Summary
Vi presenterer en protokoll for å forberede akutte skiver fra den dorsale-mellomliggende hippocampus av mus. Vi sammenligner dette tverrgående preparatet med koronar kutting når det gjelder kvaliteten på opptak og bevaring av morfologiske egenskaper av registrerte nevroner.
Abstract
Selv om den generelle arkitekturen til hippocampus er lik langs sin langsgående akse, har nyere studier avslørt fremtredende forskjeller i molekylære, anatomiske og funksjonelle kriterier som tyder på en deling i forskjellige underkretser langs rostro-caudal-omfanget. På grunn av differensialtilkobling og funksjon er det mest grunnleggende skillet mellom dorsal og ventral hippocampus, som fortrinnsvis er involvert i romlig og følelsesmessig behandling, henholdsvis. Lakkering har derfor arbeidet med romlig minnedannelse fokusert på den dorsale hippocampus.
I motsetning har elektrofysiologiske in vitro-opptak blitt fortrinnsvis utført på mellomliggende ventral hippocampus, i stor grad motivert av faktorer som skive levedyktighet og kretsintegritet. For å tillate direkte korrelasjon av in vivo-data om romlig behandling med in vitro-data har vi tilpasset tidligere snittemetoder for å oppnå svært levedyktige tverrgående hjerneskiver fra den dorsale mellomliggende hippocampus for langsiktige registreringer av hovedceller og interneuroner i dentate gyrus. Etter hvert som romlig atferd rutinemessig analyseres hos voksne mus, har vi kombinert denne tverrgående kutteprosedyren ved bruk av beskyttende løsninger for å forbedre levedyktigheten til hjernevev fra modne dyr. Vi bruker denne tilnærmingen for mus på ca 3 måneders alder. Metoden tilbyr et godt alternativ til koronarpreparatet som ofte brukes til in vitro-studier på dorsal hippocampus. Vi sammenligner disse to preparatene når det gjelder kvaliteten på opptak og bevaring av morfologiske egenskaper av registrerte nevroner.
Introduction
Hippocampus har blitt studert mye for sin avgjørende rolle i ulike aspekter av læring og minne, romlig navigasjon samt følelser. De grunnleggende kretsene til hippocampus, ofte kalt "trisynaptic circuit", er et lamellernettverk i tverrgående aksen, som i stor grad er bevart langs langsgåendeakse 1. Bidragene fra hippocampus til ulike kognitive og følelsesmessige atferd oppstår sannsynligvis fra de ulike forbindelsene som denne grunnleggende kretser gjør langs dorsoventral aksen med flere andrehjerneregioner 2,3. Utover afferent og efferent tilkobling, men et økende antall studier peker mot ytterligere forskjeller langs septo-temporal aksen av hippocampus. Slike forskjeller gjelder intern arkitektur og tilkobling, samt forskjeller i genuttrykksmønstre og nevronal morfologi4,5,6,7,8.
Tatt i tanke på eksistensen av slike forskjeller i de grunnleggende kretsene, er det rimelig å velge den spesifikke hippocampal sub-krets som skal undersøkes i henhold til spørsmålene som er adressert. Hvis spørsmålet for eksempel gjelder nevronale mekanismer involvert i romlig behandling, er dorsal snarere enn ventral hippocampus av interesse, selv om de to ikke virker uavhengig in vivo på grunn av intra-hippocampal langsgåendetilkobling 9,10,11. Langs disse linjene må ikke bare forskjellene langs langsgående akse vurderes, men også forsiktighet er nødvendig for å bevare lokale og langdistansekretser så godt som mulig. For bevaring av fiberbanene og tilkobling er vinkelen som hjernen skal bli delt inn, avgjørende.
Den første metoden rapportert i litteraturen for å inkludere trysinaptisk krets først isolert hippocampus fra hjernen og deretter gjort tverrgående skiver (vinkelrett på langsgående akser) ved hjelp av et vev helikopter12 og en vibratom13. Senere fysiologer foretrakk å få skiver fra en hel hjerneblokk for å bevare også de tilstøtende hjernestrukturene knyttet til hippocampus. For disse blokkpreparatene er det utviklet forskjellige snittevinkler med hensyn til hippocampus, for eksempel et koronalskivepreparat14 eller et horisontalt stykkepreparat kalt HEC-skive for å bevare hippocampal-entorhinalcortex-tilkoblinger 15,16,17.
I sistnevnte forberedelse parietal lobe er kuttet med en vinkel på 0 ° eller 12 ° med hensyn til horisontalplan langs rostro-caudal aksen for å danne bunnen av blokken. Skiver samles deretter fra hjernens ventrale overflate, og tillater dermed hovedsakelig høsting av den mellomliggende ventrale hippocampalregionen. Denne metoden har blitt det mest populære valget for fysiologiske studier og kan pålitelig utføres etter flere publiserte protokoller18,19,20.
Men hvis forskningsinteressen gjelder spesifikke aspekter ved romlig læring, kan den dorsale hippocampus være den mer passende undersøkelsesregionen, og det ville være nyttig å finne en kutteprosedyre av lignende kvalitet for denne hippocampalregionen. Få protokoller, som fokuserer på selve rostralpolen, er utviklet som kan tilfredsstille denne etterspørselen 21,22.
