En 3D Tail Explant Culture för att studera ryggradsdjur segmentering i zebrafisk

Summary

Här presenterar vi protokollet för 3D-vävnadskulturen i zebrafiskens bakre kroppsaxel, vilket möjliggör levande studier av ryggradsdjur segmentering. Denna explant modell ger kontroll över axeln förlängning, förändring av morfogen källor och subcellulära upplösning vävnad nivå levande imaging.

Abstract

Ryggradsdjursembryon mönstrar sin stora kroppsaxel som repetitiva somiter, prekursorerna för ryggkotor, muskler och hud. Somiter gradvis segmenterar från den presomitic mesodermen (PSM) som svanen avslutar av embryot för långsträckter posteriorly. Somiter bildas med regelbunden periodicitet och skala i storlek. Zebrafisk är en populär modellorganism eftersom den är genetiskt kanterbar och har genomskinliga embryon som möjliggör levande avbildning. Ändå, under somitogenesis, är fiskembryon lindade runt en stor, avrundande äggula. Denna geometri begränsar levande avbildning av PSM-vävnad i zebrafiskembryon, särskilt vid högre upplösningar som kräver ett nära objektivt arbetsavstånd. Här presenterar vi en tillplattad 3D-vävnadskulturmetod för levande avbildning av zebrafisksvansexplanter. Svans explanter efterlikna intakta embryon genom att visa en proportionell avmattning av axeln förlängning och förkortning av rostrocaudal somite längder. Vi kan ytterligare stoppa axelförlängningshastigheten genom explantkulturen. Detta gör det för första gången möjligt för oss att reda ut den kemiska ingången till signalgradienter från den mekanistiska ingången till axiell förlängning. I framtida studier kan denna metod kombineras med en mikrofluidisk inställning för att möjliggöra tidskontrollerade farmaceutiska problem eller screening av ryggradsdjur segmentering utan några läkemedel penetration problem.

Introduction

Metameric segmentering av organismer används ofta i naturen. Upprepade strukturer är viktiga för funktionaliteten hos laterala organ som ryggkotor, muskler, nerver, kärl, lemmar eller löv i en kroppsplan¹. Som ett resultat av sådana fysiologiska och geometriska begränsningar av axiell symmetri, de flesta phyla av Bilateria-såsom annelider, leddjur och ackord-utställning segmentering av deras embryonala vävnader (t.ex. ectoderm, mesoderm) antero-posteriorly.

Ryggradsdjursembryon segmenterar sekventiellt sin paraxiala mesoderm längs den stora kroppsaxeln till somiter med artspecifika intervall, antal och storleksfördelningar. Trots sådan robusthet bland enskilda embryon inom en art är somitsegmentering mångsidig mellan ryggradsdjur. Segmentering sker i en stor regim av tidsintervall (från 25 min i zebrafisk till 5 h hos människor), storlekar (från ~ 20 μm i svans somiter av zebrafisk till ~ 200 μm i stam somiter av möss) och räknas (från 32 i zebrafisk till ~ 300 i majsormar)². Mer intressant är att fiskembryon kan utvecklas i ett brett spektrum av temperaturer (från ~ 20,5 ° C upp till 34 ° C för zebrafisk) samtidigt som de håller sina somiter intakta med rätt storleksfördelningar genom att kompensera för både segmenteringsintervall och axiella förlängningshastigheter. Utöver sådana intressanta egenskaper stannar zebrafisk som en användbar modellorganism för att studera segmentering i ryggradsdjur på grund av den externa, synkrona och transparenta utvecklingen av en plenitude av syskonembryon samt deras tillgängliga genetiska verktyg. Ur ett mikroskopiskt perspektiv utvecklas teleostembryon på en skrymmande sfärisk äggula, som sträcker och rundar den gastrulerande vävnaden runt den (figur 1A). I den här artikeln presenterar vi en tillplattad 3D-vävnad explant kultur för zebrafisk svansar. Detta explantsystem kringgår de sfäriska begränsningarna av äggula massa, vilket ger tillgång till högupplöst levande avbildning av fisk embryon för somite mönstring.

