Summary
Здесь мы представляем протокол для 3-D культуры тканей задней оси тела рыбок данио, позволяющий изучать сегментацию позвоночных в реальном времени. Эта эксплантная модель обеспечивает контроль над удлинением оси, изменением источников морфогенов и субклеточным разрешением на тканевую визуализацию на уровне живую.
Abstract
Эмбрионы позвоночных моделируют свою основную ось тела как повторяющиеся сомиты, предшественники позвонков, мышц и кожи. Сомит прогрессивно отрезок от пресомитической мезодермы (PSM), поскольку хвостовой конец эмбриона удлиняется к заднему лонгу. Сомиты формируются с регулярной периодичностью и масштабом в размерах. Рыбка данио является популярным модельным организмом, поскольку она генетически податлива и имеет прозрачные эмбрионы, которые позволяют проводить живую визуализацию. Тем не менее, во время сомитогенеза эмбрионы рыбы оборачиваются вокруг большого, округлого желтка. Эта геометрия ограничивает живую визуализацию ткани PSM у эмбрионов рыбок данио, особенно при более высоких разрешениях, которые требуют близкого объективного рабочего расстояния. Здесь мы представляем метод сплющенной 3-D культуры тканей для живой визуализации эксплантов хвоста рыбки данио. Хвостовые экспланты имитируют интактные эмбрионы, демонстрируя пропорциональное замедление удлинения оси и укорочение ростроковых длин сомита. Кроме того, мы можем остановить скорость удлинения оси благодаря культуре эксплантата. Это впервые позволяет нам распутать химический вход сигнальных градиентов от механистического входа осевого удлинения. В будущих исследованиях этот метод может быть объединен с микрофлюидной установкой, чтобы обеспечить контролируемые по времени фармацевтические возмущения или скрининг сегментации позвоночных без каких-либо проблем с проникновением лекарств.
Introduction
Метамерная сегментация организмов широко используется в природе. Повторяющиеся структуры необходимы для функциональности боковых органов, таких как позвонки, мышцы, нервы, сосуды, конечности или листья в плане тела1. В результате таких физиологических и геометрических ограничений осевой симметрии большинство типов Bilateria, таких как кольчатые черви, членистоногие и хордовые, демонстрируют сегментацию своих эмбриональных тканей (например, эктодермы, мезодермы) с задней стороны.
Эмбрионы позвоночных последовательно сегментируют свою параксиальную мезодерму вдоль главной оси тела в сомиты с видоспецифичными интервалами, подсчетами и распределением размеров. Несмотря на такую устойчивость среди отдельных эмбрионов внутри вида, сегментация сомита универсальна между видами позвоночных. Сегментация происходит в обширном режиме временных интервалов (от 25 мин у рыбок данио до 5 ч у человека), размеров (от ~20 мкм в хвостовых сомитах рыбок данио до ~200 мкм у хоботных сомитов мышей) и подсчетов (от 32 у рыбок данио до ~300 у кукурузных змей)2. Что еще более интересно, эмбрионы рыб могут развиваться в широком диапазоне температур (от ~ 20,5 ° C до 34 ° C для рыбок данио), сохраняя при этом свои сомиты нетронутыми с правильным распределением размеров, компенсируя как интервалы сегментации, так и скорости осевого удлинения. Помимо таких интересных особенностей, рыбки данио остаются полезным модельным организмом для изучения сегментации у позвоночных из-за внешнего, синхронного и прозрачного развития обильной популяции эмбрионов братьев и сестер, а также их доступных генетических инструментов. Неблагоприятно с точки зрения микроскопии, телеостные эмбрионы развиваются на громоздком сферическом желтке, растягивая и округляя гаструлирующие ткани вокруг него(рисунок 1А). В этой статье мы представляем сплющенный 3-D тканевый эксплант культуры для хвостов рыбок данио. Эта эксплантная система обходит сферические ограничения желточной массы, позволяя получить доступ к живым изображениям эмбрионов рыб с высоким разрешением для сомит-паттерна.