I denne protokollen beskriver vi i stedet en tilnærming for å oppnå levedyktige tverrgående skiver fra den dorsale mellomliggende hippocampus som bruker snittingsvinkelen som tidligere er beskrevet for horisontalepreparater 18,19 (figur 1A& B). Vi demonstrerer kvaliteten på denne protokollen ved å sammenligne elektrofysiologiske opptak og morfologiske rekonstruksjoner i dette preparatet til de som oppnås i koronale skiver. Denne protokollen er spesielt egnet for kombinasjon med anatomiske og atferdsmessige eksperimenter hos voksne mus (tre måneder gammel i vårt tilfelle).
Protocol
Alle prosedyrer som involverte eksperimentelle dyr var i samsvar med den tyske dyrevelferdsloven og godkjent av etikkkomiteen ved Universitetet i Kiel. Parvalbumin-Cre (Pvalb-IRES-Cre) mus23 (Jackson laboratorier, Reposory nummer 008069) ble opprettholdt som heterozygous kolonier eller krysset med Ai9 Cre reporter mus24 (Jackson laboratorier, Reposory nummer 007909). Hunn- og hannmus mellom P40-P90 ble brukt. Mus ble opprettholdt i en 12-h lys-mørk syklus under standard gruppe boligforhold og ble utstyrt med mat og vann ad libitum.
1. Utarbeidelse av løsninger
MERK: Klargjør nye løsninger for hver eksperimentell dag ved hjelp av ultrarent vann (UPW) (resistivitet ved 25 °C 18,2 MΩcm). Løsningene kan oppbevares ved 4 °C i maksimalt én dag. Magnesium- og kalsiumløsninger kan lagres separat som 1 M lagerløsninger. Alle arbeidsløsningene må mettes med karbagen (95 % O2:5 % CO2)for optimal oksygenering og pH-vedlikehold før og under bruk.
- Klargjør skjæreoppløsningen (500 ml per mus) (i mM): 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4,30 NaHCO3,20 HEPES, 25 glukose, 5 Na-ascorbate, 4 Na-pyruvat, 0,5 CaCl2·2H2O og 10 MgSO4·7H2O. Titrate til pH 7,4 under en kjemisk hette med 4-5 ml 16 % saltsyre før de tilsetter de divalente kassene. Dette vil unngå nedbør av MgSO4.
MERK: KCl og NaH2PO4 kan oppbevares som 10x oppløsning ved 4 °C. Vi lager to individuelle partier med skjæreløsning. En dagen før innspillingen (lagret i en fryser over natten for å produsere knust is) og en på opptaksdagen. - Klargjør lagringsløsningen (250 ml per mus) (i mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukose, 5 Na-ascorbate, 4 Na-pyruvate, 2 CaCl2·2H2O og 2 MgSO4·7H2O. Titrate til pH 7.3-7.4 med 1 N NaOH.
MERK: NaCl, KCl og NaH2PO4 kan på lageres som 10x oppløsning ved 4 °C. - Klargjør ACSF for opptak (i mM): 122 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4,24 NaHCO3,12,5 glukose, 2 CaCl2·2H2O og 2 MgSO4·7H2O, 2 Na-ascorbate, 4 Na-pyruvate. Titrer pH til 7,3-7,4 med 1 N NaOH.
MERK: NaCl, KCl og NaH2PO4 kan kombineres i en 10x lagerløsning ved 4 °C.
2. Fremstilling av benken for kutting
- Forbered på is et beger (150 ml) og to glass Petri retter (10 cm diameter) og fyll dem med den friske skjæreløsningen. Hold løsningen oksygenert med en karbagen boblende enhet (et perforert rør eller en luftstein koblet til karbagensystemet).
MERK: Løsningen i begeret vil bli brukt til perfusjonen mens Petri-rettene vil bli brukt under skjæreprosedyren. - Utstyr operasjonsbenken med et blad i rustfritt stål, avrundede tupp pinsett, fine tips pinsett, stor saks, liten saks, en stor metall slikkepott, en tynn metall slikkepott, en børste, vibratome plate og cyanoacrylat lim eller mindre giftig n-butyl-ester cyanoacrylate lim. Immerge en rustfritt stål blad og et stykke filter papir i en av glass Petri retter på is. Denne Petri vil bli brukt til å kutte hjernen. Tegn tre parallelle linjer på bunnen av en plast Petri skål og plassere denne parabolen nær kirurgiske instrumenter.
- Klargjør oppsettet for trans-cardial perfusjon i henhold til publiserte protokoller25.
- Forbered vibratomen, fest et nytt blad på bladholderen og still inn parametrene for skjæring (bladvinkel fra horisontal plan 17°, bladsvingninger amplitude 1,5 mm, bladoverbevegelseshastighet på rundt 2 mm min-1, Oscillasjonsfrekvens 90 Hz, seksjonstykkelse 350 μm). Fyll vibratombrettet med iskald skjæreløsning og hold det under konstant oksygenering.
MERK: Vi legger til den knuste isen laget av den første batchen med skjæreløsning til den avkjølte, friske skjæreløsningen for å holde temperaturen nede. Vær oppmerksom på å holde isen fra bladet mens du skjærer. - Forbered et inkubasjonskammer fylt med skjæreløsningen under konstant oksygenering. Plasser kammeret i et forvarmet vannbad (35 °C).
MERK: Et eksempel på inkubasjonskammeret finnes i Edwards og Konnerth (1992)26. - Forbered et skivelagringskammer fylt med lagringsløsningen og hold den ved romtemperatur og under konstant oksygenering. I tilfelle vevet uttrykker et fluorescerende protein eller en lysaktivert opsin, anbefales det å holde kammeret i mørket, for eksempel inne i en boks.
