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Developmental Biology

ज़ेब्राफ़िश में कशेरुकी विभाजन का अध्ययन करने के लिए एक 3-डी टेल एक्सप्लांट संस्कृति

Published: June 30, 2021 doi: 10.3791/61981
Automatic Translation
1,3, 1,2,3
1Division of Developmental Biology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine, 3Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

Summary

यहां, हम जेब्राफिश पीछे शरीर धुरी के 3-डी ऊतक संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो कशेरुकी विभाजन के लाइव अध्ययन को सक्षम करता है। यह एक्सप्लांट मॉडल अक्ष विस्तार, मॉर्फोजेन स्रोतों में परिवर्तन, और उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन ऊतक-स्तर लाइव इमेजिंग पर नियंत्रण प्रदान करता है।

Abstract

कशेरुकी भ्रूण उनके प्रमुख शरीर धुरी को दोहराव वाले सोमाइट्स, कशेरुकी, मांसपेशियों और त्वचा के अग्रदूतों के रूप में पैटर्न करते हैं। सोमाइट्स उत्तरोत्तर प्रीसॉमिटिक मेसोडर्म (पीएसएम) से खंडित होते हैं क्योंकि भ्रूण के पूंछ अंत में पीछे की ओर बढ़ जाता है। सोमाइट्स नियमित समय-समय पर और आकार में पैमाने के साथ बनाते हैं। ज़ेब्राफ़िश एक लोकप्रिय मॉडल जीव है क्योंकि यह आनुवंशिक रूप से ट्रैक करने योग्य है और इसमें पारदर्शी भ्रूण हैं जो लाइव इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं। फिर भी, सोमितोजेनेसिस के दौरान, मछली भ्रूण एक बड़े, गोलाई जर्दी के चारों ओर लपेटा जाता है। यह ज्यामिति जेब्राफिश भ्रूण में पीएसएम ऊतक की लाइव इमेजिंग को सीमित करती है, विशेष रूप से उच्च संकल्पों पर जिसके लिए एक करीबी उद्देश्य काम करने की दूरी की आवश्यकता होती है। यहां, हम जेब्राफिश पूंछ के एक्सप्लांट की लाइव इमेजिंग के लिए एक चपटा 3-डी ऊतक संस्कृति विधि पेश करते हैं। पूंछ एक्सप्लांट अक्ष विस्तार की आनुपातिक मंदी और रोस्ट्रोकाउडल सोमाइट लंबाई को छोटा करके अक्षुण्ण भ्रूण की नकल करते हैं। हम आगे एक्सप्लांट संस्कृति के माध्यम से धुरी विस्तार गति को स्टाल करने में सक्षम हैं। यह, पहली बार, हमें अक्षीय विस्तार के यंत्रवादी इनपुट से संकेत ढाल के रासायनिक इनपुट को सुलझाने में सक्षम बनाता है। भविष्य के अध्ययनों में, इस विधि को माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि समय-नियंत्रित दवा क्षोभ या कशेरुकी विभाजन की स्क्रीनिंग को बिना किसी दवा प्रवेश चिंताओं के अनुमति दी जा सके।

Introduction

जीवों के मेटामेरिक विभाजन का व्यापक रूप से प्रकृति में उपयोग किया जाता है। शरीर की योजना1में कशेरुकी, मांसपेशियों, नसों, जहाजों, अंगों या पत्तियों जैसे पार्श्व अंगों की कार्यक्षमता के लिए बार-बार संरचनाएं आवश्यक हैं। अक्षीय सममता की ऐसी शारीरिक और ज्यामितीय बाधाओं के परिणामस्वरूप, बिलातेरिया के अधिकांश फायला- जैसे एनेलिड्स, आर्थ्रोपोड्स, और तार-प्रदर्शन उनके भ्रूणीय ऊतकों (जैसे,ेक्टोडर्म, मेसोडर्म) एंटेरो-पीछे।

कशेरुकी भ्रूण क्रमिक रूप से प्रमुख शरीर धुरी के साथ अपने पैराक्सियल मेसोडर्म को प्रजातियों-विशिष्ट अंतराल, गिनती और आकार वितरण के साथ सोमाइट्स में खंडित करते हैं। एक प्रजाति के भीतर व्यक्तिगत भ्रूण के बीच इतनी मजबूती के बावजूद, सोमाइट विभाजन कशेरुकी प्रजातियों के बीच में बहुमुखी है । विभाजन समय अंतराल के एक विशाल शासन में होता है (जेब्राफिश में 25 मिनट से मनुष्यों में 5 घंटे तक), आकार (जेब्राफिश की पूंछ सोमाइट्स में ~ 20 माइक्रोन से चूहों के ट्रंक सोलाइट्स में ~ 200 माइक्रोन) और मायने रखता है (जेब्राफिश में 32 से मकई सांपों में ~ 300 तक)2. इससे भी दिलचस्प बात यह है कि मछली भ्रूण तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला में विकसित हो सकते हैं (जेब्राफिश के लिए ~ 20.5 डिग्री सेल्सियस से 34 डिग्री सेल्सियस तक) जबकि दोनों विभाजन अंतराल और अक्षीय विस्तार गति के लिए क्षतिपूर्ति करके उचित आकार वितरण के साथ अपनी सोमाइट्स को बरकरार रखते हैं। इस तरह की दिलचस्प विशेषताओं से परे, ज़ेब्राफ़िश सहोदर भ्रूण के साथ-साथ उनके सुलभ आनुवंशिक उपकरणों के बाहरी, समकालिक और पारदर्शी विकास के कारण कशेरुकी में विभाजन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव के रूप में रहता है। एक माइक्रोस्कोपी के नजरिए से प्रतिकूल रूप से, टेलीओस्ट भ्रूण एक भारी गोलाकार जर्दी पर विकसित होते हैं, इसके चारों ओर गैस्ट्रूटिंग ऊतक को खींचते हैं और गोलाई करतेहैं (चित्रा 1A)। इस लेख में, हम जेब्राफिश पूंछ के लिए एक चपटा 3-डी ऊतक एक्सप्लांट संस्कृति पेश करते हैं। यह एक्सप्लांट सिस्टम जर्दी द्रव्यमान की गोलाकार बाधाओं को दरकिनार करता है, जिससे सोमाइट पैटर्निंग के लिए मछली भ्रूण के उच्च संकल्प लाइव इमेजिंग तक पहुंच की अनुमति होती है।