Рисунок 1:Slide Chamber Explant System for Zebrafish Embryos. (A) Эмбрионы рыбок данио имеют преимущества для живой визуализации, такие как прозрачность гаструлирующей эмбриональной ткани (синий), но ткань образуется вокруг громоздкой сферической желточной массы (желтый), которая предотвращает почти объективную визуализацию с высоким разрешением у неповрежденных эмбрионов. Хвост эксплантов можно рассечь, начиная с микрохирургического ножа (коричневого), вырезанного из ткани с передней части сомитов (красного) и продолжая на границе с желтком с задней стороны. (B) Рассеченные хвостовые экспланты могут быть размещены на покровном (светло-синем) дорсовентральном; сохранение нервной ткани (светло-серого) сверху и нотохорды (темно-серого) внизу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол предполагает использование живых эмбрионов позвоночных моложе 1 дня после оплодотворения. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с этическими принципами Медицинского центра детской больницы Цинциннати; Протоколы по животным были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (Протокол No 2017-0048).
1. Сбор эмбрионов
- Установите пары рыбок данио в аквариумах для скрещивания в ночь перед днем сбора эмбрионов. Для точного контроля за постановкой развития эмбриона используйте барьеры между спаривающимися парами.
- Поднимите барьеры до предпочтительного времени нереста и соберите икру в течение 15 минут в чашку Петри 100 мм.
- Очистите мусор от чашки Петри. Если из одной кладки собрано более 50 эмбрионов, разделите кладку на несколько чашек Петри соответственно.
- Инкубировать эмбрионы в воде рыбной системы при 28 °C до тех пор, пока они не достигнут стадии эпиболии 50% (через 5 часов после оплодотворения). Стандартизированная среда роста эмбрионов, такая как E3, также может использоваться вместо воды аквариумной системы до этапа 3.2.
- Удалите неоплодотворенные яйцеклетки под стереоскопом и переместите эмбрионы в инкубатор при 23,5 °C в течение ночи (O/N). Эмбрионы должны быть на стадии 8-10 сомитов утром следующего дня сбора.
2. Подготовка инструмента
- Стерилизуйте лезвие микрохирургии, наконечники игл (используются для рассечения ткани) и стеклянную пипетку Пастера путем замачивания в 100% этаноле (EtOH) и огненной глазури.
- Используйте два слоя прозрачной ленты (толщиной ~100-120 мкм) на слайдах микроскопа 25 мм x 75 мм. Вырежьте квадратные колодцы ~18 мм х 18 мм в центре ленты каждой горки, покрывающей скальпелем.
- Протрите подготовленные скользящие камеры 70% EtOH. Эти скважины будут вмещать ~ 40 мкл среды.
3. Пробоподготовка
- Дехорионать эмбрионы используют кончиком двух игольчатых шприцев под стереоскопом. Перенесите эмбрионы в отдельную чашку Петри с рыбьей системой для промывки.
- Используя огнеупорную стерильную стеклянную пипетку Пастера, переносят эмбрионы в 6 см чашку Петри, содержащую среду для расслоения (питательная среда клеток Лейбовица-15 с L-глютамином без фенола Красного, 0,8 мМ CaCl2 и 1× антибиотико-антимикотический раствор).
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте использовать стерилизованную стеклянную пипетку для всех переносов после этого шага.- Используйте стеклянную чашку Петри для процедуры эксплантирования, чтобы избежать полистирольных чипов во время рассечения.
- Поместите 50 мкл питательной среды (среды рассечения и 10% FBS) в слайдовую камеру.
- Стабилизируют эмбрион для рассечения под стереоскопом кончиком иглы на пересечении желточной ткани вблизи задвяза.
- Сохраняя эмбриональную ткань стабильной с помощью иглы, используйте микрохирургический нож с лезвием, удерживаемым под 45°, чтобы разрезать ткань, переднюю к задней части мозга, и отклеить желток от эмбриональной ткани, начиная с передней и двигаясь к хвостовой почке(рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не потерять ткани кожи во время очистки желтка. Кожа будет легко отслаиваться как фланкинговая однослойная эластичная ткань вокруг эмбриона во время рассечения, поэтому ее легко распознать. - Как только желток будет полностью удален из эмбрионального тела, отрежьте фланкирующую кожную ткань от хвостового бутончика. Сохраняя последние образовавшуюся 3-4 сомита неповрежденными, вырезают более переднюю ткань (полноосевой эксплант).
