Summary
כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לתרבות רקמות תלת-ממדית של ציר הגוף האחורי של דג הזברה, המאפשר מחקר חי של פילוח בעלי חוליות. מודל הסבר זה מספק שליטה על התארכות הציר, שינוי מקורות מורפוגן והדמיה חיה ברמת הרקמה בתת-תאיות.
Abstract
עוברי חוליות מעצבים את ציר הגוף העיקרי שלהם כסומיטים שחוזרים על עצמם, מבשרי החוליות, השרירים והעור. Somites בהדרגה קטע מן mesoderm presomitic (PSM) כמו קצה הזנב של העובר מתארך אחורית. סומיטים יוצרים עם מחזוריות רגילה וגודל קנה מידה. זברהפיש הוא אורגניזם מודל פופולרי כפי שהוא ניתן להנדס גנטית ויש לו עוברים שקופים המאפשרים הדמיה חיה. עם זאת, במהלך somitogenesis, עוברי דגים כרוכים סביב חלמון גדול, עיגול. גיאומטריה זו מגבילה הדמיה חיה של רקמת PSM בעוברים של דגי זברה, במיוחד ברזולוציות גבוהות יותר הדורשות מרחק עבודה אובייקטיבי קרוב. כאן, אנו מציגים שיטת תרבית רקמה תלת-ממדית שטוחה להדמיה חיה של תוכחות זברה- זנב. תרשימי זנב מחקים עוברים שלמים על ידי הצגת האטה פרופורציונלית של התארכות הציר וקיצור אורכי הסומיטה rostrocaudal. אנו מסוגלים עוד יותר לעכב את מהירות התארכות הציר באמצעות תרבות explant. זה, בפעם הראשונה, מאפשר לנו להתיר את הקלט הכימי של מעברי צבע איתות מן הקלט המכניסטי של התארכות צירית. במחקרים עתידיים, שיטה זו יכולה להיות משולבת עם התקנה מיקרופלואידית כדי לאפשר הפרעות תרופות מבוקרות זמן או הקרנה של פילוח בעלי חוליות ללא כל חששות חדירה לתרופות.
Introduction
פילוח מטמרי של אורגניזמים נמצא בשימוש נרחב בטבע. מבנים חוזרים ונשנים חיוניים לפונקציונליות של איברים לרוחב כגון חוליות, שרירים, עצבים, כלי דם, גפיים או עלים בתוכנית גוף1. כתוצאה מאילוצים פיזיולוגיים וגיאומטריים כאלה של הסימטריה הצירית, רוב הפילה של בילטריה - כגון אנלדים, פרוקי רגליים ואקורדטים - מציגים פילוח של הרקמות העובריות שלהם (למשל, אקטודרם, מזודרם) באופן אנטרו-אחורי.
עוברי חוליות מחלקים ברצף את מזודרם הפרקסיאלי שלהם לאורך ציר הגוף הראשי לסומיטים עם מרווחים, ספירות והתפלגויות גודל ספציפיים למינים. למרות החוסן הזה בקרב עוברים בודדים בתוך מין מסוים, פילוח סומיטי הוא רב-תכליתי בין מינים של בעלי חוליות. פילוח קורה במשטר עצום של מרווחי זמן (מ 25 דקות ב zebrafish כדי 5 שעות בבני אדם), גדלים (מ ~ 20 מיקרומטר בסומיטות זנב של זברה כדי ~ 200 מיקרומטר בסומיטים גזע של עכברים) וסופר (מ 32 ב zebrafish כדי ~ 300 ב נחשי תירס)2. באופן מעניין יותר, עוברי דגים יכולים להתפתח במגוון רחב של טמפרטורות (מ ~ 20 °C (עד 34 °C (70 °F) עבור דגי זברה) תוך שמירה על somites שלהם ללא פגע עם התפלגות גודל נאותה על ידי פיצוי הן מרווחי פילוח ומהירויות התארכות צירית. מעבר לתכונות מעניינות כאלה, זברה-פיש נשאר כאורגניזם מודל שימושי לחקר פילוח בחולייתנים בשל ההתפתחות החיצונית, הסינכרונית והשקופה של בשפע של עוברים אחים כמו גם הכלים הגנטיים הנגישים שלהם. מנקודת מבט מיקרוסקופית, עוברים טלוסטים מתפתחים על חלמון כדורי מגושם, מותחים ומעגלים את רקמת הגז סביבו (איור 1A). במאמר זה, אנו מציגים תרבות שטוחה 3-D רקמה explant עבור זנבות זברה. מערכת הסבר זו עוקפת את האילוצים הכדוריים של מסת החלמון, ומאפשרת גישה להדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של עוברי דגים לדוגמת דומיטי.