MERK: Et lagringskammer med flere uavhengige brønner er nyttig for å skille nivået på skivene langs hippocampus dorsoventralaksen. Et skreddersydd kammer kan bygges (figur 1D). Ta et stykke hetteglass avstandsgitter fra en 81x kryogen hetteglass oppbevaringsboks og lim bunnen på et nylonnett. Sett den øvre tredjedelen av en 5ml pipette plastspiss inn i midten av dette rutenettet, slik at den stikker ut ca 3 cm nederst. Denne plastspissen fungerer som stativet på rutenettet og holder senere luftslangen for oksygenering. Sett gitteret med stativet inn i en sylindrisk plastboks (f.eks. emballasje av sprøytefiltre) slik at det ikke kan vippe eller vingle. Dette reservoaret vil rommle 250 ml lagringsløsning.
3. Utarbeidelse av hippocampal skiver
- Bedøve musen i et bokskammer ved hjelp av isofluran (ca. 0,5 ml) under panseret. La musen hvile til pusten er treg og vanlig (ca 2-3 minutter). Test for fravær av smerteresponser med tåklem.
- Utfør trans-cardial perfusjon ved hjelp av 25 ml karbonert skjæreløsning fra begeret på isen etter publiserte protokoller25,27. Dette trinnet anbefales å kjøle ned hjernen raskt for å raskt bremse nevronal metabolisme.
- Decapitate dyret ved hjelp av den store saksen og legg hodet i den avkjølte petriskålen på is som inneholder skjæreløsningen.
- Åpne huden med den fine saksen for å eksponere skallen. Lag små laterale snitt i bunnen av skallen på begge sider av foramen magnum. Skjær deretter langs sagittalsugen som starter ved foramen magnum til den når naso-frontal suturen over olfaktorisk pære. Trekk opp saksen under sagittalkuttet for å unngå skade på det underliggende hjernevevet.
MERK: Å holde hodet nedsenket i skjæreoppløsningen bidrar til å fjerne det fra blod og holde temperaturen nede. - Bruk den avrundede tuppen pinsett for å trekke opp parietal bein for å avsløre hjernen. Vær oppmerksom på å få tak i og fjerne meninges også. Hvis de blir forlatt, kan de skade hjernen under ekstraksjon.
- Bruk den lille slikkepotten til å forsiktig øse ut hjernen i den andre petriskålen.
- Skjær hjernen i halvdeler langs langsgående sprekk ved hjelp av det forkjølte bladet.
- Bruk den store slikkepotten til å løfte en halvkule ut av skjæreløsningen og på plast petriskålen. Med halvkule liggende på sin mediale overflate, justere parietal cortex med en av de parallelle linjene for å ha en referanse for det andre kuttet som vist i figur 1B.
- Utfør det andre kuttet på ventraldelen av halvkule som plasserer bladet parallelt med linjene for å oppnå overflaten, som senere brukes til å lime hjernen på prøveholderen (se neste trinn), som vist i figur 1B. Returner halvkule inn i den oksygenerte skjæreløsningen av glassskålen og utfør samme prosedyre på den andre halvkule.
- Lim halvkulene med den nykuttede ventrale siden på vibratomprøveholderen ved hjelp av limet. Sett noen dråper skjæreoppløsning på halvkule for å stivne limet og flytt prøveholderen inn i vibratomskuffen. På denne måten vil kuttingen gå fra dorsal til ventral hippocampus.
- Fjern de første en eller to ikke-tverrgående skiver (Figur 1C,ii-iii) til interesseområdet blir synlig og deretter begynne å samle skiver.
MERK: Ikke-tverrgående, men brukbare, sunne skiver kan fås fra den dorsale hippocampus i begynnelsen av kuttprosedyren (figur 1C,ii-iii). Samlingen av hver skive krever ca 3-4 min. Ved å starte skjæringen fra dorsal i stedet for ventral hippocampus sparer vi ca 10 minutter, noe som forbedrer levedyktigheten til dorsale skiver. - Med en plastpipette (skjær bort den smale enden av spissen) overfører hver skive inn i inkubasjonskammeret (som inneholder skjæreoppløsning ved 35 °C) og la den hvile i 12 min. Den korte gjenopprettingsperioden i varm skjæreløsning reduserer i stor grad innledende nevronal hevelse, som rapportert i Ting et al. (2014)28. Deretter bruker du en børste stykket inn i lagringskammeret (som inneholder lagringsløsning ved RT) og la den hvile til starten av eksperimentet.
4. Helcelleopptak og biocytinfylling
MERK: Beskrivelsen av helcellede patch-clamp-opptak reduseres her bare til viktige trinn som bidrar til å oppnå god biocytinfylling og gjelder generelt for nevroner i ACSF. For detaljer om prosedyrene for elektrofysiologiske opptak, kan flere andre protokoller konsulteres29,30.
- Velg en passende intracellulær løsning i henhold til parameterne som skal registreres. Som et eksempel, for gjeldende klemmemålinger, kan en kaliumlimukotbasert løsning brukes (i mM): 135 K-glukosat, 3 KCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 10 fosfokreatin-Na2, 4 MgATP, 0,3 Na2-GTP. Juster pH-en til 7,3 med 1 M KOH. Osmolaliteten bør være rundt 285-290 mOsmol/ kg når 3-5 mg / ml biocytin er tilsatt.