- Желток должен отрываться в основном неповрежденным от этой процедуры. В случае разрыва желтка значительные гранулы желтка могут оставаться прикрепленными к вентральной поверхности ткани. Если это так, используйте инструмент для ресцев, чтобы аккуратно очистить оставшиеся гранулы желтка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дисбаланс тканей кожи на боковых сторонах экспланта не позволит ткани поддерживать прямое направление роста. Эксплант вместо этого будет изгибаться в сторону более растянутой кожи. Этот дисбаланс можно исправить под стереоскопом, разорвав слой кожи с помощью микрохирургического ножа. - Для эксплантов без кожи надавите на кончик слоя кожи иглой и отклейте ткань, эксплантированную микрохирургическим ножом. Эти экспланты не будут удлинять свою ось тела в культуре.
- В дополнение к полноосевым эксплантам, на этом этапе могут быть изготовлены альтернативные экспланты. Например, рассекают уже сегментированные сомиты с помощью микрохирургического ножа (полные экспланты PSM) или рассекают PSM на его половину переднезаднего (полу-PSM explants). Пожалуйста, ознакомьтесь с разделом 5.1 для применения таких альтернативных эксплантов.
- Желток должен отрываться в основном неповрежденным от этой процедуры. В случае разрыва желтка значительные гранулы желтка могут оставаться прикрепленными к вентральной поверхности ткани. Если это так, используйте инструмент для ресцев, чтобы аккуратно очистить оставшиеся гранулы желтка.
- Немедленно перенесите рассеченный эксплант на крышку 22 мм x 22 мм, на которой будет выполняться визуализация.
- Расположите эксплант плоско на дорсовентральной оси, вентральная сторона коснется чехловогослипа (рисунок 1В). Аккуратно удалите лишнюю жиму вокруг тканевой эксплант с помощью пипетки с фильтрованным наконечником 20 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Задержка переноса рассеченных эксплантов в покровный лист приводит к деформации ткани, так как она освобождается от геометрических ограничений желтка.
- Расположите эксплант плоско на дорсовентральной оси, вентральная сторона коснется чехловогослипа (рисунок 1В). Аккуратно удалите лишнюю жиму вокруг тканевой эксплант с помощью пипетки с фильтрованным наконечником 20 мкл.
- Быстро и осторожно переверните крышку эксплантом над заполненной камерой слайда со средой роста.
- Чтобы предотвратить образование пузырьков, поместите сторону квадратного покровного слипа на ленточную камеру и осторожно отпустите другую сторону. Позаботьтесь о том, чтобы не переместить /не деформировать эксплант на этом этапе.
- Осторожно удалите лишнюю среду, истекав кровью из камеры, надавливая скользящей камерой на лабораторную ткань. Крышка будет стабильно сидеть на слайд-камере для визуализации в реальном времени из-за поверхностного натяжения жидкой среды без какого-либо уплотнения.
- Для длительного культивирования (>6 часов) используйте камеру большего размера. В таких случаях можно использовать прямоугольные крышки 22 мм x 50 мм вместе с двумя параллельными полосами слоев ленты на слайдах. Между двумя ленточными полосами можно оставить зазор шириной ~1 мм, чтобы облегчить доступ воздуха в питательную среду.
- Повторите шаги 3.3-3.8, чтобы подготовить больше эксплантов. Подготовленные экспланты удлиняют свою ось тела A-P со средней скоростью ~ 30 мкм / ч и сегментируют свои сомиты с интервалами ~ 40 минут при 25 ° C(Рисунок 2A,Видео 1).
- Для неудлиняющихся эксплантов нанесите мягкое давление на стороны слайда, удерживающего образец на этапе 3.8.2, высасывая избыток среды на лабораторную ткань. В качестве альтернативы экспланты могут культивированы в однослойных скользящих камерах. Кроме того, химическая активация поверхности слайдовой камеры коллагеном типа I приведет к неудлиняющимся эксплантам(рисунок 2B,видео 2).
- Заранее выполняют покрытие камеры коллагеном I типа, полностью покрыв скользящие камеры 15-20 мл предварительно разбвеченного раствора коллагена при комнатной температуре в течение 1 ч. Используйте ламинарную вытяжку для этого протокола для поддержания стерильности. Тщательно промойте камеры со средой для рассечения на конце.
