Summary
هنا، نقدم بروتوكول زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد لمحور الجسم الخلفي لسمك الحمار الوحشي، مما يتيح الدراسة الحية للتجزئة الفقارية. يوفر هذا النموذج explant السيطرة على استطالة المحور، وتغيير مصادر مورفوجين، والتصوير الحي على مستوى الأنسجة دون الخلوية.
Abstract
الأجنة الفقارية نمط محور الجسم الرئيسي كما السخام المتكررة، والسلائف من الفقرات والعضلات والجلد. Somites الجزء تدريجيا من mesoderm presomitic (PSM) كما نهاية ذيل الجنين elongates الخلفي. سوميتس شكل مع دورية منتظمة وحجم في الحجم. حمار وحشي هو كائن نموذجي شعبية كما هو قابل للسحب وراثيا والأجنة الشفافة التي تسمح للتصوير الحي. ومع ذلك ، خلال تكوين السميتوجين ، يتم لف أجنة الأسماك حول صفار كبير مستدير. تحد هذه الهندسة من التصوير الحي لأنسجة PSM في أجنة سمك الحمار الوحشي ، خاصة في القرارات الأعلى التي تتطلب مسافة عمل موضوعية وثيقة. هنا ، نقدم طريقة زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد المسطحة للتصوير الحي لمخلفات ذيل الحمار الوحشي. تحاكي النباتات الخلفية الأجنة السليمة من خلال عرض تباطؤ نسبي في استطالة المحور وتقصير أطوال السوسميت الوردية. نحن قادرون على المماطلة سرعة استطالة محور من خلال ثقافة explant. وهذا، للمرة الأولى، يمكننا من فك المدخلات الكيميائية لتدرجات الإشارات من الإدخال الآلي للاستطالة المحورية. في الدراسات المستقبلية ، يمكن الجمع بين هذه الطريقة مع إعداد microfluidic للسماح بالاضطرابات الصيدلانية التي يتم التحكم فيها زمنيا أو فحص تجزئة الفقاريات دون أي مخاوف من اختراق الأدوية.
Introduction
يستخدم التقسيم الميتاميري للكائنات الحية على نطاق واسع في الطبيعة. الهياكل المتكررة ضرورية لوظائف الأعضاء الجانبية مثل الفقرات والعضلات والأعصاب والأوعية والأطراف أو الأوراق في خطة الجسم1. نتيجة لمثل هذه القيود الفسيولوجية والهندسية للتماثل المحوري ، فإن معظم فيلا بيلاتيريا - مثل الأنليدس والمفصليات وتجزئة عرض chordates من أنسجة الجنين (على سبيل المثال ، ectoderm ، mesoderm) antero-posteriorly.
تجزئ الأجنة الفقارية بشكل متسلسل مؤشر منتصف العمر المحوري على طول محور الجسم الرئيسي إلى زحمات مع فترات محددة للأنواع والأعداد وتوزيعات الحجم. على الرغم من هذه المتانة بين الأجنة الفردية داخل الأنواع ، فإن تجزئة السوسميت متعددة الاستخدامات بين الأنواع الفقارية. يحدث التقسيم في نظام واسع من الفواصل الزمنية (من 25 دقيقة في حمار وحشي إلى 5 ساعة في البشر) ، والأحجام (من ~ 20 ميكرومتر في ذيل somites من حمار وحشي إلى ~ 200 ميكرومتر في سومتس الجذع من الفئران) والتعول (من 32 في حمار وحشي إلى ~ 300 في ثعابين الذرة)2. والأكثر إثارة للاهتمام أن أجنة الأسماك يمكن أن تتطور في مجموعة واسعة من درجات الحرارة (من ~20.5 درجة مئوية إلى 34 درجة مئوية لسمك الحمار الوحشي) مع الحفاظ على السخامات سليمة مع توزيعات الحجم المناسبة من خلال التعويض عن كل من فترات التقسيم وسرعات الاستطالة المحورية. وإلى جانب هذه السمات المثيرة للاهتمام، يبقى سمك الحمار الوحشي ككائن حي نموذجي مفيد لدراسة التقسيم في الفقاريات بسبب التطور الخارجي المتزامن والشفاف لكثرة الأجنة الشقيقة وكذلك أدواتها الوراثية التي يمكن الوصول إليها. من منظور المجهر ، تتطور أجنة teleost على صفار كروي ضخم ، وتمتد وتتقريب الأنسجة الغازية حوله(الشكل 1A). في هذه المقالة، نقدم ثقافة explant الأنسجة ثلاثية الأبعاد بالارض لذيول حمار وحشي. هذا النظام explant يتحايل على القيود الكروية من كتلة صفار، مما يسمح بالوصول إلى التصوير الحي عالية الدقة من أجنة الأسماك لأنماط السوسميت.