MERK: For å overvåke formen på nevronen under opptaket, kan 0,3-0,5 μL/ml på 1 mM Alexa Fluor Hydrazide legges til den intracellulære oppløsningen. I dette tilfellet, husk for biocytin åpenbaring, for å matche Alexa fargestoff fargestoff farge med fluorescerende sonde kombinert med streptavidin. - Forbered patch-clamp elektroder av ≤1 μm tuppdiameter og 3-5 MΩ motstand fra tykkveggede borosilikatkapillærer.
- Start perfusjonssystemet til patch-clamp-oppsettet med en hastighet på 2,5-3 ml/min ved RT eller 35-37 °C og fest et stykke i kammeret med et U-formet anker.
- Identifiser hjerneområdet av interesse og velg en sunn nevron med soma minst 30-50 μm under overflaten av skiven.
MERK: Soma av en sunn nevron har en jevn overflate, og membrangrensene er litt kontrastert. Soma av usunn nevron vises krympet og svært kontrastert eller hovent og semi-gjennomsiktig. - Legg en glasspipette med den intracellulære oppløsningen til spissen av AgCl-elektroden er dekket. Flytt pipetten inn i oppløsningen av opptakskammeret, bruk et lett positivt trykk for å holde klar spissen av glasselektroden.
MERK: Hvis oppløsningen inneholder et Alexa-fargestoff, kan trykket styres visuelt justere mengden fluorescerende oppløsning som frigjøres fra spissen. Minimalt trykk ville unngå flekker av vevet rundt cellen. - Nærmer cellen fra en skrå vinkel og etablere kontakt innenfor den første tredjedelen av soma overflaten når du danner giga-forsegling. Slipp trykket, flytt holdepotensialet langsomt til-65 mV og påfør en mild suging gjennom munnen for å lette giga-tetningsformasjonen.
- For å etablere hele cellekonfigurasjonen, bruk sterk og kort suging for å bryte membranen. Kast opptaket hvis nevronen har et membranpotensial mer depolarisert enn-50 mV, hvis holdestrømmen øker utover 100 pA eller hvis tilgangsmotstanden øker utover 30 MΩ.
- Etter opptaket (for tilstrekkelig fylling av somata og dendritt anbefales minst 15 min; for fylling av komplekse aksoner opptil en time kanskje nødvendig31) fjern elektroden forsiktig. For dette formål sett holdingpotensialet til 0 mV og prøv å re-danne en giga-forsegling ved å sakte trekke pipetten i motsatt retning motsatt fra tilnærmingen, for eksempel for å få en ekstern patch konfigurasjon.
MERK: Tilstedeværelsen av Alexa-fargestoffet i de intracellulære løsningene hjelper visuelt styrt fjerning av pipetten fra den nevronale overflaten. Hvis kjernen i cellen ikke er i kontakt med pipettespissen, trekker en rask metode for å reformere forseglingen pipetten ut av vevet diagonalt og oppover i høy hastighet. Hvis kjernen eller en del av membranen ligger innenfor spissen, er det fare for å bryte plasmamembranen. I dette tilfellet kan en liten positiv trykkapplikasjon og lateral bevegelse hjelpe. - Legg merke til plasseringen av cellen og retningen på stykket. Etter fiksering kan den nøyaktige retningen av skiven og integriteten til den fylte cellen kontrolleres under et fluorescerende mikroskop.
5. Immunstaining, bildeoppkjøp og morfologisk rekonstruksjon
- Etter opptak, overfør skivene til en 24-brønns plate for å fikse det i paraformaldehyd (PFA) 4% i 0,1 M fosfatbufret saltvann (PBS). Inkuber i 60 min ved RT eller over natten ved 4 °C, i henhold til følsomheten til de primære antistoffene som brukes. Skiver kan lagres i 0,1 M PBS og 0,02% NaN3.
FORSIKTIG: PFA er giftig. Bruk under panseret. - Utfør immunstaining og biocytin åpenbaring innen en uke etter opptak i henhold til etablerteprotokoller 32,33.
MERK: Vi bruker en prosedyre som unngår reseksjon av skiven for å bevare integriteten til dendrittiske og aksonale prosesser. Denne prosedyren krever imidlertid lengre inkubasjonstider da antistoffer må trenge inn i vevet. Vi foreslår å teste tiden for optimal penetrasjon av antistoffer i vevet før du utfører eksperimentet. - Hent bilder ved hjelp av et konfokalt mikroskop med Z-stabel og flisskanslingsfunksjon.
- Utfør morfologisk rekonstruksjon ved hjelp av Fiji imageJ34.
MERK: Flere bildefilformater kan importeres til programmet ved hjelp av Bio-format plugin. Vi anbefaler bruk av Simple Neurite Tracer (STN) plugin35 for rekonstruksjon av dendrittene og axon. En enkel og klar tutorial er tilgjengelig på https://imagej.net/SNT og http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/. Filen som inneholder sporingsdata (.traces), hvis lagret un-komprimert, kan konverteres til en tekstfil og åpnes med Matlab eller annen programvare for tekst databehandling.
