 و n = 11 خلايا الحبيبية. متوسط±SEM، P = 0.0455 اختبار مان ويتني. n= 7 PV+ INs و n= 10 PV+ INs، P= 0.0271 اختبار مان ويتني). (E) النسبة المئوية للخلايا المهملة في جلسة تجريبية ، (n = 3 جلسات مع شريحة الإكليل ، n = 4 مع شريحة عرضية ، Mean±SEM). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الحفاظ على المورفولوجية من الخلايا الحبيبية والدريورونات في شريحة عرضية. صور كونفوكال تظهر خلايا حبيبات مملوءة بالبيوتين في شريحة عرضية(A)وفي شرائح إكلية(B)من Pvalb-IRES-Cre؛ Ai9 الفئران المعدلة وراثيا. وقد أعيد بناء المحاور ذات الصلة باللون الرمادي والرمادي الفاتح. لاحظ الفرق في طول محور عصبي والتعقيد بين التحضيرات. شريط مقياس = 100 μm. (C1) صورة Confocal تظهر tdTomato- تعبئة biocityn-positive interneuron. Hil = hilus، gcl = طبقات الخلايا الحبيبية، مل = طبقة جزيئية. شريط مقياس = 50 ميكرومتر (C2) تكبير المنطقة في C1، تظهر العمود الفقري التشعب. شريط مقياس = 2 ميكرومتر (D) إعادة بناء مورفولوجية من المحاور و dendrites من الدراجات الحيوية شغل في C1 (محور عصبي في الرمادي، سوما و dendrites في الأسود). (E) عن قرب من سوماتا من الخلايا يصور في C1 تظهر الكولوكية من biocytin وParvalbumin المناعي (PVir). شريط مقياس = 20 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وقد تمت دراسة الحصين الظهري على نطاق واسع لدوره في التعلم المكاني والملاحة أساسا من خلال التجارب السلوكية، وتتبع التشريحية، والتلاعب منطقة محددة. للجمع بين شريحة electro-الفسيولوجية الاستفسارات مع هذه التقنيات، قمنا بتجميع بروتوكول يستخدم زاوية مماثلة من قسم كما تشريح الأفقي المعدلة للمنطقة المتوسطة ventral من قرن آمون، ولكن يستخدم ترتيب تشريح مقلوب للحصول على شرائح في وقت مبكر من المنطقة الظهرية المتوسطة. هذا النهج يقلل من الوقت اللازم لشريحة وجمع منطقة الظهر من قرن آمون، وبالتالي تعزيز الشرائح قابلية البقاء.
باستخدام هذه الطريقة، ونحن قادرون على استرداد نحو 3 شرائح في نصف الكرة الأرضية من منطقة الحصين الظهرية بين 1.4 مم-2.4 مم من سطح بسال، كما هو مبين في الشكل 1C. على الرغم من أنه من غير الممكن مع هذا الإجراء للحصول على شرائح عرضية من القطب الحاجز جدا من قرن آمون، فمن الممكن لجمع حوالي اثنين من شرائح غير قابلة للحياة في نصف الكرة الأرضية من القطب الحاجز(الشكل 1C الثاني، iii). إذا كان القطب الحاجز من قرن آمون هو التركيز البحث الأولية، بروتوكولات أخرى، والتي تسمح بجمع شرائح عرضية، وخاصة من القطب الحاجز جدا من الحصين، قد تكون أكثر ملاءمة21،32. ويفضل إجراء التجارب السلوكية على الملاحة المكانية والتعلم في الفئران الناضجة مع اتصال الخلايا العصبية المتقدمة بالكامل. وبالتالي، قمنا بتحسين إجراءاتنا الخاصة بالتقطيع للتطبيق على أدمغة الحيوانات البالغة (الموضحة هنا لمدة ثلاثة أشهر من الفئران)، والتي هي أكثر حساسية للإجهاد من إعداد الأحداث المرن. وتحقيقا لهذه الغاية قمنا الجمع بين العديد من الاستراتيجيات التي تقلل من الإجهاد نقص الأكسجة المخ يتعرض في الوقت بين استخراج ووضع شرائح في ACSF المؤكسج. الحل هو الواقية من قطع