الشكل 1:نظام Explant غرفة الشريحة لأجنة حمار وحشي. (أ) أجنة حمار وحشي لها مزايا للتصوير الحي، مثل شفافية الأنسجة الجنينية الغازية (الأزرق)، ولكن الأنسجة تتشكل حول كتلة صفار كروية ضخمة (صفراء) تمنع التصوير شبه الموضوعي وعالي الدقة في الأجنة السليمة. يمكن تشريح النباتات السابقة الذيل بدءا من سكين المجهرية (البني) قطع من الأنسجة الأمامية من السخام (الأحمر) والاستمرار على الحدود مع صفار الخلفي. (ب)يمكن وضع البهلوات الذيل تشريح على غطاء (الأزرق الفاتح) dorsoventrally; الحفاظ على الأنسجة العصبية (رمادي فاتح) على أعلى وnochord (رمادي داكن) في الجزء السفلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتضمن هذا البروتوكول استخدام الأجنة الفقارية الحية التي تقل فترة ما بعد الإخصاب بيوم واحد. وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات بموجب المبادئ التوجيهية الأخلاقية للمركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال؛ تمت مراجعة البروتوكولات الحيوانية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (البروتوكول رقم 2017-0048).
1. جمع الأجنة
- إعداد أزواج من حمار وحشي في خزانات العبور في الليلة السابقة ليوم جمع الجنين. للتحكم الدقيق في تطور الجنين، استخدم الحواجز بين أزواج التزاوج.
- رفع الحواجز قبل وقت التفريخ المفضل وجمع البيض في غضون 15 دقيقة في طبق بيتري 100 ملم.
- تنظيف الحطام من طبق بيتري. إذا تم جمع أكثر من 50 جنينا من مخلب واحد، وتقسيم مخلب إلى أطباق بيتري متعددة وفقا لذلك.
- احتضان الأجنة في مياه نظام الأسماك عند 28 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة 50٪ من الإبضاء (5 ساعات بعد الإخصاب). ويمكن أيضا استخدام وسيلة موحدة لنمو الأجنة مثل E3 بدلا من مياه نظام الحوض حتى الخطوة 3.2.
- إزالة البويضات غير المخصبة تحت مجسم ونقل الأجنة إلى حاضنة 23.5 درجة مئوية بين عشية وضحاها (O / N). يجب أن تكون الأجنة في مرحلة 8-10 somites في صباح اليوم التالي لجمع.
2. إعداد الأداة
- تعقيم شفرة سكين microsurgery، نصائح إبرة (تستخدم لتشريح الأنسجة)، والزجاج باستور ماصة عن طريق نقع في الإيثانول 100٪ (EtOH) والزجاج النار.
- استخدم طبقتين من الشريط الشفاف (سمك 100-120 ميكرومتر تقريبا) على شرائح مجهر مقاس 25 مم × 75 مم. قطع ~ 18 ملم × 18 ملم آبار مربعة في وسط الشريط كل شريحة تغطي مع مشرط.
- امسح غرف الشرائح المعدة باستخدام 70٪ EtOH. هذه الآبار سوف تعقد ~ 40 ميكرولتر من المتوسطة.
3. إعداد العينة
- الأجنة dechorionate باستخدام غيض من اثنين من المحاقن إبرة تحت مجسمة. نقل الأجنة إلى طبق بيتري منفصلة مع مياه نظام السمك لشطف.
- باستخدام زجاج معقم مزجج النار باستور ماصة، نقل الأجنة في طبق بيتري 6 سم التي تحتوي على وسيط تشريح (Leibovitz-15 خلية متوسطة الثقافة مع L-الجلوتامين دون فينول الأحمر، 0.8 mM CaCl2 و 1× محلول مضاد للمضادات الحيوية المضادة للميكويت).
ملاحظة: متابعة استخدام ماصة زجاجية معقمة لكافة عمليات النقل التالية هذه الخطوة.- استخدام طبق بيتري الزجاج لإجراء explanting لتجنب رقائق البوليسترين أثناء تشريح.
- وضع 50 ميكرولتر من الأنسجة المتوسطة النمو (تشريح المتوسطة، و 10٪ FBS) في غرفة الشريحة.
- تثبيت الجنين لتشريح تحت مجسمة مع طرف إبرة عند تقاطع صفار الأنسجة بالقرب من الدماغ الخلفي.