איור 1: מערכת Explant קאמרית שקופית לעוברים של דגי זברה. (A) לעוברים של דגי זברה יש יתרונות להדמיה חיה, כגון שקיפות של רקמה עוברית מתכלה (כחולה), אך הרקמה נוצרת סביב מסת חלמון כדורית (צהובה) מגושמת המונעת הדמיה כמעט אובייקטיבית ברזולוציה גבוהה בעוברים שלמים. ניתן לנתח את פתיתי הזנב החל מסכין מיקרוכירורגית (חומה) שנחתכה מהרקמה של סומיטס (אדום) וממשיכה בגבול עם החלמון האחורי. (B)פירורי זנב מנותח ניתן להניח על כיסוי (כחול בהיר) dorsoventrally; שמירה על רקמה עצבית (אפור בהיר) מלמעלה ונונוצ'ורד (אפור כהה) בתחתית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה כרוך בשימוש בעוברים חיים של בעלי חוליות מתחת ליום אחד לאחר ההפריה. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת ההנחיות האתיות של המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי; פרוטוקולים של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקול מס' 2017-0048).
1. אוסף עוברים
- הקים זוגות של דגי זברה במכלים חוצים בלילה שלפני יום איסוף העוברים. לשליטה מדויקת בהתפתחות העובר, השתמשו במחסומים בין זוגות הזדווגות.
- להעלות מחסומים לפני זמן ההשרצה המועדף ולאסוף ביצים בתוך 15 דקות בצלחת פטרי 100 מ"מ.
- פסולת נקייה מצלחת פטרי. אם נאספים יותר מ-50 עוברים ממצמד אחד, פצלו את המצמד למספר מנות פטרי בהתאם.
- דגירה עוברים במים מערכת דגים ב 28 °C (69 °F) עד שהם מגיעים 50% שלב epiboly (5 שעות לאחר ההפריה). מדיום צמיחת עובר סטנדרטי כגון E3 יכול לשמש גם במקום מים מערכת האקווריום עד שלב 3.2.
- מוציאים ביצים לא מופרות תחת סטריאוסקופ ומעבירים את העוברים לאינקובטור של 23°C למשך הלילה (O/N). העוברים צריכים להיות בשלב 8-10 סומיטי בבוקר שלאחר יום האיסוף.
2. הכנת כלי
- לעקר את להב סכין מיקרוכירורגיה, טיפים מחט (המשמש לניתוח של הרקמה), וזכוכית פסטר פיפטה על ידי השרייה 100% אתנול (EtOH) זיגוג אש.
- השתמש בשתי שכבות של סרט שקופה (~ 100-120 מיקרומטר עובי) על שקופיות מיקרוסקופ 25 מ"מ x 75 מ"מ. חותכים ~ 18 מ"מ x 18 מ"מ בארות מרובעות במרכז הסרט של כל שקופית מכסה עם אזמל.
- נגב את תאי השקופיות המוכנים עם 70% EtOH. בארות אלה יחזיקו ~ 40 μL של בינוני.
3. הכנה לדוגמה
- עוברי Dechorionate באמצעות קצה של שני מזרקים מחט תחת סטריאוסקופ. מעבירים עוברים לצלחת פטרי נפרדת עם מי מערכת דגים לשטוף.
- באמצעות פיפטה פסטר זכוכית סטרילית מזוגגת באש, להעביר עוברים בצלחת פטרי 6 ס"מ המכיל מדיום ניתוח (ליוביץ-15 תא תרבות בינונית עם L-גלוטמין ללא פנול אדום, 0.8 mM CaCl2 ו 1× פתרון אנטיביוטי אנטי מיקוטי).
הערה: המשך להשתמש פיפטה זכוכית מעוקרת עבור כל ההעברות בעקבות שלב זה.- השתמש צלחת פטרי עבור הליך הסברה כדי למנוע שבבי פוליסטירן במהלך ניתוח.
- שים 50 μL של רקמות צמיחה בינונית (מדיום ניתוח, ו 10% FBS) בתא השקופית.
- לייצב עובר לניתוח מתחת לסטריאוסקופ עם קצה מחט בצומת רקמת החלמון ליד hindbrain.
- שמירה על יציבות הרקמה העוברית באמצעות מחט, השתמש בסכין המיקרו-כירורגית עם הלהב המוחזק ב- 45° כדי לחתוך את הרקמה לפני השטח האחורי ולקלף את החלמון מהרקמה העוברית החל מהחדר הראשי ונע לעבר ניצן הזנב(איור 1A).
הערה: היזהר לא לאבד את רקמת העור בעת ניקוי החלמון. העור היה בקלות להתקלף כמו רקמה אלסטית שכבה אחת אגף סביב העובר במהלך הניתוח, ולכן קל לזהות. - לאחר החלמון מוסר לחלוטין מהגוף העוברי, לחתוך את רקמת העור האגף מן tailbud. שמירה על האחרון נוצר 3-4 somites שלם, לחתוך את הרקמה יותר חזיתית החוצה (explant ציר מלא).