- Для эмбрионов старше 15 лет установите ткань хвоста эксплантат сбоку вместо плоского (дорсовентрального) крепления(Видео 3). Для предотвращения мышечных подергиваний в качестве анестетика3включайте 0,004% раствор трикаина в культуральную муляж.
- Для неудлиняющихся эксплантов нанесите мягкое давление на стороны слайда, удерживающего образец на этапе 3.8.2, высасывая избыток среды на лабораторную ткань. В качестве альтернативы экспланты могут культивированы в однослойных скользящих камерах. Кроме того, химическая активация поверхности слайдовой камеры коллагеном типа I приведет к неудлиняющимся эксплантам(рисунок 2B,видео 2).
4. Получение живого изображения
- Образцы изображений либо на рассечении для широкоугольной визуализации светопропуска размеров и периодов сегментации сомита, либо со структурированной микроскопией освещения / конфокального / светового листа с использованием трансгенных репортерных рыбьих линий.
- Уравновешивают температуру тканей эксплантов с помощью визуализации комнатной температуры в течение не менее 15 мин.
- Для более точного контроля температуры используйте коммерческую систему контроля температуры, установленную на инвертированный микроскоп.
- Установите интервалы кадра получения изображения на 2 - 10 минут в зависимости от интересующего биологического процесса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация сомита рыбок данио является быстрым процессом, в диапазоне от 20 до 55 мин при жизнеспособных температурах от 30 ° C до 21,5 ° C у целых эмбрионов. Экспланты будут удлибатеться и сегментироваться ~ на 30% медленнее, чем целые эмбрионы.- Обратите внимание на то, чтобы оставить достаточную задержку между наборами каналов захвата, чтобы избежать возможной фототоксичности для живой ткани. Не подвергайте ткань воздействию пучка возбуждения более половины продолжительности визуализации и максимально снижайте интенсивность пучка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Накопление активных форм кислорода (АФК), как правило, является основной причиной фототоксичности в живых образцах4. Аскорбиновая кислота в качестве мусорщика АФК может быть дополнена в питательную среду при концентрации 4 мМ для буферизации активности АФК и облегчения фототоксичности. Побочные эффекты фототоксичности может быть трудно заметить во время живой визуализации. Хвостовые экспланты являются выгодными в этом аспекте, поскольку некоторые визуальные маркеры фототоксичности, такие как митотическая остановка, затрудненное развитие тканей (т. Е. Образование сомитов, удлинение хвоста) и распадающаяся ткань, легче заметить. Пожалуйста, обратитесь к предоставленной ссылке4 для подробного обсуждения.
- Обратите внимание на то, чтобы оставить достаточную задержку между наборами каналов захвата, чтобы избежать возможной фототоксичности для живой ткани. Не подвергайте ткань воздействию пучка возбуждения более половины продолжительности визуализации и максимально снижайте интенсивность пучка.
- Используйте одноклеточную РНК, введенную эмбрионам, для получения 4-D изображений, предназначенных для сегментации и анализа на уровне клеточного разрешения.
- Используйте 300 пг РНК из транскрибированных мембран in vitro и ядерных флуоресцентных репортерных маркерных плазмид, таких как pCS-мембрана-ceruleanFP (Addgene plasmid #53749) или pCS-memb-mCherry (Addgene plasmid #53750) в сочетании с pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmid #99267) или pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmid #99271) в инъекциях. Образец фильма с маркерами клеточной мембраны и ядер см. в видео 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Средний размер клеток ткани PSM составляет около ~5 мкм в диаметре, из которых ядра составляют ~3 - 4 мкм. Размер пикселя ~0,5 мкм и z-сечение ~1 мкм должны быть записаны для правильной сегментации клеток.
- Используйте 300 пг РНК из транскрибированных мембран in vitro и ядерных флуоресцентных репортерных маркерных плазмид, таких как pCS-мембрана-ceruleanFP (Addgene plasmid #53749) или pCS-memb-mCherry (Addgene plasmid #53750) в сочетании с pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmid #99267) или pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmid #99271) в инъекциях. Образец фильма с маркерами клеточной мембраны и ядер см. в видео 4.