Figure 1
चित्रा 1:जेब्राफिश भ्रूण के लिए स्लाइड चैंबर एक्सप्लांट सिस्टम। (A)जेब्राफिश भ्रूण लाइव इमेजिंग के लिए फायदे हैं, जैसे गैस्ट्रूटिंग भ्रूणीय ऊतक (नीला) की पारदर्शिता, लेकिन ऊतक एक भारी गोलाकार जर्दी द्रव्यमान (पीला) के आसपास बनता है जो अक्षुण्ण भ्रूण में निकट उद्देश्य, उच्च-संकल्प इमेजिंग को रोकता है। पूंछ एक्सप्लांट्स को माइक्रोसर्जिकल चाकू (भूरे रंग) से शुरू किया जा सकता है जो सोमाइट्स (लाल) के ऊतक पूर्वकाल से काटा जाता है और पीछे की जर्दी के साथ सीमा पर जारी रहता है। (ख)विच्छेदित पूंछ के एक्सप्लांट्स को कवरस्लिप (हल्के नीले) डोरसोवेंट्रली पर रखा जा सकता है; तंत्रिका ऊतक (हल्के भूरे) को शीर्ष पर और नीचे नोटोकॉर्ड (डार्क ग्रे) रखना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में निषेचन के बाद 1 दिन से छोटे जीवित कशेरुकी भ्रूण का उपयोग शामिल है। सभी पशु प्रयोग सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल चिकित्सा केंद्र के नैतिक दिशा निर्देशों के तहत किया गया; संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल # 2017-0048) द्वारा पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा और अनुमोदित किया गया था।

1. भ्रूण संग्रह

  1. भ्रूण संग्रह दिवस से पहले रात को टैंकों को पार करने में जेब्राफिश के जोड़े सेट करें। भ्रूण विकास के सटीक मचान नियंत्रण के लिए, संभोग जोड़े के बीच बाधाओं का उपयोग करें।
  2. पसंदीदा स्पॉन समय से पहले बाधाओं को बढ़ाएं और 100 मिमी पेट्री डिश में 15 मिनट के भीतर अंडे एकत्र करें।
    1. पेट्री डिश से साफ मलबा। यदि एक क्लच से 50 से अधिक भ्रूण एकत्र किए जाते हैं, तो क्लच को तदनुसार कई पेट्री व्यंजनों में विभाजित करें।
  3. मछली प्रणाली के पानी में 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट भ्रूण जब तक वे 50% एपिबॉली चरण (5 घंटे के बाद निषेचन) तक पहुंचने। E3 जैसे एक मानकीकृत भ्रूण विकास माध्यम का उपयोग एक्वेरियम सिस्टम पानी के बजाय चरण 3.2 तक भी किया जा सकता है।
    1. एक स्टीरियोस्कोप के नीचे अनिषेचित अंडे निकालें और भ्रूण को रात भर 23.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (O/N) में ले जाएं। भ्रूण 8-10 somites पर होना चाहिए संग्रह दिन के बाद सुबह मंच ।

2. उपकरण तैयार करना

  1. माइक्रोसर्जरी चाकू ब्लेड, सुई युक्तियां (ऊतक के विच्छेदन के लिए उपयोग किया जाता है), और ग्लास पाश्चर पिपेट को 100% इथेनॉल (एटोह) और फायर ग्लेज़िंग में भिगोकर स्टरलाइज करें।
  2. 25 मिमी x 75 मिमी माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पारदर्शी टेप (~ 100-120 माइक्रोन मोटाई) की दो परतों का उपयोग करें। एक स्केलपेल के साथ प्रत्येक स्लाइड के टेप कवर के केंद्र में ~ 18 मिमी x 18 मिमी वर्ग कुओं को काटें।
    1. 70% EtOH के साथ तैयार स्लाइड कक्षों पोंछें। इन कुओं में ~40 माइक्रोन मीडियम होगा।