Representative Results
I denne protokollen beskriver vi hvordan man lager akutte hippocampalskiver fra den dorsale mellomliggende delen av hippocampus (figur 1A). Protokollen er spesielt egnet for eksperimenter som undersøker mekanismer involvert i romlig læring og kan kombineres med atferdsarbeid eller viral merking eller manipulasjon strategier i dorsal hippocampus35. Bruk av snittingsprosedyren som er beskrevet her til dyrene injisert med Cre-avhengig GFP som uttrykker adeno-assosiert virus (AAV-FLEX-GFP) i den dorsale hippocampus av Pvalb-IRES-Cre-mus ved forskjellige Bregma koordinerer AP-1,94 mm, ML ± 0,5-2 mm, dybde-1,25-2,25 mm for å målrette forskjellige regioner ihippocampalformasjonen 36 kunne vi oppnå minst tre tverrgående skiver som inneholder de infiserte områdene (figur 1A lysgrønn farge på 3D-modellen av hippocampus). I tillegg kan flere ikke-tverrgående, men sunne skiver fås fra de mer rostrale delene av den dorsale hippocampus (figur 1C).
For å demonstrere kvaliteten og levedyktigheten til skivene våre har vi registrert grunnleggende elektrofysiologiske og morfologiske parametere av granulatceller og tdTomato-merkede Parvalbumin-positive (PV+) interneurons i dentate gyrus av Pvalb-IRES-Cre; Ai9 transgene mus (7-12 ukers alder) og sammenlignet disse med opptak fra koronale skiver av samme region oppnådd med en standardprotokoll.
Ved visuell inspeksjon under mikroskopet infra-red differential-interference contrast (IR-DIC) har vi allerede lagt merke til klare forskjeller mellom vår tverrgående og koronale skive. Mens nevroner av hovedcellelaget i koronale skiver ofte dukket opp grove og viste sterkt kontrasterte konturer, viste nevroner i tverrgående skive for det meste glatte overflater og bare lett kontrasterte grenser, noe som indikerer bedre cellulær vitalitet (figur 2A). Årsaken til disse forskjellene i celle levedyktighet mellom koronale og tverrgående skiver kan ligge i orienteringen av snitteplanet med hensyn til fiberkanalene. Siden disse ikke er parallelt i koronale seksjoner, vil aksoner og dendritt bli kuttet. I tråd med denne antagelsen fant vi at innenfor skiver viste overflateplanene av granulatcellelag og hilus større diskontinuitet i koronalen enn tverrgående skive (trinnstørrelse i overflateplan: 41,40 ± 3,28 μm vs 25,60 ± 2,94 μm, Gjennomsnittlig ± SEM, Unpaired t-test P = 0,023), noe som tyder på en større grad av vevsfrakobling i koronarskiven (figur 2B). Dette betyr at egnede celler for patch-clamp opptak vil bare bli funnet på dypere plan av granulatcellelaget for koronale skiver, noe som igjen kan redusere gjennomstrømningen av patch-klemme opptak. Faktisk, gjennomsnittlig tid til å forsegle dannelse i vår tverrgående skive var raskere enn for koronale skiver (granulceller: 12,64± 1,50 s, n = 11 i koronar vs. 8,40 ± 0,75 s, n = 14 i tverrgående skiver, Mean ± SEM, P = 0,0335 Mann-Whitney test; PV + interneurons: 31.11 ± 2.60 s, n = 9 i koronar vs. 22.00 ± 2.18, n = 7 i tverrgående skiver, Mean ± SEM, P = 0.0283 Mann-Whitney test) (Figur 2C). Som proxy for celleintegritet og helse registrerte vi deretter hvilemembranpotensialet (RMP) av granulceller og PV + interneurons, som ble betydelig mer depolarisert i både granulceller og PV + interneurons i koronar vs. tverrgående skiver (granulceller:-62,55 ± 3,54 mV, n=11 i koronar vs.-71.06 ± 2.31 mV, n=14 i tverrgående skiver, Gjennomsnitt ± SEM, P= 0,0455 Mann-Whitney test; PV + interneurons:-52,75 ± 1,66 mV, n = 7 i koronar vs.-59,36 ± 2,25 mV, n = 6 i tverrgående skiver Mean ± SEM, P = 0,0271 Mann-Whitney test) (Figur 2D). Disse dataene tyder på et høyere antall friske nevroner i tverrgående vs. koronal skive forberedelse. Faktisk resulterte innføring av en cut-off for akseptabel RMP (-55 mV for granulceller;-45 mV for PV + interneurons) i en høyere prosentandel av ekskluderte celler i koronar enn i tverrgående skiver (39,67 ± 8,37 %, n=3 eksperimentelle økter vs. 23,00 ± 3,85 %, n=4 eksperimentelle økter) (figur 2E). Videre indikerte rekonstruksjon av nevronal morfologi fra registrerte granulceller at som forventede sjanser var mye bedre å hente en komplett aksonær arborisering for granulatceller i tverrgående skive (figur 3A, B). I tillegg tillot den morfologiske rekonstruksjonen av PV + interneurons i tverrgående skiver skildringen av omfattende aksonære og dendrittiske arboriseringer, inkludert visualisering av små detaljer som dendrittiske spines35(Figur 3C).