- החלמון צריך לרדת בעיקר שלם מהליך זה. במקרה של חלמון קרוע, גרגירים משמעותיים של חלמון יכולים להישאר מחוברים לפני השטח הגחוני של הרקמה. אם כן, השתמשו בכלי ריסים לניקוי גרגירי החלמון הנותרים בעדינות.
הערה: חוסר איזון של רקמות העור בצדדים הצדדיים של explant לא יאפשר לרקמה לשמור על כיוון צמיחה ישר. במקום זאת, ההסבר יתכופף לכיוון הצד של עור מתוח יותר. חוסר איזון זה ניתן לתקן תחת סטריאוסקופ על ידי קרע שכבת העור בעזרת סכין מיקרוכירורגית. - לקבלת קללות ללא עור, לחץ על קצה של שכבת העור עם מחט לקלף את הרקמה explant עם הסכין microsurgical. תרביצים אלה לא יזרזו את ציר גופם בתרבות.
- בנוסף לציר המלא explants, explants חלופי יכול להתבצע בשלב זה. לדוגמה, לנתח סומיטיות כבר מקוטע באמצעות סכין מיקרוכירורגית (explants PSM מלא) או לנתח את PSM לתוך חצי anteroposterior שלה (explants חצי PSM). אנא עיין בסעיף 5.1 ליישום של תרשימים חלופיים כאלה.
- החלמון צריך לרדת בעיקר שלם מהליך זה. במקרה של חלמון קרוע, גרגירים משמעותיים של חלמון יכולים להישאר מחוברים לפני השטח הגחוני של הרקמה. אם כן, השתמשו בכלי ריסים לניקוי גרגירי החלמון הנותרים בעדינות.
- העבר מיד את ההסבר המנותח לכיסוי של 22 מ"מ x 22 מ"מ שעליו תבוצע ההדמיה.
- מסדרים את האקספלנט שטוח על ציר הגבורה, צד הגחוני נוגע בכיסוי(איור 1B). הסר בעדינות את המדיה העודפת סביב הרקמה באמצעות פיפטה עם קצה מסונן של 20 μL.
הערה: העברה מאוחרת של זרזים מנותחים לכיסוי גורמת לעיוותים של הרקמה, שכן היא משוחררת מהמגבלות הגיאומטריות של החלמון.
- מסדרים את האקספלנט שטוח על ציר הגבורה, צד הגחוני נוגע בכיסוי(איור 1B). הסר בעדינות את המדיה העודפת סביב הרקמה באמצעות פיפטה עם קצה מסונן של 20 μL.
- במהירות ובזהירות להפוך את הכיסוי עם explant מעל תא שקופיות בינוני הצמיחה מלא.
- כדי למנוע היווצרות בועה, מניחים צד של כיסוי מרובע על תא הקלטת ומשחררים את הצד השני בעדינות. היזהר לא לזוז / לעוות את explant בשלב זה.
- הסר בעדינות דימום מדיה עודף מחוץ לתא על-ידי לחיצה על תא השקופית על רקמת מעבדה. הכיסוי יישב ביציבות על תא השקופית להדמיה חיה, בשל מתח פני השטח של המדיום הנוזלי ללא כל איטום.
- במשך תקופה ארוכה culturing (>6 שעות), להשתמש בתא גדול יותר. ניתן להשתמש בכיסויים מלבניים 22 מ"מ x 50 מ"מ יחד עם שני נתיבים מקבילים של שכבות סרט הדבקה בשקופיות במקרים כאלה. ניתן להשאיר מרווח ברוחב ~ 1 מ"מ בין שני נתיבי קלטת כדי להקל על הגישה לאוויר למדיום הגדילה.
- חזור על שלבים 3.3-3.8 כדי להכין תדרים נוספים. תערוכות מוכנות יארכו את ציר הגוף A-P שלהם עם מהירות ממוצעת של ~ 30 מיקרומטר / שעה וקטע somites שלהם עם ~ 40 דקות מרווחים ב 25 °C(איור 2A, וידאו 1).
- עבור explants לא מאריך, להחיל לחץ עדין על הצדדים של שקופית מחזיק את המדגם בשלב 3.8.2 תוך מציצת התקשורת העודפת על רקמת מעבדה. לחלופין, ניתן לתרבת תרבית explants בתאי שקופיות שכבת קלטת אחת. כמו כן, הפעלה כימית של משטח תא השקופיות באמצעות קולגן מסוג I תגרום לתדרים לא מאריכים(איור 2B, וידאו 2).