3. नमूना तैयार करना

  1. एक स्टीरियोस्कोप के नीचे दो सुई सीरिंज की नोक का उपयोग कर dechorionate भ्रूण। कुल्ला करने के लिए मछली प्रणाली के पानी के साथ एक अलग पेट्री डिश में भ्रूण स्थानांतरित करें।
  2. आग से चमकता हुआ बाँझ ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, विच्छेदन माध्यम वाले 6 सेमी पेट्री डिश में भ्रूण को स्थानांतरित करें (लीबोविट्ज-15 सेल कल्चर माध्यम एल-ग्लूटामाइन के साथ फिनोल रेड, 0.8 m M CaCl2 और 1× एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान)।
    नोट: इस चरण के बाद सभी स्थानान्तरण के लिए एक निष्फल ग्लास पिपेट का उपयोग करना जारी रखें।
    1. विच्छेदन के दौरान पॉलीस्टीरिन चिप्स से बचने के लिए एक्सप्लांटिंग प्रक्रिया के लिए ग्लास पेट्री डिश का उपयोग करें।
  3. स्लाइड चैंबर में ऊतक विकास माध्यम (विच्छेदन माध्यम, और 10% एफबीएस) के 50 माइक्रोन रखो।
  4. हिंडब्रेन के पास जर्दी-ऊतक चौराहे पर सुई की नोक के साथ स्टीरियोस्कोप के नीचे विच्छेदन के लिए एक भ्रूण को स्थिर करें।
  5. भ्रूण के ऊतकों को सुई के साथ स्थिर रखते हुए, 45 डिग्री पर आयोजित ब्लेड के साथ माइक्रोसर्जिकल चाकू का उपयोग करें ताकि टिब्राइन को अलग किया जा सके और पूर्वकाल से शुरू होने वाले भ्रूणीय ऊतक से जर्दी छील सके और पूंछ की कली(चित्रा 1A)की ओर बढ़ सके।
    नोट: जर्दी की सफाई करते समय त्वचा के ऊतकों को न खोने के लिए सावधान रहें। त्वचा आसानी से विच्छेदन के दौरान भ्रूण के चारों ओर एक फ्लैंकिंग सिंगल लेयर लोचदार ऊतक के रूप में छील देगी, इसलिए इसे पहचानना आसान है।
  6. एक बार जर्दी भ्रूणीय शरीर से पूरी तरह से हटा दिया जाता है, तो टेलबड से फ्लैंकिंग स्किन टिश्यू काट लें। पिछले गठित 3-4 somites बरकरार रखते हुए, अधिक पूर्वकाल ऊतक बाहर कटौती (पूर्ण अक्ष explant) ।
    1. जर्दी को मुख्य रूप से इस प्रक्रिया से बरकरार आना चाहिए। एक उठी जर्दी के मामले में, जर्दी के महत्वपूर्ण कणिकाएं ऊतक की वेंट्रल सतह से जुड़ी रह सकती हैं। यदि हां, तो शेष जर्दी कणिकाओं को धीरे-धीरे साफ करने के लिए एक चाबुक उपकरण का उपयोग करें।
      नोट: एक एक्सप्लांट के पार्श्व पक्षों पर त्वचा के ऊतकों का असंतुलन ऊतक को सीधे विकास की दिशा बनाए रखने की अनुमति नहीं देगा। इसके बजाय एक्सप्लांट अधिक फैला हुआ त्वचा के किनारे की ओर झुक जाएगा। इस असंतुलन को माइक्रोसर्जिकल चाकू की सहायता से त्वचा की परत को तोड़कर स्टीरियोस्कोप के नीचे ठीक किया जा सकता है।
    2. स्किनलेस एक्सप्लांट्स के लिए, सुई के साथ त्वचा की परत के एक टिप पर दबाएं और ऊतक को माइक्रोसर्जिकल चाकू से हटा दें। ये एक्सप्लांट संस्कृति में अपने शरीर की धुरी को बढ़ा नहीं देंगे।
    3. पूर्ण अक्ष एक्सप्लांट के अलावा, इस चरण में वैकल्पिक एक्सप्लांट किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, माइक्रोसर्जिकल चाकू (पूर्ण पीएसएम एक्सप्लांट) का उपयोग करके पहले से ही खंडित सोमाइट्स को काटना या पीएसएम को अपने आधे एंटेरोपोस्टर (आधा पीएसएम एक्सप्लांट) में विच्छेदन करना। कृपया ऐसे वैकल्पिक एक्सप्लांट के आवेदन के लिए धारा 5.1 देखें।
  7. तुरंत विच्छेदित एक्सप्लांट को 22 मिमी x 22 मिमी कवरलिप में स्थानांतरित करें जिस पर इमेजिंग की जाएगी।
    1. डोरसोपेत्र धुरी पर एक्सप्लांट फ्लैट की व्यवस्था करें, वेंट्रल साइड कवरस्लिप(चित्रा 1B)को छूते हुए। धीरे-धीरे 20 माइक्रोन फ़िल्टर टिप पिपेट का उपयोग करके ऊतक एक्सप्लांट के चारों ओर अतिरिक्त मीडिया को हटा दें।
      नोट: ऊतक के विरूपण में कवर्लिप परिणाम के लिए विच्छेदित एक्सप्लांट के विलंबित हस्तांतरण, क्योंकि यह जर्दी की ज्यामितीय बाधाओं से राहत मिली है।
  8. तेजी से और ध्यान से विकास माध्यम से भरे स्लाइड चैंबर पर एक्सप्लांट के साथ कवरस्लिप फ्लिप।
    1. बुलबुला गठन को रोकने के लिए, टेप कक्ष पर वर्ग कवर्लिप के एक तरफ रखें और दूसरी तरफ धीरे-धीरे छोड़ें। इस स्टेप में एक्सप्लांट को मूव/विकृत न करने का ध्यान रखें ।
    2. धीरे से एक प्रयोगशाला ऊतक पर स्लाइड चैंबर दबाने से कक्ष से बाहर खून बह रहा अतिरिक्त मीडिया को हटा दें । कवरलिप बिना किसी सीलिंग के तरल माध्यम की सतह तनाव के कारण लाइव इमेजिंग के लिए स्लाइड चैंबर पर स्थिर रूप से बैठेंगे।
    3. लंबे समय तक खेती (>6 घंटे) के लिए, एक बड़े कक्ष का उपयोग करें। स्लाइड पर टेप परतों के दो समानांतर लेन के साथ 22 मिमी x 50 मिमी आयताकार कवर्लिप का उपयोग ऐसे मामलों में किया जा सकता है। विकास माध्यम में हवा का उपयोग करने के लिए दो टेप लेन के बीच में ~ 1 मिमी चौड़ा अंतर छोड़ा जा सकता है।
  9. अधिक एक्सप्लांट तैयार करने के लिए 3.3-3.8 चरणों को दोहराएं। तैयार एक्सप्लांट्स अपने ए-पी बॉडी एक्सिस को औसतन ~ 30 माइक्रोन/एच गति के साथ बढ़ाएंगे और 25 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 2 ए,वीडियो 1)पर ~ 40 मिनट के अंतराल के साथ अपने सोमाइट्स को सेगमेंट करेंगे।
    1. गैर-विस्तारित एक्सप्लांट्स के लिए, प्रयोगशाला ऊतक पर अतिरिक्त मीडिया को चूसने के दौरान कदम 3.8.2 में नमूना रखने वाले स्लाइड के किनारों पर कोमल दबाव लागू करें। वैकल्पिक रूप से, एक्सप्लांट को सिंगल टेप लेयर स्लाइड कक्षों में सुसंस्कृत किया जा सकता है। इसके अलावा, टाइप I कोलेजन के साथ स्लाइड चैंबर की सतह को रासायनिक रूप से सक्रिय करने से गैर-विस्तारित एक्सप्लांट्स(चित्रा 2 बी,वीडियो 2)में परिणाम होगा।
      1. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पूर्वाक्षित कोलेजन समाधान के 15-20 एमएल के साथ स्लाइड कक्षों को पूरी तरह से कवर करके पहले से टाइप I कोलेजन के साथ कक्ष की कोटिंग करें। बंध्यता बनाए रखने के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए एक लैमिनार प्रवाह हुड का उपयोग करें। ध्यान से अंत में विच्छेदन माध्यम के साथ कक्षों कुल्ला।
    2. 15 सोमाइट चरण से पुराने भ्रूण के लिए, एक फ्लैट (डोरसोवेंट्रल) माउंट(वीडियो 3)के बजाय पूंछ एक्सप्लांट ऊतक को बाद में माउंट करें। पेशी हिलने से रोकने के लिए, संस्कृति मीडिया में 0.004% ट्राइकेन समाधान को एनेस्थेटिक एजेंट3के रूप में शामिल करें।