Figur 1:Slide Chamber Explant System for Zebrafish Embryos. (A) Zebrafiskembryon har fördelar för levande avbildning, såsom insyn i gastrulaterande embryonal vävnad (blå), men vävnaden bildas runt en skrymmande sfärisk äggulamassa (gul) som förhindrar nära objektiv, högupplöst avbildning i intakta embryon. Svans explanter kan dissekeras börjar med en mikrokirurgisk kniv (brun) skuren från vävnaden främre av somiter (röd) och fortsätter vid gränsen till äggulan bakre. B)Dissekerade svansexplanter kan placeras på ett täckglas (ljusblått) dorsoventrally. hålla neural vävnad (ljusgrå) på toppen och notochord (mörkgrå) längst ner. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Protocol

Detta protokoll omfattar användning av levande ryggradsdjur embryon yngre än 1 dag efter befruktning. Alla djurförsök utfördes enligt de etiska riktlinjerna från Cincinnati Children's Hospital Medical Center; djurprotokollen granskades och godkändes av den institutionella kommittén för djurs vård och användning (protokoll nr 2017–20048).

1. Insamling av embryon

1. Ställ in par zebrafiskar i korsningstankar natten före embryosamlingsdagen. För exakt iscensättningskontroll av embryoutveckling, använd barriärer mellan parningspar.
2. Höj barriärer före föredragen gyttid och samla ägg inom 15 minuter i en 100 mm Petri-skål.
   1. Rena skräp från Petri-skålen. Om mer än 50 embryon samlas in från en enda koppling, dela kopplingen i flera Petri-rätter i enlighet därmed.
3. Inkubera embryon i fisksystemets vatten vid 28 °C tills de når 50 % epibolystadium (5 timmar efter befruktning). Ett standardiserat embryotillväxtmedium som E3 kan också användas istället för akvariesystemets vatten fram till steg 3.2.
   1. Ta bort obefruktade ägg under ett stereoscope och flytta embryona till en inkubator på 23,5 °C över natten (O/N). Embryon ska vara på 8-10 somiter scenen morgonen efter insamlingsdagen.

2. Verktygsberedning

1. Sterilisera mikrokirurgiknivbladet, nålspetsarna (som används för dissekering av vävnaden) och glaspastagetten Pasteur genom att blötlägga i 100% etanol (EtOH) och brandglas.
2. Använd två lager genomskinlig tejp (~100-120 μm tjocklek) på 25 mm x 75 mm mikroskoprutschbanor. Skär ~18 mm x 18 mm kvadratiska brunnar i mitten av varje diaus tejpbeläggning med en skalpell.
   1. Torka av de förberedda skjutkamrarna med 70 % EtOH. Dessa brunnar kommer att rymma ~ 40 μL medium.