- الحفاظ على الأنسجة الجنينية مستقرة مع إبرة، واستخدام سكين المجهرية مع شفرة عقد في 45° لقطع الأنسجة الأمامية إلى الدماغ الخلفي وبصرف النظر وقشر صفار قبالة الأنسجة الجنينية بدءا من الأمامي والتحرك نحو برعم الذيل(الشكل 1A).
ملاحظة: يجب الحرص على عدم فقدان أنسجة الجلد أثناء تنظيف صفار. سوف يقشر الجلد بسهولة كأنسجة مرنة طبقة واحدة حول الجنين أثناء التشريح ، لذلك من السهل التعرف عليه. - بمجرد إزالة الصفار بالكامل من الجسم الجنيني ، اقطع أنسجة الجلد المحيطة من ذيله. الحفاظ على آخر شكل 3-4 somites سليمة، وقطع الأنسجة الأمامية أكثر من (كامل محور explant).
- يجب أن يخرج الصفار سليما بشكل رئيسي من هذا الإجراء. في حالة تمزق الصفار ، يمكن أن تبقى حبيبات كبيرة من الصفار متصلة بالسطح البطني للأنسجة. إذا كان الأمر كذلك، استخدم أداة جلدة لتنظيف حبيبات صفار المتبقية بلطف.
ملاحظة: عدم توازن أنسجة الجلد على الجوانب الجانبية للانحلال لن يسمح للأنسجة بالحفاظ على اتجاه نمو مستقيم. وexplant بدلا من ذلك ينحني نحو جانب الجلد أكثر امتدت. يمكن تصحيح هذا الخلل تحت المجسمة عن طريق تمزق طبقة الجلد بمساعدة سكين الجراحة الدقيقة. - بالنسبة للمقشرات الخالية من الجلد، اضغط على طرف من طبقة الجلد بإبرة وقشر الأنسجة بسكين الجراحة الدقيقة. هذه النباتات الملحقة لن تطيل محور جسمها في الثقافة.
- بالإضافة إلى explants المحور الكامل، يمكن إجراء explants بديلة في هذه الخطوة. على سبيل المثال ، تشريح السخامات المجزأة بالفعل باستخدام السكين المجهرية (النباتات الكاملة PSM) أو تشريح PSM في نصفها الأمامي (نصف PSM explants). يرجى الاطلاع على الفرع 5-1 للاطلاع على تطبيق هذه البدائل.
- يجب أن يخرج الصفار سليما بشكل رئيسي من هذا الإجراء. في حالة تمزق الصفار ، يمكن أن تبقى حبيبات كبيرة من الصفار متصلة بالسطح البطني للأنسجة. إذا كان الأمر كذلك، استخدم أداة جلدة لتنظيف حبيبات صفار المتبقية بلطف.
- نقل على الفور explant تشريح إلى 22 ملم × 22 ملم coverslip التي سيتم إجراء التصوير.
- ترتيب شقة explant على محور الظهر، الجانب البطني لمس غطاء(الشكل 1B). إزالة بلطف وسائل الإعلام الزائدة حول explant الأنسجة باستخدام ماصة تلميح 20 ميكرولتر تصفيتها.
ملاحظة: تأخر نقل النباتات المسلخة إلى غطاء يؤدي إلى تشوهات في الأنسجة، كما يتم تخفيفه من القيود الهندسية للصفار.
- ترتيب شقة explant على محور الظهر، الجانب البطني لمس غطاء(الشكل 1B). إزالة بلطف وسائل الإعلام الزائدة حول explant الأنسجة باستخدام ماصة تلميح 20 ميكرولتر تصفيتها.
- بسرعة وبعناية الوجه coverslip مع explant على نمو متوسطة شغل غرفة الشريحة.
- لمنع تشكيل فقاعة، ضع جانبا من غطاء مربع على غرفة الشريط والإفراج عن الجانب الآخر بلطف. الحرص على عدم نقل / تشوه explant في هذه الخطوة.
- قم بإزالة نزيف الوسائط الزائدة بلطف من الغرفة عن طريق الضغط على غرفة الشريحة على نسيج مختبري. سوف يجلس غطاء الأغطية بشكل ثابت على غرفة الشريحة للتصوير الحي ، بسبب التوتر السطحي للوسط السائل دون أي ختم.
- لغرس على المدى الطويل (>6 ساعات)، استخدم غرفة أكبر. 22 مم × 50 مم يمكن استخدام الأغطية المستطيلة جنبا إلى جنب مع اثنين من الممرات المتوازية من طبقات الشريط على الشرائح في مثل هذه الحالات. ويمكن ترك فجوة ~ 1 ملم واسعة في ما بين اثنين من الممرات الشريط لتسهيل الوصول إلى الهواء في المتوسط النمو.