4. लाइव छवि अधिग्रहण

  1. छवि नमूने या तो वाइडफील्ड के लिए एक विच्छेदन गुंजाइश पर सोमाइट विभाजन आकार और अवधि के प्रकाश इमेजिंग प्रेषित, या संरचित रोशनी के साथ/
  2. कम से कम 15 मिनट के लिए इमेजिंग कमरे के तापमान के साथ ऊतक के तापमान को बराबर करें।
    1. अधिक सटीक तापमान नियंत्रण के लिए, एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार वाणिज्यिक तापमान नियंत्रण प्रणाली का उपयोग करें।
  3. ब्याज की जैविक प्रक्रिया के आधार पर छवि अधिग्रहण फ्रेम अंतराल को 2 - 10 मिनट तक सेट करें।
    नोट: ज़ेब्राफ़िश सोमाइट सेगमेंटेशन एक तेज प्रक्रिया है, जो पूरे भ्रूण में 30 डिग्री सेल्सियस से 21.5 डिग्री सेल्सियस के व्यवहार्य तापमान के लिए 20 -55 मिनट के बीच है। Explants विस्तारित और खंड ~ 30% पूरे भ्रूण की तुलना में धीमी होगी।
    1. ऊतक जीने के लिए संभावित फोटोकॉक्सीसिटी से बचने के लिए चैनल अधिग्रहण के सेट के बीच पर्याप्त देरी छोड़ने पर ध्यान दें। इमेजिंग अवधि के आधे से अधिक के लिए उत्तेजन बीम के लिए ऊतक का पर्दाफाश न करें और जितना संभव हो बीम तीव्रता कम करें।
      नोट: प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का संचय आम तौर पर जीवित नमूनों में फोटोटॉक्सिकिटी का प्रमुख कारण है4। एक आरओएस मेहतर के रूप में एस्कॉर्बिक एसिड को बफर आरओएस गतिविधि के लिए 4 एमएम एकाग्रता पर विकास माध्यम में पूरक किया जा सकता है और फोटोटोक्सिसिटी को कम किया जा सकता है। लाइव इमेजिंग के दौरान फोटोटॉक्सिसिटी के प्रतिकूल प्रभावों को नोटिस करना मुश्किल हो सकता है। पूंछ के एक्सप्लांट इस पहलू में फायदे में हैं क्योंकि फोटोटॉक्सिटी के कुछ दृश्य मार्कर जैसे माइटोटिक गिरफ्तारी, बाधित ऊतक विकास (यानी, सोमाइट्स का गठन, पूंछ विस्तार), और ऊतक को विघटित करना आसान है। विस्तृत चर्चा के लिए उपलब्ध कराए गए संदर्भ4 का उल्लेख करें।
  4. सेलुलर रिज़ॉल्यूशन स्तर में खंडित और विश्लेषण करने के उद्देश्य से 4-डी छवियों को प्राप्त करने के लिए एकल सेल-स्टेज आरएनए इंजेक्शन भ्रूण का उपयोग करें।
    1. इन विट्रो लिखित झिल्ली और परमाणु फ्लोरोसेंट रिपोर्टर मार्कर प्लाज्मिड्स जैसे पीसी-झिल्ली-सेरूलनएफपी (ऐडजीन प्लाज्मिड #53749) या पीसी-मेम्ब-मचेरी (ऐडजीन) से आरएनए के 300 पीजी का उपयोग करें प्लाज्मिड #53750) इंजेक्शन में pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmid #99267) या pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmid #99271) के साथ संयोजन में । सेल झिल्ली और नाभिक मार्कर के साथ एक नमूना फिल्म के लिए कृपया वीडियो 4देखें ।
      नोट: पीएसएम ऊतक का औसत सेल आकार व्यास में लगभग ~ 5 माइक्रोन है, जिसमें से नाभिक में ~ 3 - 4 माइक्रोन शामिल हैं। उचित सेल सेगमेंटेशन के लिए ~ 0.5 माइक्रोन का पिक्सल आकार और ~ 1 माइक्रोन का जेड-सेक्शनिंग दर्ज किया जाना चाहिए।

5. पूंछ के एक्सप्लांट्स का इम्यूनोदाता

नोट: विभिन्न विच्छेदन परिदृश्यों (विस्तार, गैर-विस्तार, पूंछ कली विच्छेदन, आधा पीएसएम आदि) के बाद उगाए जाने वालेऊतकों को फ्लैट-माउंटेड पूंछ एक्सप्लांट के रूप में स्लाइड कक्षों से ब्याज के प्रोटीन के आगे इम्यूनोदाता मात्राकरण के लिए बरामद किया जा सकता है। यहां, हम एफजीएफ सिग्नलिंग रेडिएंट रीडआउट के रूप में एक्सप्लांट के डि-फॉस्फोरिलेटेड एक्स्ट्रासेलुलर सिग्नल विनियमित किनेज (पीपीईआरके) के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल को प्रस्तुत करते हैं।