ACSF25,27,28 مع منخفضة Na+ و Ca2+ ولكن عالية ملغ2 + للحد من الضرر excitotoxic وتورم الخلية بسبب تنشيط مستقبلات NMDA. بالإضافة إلى ذلك، يوفر HEPES التخزين المؤقت المستقر والمركبات مثل أسكوربات و بيروفات يقلل من الإجهاد التأسدي. القذف عبر cardial مع المبردة والأكسجين حل قطع واقية يستفيد من شبكة شعرية كثيفة للغاية تزويد الدماغ للحد بسرعة ومتجانس الطلب الأيضي والغلوتامات الناجمة عن exciticicity في أنسجة الدماغ. في وقت لاحق ما يقرب من جميع الخطوات التالية لقطع الرأس يتم تنفيذها داخل حلول مبردة والأكسجين للحفاظ على التمثيل الغذائي والحرمان من الأكسجين إلى الحد الأدنى خلال الإجراء بأكمله. وهناك استراتيجيات أخرى للحد من تلف الدماغ أثناء تشريح موجودة، ويمكن أن تكون صالحة على قدم المساواة38. لإظهار جودة إعدادنا ، قارناها بإعداد شريحة إكليلية ، والذي يستخدم عادة للتسجيل من الحصين الظهري. على الرغم من أن شرائح الإكليلية يمكن استخدامها للحصول على تسجيل جيد رقعة المشبك في gyrus dentate, عدد الخلايا العصبية غير صحية وقطع أعلى مما كانت عليه في شريحة عرضية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الحفاظ على سلامة ال arborizations محور عصبي وتشعب أفضل في شريحة عرضية. كما واقع الأمر سلامة محاور العجلة الخلية الحبيبية (الشكل 3A) ، والتي تعمل متعامد إلى المحور الطولي من الحصين بمثابة مؤشر على طائرة التقطيع عرضية1.
لملء الخلايا العصبية المصححة، نقترح مقاومة القطب بين 3 و 5 MΩ. قطر من غيض من حوالي 1 ميكرومتر، يسمح إنجاز المقاومة ختم جيدة أثناء التسجيل وجيدة إعادة الختم عند التراجع القطب. التفاصيل الأكثر أهمية هي تجنب شفط أجزاء من سوما أو نواة في ماص. لهذا السبب، نقترح تضمين صبغة أليكسا في الحل داخل الخلايا عندما يكون ذلك ممكناً. تسمح الصبغة بمراقبة شكل الخلية أثناء التسجيل وإعادة الختم. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح لتقييم سلامة الخلية المصححة بعد التثبيت، والتي يمكن أن توفر الوقت المناعة الستويستوتيستري، في حالات الحشوات غير الناجحة. بسبب صبغات اليكسا هي إخماد مع وقت التثبيت الطويل، ونحن نقترح تثبيت قصيرة إذا كان ذلك ممكنا.
بالنسبة للمناعة اللاحقة، نستخدم بروتوكولًا لا يتطلب إعادة تقطيع الشريحة. نقترح جعل تلطيخ في غضون أسبوع واحد بعد التثبيت. كلما طالت مدة بقاء الشرائح في الثلاجة، كلما ارتفعت فرصة تدهور الأنسجة. إذا تعذر تجنب التخزين الطويل، نقترح زيادة تركيز NaN3 في برنامج تلفزيوني إلى 0.05٪ وتحديثه أسبوعيًا. مناعة من شريحة كاملة يعني أن أوقات الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية زيادة. عادة، للكشف biocytin، حضانة واحدة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية يكفي، ولكن إذا جنبا إلى جنب مع تلطيخ للبروتينات الأخرى، يمكن أن تستمر عملية تلطيخ كامل لفترة أطول من ذلك بكثير. يجب تحسين منع التجوّل وحضانة الجسم المضادة بشكل فردي. عادة، بالنسبة للجسم المضاد الأساسي، يومين كافية في حين أن يوم واحد يمكن أن يكون كافيا للثانوي. نوصي بزيادة مدة الغسيل الخطوات جنبا إلى جنب مع حضانات الأجسام المضادة أطول لتجنب زيادة الخلفية.