- كرر الخطوات 3.3-3.8 لإعداد المزيد من النباتات السابقة. سوف explants أعدت استطالة محور الجسم A-P بمتوسط ~ 30 ميكرومتر / ساعة السرعة والجزء السخام مع فترات ~ 40 دقيقة في 25 درجة مئوية (الشكل 2A، فيديو 1).
- بالنسبة للنباتات غير الممدودة، ضع ضغطا لطيفا على جانبي الشريحة التي تحمل العينة في الخطوة 3.8.2 أثناء امتصاص الوسائط الزائدة على نسيج مختبري. بدلا من ذلك، يمكن استزراع explants في حجرات الشرائح طبقة شريط واحد. أيضا، تفعيل كيميائيا سطح غرفة الشريحة مع نوع I الكولاجين سيؤدي إلى explants غير ممدود (الشكل 2B،فيديو 2).
- قم بطلاء الغرفة باستخدام الكولاجين من النوع الأول مقدما من خلال تغطية غرف الشرائح بالكامل مع 15-20 مل من محلول الكولاجين قبل التكميل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. استخدام غطاء محرك السيارة تدفق صفح لهذا البروتوكول للحفاظ على العقم. غرف شطف بعناية مع وسيط تشريح في نهاية المطاف.
- للأجنة الأكبر سنا من 15 مرحلة سوميت، جبل الذيل explant الأنسجة أفقيا بدلا من شقة (dorsoventral) جبل (فيديو 3). لمنع ارتعاش العضلات، وتشمل 0.004٪ حل tricaine في وسائل الإعلام الثقافة كعامل مخدر3.
- بالنسبة للنباتات غير الممدودة، ضع ضغطا لطيفا على جانبي الشريحة التي تحمل العينة في الخطوة 3.8.2 أثناء امتصاص الوسائط الزائدة على نسيج مختبري. بدلا من ذلك، يمكن استزراع explants في حجرات الشرائح طبقة شريط واحد. أيضا، تفعيل كيميائيا سطح غرفة الشريحة مع نوع I الكولاجين سيؤدي إلى explants غير ممدود (الشكل 2B،فيديو 2).
4. الحصول على صورة حية
- عينات الصورة إما على نطاق تشريح للتصوير الضوئي المنقول على نطاق واسع من أحجام وفترات تجزئة السوسميت ، أو مع الإضاءة المنظمة / المجهر ورقة confocal / ضوء باستخدام خطوط السمك مراسل المعدلة وراثيا.
- توازن درجة حرارة النباتات الأنسجة مع درجة حرارة غرفة التصوير لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- للتحكم في درجة الحرارة بدقة أكبر، استخدم نظام التحكم التجاري في درجة الحرارة المثبت على مجهر مقلوب.
- تعيين فواصل إطار الحصول على الصورة إلى 2 - 10 دقيقة اعتمادا على العملية البيولوجية للاهتمام.
ملاحظة: تجزئة سوسميت حمار وحشي عملية سريعة تتراوح بين 20 - 55 دقيقة لدرجات حرارة قابلة للحياة من 30 درجة مئوية إلى 21.5 درجة مئوية في الأجنة الكاملة. سوف Explants استطالة والجزء ~ 30٪ أبطأ من الأجنة كلها.- انتبه إلى ترك ما يكفي من التأخير بين مجموعات من عمليات الاستحواذ على القناة لتجنب السمية الضوئية المحتملة للأنسجة الحية. لا تعرض النسيج لشعاع الإثارة لأكثر من نصف مدة التصوير وخفض كثافة الحزمة قدر الإمكان.
ملاحظة: تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هو عموما السبب الرئيسي للسمية الضوئية في العينات الحية4. حمض الأسكوربيك كما زبال ROS يمكن أن تستكمل إلى متوسط النمو في تركيز 4 MM لحاجز نشاط ROS وتخفيف السمية الضوئية. قد يكون من الصعب ملاحظة الآثار الضارة للسمية الضوئية أثناء التصوير الحي. النباتات الخلفية مفيدة في هذا الجانب لأن بعض العلامات البصرية للسمية الضوئية مثل اعتقال ميتوتيك ، وعرقلة نمو الأنسجة (أي تشكيل السخام ، استطالة الذيل) ، والأنسجة المتفككة أسهل في الملاحظة. يرجى الرجوع إلى المرجع4 المقدم لإجراء مناقشة مفصلة.