- בצע ציפוי של התא עם קולגן מסוג I מראש על ידי כיסוי מלא של תאי השקופית עם 15-20 מ"ל של פתרון קולגן טרום בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות. השתמש מכסה המנוע זרימה למינארי לפרוטוקול זה כדי לשמור על סטריליות. יש לשטוף בזהירות את התאים עם מדיום הניתוח בסוף.
- לעוברים מעל גיל 15, עלו על רקמת האקספלנט של הזנב לרוחב במקום הר שטוח (דורסובנטרלי)(וידאו 3). כדי למנוע עוויתות שרירים, כלול פתרון 0.004% טריקאין במדיה התרבותית כסוכן הרדמה3.
- עבור explants לא מאריך, להחיל לחץ עדין על הצדדים של שקופית מחזיק את המדגם בשלב 3.8.2 תוך מציצת התקשורת העודפת על רקמת מעבדה. לחלופין, ניתן לתרבת תרבית explants בתאי שקופיות שכבת קלטת אחת. כמו כן, הפעלה כימית של משטח תא השקופיות באמצעות קולגן מסוג I תגרום לתדרים לא מאריכים(איור 2B, וידאו 2).
4. רכישת תמונה חיה
- דגימות תמונה או על טווח ניתוח עבור הדמיית אור משודר שדה רחב של גודלים ותקופות פילוח סומיטי, או עם מיקרוסקופיה מובנית תאורה / confocal / גיליון אור באמצעות קווי דגים כתב מהונדס.
- השווה את הטמפרטורה של רקמות explants עם טמפרטורת חדר הדמיה לפחות 15 דקות.
- לבקרת טמפרטורה מדויקת יותר, השתמשו במערכת בקרת טמפרטורה מסחרית המותקנת על מיקרוסקופ הפוך.
- הגדר את מרווחי המסגרות של רכישת התמונה ל- 2 - 10 דקות בהתאם לתהליך הביולוגי של עניין.
הערה: פילוח סומייט זברה הוא תהליך מהיר, הנע בין 20 - 55 דקות לטמפרטורות קיימא של 30 °C (70 °F) עד 21 °C (70 °F) בעוברים שלמים. Explants יהיה להאריך פלח ~ 30% איטי יותר מאשר העוברים כולו.- שים לב להשאיר מספיק עיכוב בין סטים של רכישות ערוץ כדי למנוע פוטוטוקסיות אפשרית לרקמות חיות. אין לחשוף את הרקמה לקרן העירור במשך יותר ממחצית משך ההדמיה ולהוריד את עוצמת הקרן ככל האפשר.
הערה: הצטברות של מיני חמצן תגובתי (ROS) היא בדרך כלל הגורם העיקרי של phototoxicity בדגימותחיות 4. חומצה אסקורבית כמו נבלות ROS ניתן להשלים בינוני צמיחה ב 4 mM ריכוז כדי לאגור פעילות ROS ולהקל phototoxicity. תופעות לוואי של phototoxicity עשוי להיות קשה להבחין במהלך הדמיה חיה. מקלעי זנב הם יתרון בהיבט זה מאז כמה סמנים חזותיים של phototoxicity כגון מעצר מיטוטי, התפתחות רקמות מעוכבים (כלומר, היווצרות של somites, התארכות הזנב), ורקמות מתפוררות קל יותר להבחין. נא עיין בהפניה4 שסופקה לדיון מפורט.
- שים לב להשאיר מספיק עיכוב בין סטים של רכישות ערוץ כדי למנוע פוטוטוקסיות אפשרית לרקמות חיות. אין לחשוף את הרקמה לקרן העירור במשך יותר ממחצית משך ההדמיה ולהוריד את עוצמת הקרן ככל האפשר.
- השתמש בעוברים מוזרקים RNA בשלב תא יחיד כדי לרכוש תמונות 4-D שנועדו להיות מקוטעים ומנותחים ברמת הרזולוציה התאית.
- השתמש 300 pg של RNA מן הממברנות תעתיק במבחנה פלסמידים סמן כתב פלואורסצנטי גרעיני כגון pCS-ממברנה-ceruleanFP (פלסמיד Addgene #53749) או pCS-memb-mCherry (הוסף פלסמיד #53750) בשילוב עם pCS2+ H2B-mTagBFP2 (#99267 פלסמיד Addgene) או pCS2 + H2B-TagRFP-T (#99271 פלסמיד Addgene) בזריקות. לסרט לדוגמה עם סמני קרום תאים וגרעינים ראו וידאו 4.
הערה: גודל התא הממוצע של רקמת PSM הוא כ ~ 5 מיקרומטר קוטר, מתוכם גרעינים מורכב ~ 3 - 4 מיקרומטר. גודל פיקסל של ~ 0.5 מיקרומטר ו z-sectioning של ~ 1 מיקרומטר צריך להיות רשום עבור פילוח התא הנכון.