Figur 1: Illustrasjon av snittingsprosedyren for å få skiver fra dorsal-intermediate hippocampus. (A) Tredimensjonal representasjon av hippocampalformasjonen som viser sin romlige orientering i hjernen (modifisert fra Brain Explorer, Allen Institute)37. Dorsale, mellomliggende og ventrale divisjoner av hippocampus (dHPC, iHPC, vHPC) er angitt, ifølge Dong et al. (2009)7. Den delen av dorsal-intermediate hippocampus som skal skjæres er angitt i lys grønn. Inndatasettet til høyre viser retningen på referanseaksene. (B) Tegneserie av en hjerne halvkule som viser justeringen av parietal cortex med parallelle linjer på Petri parabolen. Den røde stiplede linjen indikerer hvor du skal utføre trimming kuttet (punkt 3.9 i protokollen) for å skape overflaten for liming av halvkule på prøveholderen. De svarte stiplede linjene angir hvor skiver samles inn. (C) Bright felt bilde serie av hippocampal skiver innhentet etter denne prosedyren. Fra pialoverflaten, dorsal til ventral: (i) 0,70 mm, (ii) 1,05 mm, (iii) 1,40 mm, (iv) 1,75 mm, (v) 2,10 mm, (vi) 2,45 mm (vii) 2,80 mm, (viii) 3,15 mm. Vektstangen= 1 mm. (D) Bilde av oppbevaringskammeret og materialet som trengs for monteringen. 1. Hetteglass avstandsgitter fra en 81x kryogen hetteglass oppbevaringsboks, 2. Sylindrisk plastboks. 3. Nylon nett, 4. Pipettespissen. Innfelt. Sidevisning av gitteret og rørholderen for å sette inn i den sylindriske boksen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tverrgående skive viser forbedret skive levedyktighet sammenlignet med koronarskivet. (A) DIC-IR mikrografer som viser sunne (svarte piler) og usunne (hvite piler) eksempler på nevronal somata i tverrgående og koronale skiver. Hil=hilus, gcl=granulcellelag, ml= molekylært lag. Vektstangen = 50 μm. (B) Begge snittingsprosedyrene produserer et trinn mellom overflaten av granulatcellelaget og hilus (indikert med pilhoder). Høyden på trinnet er et tegn på omfanget av vevsfrakobling og er betydelig lavere i tverrgående seksjoner enn i koronar (n = 5 tverrgående og n = 5 koronale skiver, Mean±SEM, P = 0,0238 Mann-Whitney test). (C) Tid for giga-ohm tetningsdannelse i granulceller (n = 14 celler i tverrgående, n = 11 celler koronar; Mean±SEM, P = 0,0355, Mann-Whitney test) og PV + INs (n = 7 celler i transversal, n = 9 celler i koronale skiver, Mean±SEM, P = 0,0283 Mann-Whitney test) skiver. (D)Hvilemembranpotensial (RMP) av celler lappet (henholdsvis n = 14 og n = 11 granulatceller. Mener±SEM, P = 0,0455 Mann-Whitney test. n=7 PV+ IN og n=10 PV+ INs, P= 0,0271 Mann-Whitney-test). (E) Prosentandel av kasserte celler i en eksperimentell økt, (n = 3 økter med koronar skive, n = 4 med tverrgående skive, Mean±SEM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Morfologisk bevaring av granulatceller og interneuroner i tverrgående skive. Konfokale bilder som viser biocytinfylte granulceller i en tverrgående skive (A) og i en koronal skiver (B) av Pvalb-IRES-Cre; Ai9 transgene mus. De respektive aksonene er rekonstruert i grå og lysegrå. Legg merke til forskjellen i axon lengde og kompleksitet mellom preparatene. Vektlinje=100 μm. (C1) Konfokalbilde som viser en biocitynfylt tdTomato-positiv internuron. Hil=hilus, gcl=granulatcellelag, ml= molekylært lag. Vektlinje=50 μm. (C2) Forstørrelse av det boksede området i C1, som viser dendrittiske pigger. Vekt bar = 2 μm (D) Morfologisk rekonstruksjon av aksoner og dendritt av biocytin fylt interneuron i C1 (axon i grå, soma og dendritt i svart). (E) Nærbilde av somata av cellene avbildet i C1 viser colocalization av biocytin og Parvalbumin-immunoreaktivitet (PVir). Skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Den dorsale hippocampus har blitt grundig studert for sin rolle i romlig læring og navigasjon hovedsakelig gjennom atferdseksperimenter, anatomisk sporing og regionspesifikke manipulasjoner. For å kombinere slice-electro-fysiologiske henvendelser med disse teknikkene, har vi satt sammen en protokoll som bruker en lignende snittingsvinkel som den modifiserte horisontale kuttingen for hippocampusens mellomliggende ventrale region, men bruker en omvendt kutting for å få tidlige skiver fra den dorsale mellomliggende regionen. Denne tilnærmingen reduserer tiden som kreves for å skjære og samle den dorsale regionen hippocampus, og dermed forbedre skiver levedyktighet.