3. Provberedning

1. Dechorionate embryon med spetsen av två nål sprutor under ett stereoscope. Överför embryon till en separat petriskål med fisksystemvatten för att skölja.
2. Använd en eldglasad steril glas Pasteurpipett, överför embryon i en 6 cm Petri-maträtt som innehåller dissekeringsmedium (Leibovitz-15 cellkulturmedium med L-glutamin utan fenolrött, 0,8 mM CaCl₂ och 1× antibiotisk antimykotisk lösning).
   OBS: Fortsätt att använda en steriliserad glaspipett för alla överföringar enligt detta steg.
   1. Använd en petriskål i glas för explantering för att undvika polystyrenflis under dissekering.
3. Lägg 50 μL vävnadstillväxtmedium (dissekeringsmedium och 10 % FBS) i skjutkammaren.
4. Stabilisera ett embryo för dissekering under stereoskopet med en nålspets vid äggula-vävnadskorsningen nära bakhjärnan.
5. Håll den embryonala vävnaden stabil med en nål, använd den mikrokirurgiska kniven med bladet som hålls vid 45° för att skära vävnaden främre till bakhjärnan isär och skala äggulan från den embryonala vävnaden från den främre och rör sig mot svansknoppen (Figur 1A).
   OBS: Var noga med att inte förlora hudvävnaden när du rengör äggulan. Huden skulle lätt skalas av som en flankerande enskikts elastisk vävnad runt embryot under dissekeringen, så det är lätt att känna igen.
6. När äggulan är helt borttagen från den embryonala kroppen, skär den flankerande hudvävnaden från svanssäcken. Håll den senast bildade 3-4 somiterna intakt, skär ut den mer främre vävnaden (fullaxel explant).
   1. Äggulan bör huvudsakligen lossna intakt från denna procedur. Vid en brusten äggula kan betydande korn av äggula förbli fäst vid vävnadens ventrala yta. Om så är möjligt, använd ett surrverktyg för att rengöra återstående äggulagranulat försiktigt.
      OBS: En obalans av hudvävnader på sidorna av en explant skulle inte tillåta vävnaden att upprätthålla en rak tillväxtriktning. Explanten böjer sig istället mot sidan av mer sträckt hud. Denna obalans kan korrigeras under stereoskopet genom att bryta hudskiktet med hjälp av mikrokirurgisk kniv.
   2. För hudlösa explanter, tryck på en spets av hudskiktet med nål och skala av vävnaden explant med den mikrokirurgiska kniven. Dessa explanter kommer inte att förlänga sin kroppsaxel i kulturen.
   3. Förutom de fulla axelexplanterna kan alternativa explanter göras i detta steg. Dissekera till exempel redan segmenterade somiter med hjälp av den mikrokirurgiska kniven (full-PSM explants) eller dissekera PSM i sin halv anteroposterior (halv-PSM explants). Se avsnitt 5.1 för tillämpning av sådana alternativa explanter.
7. Överför omedelbart den dissekerade explanten till ett 22 mm x 22 mm täckglas på vilket avbildningen kommer att utföras.
   1. Ordna explantplanet på dorsoventralaxeln, ventral sida som vidrör täcket (Figur 1B). Ta försiktigt bort överflödiga medier runt vävnadsexplantan med en 20 μL filtrerad spetspipett.
      OBS: Fördröjd överföring av dissekerade explanter till täckglaset resulterar i deformationer av vävnaden, eftersom den lindras från äggulans geometriska begränsningar.
8. Vänd snabbt och försiktigt täcket med explanten över den tillväxtmediet fyllda skjutkammaren.
   1. För att förhindra bubbelbildning, placera en sida av det fyrkantiga täcket på tejpkammaren och släpp den andra sidan försiktigt. Var noga med att inte flytta/deformera explanten i det här steget.
   2. Avlägsna försiktigt överflödiga medier som blöder ut ur kammaren genom att trycka på skjutkammaren på en laboratorievävnad. Täcket sitter stabilt på skjutkammaren för levande avbildning på grund av ytspänningen i det flytande mediet utan tätning.
   3. För långsiktig odling (>6 timmar), använd en större kammare. 22 mm x 50 mm rektangulära täcken tillsammans med två parallella körfält av bandskikt på diabilder kan användas i sådana fall. Ett ~1 mm brett mellanrum kan lämnas mellan två tejpbanor för att underlätta lufttillgången till tillväxtmediet.
9. Upprepa steg 3.3-3.8 för att förbereda fler explanter. Förberedda explanter försträcker sin A-P-kroppsaxel med en hastighet av ~30 μm/h och segmenterar deras somiter med ~40 min intervall vid 25 °C (Figur 2A, Video 1).
   1. För icke-långsträckta explanter, applicera försiktigt tryck på sidorna av diabilden som håller provet i steg 3.8.2 medan du suger ut överflödiga medier på en laboratorievävnad. Alternativt kan explanter odlas i enbandslagers skjutkammare. Att kemiskt aktivera glidkammarens yta med typ I-kollagen resulterar också i icke-långsträckta explanter(figur 2B,video 2).
      1. Utför beläggning av kammaren med typ I-kollagen i förväg genom att helt täcka skjutkamrarna med 15-20 ml förförd kollagenlösning vid rumstemperatur i 1 timme. Använd en laminär flödeshuv för detta protokoll för att bibehålla steriliteten. Skölj försiktigt kamrarna med dissekeringsmedium i slutet.
   2. För embryon äldre än 15 somitsteg, montera svans explant vävnaden i senareled istället för en platt (dorsoventral) fäste (Video 3). För att förhindra muskelryckningar, inkludera 0,004% trikainlösning i kulturmedierna som bedövningsmedel³.