- השתמש 300 pg של RNA מן הממברנות תעתיק במבחנה פלסמידים סמן כתב פלואורסצנטי גרעיני כגון pCS-ממברנה-ceruleanFP (פלסמיד Addgene #53749) או pCS-memb-mCherry (הוסף פלסמיד #53750) בשילוב עם pCS2+ H2B-mTagBFP2 (#99267 פלסמיד Addgene) או pCS2 + H2B-TagRFP-T (#99271 פלסמיד Addgene) בזריקות. לסרט לדוגמה עם סמני קרום תאים וגרעינים ראו וידאו 4.
5. חיסון של מפרצי זנב
הערה: רקמות הגדלות לאחר תרחישי ניתוח שונים (התארכות, אי-התארכות, ניצן זנב מנותח, חצי PSM וכו ') כמו זנב שטוח רכוב explants5 ניתן לשחזר מתאי שקופיות לכימותים immunostaining נוספים של חלבונים מעניינים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול המשמש עבור אות חוץ תאי di-phosphorylated מוסדר קינאז (ppERK) כתמים של explants כמו FGF איתות קריאה הדרגתית.
- לאחר היווצרות של somites עד השלב הרצוי, בזהירות להעביר את coverslip באמצע הדרך לפינה של תא השקופית מבלי להרים.
- בעזרת ~ 100 μL של מדיום ניתוח משלים בזכוכית פסטר פיפטה, לשחזר את explants מן השקופית ולהעביר לתוך צלחת תרבות התא 64-גם.
הערה: החל משלב זה, ניתן לבצע את כל החלפת הפתרונות תחת טווח ניתוח עם פיפטה זכוכית נפרדת לדגימות קבועות. זה יבטיח לא לאבד רקמות explant בבארות או להעביר אותם בין לבין. - לאחר העברת כל explants, למצוץ את המדיום המוגזם מתוך בארות אחד אחד ולשים 100 μL של 4% paraformaldehyde ב PBS (PFA) לתוך כל באר.
אזהרה: PFA הוא פתרון רעיל עם השפעות מסרטנים. יש להשתמש ב- PPE מתאים בעת הטיפול. - לתקן explants בצלחת 64-באר בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה על שייקר.
- רקמות רגישות יותר לעיוותים מאשר לעוברים שלמים. כוונן את מהירות השייקר בהתאם.
- לשטוף את התיקון עם 150 μL של PBS-Tw (0.1% Tween20 ב PBS) שלוש פעמים. לאסוף את הכביסה הראשונה במיכל ספציפי "פסולת PFA".
- לייבש explants ב 4×5 דקות צעדים על ידי החלפת ~ 40 μL של פתרון בכל פעם עם 100% מתנול (MeOH).
אזהרה: MeOH הוא כימיקל רעיל שהוא נדיף ודליק. עבוד בחלל מאוורר היטב והשתמש ב- PPE מתאים לטיפול. - כמו השלב האחרון של התייבשות, להסיר את כל הפתרון מבארות ולהחליף עם 100 μL של MeOH. דגירה ב -20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
הערה: השתמש במיכל ספציפי של "MeOH Waste" כדי לאסוף את הפתרונות עד שלב 5.11. - מוסיפים 50 μL של MeOH ומנערים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- Rehydrate explants ב 4×5 דקות צעדים על ידי החלפת ~ 40 μL של פתרון בכל פעם עם PBS-T (0.1% טריטון-X 100 ב PBS). השתמש במיכל ספציפי "MeOH Waste" כדי לאסוף את הפתרונות.
- כצעד האחרון של התייבשות, להסיר את כל הפתרון מבארות ולהחליף עם 100 μL של PBS-T.
- עבור רקמות חדירות לטפל explants עם 1.5% טריטון-X 100 ב PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.
- לשטוף דגימות עם MAB-D-T (0.1% טריטון-X 100 דטרגנט ו 1% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ב 150 mM NaCl 100 mM חומצה מאלית חיץ pH 7.5) 3×5 דקות.
אזהרה: DMSO הוא דליק ומוטוגן רעיל. יש להשתמש ב- PPE מתאים בעת הטיפול. - דגירה explants ב 100 μL / גם פתרון חסימת סרום (2% סרום שור עוברי ב MAB-D-T) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- החלף את כל פתרון החסימה בתמיסת נוגדן ראשונית 50-100 μL /well (דילול של 1:1000 של נוגדן עכבר חד שבטי נגד ppERK בבלוק סרום). דגימות דגירה O / N (>16 שעות) ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר.