  1. वांछित चरण तक सोमाइट्स के गठन के बाद, सावधानी से कवरस्लिप को बिना लिफ्टिंग के स्लाइड चैंबर के कोने में आधे रास्ते में शिफ्ट करें।
  2. एक ग्लास पाश्चर पिपेट में पूरक विच्छेदन माध्यम के ~ 100 माइक्रोन की मदद से, स्लाइड से एक्सप्लांट को ठीक करें और 64-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: इस चरण के साथ शुरुआत, सभी समाधान प्रतिस्थापन निश्चित नमूनों के लिए एक अलग ग्लास पिपेट के साथ एक विच्छेदन गुंजाइश के तहत किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करेगा कि कुओं में एक्सप्लांट ऊतकों को खोना या उन्हें बीच में स्थानांतरित नहीं करना होगा।
  3. सभी एक्सप्लांट्स को स्थानांतरित करने के बाद, एक-एक करके कुओं से अत्यधिक माध्यम को चूस लें और पीबीएस (पीएफए) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 100 माइक्रोन को प्रत्येक कुएं में डाल दें।
    सावधानी: पीएफए कैंसरजनक प्रभावों के साथ एक विषाक्त समाधान है। हैंडलिंग करते समय उचित पीपीई का उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. एक शेखर पर 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक 64-अच्छी तरह से प्लेट में एक्सप्लांट ठीक करें।
    1. ऊतक एक्सप्लांट पूरे भ्रूण की तुलना में विकृतियों के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं। शेकर की गति को तदनुसार समायोजित करें।
  5. तीन बार पीबीएस-टीडब्ल्यू (पीबीएस में 0.1% Tween20) के 150 माइक्रोन के साथ फिक्सेटिव को धोएं। एक विशिष्ट "पीएफए अपशिष्ट" कंटेनर में पहला धोने लीजिए।
  6. 100% मेथनॉल (MeOH) के साथ हर बार समाधान के ~ 40 माइक्रोन की जगह 4×5 मिनट चरणों में निर्जलित एक्सप्लांट्स।
    सावधानी: MeOH एक विषाक्त रसायन है जो अस्थिर और ज्वलनशील है। एक अच्छी तरह से हवादार अंतरिक्ष में काम करें और हैंडलिंग के लिए उचित पीपीई का उपयोग करें।
  7. निर्जलीकरण के अंतिम चरण के रूप में, कुओं से सभी समाधान निकालें और MeOH के 100 माइक्रोन के साथ बदलें। 15 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: चरण 5.11 तक समाधान एकत्र करने के लिए एक विशिष्ट "MeOH अपशिष्ट" कंटेनर का उपयोग करें।
  8. MeOH के 50 माइक्रोन जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिला।
  9. पीबीएस-टी (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-एक्स 100) के साथ हर बार ~ 40 माइक्रोन समाधान की जगह 4×5 मिनट चरणों में रिहाइड्रेट एक्सप्लांट्स।) समाधान एकत्र करने के लिए एक विशिष्ट "MeOH अपशिष्ट" कंटेनर का उपयोग करें।
  10. रिहाइड्रेशन के अंतिम चरण के रूप में, कुओं से सभी समाधान निकालें और पीबीएस-टी के 100 माइक्रोल के साथ बदलें।
  11. ऊतक पारमेबिलाइजेशन के लिए शेकर पर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए पीबीएस में 1.5% ट्राइटन-एक्स 100 के साथ एक्सप्लांट्स का इलाज करें।
  12. 150 mm NaCl 100 m maleic एसिड बफर पीएच 7.5) ×3.5 मिनट में एमएबी-डी-टी (0.1% ट्राइटन-एक्स 100 डिटर्जेंट और 1% डिमेथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ नमूने धोएं।
    सावधानी: डीएमएसओ ज्वलनशील और विषैला म्यूटेन है। हैंडलिंग करते समय उचित पीपीई का उपयोग किया जाना चाहिए।
  13. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 100 μL/अच्छी तरह से सीरम अवरुद्ध समाधान (MAB-D-T में 2% भ्रूण गोजातीय सीरम) में इनक्यूबेट explants ।
  14. सीरम ब्लॉक में पीपीईआरके के खिलाफ मोनोक्लोनल माउस एंटीबॉडी के 1:1000 कमजोर पड़ने के साथ सभी अवरुद्ध समाधान को बदलें। इनक्यूबेट नमूने ओ/एन (>16 एच) शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
  15. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को एमएबी-डी-टी 5×5 मिनट के साथ धोएं।
  16. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में इनक्यूबेट नमूने (एलेक्सा फ्लोर 597 बकरी विरोधी माउस IgG2b (1:200) और Hoechst 33342 (1:5000) MAB-D-T में) O/N एक शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए।
    नोट: इस कदम से शुरू, माध्यमिक एंटीबॉडी इलाज नमूनों के प्रकाश जोखिम से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ६४ अच्छी तरह से थाली को कवर ।
    सावधानी: Hoechst 33342 एक संभावित कैंसरकारक है। हैंडलिंग करते समय उचित पीपीई का उपयोग किया जाना चाहिए।
  17. पीबीएस-टीडब्ल्यू 3×5 मिनट के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान धोएं।
  18. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीएफए के साथ नमूने ठीक करें।
  19. पीबीएस-टीडब्ल्यू के साथ फिक्स्ड को धोएं और 60% ग्लिसरोल के भीतर नमूनों को बराबर करें। नेल पॉलिश और इमेजिंग के लिए 60% ग्लाइसरोल के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट एक्सप्लांट्स। प्रतिनिधि इम्यूनोस्टेपिंग परिणामों के लिए कृपया चित्र 3देखें ।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल लाइव जेब्राफिश पूंछ के पौधों की फ्लैट ज्यामितीय खेती को सक्षम बनाता है। ऊतक संस्कृति पूरे भ्रूण पर तीन प्रमुख फायदे प्रस्तुत करता है: 1) धुरी विस्तार गति का नियंत्रण, 2) सरल विच्छेदन द्वारा विभिन्न सिग्नलिंग (मॉर्फोजेन) स्रोतों पर नियंत्रण, और 3) निकट उद्देश्य, उच्च आवर्धन और उच्च एनए लाइव इमेजिंग।