5. Иммуноокрашивание хвостовых эксплантов
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани, выращенные после различных сценариев рассечения (удлинение, неудлинение, рассечение хвостовой почки, половина PSM и т. Д.), Как плоского хвостовые экспланты5, могут быть извлечены из слайдовых камер для дальнейшего иммуноокрашивания количественных размеров интересующих белков. Здесь мы представляем протокол, используемый для окрашивания эксплантов дифосфорилированной внеклеточной регулируемой киназой (ppERK) в качестве считывания градиента сигналов FGF.
- После формирования сомитов до нужного этапа осторожно перекладывайте крышку наполовину в угол скользящей камеры без подъема.
- С помощью ~100 мкл дополнительной среды для рассечения в стеклянной пипетке Пастера извлекают экспланты из слайда и переносят в 64-скважинную пластину для культивовки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, все замены раствора могут быть выполнены под рассечением с помощью отдельной стеклянной пипетки для фиксированных образцов. Это позволит не терять эксплантные ткани в колодцах или переносить их между ними. - После переноса всех эксплантов высасывайте избыточную среду из скважин по одному и помещайте в каждую скважину 100 мкл 4% параформальдегида в ПБС (ПФА).
ВНИМАНИЕ: ПФА является токсичным раствором с канцерогенным действием. При обращении следует использовать правильные СИЗ. - Зафиксируйте экспланты в 64-скважинной пластине при комнатной температуре в течение 1 ч на шейкере.
- Тканевые экспланты более чувствительны к деформациям, чем целые эмбрионы. Отрегулируйте скорость шейкерного встряхивания соответствующим образом.
- Вымойте фиксатор 150 мкл PBS-Tw (0,1% Tween20 в PBS) три раза. Соберите первую стирку в специальный контейнер «PFA Waste».
- Обезвоживать экспланты на 4×5 мин, заменяя ~40 мкл раствора каждый раз 100% метанолом (MeOH).
ВНИМАНИЕ: MeOH является токсичным химическим веществом, которое является летучим и легковоспламеняющимся. Работайте в хорошо проветриваемом помещении и используйте надлежащие СИЗ для обработки. - В качестве последней ступени обезвоживания удалите весь раствор из скважин и замените 100 мкл MeOH. Инкубировать при -20 °C в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте специальный контейнер "MeOH Waste" для сбора растворов до шага 5.11. - Добавьте 50 мкл MeOH и встряхните при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Эксплантировать экспланты 4×5 мин путем замены ~40 мкл раствора каждый раз PBS-T (0,1% Triton-X 100 в PBS). Используйте специальный контейнер «MeOH Waste» для сбора решений.
- В качестве последней ступени регидратации удалите весь раствор из скважин и замените 100 мкл PBS-T.
- Для пермеабилизации тканей обрабатывают экспланты 1,5% Тритон-Х 100 в ПБС в течение 20 мин при комнатной температуре на шейкере.
- Промывайте образцы MAB-D-T (0,1% моющего средства Triton-X 100 и 1% диметилсульфоксида (DMSO) в 150 мМ NaCl 100 мМ буфера малеиновой кислоты pH 7,5) 3×5 мин.
ВНИМАНИЕ: ДМСО является легковоспламеняющимся и токсичным мутагеном. При обращении следует использовать правильные СИЗ. - Инкубировать экспланты в 100 мкл/хорошо блокирующий раствор сыворотки (2% фетальная бытовая сыворотка в MAB-D-T) в течение 2 часов при комнатной температуре.
- Заменить весь блокирующий раствор раствором первичного антитела 50-100 мкл/хорошо (разведение моноклональных мышиных антител против ppERK в сывороточной блокаде 1:1000). Инкубировать образцы O/N (>16 ч) при 4 °C на шейкере.
- Промыть раствор первичных антител МАБ-D-Т 5×5 мин.
- Инкубировать образцы во вторичном растворе антител (Alexa Fluor 597 козьи против мыши IgG2b (1:200) и Hoechst 33342 (1:5000) в MAB-D-T) O/N при 4 °C на шейкере или в течение 3 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этой ступени, покройте 64-скважинную пластину алюминиевой фольгой, чтобы избежать светового воздействия вторичных образцов, обработанных антителами.