- לשטוף את פתרון הנוגדנים העיקרי עם MAB-D-T 5×5 דקות.
- דגימות דגירה בתמיסת נוגדנים משנית (Alexa Fluor 597 עז נגד עכבר IgG2b (1:200) ו Hoechst 33342 (1:5000) ב MAB-D-T) O /N ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר או במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
הערה: החל משלב זה, לכסות את צלחת 64-well עם רדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור של נוגדנים משניים שטופלו דגימות.
אזהרה: הוצ'סט 33342 הוא חומר מסרטן פוטנציאלי. יש להשתמש ב- PPE מתאים בעת הטיפול. - לשטוף את פתרון הנוגדנים המשני עם PBS-Tw 3×5 דקות.
- לתקן דגימות עם PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את התיקון עם PBS-Tw ו דגימות שיווי משקל בתוך 60% גליצרול. הר explants על שקופיות מיקרוסקופ עם לק ציפורניים ו 60% גליצרול להדמיה. לתוצאות חיסוניות מייצגות ראו איור 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר culturing גיאומטרי שטוח של זנב זברה חי explants. תרבית הרקמות מציגה שלושה יתרונות עיקריים על פני עוברים שלמים: 1) שליטה במהירות התארכות הציר, 2) שליטה על מקורות איתות (מורפוגן) שונים על ידי ניתוח פשוט, ו -3) כמעט אובייקטיבי, הגדלה גבוהה והדמיה חיה גבוהה של NA.
תאי שקופית שאינם מטופלים כימית מאפשרים לזנב להאריך את הציר הראשי שלו (איור 2A)על ידי אקטודרם העור העוטף את הרקמה שמתחתיו. כאשר תרביתנו את האקספלנטים בתאי השקופיות המופעלים כימית (עם קולגן מסוג I), אקטודרם העור נמתח ודבק בתא השקופיות, שעצר את התארכות הציר של ההסבר. למרות זאת, הסומיטים המשיכו לפלח (איור 2B, סרטים משלימים S1 ו- S2). כמתואר בפרוטוקול, ניתן לעצור את התארכות הציר גם ישירות על ידי הפעלת לחץ פיזי במהלך תהליך ההרכבה או הרכבה של גישושים בתא שקופיות רדוד יותר. כימות מהירות התארכות הציר תחת מעצורים פיזיים כאלה ניתן למצוא בעבודה שלנו שפורסמו בעבר5.
איור 2: שליטה בהארכת הציר ב- Explants. (A) Explants בתרבית בתא שקופיות רגיל (משמאל) מוארכים באופן אקסינלי כשהם ממשיכים לפלח סומיטיות חדשות. אור משודר (שמאל, גווני אפור) ותמונות סמן גרעיני מהונדס (ימין, אדום) מוצגות למשך 2 שעות של תרבות. (B)הפעלת תא השקופיות באופן כימי עם קולגן מסוג I לפני שהתארכות הצירים מעכבת את התארכות הצירים, אך אינה משפיעה על מהירות הפילוח הסומית. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר.
שנית, explants יכול להיות תרבותי על ידי ניתוח מקורות של מורפוגנים כדי לזהות מידע מאלף שהם מספקים עבור תהליכים התפתחותיים. כאן אנו מציגים שלוש תמונות למופת המציגות את ההשפעה של ניתוחים על רמות האיתות של ppERK (איור 3). ברקמת PSM נקבע שיפוע איתות FGF מהגבי לאנטריור (לקרוא על ידי רמות ppERK). רק רקמת ניצן הזנב מתמללת באופן פעיל fgf86 ומהווה מקור עבור שיפוע זה בעזרת דיפוזיביות ליגנד FGF5. קליטת הזנב מפספסת את חלק ניצן הזנב של הרקמה לאחר ניתוח (איור 3C)גורמת למדרג ppERK קצר יותר (איור 3B, 3D). בניגוד, שיפוע חומצה רטינואית הוקמה מן הצד השני אל האחורי הן PSM ואת הרקמה העצבית הגבית. לאחרונה נוצר somites ואת הקצה החלקני של PSM אקספרס חומצה רטינואית (RA) סינתזה אנזימים ולפעול כמקור עבור שיפוע RA7. כאשר ניתחנו את רקמת ה-PSM החיצונית באקסלנטים(איור 3E),עדיין ראינו היקף תקין של שיפוע ppERK (איור 3F) כפי שניתן לראות על ידי immunostaining. ניצול מפורט של כוח זה של שיטת explant ניתן למצוא במחקר האחרון שלנו5.