रासायनिक रूप से अनुपचारित स्लाइड कक्षों पूंछ explant के नीचे ऊतक के चारों ओर त्वचा ectoderm लपेटन द्वारा अपनी प्रमुख धुरी(चित्रा 2A)बढ़ाना करने के लिए अनुमति देते हैं । जब हमने रासायनिक रूप से सक्रिय स्लाइड कक्षों (टाइप आई कोलेजन के साथ) पर एक्सप्लांट को सुसंस्कृत किया, तो त्वचा ectoderm फैला और स्लाइड कक्ष का पालन किया, जिसने एक्सप्लांट के अक्ष विस्तार को रोक दिया। इसके बावजूद, सोमाइट्स ने(चित्रा 2B,पूरक फिल्में S1 और S2)को खंडित करना जारी रखा । जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है, बढ़ते प्रक्रिया के दौरान शारीरिक दबाव लागू करके या एक धीमा स्लाइड कक्ष में बढ़ते एक्सप्लांट द्वारा एक्सिस विस्तार को भी सीधे रोका जा सकता है। इस तरह के भौतिक संयम के तहत अक्ष विस्तार गति का मात्राकरण हमारे पहले प्रकाशित कार्य5में पाया जा सकता है ।

Figure 2
चित्र 2:एक्सप्लांट्स में एक्सिस विस्तार का नियंत्रण। (ए)एक नियमित स्लाइड चैंबर (बाएं) पर सुसंस्कृत एक्सप्लांट्स के रूप में वे नए somites विभाजन रखने के लिए । संचारित प्रकाश (बाएं, ग्रेस्केल) और ट्रांसजेनिक परमाणु मार्कर (दाएं, लाल) स्नैपशॉट संस्कृति अवधि के 2 घंटे के लिए दिखाए जाते हैं। (ख)रासायनिक रूप से टाइप I कोलेजन के साथ स्लाइड चैंबर को सक्रिय करने से पहले अक्षीय विस्तार स्टालों को ̈लगिंग लेकिन सोमाइट विभाजन गति को प्रभावित नहीं करता है । स्केल बार 100 माइक्रोन है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

दूसरे, विस्तार को मॉर्फोजन के स्रोतों को विच्छेदन करके सुसंस्कृत किया जा सकता है ताकि वे विकासात्मक प्रक्रियाओं के लिए प्रदान की जाने वाली शिक्षाप्रद जानकारी की पहचान कर सकें। यहां हम पीपीईआरके सिग्नलिंग स्तर(चित्र 3)पर विच्छेदन के प्रभाव को दिखाने वाली तीन अनुकरणीय छवियां पेश करते हैं। पीएसएम ऊतक में एक एफजीएफ सिग्नलिंग ढाल पीछे से पूर्वकाल तक स्थापित किया जाता है (पीपीईआरके स्तर से पढ़ें)। केवल पूंछ कली ऊतक सक्रिय रूप से fgf86 टाइप करता है और एफजीएफ लिगांड डिफ्यूजिटी5की मदद से इस ढाल के लिए एक स्रोत बनाता है । विच्छेदन(चित्रा 3C)के बाद ऊतक के पूंछ कली भाग को याद करने वाले पूंछ के पौधों के परिणामस्वरूप एक छोटा पीपेआरके ढाल(चित्रा 3B,3D) होताहै। विरोध करते हुए, पीएसएम और पृष्ठीय तंत्रिका ऊतक दोनों में पूर्वकाल से पीछे तक एक रेटिनोइक एसिड ढाल स्थापित किया जाता है। हाल ही में सोमाइट्स का गठन किया और पीएसएम एक्सप्रेस रेटिनोइक एसिड (आरए) के पूर्ववर्ती छोर एंजाइमों को संश्लेषित करने और आरए ढाल7के लिए एक स्रोत के रूप में कार्य करते हैं । जब हमने एक्सप्लांट्स(चित्रा 3E)में पूर्वकाल पीएसएम ऊतक को विच्छेदित किया, तो हमने अभी भी इम्यूनोदाता द्वारा कल्पना के रूप में पीपीईआरके ढाल(चित्रा 3F)की एक सामान्य सीमा देखी। एक्सप्लांट विधि की इस ताकत का विस्तृत उपयोग हमारे हालिया अध्ययन5में पाया जा सकता है ।

तीसरा, फ्लैट-माउंटेड जेब्राफिश एक्सप्लांट ऊतक मॉर्फोजेनेसिस के उच्च रिज़ॉल्यूशन लाइव अवलोकन के लिए इष्टतम हैं। यहां हम एक फिल्म(वीडियो 4)एक ट्रांसजेनिक एक सेल झिल्ली मार्कर (लाल के साथ झूठा रंग) के रूप में EGFP व्यक्त और एक दूर लाल सेल नाभिक मार्कर (सियान के साथ झूठा रंग) के साथ दाग के साथ लिया एक ट्रांसजेनिक एक्सप्लांट के साथ लिया प्रस्तुत करते हैं । आगे मात्राकरण के बिना, कई प्रक्रियाओं जैसे कि पूंछ की कली में न्यूरोमेसोडरमल प्रोजेनिटर का प्रवेश, पूर्वकाल की तुलना में पीछे पीएसएम कोशिकाओं की उच्च गतिशीलता, और सोमिटिक सीमा कोशिकाओं का अधिधिकरण सीधे फिल्म में देखा जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3:टेल एक्सप्लांट्स का इम्यूनोस्टेटिंग। (ए)पूर्ण पीएसएम एक नियंत्रण के रूप में पीएसएम के साथ अक्षुण्ण सिग्नलिंग ग्रेडिएंट के साथ पौधों को हटाता है। (ख)इम्यूनोस्टेपिंग के साथ पूर्ण पीएसएम एक्सप्लांट में नियमित पीपेआरके ढाल मनाया जाता है। (ग)पूंछ कली विच्छेदित एक्सप्लांट्स पीछे के एफजीएफ सिग्नलिंग स्रोत का एक प्रमुख हिस्सा गायब हैं। (घ)पूंछ कली विच्छेदित एक्सप्लांट्स में बहुत पीछे से प्रतिबंधित पीपेआरके सिग्नल मनाया जाता है । (ई)पूर्वकाल पीएसएम और सोमिटिक ऊतक को आरए सिग्नलिंग जैसे संभावित पूर्वकाल पीएसएम सिग्नलिंग कारकों के लिए स्रोतों को हटाने के लिए विच्छेदित किया जा सकता है। (एफ)पूर्ववर्ती पीएसएम हटाने से पीपीईआरके ढाल की सामान्य सीमा में कोई परिवर्तन नहीं होता है। इम्यूनोदाता प्रोटोकॉल के लिए एक्सप्लांटिंग के बाद ऊतकों को 2 घंटे तय किया गया था। स्केल बार 100 माइक्रोन है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1: 3डी एक्सप्लांट्स में एक्सिस विस्तार और सोमाइट सेगमेंटेशन। वाइडफील्ड प्रेषित प्रकाश (ऊपर) और परमाणु स्थानीयकृत जीएफपी (झूठे रंग का लाल) एपिफ्लोरेसेंस (नीचे) नियमित स्लाइड चैंबर फ्लैट-माउंटेड एक्सप्लांट की समय चूक छवियां। पूंछ ऊतक 13 somites चरण में भ्रूण से लगाया गया था । छवि अधिग्रहण 3 मिनट फ्रेम अंतराल के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर किया जाता है। स्केल बार 100 माइक्रोन है. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.