ВНИМАНИЕ: Hoechst 33342 является потенциальным канцерогеном. При обращении следует использовать правильные СИЗ. - Промыть раствор вторичных антител PBS-Tw 3×5 мин.
- Зафиксируйте образцы с помощью PFA в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Промыть фиксатор PBS-Tw и уравновесить образцы в пределах 60% глицерина. Установите экспланты на слайды микроскопа с лаком для ногтей и 60% глицерином для визуализации. Для репрезентативных результатов иммуноокрашивания, см. Рисунок 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол позволяет культивировать плоскую геометрическую культивирование живых эксплантов хвоста рыбки данио. Культура тканей имеет три основных преимущества перед целыми эмбрионами: 1) контроль скорости удлинения оси, 2) контроль над различными источниками сигнализации (морфогена) путем простого рассечения и 3) околоцелевой, с высоким увеличением и высокой NA живой визуализацией.
Химически необработанные скользящие камеры позволяют хвостовому экспланту удлинять свою большую ось(рисунок 2А)эктодермой кожи, обернутой вокруг ткани под ней. Когда мы культивировали экспланты на химически активированных скользящих камерах (с коллагеном типа I), эктодерма кожи растянулась и приклеилась к камере скольжения, что остановило удлинение оси экспланта. Несмотря на это, сомиты продолжали сегментироваться(рисунок 2B,дополнительные фильмы S1 и S2). Как описано в протоколе, удлинение оси также может быть остановлено непосредственно путем применения физического давления во время процесса монтажа или монтажа эксплантов в более мелкой скользящей камере. Количественную оценку скорости удлинения оси при таких физических ограничениях можно найти в нашей ранее опубликованной работе5.
Рисунок 2:Контроль удлинения оси в эксплантатах. (A) Экспланты, культивируемые в обычной скользящей камере (слева), удлиняются в осевом направлении, поскольку они продолжают сегментировать новые сомиты. Снимки пропускаемого света (слева, оттенки серого) и трансгенного ядерного маркера (справа, красный) показаны в течение 2 ч продолжительности культивирования. (B) Химическая активация скользящей камеры коллагеном типа I перед культивированием останавливает осевое удлинение, но не влияет на скорость сегментации сомита. Шкала составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Во-вторых, экспланты могут быть культивированы путем препарирования источников морфогенов для выявления поучительной информации, которую они предоставляют для процессов развития. Здесь мы представляем три примера изображения, показывающих влияние рассечений на сигнальные уровни ppERK(рисунок 3). В ткани PSM устанавливается сигнальный градиент FGF от задней до передней (считывается уровнями ppERK). Только ткань хвостовой почки активно транскрибирует fgf86 и образует источник для этого градиента с помощью диффузии лиганда FGF5. Экспланты хвоста, в которых отсутствует часть ткани хвостовой почки после рассечения(рисунок 3C),приводят к более короткому градиенту ppERK(рисунок 3B,3D). Напротив, градиент ретиноевой кислоты устанавливается от передней к задней как в PSM, так и в дорсальной нервной ткани. Недавно образовавшуюся сомиты и передний конец ПСМ экспрессируют ферменты ретиноевой кислоты (РА), синтезируя ферменты и выступая в качестве источника градиента РА7. Когда мы рассекли переднюю ткань PSM в эксплантах(рисунок 3E),мы все еще наблюдали нормальную степень градиента ppERK(рисунок 3F),визуализируемую иммуноокрашивающим. Подробное использование этого метода силы экспланта можно найти в нашем недавнем исследовании5.
В-третьих, плоскомонтированные экспланты рыбок данио оптимальны для наблюдения за морфогенезом тканей с высоким разрешением. Здесь мы представляем фильм(Видео 4),снятый с трансгенным эксплантом, экспрессирующим EGFP в виде маркера клеточной мембраны (ложный окрашенный красным цветом) и окрашенный маркером ядер дальних красных клеток (ложный цвет с синим). Без дальнейшей количественной оценки многие процессы, такие как попадание нейромезодермальных прародителей в хвостовую почку, более высокая подвижность задних клеток PSM по сравнению с передними и эпителизация сомитических пограничных клеток, можно непосредственно наблюдать в фильме.