4. Live bildförvärv

1. Bildprover antingen på ett dissekeringsområde för bredfältsöverförd ljusavbildning av somitsegmenteringsstorlekar och perioder, eller med strukturerad belysning/konfokal/ljusplåtsmikroskopi med hjälp av transgena reporterfisklinjer.
2. Balansera temperaturen på vävnadsexplanter med avbildningsrummets temperatur i minst 15 minuter.
   1. För mer exakt temperaturreglering, använd ett kommersiellt temperaturkontrollsystem monterat på ett inverterat mikroskop.
3. Ställ in bildförvärvsramintervallen till 2 - 10 min beroende på den biologiska intresseprocessen.
   OBS: Zebrafisk somitsegmentering är en snabb process som sträcker sig mellan 20 och 55 min för livskraftiga temperaturer på 30 °C till 21,5 °C i hela embryon. Explanter kommer att förlänga och segmentera ~ 30% långsammare än hela embryona.
   1. Var uppmärksam på att lämna tillräckligt med fördröjning mellan uppsättningar av kanalförvärv för att undvika eventuell fototoxicitet för levande vävnad. Utsätt inte vävnaden för excitationsstrålen under mer än hälften av avbildningstiden och sänk strålintensiteten så mycket som möjligt.
      ANM.: Ackumulering av reaktiva syrearter (ROS) är i allmänhet den främsta orsaken till fototoxicitet i levande prover⁴. Askorbinsyra som en ROS-asätare kan kompletteras till tillväxtmedium vid 4 mM koncentration för att buffra ROS-aktivitet och lindra fototoxicitet. Negativa effekter av fototoxicitet kan vara svåra att märka under live imaging. Svansexplanter är fördelaktiga i denna aspekt eftersom vissa visuella markörer för fototoxicitet såsom mitotisk arrestering, hindrad vävnadsutveckling (dvs. bildandet av somiter, svansförlängning) och sönderfallande vävnad är lättare att märka. Se den angivna referens⁴ för en detaljerad diskussion.
4. Använd RNA-injicerade embryon i en cellsteg för att förvärva 4D-bilder avsedda att segmenteras och analyseras i cellulär upplösningsnivå.
   1. Använd 300 pg RNA från transkriberade membran in vitro och nukleära fluorescerande reportermarkörplasmider såsom pCS-membrane-ceruleanFP (Addgene plasmid #53749) eller pCS-memb-mCherry (Add plasmid #53750) i kombination med pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmid #99267) eller pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmid #99271) i injektioner. En provfilm med cellmembran- och nukleimarkörer finns i Video 4.
      OBS: Genomsnittlig cellstorlek på PSM-vävnad är ca ~5 μm i diameter, varav atomkärnor omfattar ~3 - 4 μm. En pixelstorlek på ~0,5 μm och en z-sektionering på ~1 μm bör registreras för korrekt cellsegmentering.

5. Immunostaining av svans explanter

OBS: Vävnader som odlas efter olika dissekeringsscenarier (långsträckta, icke-långsträckta, svansknopp dissekerade, hälften PSM etc.) eftersom plattmonterade svansexplanter⁵ kan återvinnas från glidkammare för ytterligare immunostaining kvantifieringar av proteiner av intresse. Här presenterar vi protokollet som används för di-fosforylerad extracellulär signal reglerad kinas (ppERK) färgning av explanter som FGF signalering gradient avläsning.