שלישית, explants זברה רכוב שטוח הם אופטימליים עבור תצפית חיה ברזולוציה גבוהה של morphogenesis רקמה. כאן אנו מציגים סרט (וידאו 4) נלקח עם explant מהונדס המבטא EGFP כסמן קרום התא (בצבע כוזב עם אדום) ומוכתם עם סמן גרעיני תא אדום רחוק (בצבע כוזב עם ציאן). ללא כימות נוסף, תהליכים רבים כגון חדירה של אבות neuromesodermal לתוך ניצן הזנב, תנועתיות גבוהה יותר של תאים PSM האחורי לעומת הקדמון, אפיתלליזציה של תאי גבול סומיטיים ניתן לראות ישירות בסרט.
איור 3: כשל חיסוני של Explants זנב. (A) PSM מלא explants עם מעברי צבע איתות שלמים לאורך PSM כפקד. (B)מעבר צבע רגיל ppERK נצפתה PSM מלא explants עם immunostaining. (C)ניצן זנב ניתוח explants חסרים חלק מרכזי של מקור איתות FGF האחורי. (D)אות ppERK מוגבל מאוד אחורית נצפתה ב explants ניצן הזנב מנותח. (ה)PSM TERIor ורקמות סומיטיות ניתן לנתח החוצה כדי להסיר את המקורות עבור גורמי איתות PSM PSM אפשריים כגון איתות RA. (F) הסרת PSM מזערית אינה משנה את ההיקף הרגיל של מעבר צבע ppERK. רקמות תוקנו 2 שעות לאחר explanting עבור פרוטוקול immunostaining. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר.
סרט 1: התארכות ציר ופילוח סומיט ב Explants 3D. Widefield משודר אור (למעלה) גרעיני מקומי GFP (אדום בצבע כוזב) epifluorescence (למטה) זמן לשגות תמונות של תא שקופיות רגיל שטוח רכוב explant. רקמת הזנב הוסברה מעובר בשלב 13 סומיטי. רכישת תמונה מתבצעת במיקרוסקופ הפוך עם מרווחי מסגרת של 3 דקות. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר.
סרט 2: התארכות ציר תקועה בתא שקופיות המופעל כימית. Widefield משודר אור (למעלה) ו גרעיני מקומי GFP (אדום בצבע כוזב) epifluorescence (למטה) זמן לשגות תמונות של explant שטוח רכוב. 11 somites שלב העובר explant היה רכוב על תא שקופיות מצופה פתרון קולגן זנב חולדה במשך 30 דקות לפני ההרכבה. רכישת תמונה מתבצעת במיקרוסקופ הפוך עם מרווחי מסגרת של 3 דקות. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר.
סרט 3: הרכבה רוחבית של קללות עובר בשלב מאוחר. Widefield משודר אור (שמאל) ו גרעיני מקומי GFP (אדום בצבע כוזב) epifluorescence (ימין) זמן לשגות תמונות של תא שקופיות רגיל רכוב לרוחב explant. רקמת הזנב הוסברה מעובר בשלב 15 סומיטי ותמיסת הטריקאין שימשה להרדמה. רכישת תמונה מתבצעת במיקרוסקופ הפוך עם מרווחי מסגרת של 3 דקות. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר.
סרט 4: הדמיה ברזולוציה של תא יחיד של קללות זנב. הדמיה קונפוקלית של זמן לשגות של explant המבטא EGFP כמו סמן קרום (אדום בצבע כוזב) ואדום רחוק מוכתם גרעינים בחיים (ציאן בצבע כוזב). הקרנת עוצמת ממוצעת מ-5 שכבות z (10 מיקרומטר) מוצגת בסרט במשך שעה. רכישת תמונה מתבצעת על מיקרוסקופ קונפוקל הפוך גלאי GaAsP עם 40× אפוכרומטי 1S DIC-מים טבילה 1.15 NA עדשה אובייקטיבית, עם מרווחי מסגרת 4 דקות. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של טכניקת explant תרבות רקמה שפיתחנו והשתמשנו לאחרונה5 עבור עוברי זברה. הטכניקה שלנו מתבססת על שיטות ההסבר הקודמות בחומוס8 ובזברפיש9,10,11 אורגניזמים מודל. גישושים זנב מוכן עם פרוטוקול זה יכול לשרוד כל עוד >12 שעות בתא שקופיות פשוט, ממשיך להאריך את ציר הגוף העיקרי שלה ופילוח somites, עד סוף somitogenesis.