Рисунок 3:Иммуноокрашивание хвостовых эксплантов. (A) Полные PSM экспланты с интактными сигнальными градиентами вдоль PSM в качестве контроля. (B) Регулярный градиент ppERK наблюдается в полных эксплантатах PSM с иммуноразрашивающим. (C) В хвостовых почках рассеченных эксплантов отсутствует большая часть заднего источника сигнализации FGF. (D) Очень задний ограниченный сигнал ppERK наблюдается в расчлененные экспланты хвостовых почек. (E)Передний PSM и сомитическая ткань могут быть рассечены для удаления источников возможных передних сигнальных факторов PSM, таких как передача сигналов РА. (F)Переднее удаление PSM не изменяет нормальную степень градиента ppERK. Ткани фиксировали через 2 ч после эксплантирования для протокола иммуноокрашения. Шкала составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Фильм 1: Удлинение оси и сегментация Сомита в 3D-эксплантах. Широкоугольный проходящий свет (сверху) и ядерный локализованный GFP (ложный красный цвет) эпифлуоресценция (внизу) замедленные изображения обычной скользящей камеры с плоским креплением. Ткань хвоста эксплантировалась из эмбриона на стадии 13 сомитов. Получение изображения осуществляется на инвертированный микроскоп с интервалом кадра 3 мин. Шкала составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот фильм.
Фильм 2: Удлинение оси на химически активированной скользящей камере. Широкоугольный проходящий свет (сверху) и ядерный локализованный GFP (ложный красный цвет) эпифлуоресценция (снизу) замедленные изображения плоского эксплантата. Эксплант эмбриона стадии 11 сомитов был установлен на скользящей камере, покрытой раствором коллагена крысиного хвоста, в течение 30 минут перед установкой. Получение изображения осуществляется на инвертированный микроскоп с интервалом кадра 3 мин. Шкала составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот фильм.
Фильм 3: Латеральная установка эксплантов эмбрионов поздней стадии. Широкоугольный проходящий свет (слева) и ядерный локализованный GFP (ложный красный цвет), эпифлуоресценция (справа) замедленная съемка обычной слайд-камеры с боковым креплением эксплантата. Ткань хвоста эксплантировали из эмбриона на стадии 15 сомитов и раствор трицина использовали в качестве анестетика. Получение изображения осуществляется на инвертированный микроскоп с интервалом кадра 3 мин. Шкала составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот фильм.
Фильм 4: Визуализация хвостовых эксплантов с разрешением одной клетки. Покадровая конфокальная визуализация экспланта, экспрессирующего EGFP в виде мембранного маркера (ложный красный цвет) и далеко красного цвета, окрашенного для ядер в живых (ложно окрашенный в циан). Средняя интенсивность проекции от 5 z-слоев (10 мкм) показана в фильме в течение 1 часа. Получение изображения осуществляется на детекторе GaAsP инвертированного конфокального микроскопа с 40× апохроматической λS DIC-водой с погружением в воду объектива 1.15 NA, с интервалами кадра 4 мин. Шкала составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот фильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье представлен подробный протокол метода эксплантатов тканевых культур, который мы разработали и недавно использовали5 для эмбрионов рыбок данио. Наша методика основана на предыдущих методах эксплантата у цыплят8 и рыбок данио9,10,11 модельных организмов. Хвостовые экспланты, приготовленные по этому протоколу, могут выживать до >12 ч в простой скользящей камере, продолжая удлиняя свою основную ось тела и сегментируя сомиты, до конца сомитогенеза.
Следует позаботиться о том, чтобы сохранить ткань экспланта здоровыми и успешно удлиняющимися в течение длительного времени. Во-первых, тканевую эксплант следует рассеченить, не повреждая интактность задних тканей. Мы заметили, что клетки кожи обеспечивают мешочек для нейромезодермальных клеток-прародителя, проникающих в задний хвостовой бутон. Если кожа эксплантов отслаивается от этих высокоподвижных клеток, покиньте ткань хвостового бута и мигрируйте с задней стороны над покровом за пределы тканей. Во-вторых, посредственно несбалансированное напряжение кожной ткани может привести к удлинению расклоняющихся осей, что может согнуть ось PSM и нотохорду. Короткий щелевой разрез, сделанный на фланкинговых клетках кожи с обеих сторон эксплантата, помогает облегчить эту проблему. Помимо проблем, связанных с кожей, особое внимание следует уделять поддержанию стерильности питательных сред и инструментов для рассечения для более длительных культур.