1. Efter bildandet av somiter till önskat stadium, flytta försiktigt täcket halvvägs till hörnet av skjutkammaren utan att lyfta.
2. Med hjälp av ~ 100 μL extra dissekeringsmedium i en glas Pasteur-pipett, återhämta explanterna från bilden och överför till en 64-brunns cellkulturplatta.
   OBS: Från och med detta steg kan alla lösningsbyten utföras under ett dissektionsomfång med en separat glaspipett för fasta prover. Detta kommer att säkerställa att man inte förlorar explantvävnader i brunnar eller överför dem däremellan.
3. Efter överföring av alla explanter, sug ut det överdrivna mediet ur brunnarna en efter en och sätt 100 μL 4% paraformaldehyd i PBS (PFA) i varje brunn.
   VARNING: PFA är en giftig lösning med cancerframkallande effekter. Korrekt personlig skyddsutrustning bör användas vid hantering.
4. Fixera explanter i en 64-brunnsplatta vid rumstemperatur i 1 timme på en skakapparat.
   1. Vävnad explanter är känsligare för deformationer än hela embryon. Justera skakapparatens hastighet i enlighet därmed.
5. Tvätta fixeringen med 150 μL PBS-Tw (0,1% Tween20 i PBS) tre gånger. Samla den första tvätten i en specifik "PFA Waste" behållare.
6. Torka explanter i 4×5 min steg genom att ersätta ~ 40 μL lösning varje gång med 100% metanol (MeOH).
   VARNING: MeOH är en giftig kemikalie som är flyktig och brandfarlig. Arbeta i ett välventilerat utrymme och använd korrekt personlig skyddsutrustning för hantering.
7. Som det sista steget i uttorkning, ta bort all lösning från brunnar och ersätt med 100 μL MeOH. Inkubera vid -20 °C i 15 min.
   OBS: Använd en specifik "MeOH Waste"-behållare för att samla in lösningarna fram till steg 5.11.
8. Tillsätt 50 μL MeOH och skaka i rumstemperatur i 5 min.
9. Återfukta explanter i 4×5 min steg genom att ersätta ~40 μL lösning varje gång med PBS-T (0,1% Triton-X 100 i PBS). Använd en specifik "MeOH Waste"-behållare för att samla in lösningarna.
10. Som det sista steget i rehydrering, ta bort all lösning från brunnar och ersätt med 100 μL PBS-T.
11. För vävnadspermeabilisering behandla explanter med 1,5% Triton-X 100 i PBS i 20 min vid rumstemperatur på skakapparaten.
12. Tvätta prover med MAB-D-T (0,1% Triton-X 100 tvättmedel och 1% dimetylsulfoxid (DMSO) i 150 mM NaCl 100 mM maleinsyrabuffert pH 7,5) 3×5 min.
    VARNING: DMSO är brandfarligt och giftigt mutagen. Korrekt personlig skyddsutrustning bör användas vid hantering.
13. Inkubera explanter i 100 μL/brunn serumblockeringslösning (2% fetala nötkreatursserum i MAB-D-T) i 2 timmar vid rumstemperatur.
14. Ersätt all blockeringslösning med 50-100 μL/brunn primär antikroppslösning (1:1000 utspädning av monoklonal musantikropp mot ppERK i serumblock). Inkubera prover O/N (>16 h) vid 4 °C på skakapparaten.
15. Tvätta den primära antikroppslösningen med MAB-D-T 5×5 min.
16. Inkubera prover i sekundär antikroppslösning (Alexa Fluor 597 getmus IgG2b (1:200) och Hoechst 33342 (1:5000) i MAB-D-T) O/N vid 4 °C på en skakapparat eller i 3 timmar vid rumstemperatur.
    OBS: Börja i detta steg, täck 64-brunnsplattan med aluminiumfolie för att undvika ljusexponering av sekundära antikroppsbehandlade prover.
    VARNING: Hoechst 33342 är ett potentiellt cancerframkallande ämne. Korrekt personlig skyddsutrustning bör användas vid hantering.
17. Tvätta den sekundära antikroppslösningen med PBS-Tw 3×5 min.
18. Fixera proverna med PFA i 15 minuter vid rumstemperatur.
19. Tvätta fixeringen med PBS-Tw och jämviktsprover inom 60% glycerol. Montera explanter på mikroskoprutschbanor med nagellack och 60% glycerol för avbildning. Representativa immunostainingresultat finns i figur 3.