फिल्म 2: रासायनिक रूप से सक्रिय स्लाइड चैंबर पर रुकी धुरी विस्तार । वाइडफील्ड प्रेषित प्रकाश (ऊपर) और परमाणु स्थानीयकृत जीएफपी (झूठे रंग का लाल) एपिफ्लोरेसेंस (नीचे) फ्लैट-घुड़सवार एक्सप्लांट की समय चूक छवियां। एक 11 somites मंच भ्रूण एक्सप्लांट एक स्लाइड चैंबर पर घुड़सवार था 30 मिनट के लिए चूहा पूंछ कोलेजन समाधान के साथ लेपित से पहले । छवि अधिग्रहण 3 मिनट फ्रेम अंतराल के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर किया जाता है। स्केल बार 100 माइक्रोन है. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.

फिल्म 3: देर से मंच भ्रूण Explants के पार्श्व बढ़ते । वाइडफील्ड प्रेषित प्रकाश (बाएं) और परमाणु स्थानीयकृत जीएफपी (झूठे रंग का लाल) epifluorescence (दाएं) समय चूक छवियों के एक नियमित स्लाइड चैंबर पार्श्व घुड़सवार एक्सप्लांट । पूंछ ऊतक 15 somites चरण में भ्रूण से लगाया गया था और ट्राइकेन समाधान एनेस्थेटिक्स के रूप में इस्तेमाल किया गया था । छवि अधिग्रहण 3 मिनट फ्रेम अंतराल के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर किया जाता है। स्केल बार 100 माइक्रोन है. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.

फिल्म 4: टेल एक्सप्लांट्स की सिंगल सेल रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग। झिल्ली मार्कर (झूठे रंग का लाल) और लाइव (झूठे रंग का सियान) में नाभिक के लिए अभी तक लाल दाग के रूप में EGFP व्यक्त एक explant के समय चूक कॉन्फोकल इमेजिंग । 5 जेड-लेयर (10 माइक्रोन) से औसत तीव्रता प्रक्षेपण 1 घंटे से अधिक फिल्म में दिखाया गया है । छवि अधिग्रहण 4 मिनट फ्रेम अंतराल के साथ 40× एपोक्रोमेटिक λS डीआईसी-पानी विसर्जन 1.15 एनए ऑब्जेक्टिव लेंस के साथ एक GaAsP डिटेक्टर उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर किया जाता है। स्केल बार 100 माइक्रोन है. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

यह लेख एक ऊतक संस्कृति एक्सप्लांट तकनीक का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसे हमने हाल ही में जेब्राफिश भ्रूण के लिएविकसित और उपयोग किया है। हमारी तकनीक लड़की 8 और जेब्राफिश9,10, 11मॉडल जीवों में पिछले एक्सप्लांट विधियों परबनाता है। इस प्रोटोकॉल के साथ तैयार पूंछ के एक्सप्लांट एक साधारण स्लाइड कक्ष में >12 घंटे तक जीवित रह सकते हैं, जो सोमितोजनेसिस के अंत तक अपने प्रमुख शरीर की धुरी और खंडित सोमाइट्स को बढ़ाना जारी रखते हैं।

ऊतक को स्वस्थ रखने और लंबी अवधि के लिए सफलतापूर्वक विस्तारित रखने के लिए देखभाल दी जानी चाहिए। सबसे पहले, ऊतक एक्सप्लांट को पीछे के ऊतकों की बरकरारता को नुकसान पहुंचाए बिना विच्छेदित किया जाना चाहिए। हमने देखा कि त्वचा की कोशिकाएं न्यूरोमेसोडरमल प्रोजेनिटर कोशिकाओं के पीछे की टेलबड में प्रवेश करने के लिए एक थैली प्रदान कर रही हैं। यदि एक्सप्लांट की त्वचा इन अत्यधिक मोटिवल कोशिकाओं से खुली हो जाती है, तो टेलबड ऊतक छोड़ दें और ऊतक सीमा से परे कवरस्लिप पर पीछे से माइग्रेट करें। दूसरा, त्वचा के ऊतकों के ध्यान में असंतुलित तनाव के परिणामस्वरूप अलग-अलग अक्ष विस्तार हो सकता है, जो पीएसएम और नोटोकोर्ड की धुरी को मोड़ सकता है। एक्सप्लांट के दोनों किनारों पर फ्लैंकिंग त्वचा कोशिकाओं के लिए बनाया गया एक छोटा भट्ठा कट उस चिंता को कम करने में मदद करता है। त्वचा-प्रासंगिक चिंताओं के अलावा, लंबी अवधि की संस्कृतियों के लिए विकास मीडिया और विच्छेदन उपकरणों की बंध्यता को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त ध्यान दिया जाना चाहिए।