При правильном уходе эксплантная культура рекапитулирует здоровый рост целых эмбрионов. Мы наблюдали мышечные подергивания в эксплантатах, начиная со стадии 20 сомитов, как и у целых эмбрионов12. Хотя мы сосредоточились на ткани PSM для изучения сегментации сомита, соседние ткани, такие как эктодерма кожи, нейронный киль (позже нервный стержень и нервная трубка), нотохорд, промежуточная и боковая пластинчатая мезодерма также остаются нетронутыми при описанных условиях культивирования(рисунок 1B). Это особенно выгодно для тканей, скрытых желтком, которые могут быть изображены в высоком разрешении на вентрально установленных эксплантатах, таких как нотохорд, жизикул Купфера и другие ткани, развивающиеся на стадиях сегментации12. Следует подчеркнуть, что эксплантная система не растет так быстро, как целые эмбрионы, и не сегментирует сомиты в том же темпе, что и целые эмбрионы. Это ограничение для эксплантной системы может также изменять временную динамику других событий, ненаблюдаемых здесь.
Здесь мы представили репрезентативные результаты, которые подчеркивают три основных преимущества системы хвостового эксплантата по сравнению с экспериментами с целым эмбрионом. Недавно мы использовали этот метод для распутывания поучительных ролей удлинения оси от морфогенных градиентов для сегментации сомита5. Поздние достижения в области световой листовой микроскопии сделали возможным живое изображение всего эмбриона13 для нескольких модельных организмов. Но большинство из этих методов по-прежнему не имеют надлежащего субклеточного разрешения и едва доступны для более широкого исследовательского сообщества. Модель хвостового эксплантата, описанная здесь, делает субклеточное разрешение тканевого уровня живой визуализации доступным с помощью простых инвертированных или конфокальных микроскопов. Помимо методологических преимуществ, такая живая визуализация может дать представление о сегментации задней оси тела позвоночных. Сохраняя протокол как можно более прямым и доступным, эксплантная система также может принести пользу более широкой области биологии развития рыбок данио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать и заявлять об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим AECOM Zebrafish Core Facility и Cincinnati Children's Veterinary Services за содержание рыбы, Cincinnati Children's Imaging Core за техническую помощь, Didar Saparov за помощь в производстве видео и Hannah Seawall за редактирование рукописи. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером R35GM140805 для E.M.Ö. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | for dechorionating embryos and manipulations |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | for immunostaining |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | for tissue dissection media |
| Calcium Chloride Anhydrous, Powder | Sigma-Aldrich | 499609 | for tissue dissection media |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | for immunostaining |
| Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel | Integra-Miltex | MIL4-411 | for preparing tape slide wells |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | additional for tissue culture media |
| Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | secondary antibody for immunostaining |
| L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red | GIBCO | 21083-027 | for tissue dissection media |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | for immunostaining |
| Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade | Surgical Specialties | 72-2863 | for tissue dissection |
| Mouse monoclonal anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | for ppERK immunostaining |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (optional) for live staining of cell nuclei |
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | for fixation of samples for immunostaining |
| Rat Tail Collagen Coating Solution | Sigma-Aldrich | 122-20 | (optional) for chemically activating slide chambers |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (optional) for temperature control during live imaging |
| Transparent Tape 3/4'' | Scotch | S-9782 | for preparing tape slide wells |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | for immunostaining |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunostaining |
| Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
References
- Assheton, R. Growth in length: Embryological Essays. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , University of Oregon Press. Oregon. (1995).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (1700003), (2017).
- Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish. Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).
- Dubrulle, J., Pourquié, O. fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo. Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).
- Diez del Corral, R., et al. Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension. Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).
- Stern, H. M., Hauschka, S. D. Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants. Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M.
- Manning, A. J., Kimelman, D. Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors. Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