Representative Results

Detta protokoll möjliggör platt geometrisk odling av levande zebrafisk svans explanter. Vävnadskulturen har tre stora fördelar jämfört med hela embryon: 1) kontroll av axelförlängningshastighet, 2) kontroll över olika signaleringskällor (morfogen) genom enkel dissekering och 3) nära objektiv, hög förstoring och hög NA-liveavbildning.

Kemiskt obehandlade glidkammare gör det möjligt för svansexplantan att förlänga sin huvudaxel (figur 2A) genom hudens ectoderm-omslag runt vävnaden under. När vi odlade explanterna på de kemiskt aktiverade glidkamrarna (med typ I-kollagen) sträckte sig hudens ectoderm och fastnade på glidkammaren, vilket stoppade explantens axelförlängning. Trots detta fortsatte somiterna att segmentera (figur 2B,kompletterande filmer S1 och S2). Som beskrivs i protokollet kan axelförlängning också stoppas direkt genom att applicera fysiskt tryck under monteringsprocessen eller montera explanter i en grundare skjutkammare. Kvantifiering av axelförlängningshastigheten under sådana fysiska begränsningar finns i vårt tidigare publicerade arbete⁵.

Figur 2:Kontroll av axelförlängning iexplanter. (A) Explanter odlade på en vanlig skjutkammare (vänster) förlånger axiellt när de fortsätter att segmentera nya somiter. Överförda ljus (vänster, gråskala) och transgena nukleära markörer (höger, röd) visas för 2 h odlingstid. B)Kemiskt aktivering av skjutkammaren med typ I-kollagen innan odlingen stoppar den axiella förlängningen men påverkar inte somitsegmenteringshastigheten. Skalbaren är 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För det andra kan explanter odlas genom att dissekera källorna till morfiner för att identifiera lärorik information som de tillhandahåller för utvecklingsprocesser. Här presenterar vi tre exemplariska bilder som visar effekten av dissekeringar på ppERK-signalnivåer (figur 3). I PSM-vävnaden fastställs en FGF-signalgradient från bakre till främre (läses upp av ppERK-nivåer). Endast svansknoppvävnaden transkriberar aktivt fgf8⁶ och bildar en källa för denna gradient med hjälp av FGF ligand diffusivitet⁵. Svansexplanter som saknar vävnadens svansknoppsdel efter dissekering (figur 3C) resulterar i en kortare ppERK-lutning (figur 3B, 3D). Motsatt, en retinoic syra gradient är etablerad från främre till bakre i både PSM och dorsala neurala vävnad. Nyligen bildade somiter och den främre änden av PSM express retinoic acid (RA) syntetisera enzymer och fungera som en källa för RA gradient⁷. När vi dissekerade ut den främre PSM-vävnaden i explanterna (figur 3E), observerade vi fortfarande en normal utsträckning av ppERK-gradienten (Figur 3F) som visualiseras genom immunostaining. Ett detaljerat utnyttjande av denna styrka av explant metod kan hittas i vår senaste studie⁵.

För det tredje är plattmonterade zebrafiskexplanter optimala för högupplöst levande observation av vävnadsmorfogenes. Här presenterar vi en film (Video 4) tagen med en transgen explant som uttrycker EGFP som en cellmembranmarkör (falsk färgad med rött) och färgad med en långröd cellkärna markör (falsk färgad med cyan). Utan ytterligare kvantifiering kan många processer som ingression av neuromesodermala stamceller i svansknoppen, högre motilitet av bakre PSM-celler jämfört med främre och epitelialisering av somitiska gränsceller direkt observeras i filmen.