יש לתת טיפול כדי לשמור על רקמת explant בריא בהצלחה התארכות במשך זמן רב. ראשית, יש לנתח את הרקמה מבלי לפגוע בשלמות הרקמות האחוריות. הבחנו כי תאי העור מספקים כיס לתאי אב neuromesodermal חודר לתוך tailbud האחורי. אם העור של explants מקבל קלוף את התאים האלה מאוד motile, להשאיר את רקמת tailbud לנדוד אחורית על כריכה מעבר לגבולות הרקמה. שנית, מתח בינוני לא מאוזן של רקמת העור יכול לגרום התארכות ציר מתפצל, אשר יכול לכופף את הציר של PSM ו notochord. חתך קצר חתוך שנעשה לתאי העור האגפים משני צידי האקספלנט עוזר להקל על דאגה זו. מלבד החששות הרלוונטיים לעור, יש להקדיש תשומת לב נוספת לשמירה על הסטריליות של אמצעי הצמיחה והניתוח לתרבויות ארוכות יותר.
בזהירות נאותה, התרבות המוסברת מסכבת מחדש את הצמיחה הבריאה של עוברים שלמים. ראינו עוויתות שרירים ב explants החל מ 20 במה somites כמו בעוברים שלמים12. למרות שהתמקדנו ברקמת PSM לחקר פילוח סומיטי, רקמות סמוכות כגון אקטודרם העור, שדרית עצבית (מוט עצבי מאוחר יותר וצינור עצבי), נוטוקור, מסודרם צלחת ביניים ולרוחב גם להישאר שלם בתנאי culturing המתוארים (איור 1B). זה יתרון במיוחד עבור רקמות מוסתרות על ידי החלמון שניתן לדמיין ברזולוציה גבוהה ב explants רכובים על גחון, כגון notochord, Vesicle של קופר ורקמות אחרות המתפתחות בשלבי פילוח12. יודגש כי מערכת ההסבר אינה צומחת מהר כמו עוברים שלמים, ואינה חוצה סומיטיות באותו קצב כמו עוברים שלמים. מגבלה זו עבור מערכת explant יכול גם לשנות את הדינמיקה הזמנית של אירועים אחרים unobserved כאן.
כאן, הצגנו תוצאות מייצגות המדגישות שלושה יתרונות עיקריים של מערכת explant הזנב על פני ניסויי עוברים שלמים. לאחרונה השתמשנו בשיטה זו כדי להתיר תפקידים מאלפים של התארכות ציר ממדרגי מורפוגן עבור פילוח סומייט5. התקדמות מאוחרת במיקרוסקופיית יריעות אור הפכה הדמיה חיה של עובר שלם לאפשרית13 עבור מספר אורגניזמים מודל. אבל רוב השיטות הללו עדיין חסרות פתרון תת-תאי מתאים ובקושי נגישות לקהילת המחקר הרחבה יותר. מודל הסבר הזנב המתואר כאן הופך הדמיה חיה ברמת הרקמה ברזולוציה תת-תאית לנגישה עם מיקרוסקופים הפוכים או קונפוקליים פשוטים. מלבד יתרונות מתודולוגיים, הדמיה חיה כזו יכולה לספק תובנות על פילוח ציר הגוף החולייתני האחורי. שמירה על הפרוטוקול ישיר ונגיש ככל האפשר, מערכת explant יכול גם להועיל לתחום ביולוגיה התפתחותית zebrafish רחב יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף ולא להצהיר על ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים למתקן הליבה של AECOM Zebrafish ולשירותים הווטרינריים לילדים בסינסינטי על תחזוקת הדגים, ליבת ההדמיה לילדים בסינסינטי על הסיוע הטכני, דידר ספירוב על הסיוע בהפקת וידאו וחנה סיוול על עריכת כתב היד. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R35GM140805 כדי E.M.Ö. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | for dechorionating embryos and manipulations |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | for immunostaining |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | for tissue dissection media |
| Calcium Chloride Anhydrous, Powder | Sigma-Aldrich | 499609 | for tissue dissection media |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | for immunostaining |
| Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel | Integra-Miltex | MIL4-411 | for preparing tape slide wells |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | additional for tissue culture media |
| Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | secondary antibody for immunostaining |
| L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red | GIBCO | 21083-027 | for tissue dissection media |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | for immunostaining |
| Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade | Surgical Specialties | 72-2863 | for tissue dissection |
| Mouse monoclonal anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | for ppERK immunostaining |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (optional) for live staining of cell nuclei |
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | for fixation of samples for immunostaining |
| Rat Tail Collagen Coating Solution | Sigma-Aldrich | 122-20 | (optional) for chemically activating slide chambers |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (optional) for temperature control during live imaging |
| Transparent Tape 3/4'' | Scotch | S-9782 | for preparing tape slide wells |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | for immunostaining |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunostaining |
| Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
References
- Assheton, R. Growth in length: Embryological Essays. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , University of Oregon Press. Oregon. (1995).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (1700003), (2017).
- Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish. Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).
- Dubrulle, J., Pourquié, O. fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo. Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).
- Diez del Corral, R., et al. Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension. Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).
- Stern, H. M., Hauschka, S. D. Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants. Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M.
- Manning, A. J., Kimelman, D. Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors. Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