Ved hjelp av denne metoden er vi i stand til rutinemessig å hente omtrent tre skiver per halvkule av den dorsale hippocampalregionen mellom 1,4 mm-2,4 mm fra pialoverflaten, som vist i figur 1C. Selv om det ikke er mulig med denne prosedyren for å få tverrgående skiver fra selve septalpolen på hippocampus, er det mulig å samle ca to ekstra levedyktige ikke-transversale skiver per halvkule fra septalstangen (figur 1C ii, iii). Hvis septalpolen på hippocampus er det primære forskningsfokuset, kan andre protokoller, som tillater innsamling av tverrgående skiver, spesielt fra selve septalpolen på hippocampus, være bedreegnet 21,32. Atferdseksperimenter på romlig navigasjon og læring utføres fortrinnsvis hos modne mus med fullt utviklet nevronal tilkobling. Følgelig har vi optimalisert vår kutteprosedyre for anvendelsen av hjernen til voksne dyr (vist her i tre måneder gamle mus), som er mer følsomme for stress enn det elastiske juvenil preparatet. For dette formål har vi kombinert flere strategier som reduserer det hypoksiske stresset hjernen blir utsatt for i tiden mellom ekstraksjon og plassering av skivene i oksygenert ACSF. Den beskyttende skjæreløsningen er en NMDG-basert ACSF25,27,28 med lav Na+ og Ca 2 + men høy Mg2 + for å redusere eksoksisk skade og cellehevelse på grunn av aktivering av NMDA-reseptorer. I tillegg gir HEPES stabil bufring og forbindelser som askorbat og pyruvat reduserer oksidativt stress. Den trans-cardial perfusjon med kjølt og oksygenert beskyttende kutte løsning utnytter den ekstremt tette kapillær nettverk som forsyner hjernen til raskt og homogent redusere metabolsk etterspørsel og glutamat-indusert excitotoxicity i hjernevevet. Deretter utføres nesten alle trinnene etter halshugging innenfor de avkjølte og oksygenerte løsningene for å holde metabolismen og oksygenmangelen til et minimum under hele prosedyren. Andre strategier for å redusere hjerneskade under kutting eksisterer og kan være likegyldige 38. For å demonstrere kvaliteten på vårt preparat, sammenligner vi det med et koronarskivepreparat, som vanligvis brukes til å registrere fra den dorsale hippocampus. Selv om koronale skiver kan brukes til å oppnå god patch-clamp opptak i dentate gyrus, antall usunne og frakoblede nevroner er høyere enn i tverrgående skive. I tillegg er integriteten til aksonære og dendrittiske arboriseringer bedre bevart i tverrgående skive. Faktisk integriteten til granulatcelleaksoner (figur 3A), som kjører ortogonal til hippocampus langsgående akse fungerer som en indikator på et tverrgående skjærplan1.
For fylling av lappede nevroner foreslår vi en elektrodemotstand mellom 3 og 5 MΩ. En diameter på spissen på ca 1 μm, tillater oppnåelse av en god tetningsmotstand under opptak og god re-tetting ved elektrode tilbaketrekking. Den mest avgjørende detalj er å unngå suging av deler av soma eller kjernen i pipetten. Av denne grunn foreslår vi å inkludere et Alexa-fargestoff i den intracellulære løsningen når det er mulig. Fargestoffet gjør det mulig å overvåke celleformen under opptak og re-tetting. Videre tillater det å vurdere integriteten til den lappede cellen etter fiksering, noe som kan spare immunohistochemistry tid, i tilfeller av mislykkede fyllinger. På grunn av Alexa fargestoffer er slukket med lang fikseringstid, foreslår vi kort fiksering hvis mulig.
For etterfølgende immunstaining bruker vi en protokoll som ikke krever re-snitting av skiven. Vi foreslår at du lager farging innen en uke etter fiksering. Jo lenger skivene forblir i kjøleskapet, desto større er sjansen for vevsnedbrytning. Hvis en lang lagring ikke kan unngås, foreslår vi at nan3-konsentrasjonen i PBS økes til 0,05 % og oppdatere den ukentlig. Immunstaining av hele skiven betyr at inkubasjonstidene med primære og sekundære antistoffer øker. Vanligvis, for å avsløre biocytin, er en overnattingsinkubasjon ved 4 ° C nok, men hvis kombinert med farging for andre proteiner, kan hele fargingsprosedyren vare mye lenger. Permeabilisering-blokkering og anti-kroppen inkubasjon må optimaliseres individuelt. Vanligvis, for det primære antistoffet, er to dager tilstrekkelig, mens en dag kan være nok for den sekundære. Vi anbefaler å øke varigheten av vasketrinnene sammen med lengre antistoffinkubasjoner for å unngå økning av bakgrunn.