في هذا البروتوكول قد قدمنا طريقة تشريح للحصول على شرائح فرس النهر عرضية أو تقريبا عابرة الحفاظ على صلاحية الخلايا العصبية من الأنسجة البالغة ونهج عملي لاستعادة مورفولوجيا والهوية الكيميائية العصبية من الخلايا العصبية مصححة. يمكن إجراء هذه الطريقة بسهولة لمطابقة النتائج الكهرو فسيولوجية مع الدراسات التشريحية والسلوكية التي تركز على الجزء المتوسط الظهري من قرن آمون.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونشكر كيرستن كرونبيتر وديدير غريميل على المساعدة التقنية. نشكر أومبرتو موريلي على المساعدة في برامج الجرافيك وماتياس هوب لفيديو التصوير، وتحرير الفيديو. تم دعم العمل في مختبرنا من قبل دويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143 ، SFB 1461 (Project-ID 434434223) وGK2154 ، ومنحة مجلس البحوث الطبية G1100546 /2 وجامعة كييل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringes Omnifix-F | Braun melsungen AG | 9161406V | |
| 24 multiwells | SARSTEDT | 8,33,922 | |
| 81x criogenic vial storage box | Fisherscientific | 15-350-107B | storage chamber |
| Alexa Hydrazide dye | Invitrogen | A10436 | |
| Big scissor | Fine science tool | 14010-15 | graefe forceps |
| Biocytin | IRIS biotech. | LS3510.0250 | |
| Borosilicate Glass capillaries | Science products | GB150TF-10 | storage chamber |
| Brush 5 | Leonhardy | 241 | Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.2 | aCSF solution |
| Carbon steel microtome blade | feather | C35 | |
| Chloridric acid | Roth | K025.1 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | with Airyscan |
| Cyanoacrylate glue | UHU | 509141 | |
| Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond | 3M | ||
| EGTA | Roth | 3054.1 | |
| Fiji ImageJ | fiji.sc | ||
| Filter paper 113A | ROTILABO Roth | AP180.1 | |
| Fine tip tweezer | Dumont | 0245fo | |
| Glass becker (150 ml) | ROTILABO Roth | X690.1 | incubation chamber and dissection |
| Glass Petri dishes (10 cm dia.) | ROTILABO Roth | 0690.1 | |
| Glucose | Roth | X997.2 | aCSF solution |
| Heated water bath | Grant Instruments Ltd | SUB14 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | aCSF solution |
| Isofluoran | baxter | 5239.2 | Anesthetic |
| Large spatula | Roth | E286.1 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | |
| Microfil | World precision instruments | MF34G | |
| Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF solution |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | 566380 | |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments | 64-0198 | incubation chamber and storage chamber |
| Paraformaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline 10X | Panbiotech | P04-53500 | |
| Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | |
| Pipette puller | Sutter instrument | P-2000 | |
| Pipette tips | SARSTEDT | 7,07,62,211 | incubation chamber |
| Plastic box for syringe filters | SUPELCO | 54135-U | storage chamber |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.3 | aCSF solution |
| Potassium Gluconate | Roth | P1847 | |
| Probenbecker becker (100 ml) | ROTILABO Roth | HT85.1 | incubation chamber |
| Rounded tip tweezers | Fine science tool | 11051-10 | |
| Sainless steel blade | Gillette | Vibratome | |
| Small scissor | Fine science tool | 14010-10 | mayo scissor straight |
| Sodium Ascorbate | Roth | 3149.2 | aCSF solution |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium Bicarbonate | Roth | 6885.1 | aCSF solution |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | aCSF solution |
| Sodium Hydroxide | Roth | K021.1 | |
| Sodium Phosphate monobasicdihydrat | Roth | K300.1 | aCSF solution |
| Sodium Pyruvate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Streptavidin conjiugated Alexa 488 | Invitogen | s11223 | |
| Thin spatula | Roth | E286.1 | Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm |
| Transfer pipette | Sarstedt | 861171 | |
| Triton x100 | Roth | 3051.1 | |
| Vibratome | Thermoscientific | Microm HM650V | |
| Filter device for ultrapure water | Merck-Millipore | Milli-Q IQ 7000 |
References
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- David, A., Pierre, L. Hippocampal Neuroanatomy. The Hippocampus Book. , 37-114 (2006).