Figur 3: Immunostaining av tail explants. (A) Fullständiga PSM explanter med intakta signalgradienter längs PSM som kontroll. B)Regelbunden ppERK-gradient observeras i fulla PSM-explanter med immunostaining. (C) Tail bud dissekerade explanter saknar en stor del av bakre FGF signalering källa. D)En mycket bakre begränsad ppERK-signal observeras i svansknopp dissekerade explanter. (E) Främre PSM och somitisk vävnad kan dissekeras för att avlägsna källorna för eventuella främre PSM-signaleringsfaktorer som RA-signalering. (F) Främre PSM-borttagning ändrar inte den normala omfattningen av ppERK-lutningen. Vävnader var fasta 2 h efter explanting för immunostaining protokoll. Skalbaren är 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Film 1: Axelförlängning och somitsegmentering i 3D-explanter. Widefield överförde ljus (överst) och nukleära lokaliserade GFP (falskt färgade röda) epifluorescens (nedre) tidsfördröjningsbilder av en vanlig bildkammare plattmonterad explant. Svansvävnad explanterades från embryo på 13 somiter stadium. Bildförvärv utförs på ett inverterat mikroskop med 3 min ramintervaller. Skalbar är 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film 2: Stoppad axelförlängning på kemiskt aktiverad bildkammare. Widefield överförde ljus (överst) och kärn- lokaliserade GFP (falskt färgat rött) epifluorescens (botten) time lapse avbildar av en flat-monterad explant. En 11 somites steg embryo explant monterades på en slide kammare belagt med råtta svans kollagen lösning i 30 min innan montering. Bildförvärv utförs på ett inverterat mikroskop med 3 min ramintervaller. Skalbar är 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film 3: Sidomontering av embryoexplanter i sen fas. Widefield överfört ljus (vänster) och nukleära lokaliserade GFP (falskt färgade röda) epifluorescens (höger) tidsfördröjning bilder av en vanlig bildkammare lateral-monterad explant. Svansvävnad explanterades från embryo i 15 somites stadium och trikainlösning användes som bedövningsmedel. Bildförvärv utförs på ett inverterat mikroskop med 3 min ramintervaller. Skalbar är 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film 4: Encellsupplösningsavbildning av tail explanter. Time-lapse confocal imaging av en explant uttrycker EGFP som membran markör (falskt färgade röda) och långt röd färgas för atomkärnor i levande (falsk färgad cyan). Genomsnittlig intensitetsprojektion från 5 z-lager (10 μm) visas i filmen över 1 timme. Bildförvärv utförs på ett GaAsP-detektorinverterat konfokalt mikroskop med en 40× apochromatic λS DIC-vattensänkning 1,15 NA objektiv, med 4 minuters ramintervaller. Skalbar är 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Discussion

Denna artikel presenterar ett detaljerat protokoll av en vävnad kultur explant teknik vi utvecklat och använt nyligen⁵ för zebrafisk embryon. Vår teknik bygger på de tidigare explantmetoderna hos kyckling⁸ och zebrafisk^{9,10,11 modellorganismer.} Svans explanter som utarbetats med detta protokoll kan överleva så länge som >12 h i en enkel glidkammare, fortsätter att förlänga sin stora kroppsaxel och segmentera somiter, till slutet av somitogenesis.

Försiktighet bör ges för att hålla explantvävnaden frisk och framgångsrikt långsträckt under långa varaktigheter. Först bör vävnad explanten dissekeras utan att skada intaktheten hos de bakre vävnaderna. Vi observerade att hudcellerna ger en påse för neuromesodermala stamceller som intränger i den bakre tailbud. Om explanternas hud skalas av från dessa mycket motila celler, lämna tailbudvävnaden och migrera bakre över täcket utanför vävnadsgränserna. För det andra kan mediolateralt obalanserad spänning i hudvävnaden resultera i divergerande axelförlängning, vilket kan böja PSM: s och notokostongs axel. En kort slitsskärning gjord på de flankerande hudcellerna på båda sidor av explanten hjälper till att lindra den oron. Förutom de hudrelevanta problemen bör extra uppmärksamhet ägnas åt att upprätthålla steriliteten hos tillväxtmedierna och dissekeringsverktygen under längre tid.