उचित देखभाल के साथ, एक्सप्लांट संस्कृति पूरे भ्रूण के स्वस्थ विकास को पुनः रीकैपिटुलेट करती है। हमने 20 सोमाइट्स स्टेज से शुरू होने वाले एक्सप्लांट्स में मांसपेशियों के झटकों को देखा जैसे पूरे भ्रूण12में । यद्यपि हमने सोमाइट सेगमेंटेशन के अध्ययन के लिए पीएसएम ऊतक पर ध्यान केंद्रित किया, त्वचा ectoderm, तंत्रिका कील (बाद में तंत्रिका रॉड और तंत्रिका ट्यूब), नोटोकॉर्ड, मध्यवर्ती और पार्श्व प्लेट मेसोडर्म जैसे आसन्न ऊतक भी वर्णित संस्कृति स्थितियों(चित्रा 1B)के तहत बरकरार रहते हैं। यह विशेष रूप से जर्दी द्वारा अस्पष्ट ऊतकों के लिए लाभप्रद है जिसे वेंट्रैल घुड़सवार एक्सप्लांट्स में उच्च रिज़ॉल्यूशन में इमेज किया जा सकता है, जैसे नोटोकॉर्ड, कुफर की वेसिकल और अन्य ऊतक विभाजन चरणों में विकसित हो रहे हैं12। इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि एक्सप्लांट प्रणाली पूरे भ्रूण के रूप में तेजी से विकसित नहीं होती है, और पूरे भ्रूण के समान गति से सोमाइट्स को खंडित नहीं करती है। एक्सप्लांट सिस्टम के लिए यह सीमा यहां अनुप्रेरित अन्य घटनाओं की लौकिक गतिशीलता को भी बदल सकती है।

यहां, हमने प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जो पूरे भ्रूण प्रयोगों पर पूंछ एक्सप्लांट प्रणाली के तीन प्रमुख फायदों को उजागर करते हैं। हमने हाल ही में इस विधि का उपयोग सोमाइट सेगमेंटेशन5के लिए मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट्स से अक्ष विस्तार की शिक्षाप्रद भूमिकाओं को सुलझाने के लिए किया था। प्रकाश पत्रक माइक्रोस्कोपी में देर से प्रगति ने कई मॉडल जीवों के लिए पूरे भ्रूण लाइव इमेजिंग कोसंभव बना दिया है। लेकिन इन तरीकों के अधिकांश अभी भी उचित उपकोशिकीय संकल्प की कमी है और व्यापक अनुसंधान समुदाय के लिए मुश्किल से सुलभ हैं । यहां वर्णित टेल एक्सप्लांट मॉडल उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन टिश्यू-लेवल लाइव इमेजिंग को सरल उल्टे या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ सुलभ बनाता है। पद्धतिगत फायदों के अलावा, इस तरह के लाइव इमेजिंग पीछे कशेरुकी शरीर धुरी के विभाजन पर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । प्रोटोकॉल को यथासंभव प्रत्यक्ष और सुलभ रखते हुए, एक्सप्लांट प्रणाली व्यापक जेब्राफिश विकासात्मक जीव विज्ञान क्षेत्र को भी लाभ पहुंचा सकती है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है और हितों के कोई संघर्ष की घोषणा की ।

Acknowledgments

हम मछली के रखरखाव के लिए AECOM ज़ेब्राफ़िश कोर सुविधा और सिनसिनाटी बच्चों की पशु चिकित्सा सेवाओं, तकनीकी सहायता के लिए सिनसिनाटी बच्चों की इमेजिंग कोर, वीडियो उत्पादन के साथ सहायता के लिए दीदार सप्रोव और पांडुलिपि संपादन के लिए हन्ना सीवॉल का शुक्रिया अदा करते हैं । इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या R35GM140805 से ई.M.Ö के तहत समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Co. REF 309597 for dechorionating embryos and manipulations
200 Proof Ethanol, Anhydrous Decon Labs 2701 for immunostaining
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955 for tissue dissection media
Calcium Chloride Anhydrous, Powder Sigma-Aldrich 499609 for tissue dissection media
Dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich D5879 for immunostaining
Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel Integra-Miltex MIL4-411 for preparing tape slide wells
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich 886-86-2 (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher A3160601 additional for tissue culture media
Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 Invitrogen Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 secondary antibody for immunostaining
L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red GIBCO 21083-027 for tissue dissection media
Methanol Sigma-Aldrich 179337 for immunostaining
Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade Surgical Specialties 72-2863 for tissue dissection
Mouse monoclonal anti-ppERK Sigma-Aldrich Cat#M8159; RRID:AB_477245 for ppERK immunostaining
NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent Invitrogen R37106 (optional) for live staining of cell nuclei
Paraformaldehyde Powder, 95% Sigma-Aldrich 158127 for fixation of samples for immunostaining
Rat Tail Collagen Coating Solution Sigma-Aldrich 122-20 (optional) for chemically activating slide chambers
Stage Top Incubator Tokai Hit tokai-hit-stxg (optional) for temperature control during live imaging
Transparent Tape 3/4'' Scotch S-9782 for preparing tape slide wells
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 for immunostaining
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 for immunostaining
Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) Campbell et al., 2015 ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 transgenic fish with nuclear localized EGFP
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) Cooper et al., 2005 ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 transgenic fish with cell membrane localized EGFP

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 172 विभाजन सोमाइट्स जेब्राफिश कशेरुकी ऊतक संस्कृति लाइव इमेजिंग एक्सप्लांट एक्सिस विस्तार इम्यूनोस्टेपिंग
ज़ेब्राफ़िश में कशेरुकी विभाजन का अध्ययन करने के लिए एक 3-डी टेल एक्सप्लांट संस्कृति
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Simsek, M. F., Özbudak, E. M. A … More

Simsek, M. F., Özbudak, E. M. A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish. J. Vis. Exp. (172), e61981, doi:10.3791/61981 (2021).

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