I denne protokollen har vi presentert en kuttemetode for å oppnå tverrgående eller nesten tverrgående hippocampalskiver som bevarer nevronal levedyktighet av voksent vev og en praktisk tilnærming for å gjenopprette morfologien og den nevrokjemiske identiteten til de lappede nevronene. Denne metoden kan enkelt utføres for å matche elektrofysiologiske resultater med anatomiske og atferdsstudier med fokus på den mellomliggende-dorsale delen av hippocampus.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Kerstin Kronenbitter og Didier Gremelle, for teknisk assistanse. Vi takker Umberto Morelli for hjelp med grafisk programvare og Mathias Hoppe for videografi, og videoredigering. Arbeidet i laboratoriet vårt ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, SFB 1461 (Prosjekt-ID 434434223) og GRK2154, Medical Research Council grant G1100546/2 og Kiel University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringes Omnifix-F | Braun melsungen AG | 9161406V | |
| 24 multiwells | SARSTEDT | 8,33,922 | |
| 81x criogenic vial storage box | Fisherscientific | 15-350-107B | storage chamber |
| Alexa Hydrazide dye | Invitrogen | A10436 | |
| Big scissor | Fine science tool | 14010-15 | graefe forceps |
| Biocytin | IRIS biotech. | LS3510.0250 | |
| Borosilicate Glass capillaries | Science products | GB150TF-10 | storage chamber |
| Brush 5 | Leonhardy | 241 | Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.2 | aCSF solution |
| Carbon steel microtome blade | feather | C35 | |
| Chloridric acid | Roth | K025.1 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | with Airyscan |
| Cyanoacrylate glue | UHU | 509141 | |
| Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond | 3M | ||
| EGTA | Roth | 3054.1 | |
| Fiji ImageJ | fiji.sc | ||
| Filter paper 113A | ROTILABO Roth | AP180.1 | |
| Fine tip tweezer | Dumont | 0245fo | |
| Glass becker (150 ml) | ROTILABO Roth | X690.1 | incubation chamber and dissection |
| Glass Petri dishes (10 cm dia.) | ROTILABO Roth | 0690.1 | |
| Glucose | Roth | X997.2 | aCSF solution |
| Heated water bath | Grant Instruments Ltd | SUB14 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | aCSF solution |
| Isofluoran | baxter | 5239.2 | Anesthetic |
| Large spatula | Roth | E286.1 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | |
| Microfil | World precision instruments | MF34G | |
| Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF solution |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | 566380 | |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments | 64-0198 | incubation chamber and storage chamber |
| Paraformaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline 10X | Panbiotech | P04-53500 | |
| Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | |
| Pipette puller | Sutter instrument | P-2000 | |
| Pipette tips | SARSTEDT | 7,07,62,211 | incubation chamber |
| Plastic box for syringe filters | SUPELCO | 54135-U | storage chamber |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.3 | aCSF solution |
| Potassium Gluconate | Roth | P1847 | |
| Probenbecker becker (100 ml) | ROTILABO Roth | HT85.1 | incubation chamber |
| Rounded tip tweezers | Fine science tool | 11051-10 | |
| Sainless steel blade | Gillette | Vibratome | |
| Small scissor | Fine science tool | 14010-10 | mayo scissor straight |
| Sodium Ascorbate | Roth | 3149.2 | aCSF solution |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium Bicarbonate | Roth | 6885.1 | aCSF solution |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | aCSF solution |
| Sodium Hydroxide | Roth | K021.1 | |
| Sodium Phosphate monobasicdihydrat | Roth | K300.1 | aCSF solution |
| Sodium Pyruvate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Streptavidin conjiugated Alexa 488 | Invitogen | s11223 | |
| Thin spatula | Roth | E286.1 | Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm |
| Transfer pipette | Sarstedt | 861171 | |
| Triton x100 | Roth | 3051.1 | |
| Vibratome | Thermoscientific | Microm HM650V | |
| Filter device for ultrapure water | Merck-Millipore | Milli-Q IQ 7000 |
References
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- David, A., Pierre, L. Hippocampal Neuroanatomy. The Hippocampus Book. , 37-114 (2006).
- Dong, H. W., Swanson, L. W., Chen, L., Fanselow, M. S., Toga, A. W. Genomic-anatomic evidence for distinct functional domains in hippocampal field CA1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (28), 11794-11799 (2009).
- Royer, S., Sirota, A., Patel, J., Buzsaki, G. Distinct representations and theta dynamics in dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neuroscience. 30 (5), 1777-1787 (2010).
- Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
- Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Rep. 27 (13), 3725-3732 (2019).
- Cembrowski, M. S., Spruston, N. Heterogeneity within classical cell types is the rule: lessons from hippocampal pyramidal neurons. Nature Reviews Neuroscience. 20 (4), 193-204 (2019).
- Moser, M. B., Moser, E. I., Forrest, E., Andersen, P., Morris, R. G. Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9697-9701 (1995).
- Pothuizen, H. H., Zhang, W. N., Jongen-Relo, A. L., Feldon, J., Yee, B. K. Dissociation of function between the dorsal and the ventral hippocampus in spatial learning abilities of the rat: a within-subject, within-task comparison of reference and working spatial memory. European Journal of Neuroscience. 19 (3), 705-712 (2004).
- Fredes, F., et al. Ventro-dorsal Hippocampal Pathway Gates Novelty-Induced Contextual Memory Formation. Current Biology. 31 (1), 25-38 (2021).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
- Andersen, P.
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. Journal of Neurophysiology. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Walther, H., Lambert, J. D., Jones, R. S., Heinemann, U., Hamon, B. Epileptiform activity in combined slices of the hippocampus, subiculum and entorhinal cortex during perfusion with low magnesium medium. Neurosci Lett. 69 (2), 156-161 (1986).
- Rafiq, A., DeLorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex/hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70 (5), 1962-1974 (1993).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Davie, J. T., et al.
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
- Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).
- Dougherty, K. A., Islam, T., Johnston, D. Intrinsic excitability of CA1 pyramidal neurones from the rat dorsal and ventral hippocampus. Journal of Physiology. 590 (22), 5707-5722 (2012).
- Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain and Neuroscience Advances. 1 (1), (2017).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Archives. 414 (5), 600-612 (1989).
- Djurisic, M. Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice. Journal of Visualized Experiments. (161), e61377 (2020).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. P. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols, 2nd Edition. 1183, 221-242 (2014).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706 (2014).
- Norenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 894-899 (2010).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers. Journal of Visualized Experiments. (118), e54880 (2016).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nature Protocols. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Murray, A. J., et al. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14 (3), 297-299 (2011).
- Otis, T. S., Staley, K. J., Mody, I. Perpetual inhibitory activity in mammalian brain slices generated by spontaneous GABA release. Brain Research. 545 (1-2), 142-150 (1991).
- Varela, C., Llano, D. A., Theyel, B. B. An introduction to in vitro slice approaches for the study of neuronal circuitry. Neuromethods. 67, 103-125 (2012).