Med rätt vård rekapitulerar explantkulturen den hälsosamma tillväxten av hela embryon. Vi observerade muskulösa ryckningar i explanterna från 20 somiter scenen som i hela embryon¹². Även om vi fokuserade på PSM-vävnaden för studier av somit segmentering, förblir intilliggande vävnader såsom huden ectoderm, neural köl (senare neural stång och neurala röret), notochord, mellanliggande och laterala plattan mesoderm också intakta under de beskrivna odlingsförhållandena (Figur 1B). Detta är särskilt fördelaktigt för vävnader som skyms av äggulan som kan avbildas i hög upplösning vid ventrally monterade explanter, såsom notochord, Kupffers vesikel och andra vävnader som utvecklas vid segmenteringsstadier¹². Det bör betonas att explanteringssystemet inte växer lika snabbt som hela embryon och inte segmenterar somiter i samma takt som hela embryon. Denna begränsning för explantsystemet kan också förändra temporal dynamiken i andra händelser som inte observerats här.

Här presenterade vi representativa resultat som belyser tre stora fördelar med svansexplantsystemet jämfört med hela embryoexperiment. Vi använde nyligen denna metod för att reda ut lärorika roller av axelförlängning från morfogengradienter för somitsegmentering⁵. Sena framsteg i ljusplåtmikroskopi har gjort hela embryot levande avbildning^{möjligt 13} för flera modellorganismer. Men de flesta av dessa metoder saknar fortfarande ordentlig subcellulär upplösning och är knappt tillgängliga för det bredare forskarsamhället. Svans explant modell beskrivs här gör subcellulär upplösning vävnad nivå live imaging tillgänglig med enkla inverterade eller konfokal mikroskop. Bortsett från metodologiska fördelar kan sådan levande avbildning ge insikter om segmentering av den bakre ryggradsdjurkroppsaxeln. Genom att hålla protokollet så direkt och tillgängligt som möjligt kan explantsystemet också gynna det bredare zebrafiskutvecklingsbiologiska området.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Co.	REF 309597	for dechorionating embryos and manipulations
200 Proof Ethanol, Anhydrous	Decon Labs	2701	for immunostaining
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955	for tissue dissection media
Calcium Chloride Anhydrous, Powder	Sigma-Aldrich	499609	for tissue dissection media
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	for immunostaining
Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel	Integra-Miltex	MIL4-411	for preparing tape slide wells
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	886-86-2	(optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	A3160601	additional for tissue culture media
Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594	Invitrogen	Cat#A-21145; RRID: AB_2535781	secondary antibody for immunostaining
L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red	GIBCO	21083-027	for tissue dissection media
Methanol	Sigma-Aldrich	179337	for immunostaining
Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade	Surgical Specialties	72-2863	for tissue dissection
Mouse monoclonal anti-ppERK	Sigma-Aldrich	Cat#M8159; RRID:AB_477245	for ppERK immunostaining
NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent	Invitrogen	R37106	(optional) for live staining of cell nuclei
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127	for fixation of samples for immunostaining
Rat Tail Collagen Coating Solution	Sigma-Aldrich	122-20	(optional) for chemically activating slide chambers
Stage Top Incubator	Tokai Hit	tokai-hit-stxg	(optional) for temperature control during live imaging
Transparent Tape 3/4''	Scotch	S-9782	for preparing tape slide wells
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	for immunostaining
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	for immunostaining
Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)	Campbell et al., 2015	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4	transgenic fish with nuclear localized EGFP
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)	Cooper et al., 2005	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75	transgenic fish with cell membrane localized EGFP