- Dong, H. W., Swanson, L. W., Chen, L., Fanselow, M. S., Toga, A. W. Genomic-anatomic evidence for distinct functional domains in hippocampal field CA1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (28), 11794-11799 (2009).
- Royer, S., Sirota, A., Patel, J., Buzsaki, G. Distinct representations and theta dynamics in dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neuroscience. 30 (5), 1777-1787 (2010).
- Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
- Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Rep. 27 (13), 3725-3732 (2019).
- Cembrowski, M. S., Spruston, N. Heterogeneity within classical cell types is the rule: lessons from hippocampal pyramidal neurons. Nature Reviews Neuroscience. 20 (4), 193-204 (2019).
- Moser, M. B., Moser, E. I., Forrest, E., Andersen, P., Morris, R. G. Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9697-9701 (1995).
- Pothuizen, H. H., Zhang, W. N., Jongen-Relo, A. L., Feldon, J., Yee, B. K. Dissociation of function between the dorsal and the ventral hippocampus in spatial learning abilities of the rat: a within-subject, within-task comparison of reference and working spatial memory. European Journal of Neuroscience. 19 (3), 705-712 (2004).
- Fredes, F., et al. Ventro-dorsal Hippocampal Pathway Gates Novelty-Induced Contextual Memory Formation. Current Biology. 31 (1), 25-38 (2021).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
- Andersen, P.
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. Journal of Neurophysiology. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Walther, H., Lambert, J. D., Jones, R. S., Heinemann, U., Hamon, B. Epileptiform activity in combined slices of the hippocampus, subiculum and entorhinal cortex during perfusion with low magnesium medium. Neurosci Lett. 69 (2), 156-161 (1986).
- Rafiq, A., DeLorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex/hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70 (5), 1962-1974 (1993).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Davie, J. T., et al.
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
- Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).
- Dougherty, K. A., Islam, T., Johnston, D. Intrinsic excitability of CA1 pyramidal neurones from the rat dorsal and ventral hippocampus. Journal of Physiology. 590 (22), 5707-5722 (2012).
- Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain and Neuroscience Advances. 1 (1), (2017).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Archives. 414 (5), 600-612 (1989).
- Djurisic, M. Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice. Journal of Visualized Experiments. (161), e61377 (2020).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. P. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols, 2nd Edition. 1183, 221-242 (2014).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706 (2014).
- Norenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 894-899 (2010).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers. Journal of Visualized Experiments. (118), e54880 (2016).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nature Protocols. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Murray, A. J., et al. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14 (3), 297-299 (2011).
- Otis, T. S., Staley, K. J., Mody, I. Perpetual inhibitory activity in mammalian brain slices generated by spontaneous GABA release. Brain Research. 545 (1-2), 142-150 (1991).
- Varela, C., Llano, D. A., Theyel, B. B. An introduction to in vitro slice approaches for the study of neuronal circuitry. Neuromethods. 67, 103-125 (2012).