- انتبه إلى ترك ما يكفي من التأخير بين مجموعات من عمليات الاستحواذ على القناة لتجنب السمية الضوئية المحتملة للأنسجة الحية. لا تعرض النسيج لشعاع الإثارة لأكثر من نصف مدة التصوير وخفض كثافة الحزمة قدر الإمكان.
- استخدم أجنة حقن الحمض النووي الريبي أحادية المرحلة من الخلية للحصول على صور رباعية الأبعاد مخصصة لتقسيمها وتحليلها على مستوى الدقة الخلوية.
- استخدام 300 pg من الحمض النووي الريبي من الأغشية المنسوخة في المختبر وعلامة المراسلة الفلورية النووية plasmids مثل pCS-membrane-ceruleanFP (أدجين بلازميد #53749) أو pCS-memb-mCherry (أدجين 2000 #53750 البلازميد) بالاشتراك مع جهاز pCS2+ H2B-mTagBFP2 (#99267 أدجين بلازميد) أو جهاز pCS2+ H2B-TagRFP-T (#99271 أدجين بلازميد) في الحقن. للحصول على عينة الفيلم مع غشاء الخلية وعلامات النوى يرجى الاطلاع على الفيديو 4.
ملاحظة: يبلغ متوسط حجم الخلية من أنسجة PSM حوالي ~ 5 ميكرومتر في القطر ، منها نواة تضم ~ 3 - 4 ميكرومتر. يجب تسجيل حجم بكسل ~0.5 ميكرومتر وقسم z من ~ 1 ميكرومتر لتقسيم الخلايا بشكل صحيح.
- استخدام 300 pg من الحمض النووي الريبي من الأغشية المنسوخة في المختبر وعلامة المراسلة الفلورية النووية plasmids مثل pCS-membrane-ceruleanFP (أدجين بلازميد #53749) أو pCS-memb-mCherry (أدجين 2000 #53750 البلازميد) بالاشتراك مع جهاز pCS2+ H2B-mTagBFP2 (#99267 أدجين بلازميد) أو جهاز pCS2+ H2B-TagRFP-T (#99271 أدجين بلازميد) في الحقن. للحصول على عينة الفيلم مع غشاء الخلية وعلامات النوى يرجى الاطلاع على الفيديو 4.
5. التثبيط المناعي للنباتات السابقة الذيل
ملاحظة: الأنسجة نمت بعد سيناريوهات تشريح مختلفة (ممدود، غير ممدود، ذيل برعم تشريح، نصف PSM الخ) كما شقة محمولة الذيل explants 5 يمكن استردادها من غرف الشريحةلمزيد من القياس الكمي المناعي من البروتينات ذات الاهتمام. هنا، نقدم البروتوكول المستخدم لإشارة خارج الخلية دي الفوسفورية ينظم كيناز (ppERK) تلطيخ من النباتات الخارجية كما FGF إشارة قراءات التدرج.
- بعد تشكيل somites حتى المرحلة المطلوبة، تحول بحذر coverslip في منتصف الطريق إلى زاوية غرفة الشريحة دون رفع.
- مع مساعدة من ~ 100 ميكرولتر من المتوسط تشريح التكميلية في ماصة باستور الزجاج، واستعادة explants من الشريحة ونقلها إلى لوحة ثقافة الخلية 64 جيدا.
ملاحظة: بدءا من هذه الخطوة، يمكن إجراء كافة الحلول البديلة ضمن نطاق تشريح مع ماصة زجاجية منفصلة لعينات ثابتة. وهذا يضمن عدم فقدان الأنسجة explant في الآبار أو نقلها في ما بين. - بعد نقل جميع explants، تمتص المتوسطة المفرطة من الآبار واحدا تلو الآخر ووضع 100 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني (PFA) في كل بئر.
تحذير: PFA هو محلول سام مع آثار مسرطنة. وينبغي استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء التعامل معها. - إصلاح explants في لوحة 64 جيدا في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على شاكر.
- النباتات الأنسجة هي أكثر حساسية للتشوهات من الأجنة كلها. ضبط سرعة شاكر وفقا لذلك.
- غسل المثبت مع 150 ميكروغرام من PBS-Tw (0.1٪ Tween20 في برنامج تلفزيوني) ثلاث مرات. جمع أول غسل في حاوية محددة "PFA النفايات".
- المجففة explants في 4×5 دقيقة الخطوات عن طريق استبدال ~ 40 ميكرولتر من الحل في كل مرة مع الميثانول 100٪ (MeOH).
تحذير: MeOH هي مادة كيميائية سامة وهي متقلبة و قابلة للاشتعال. العمل في مساحة جيدة التهوية واستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة للتعامل معها. - كخطوة أخيرة من الجفاف، وإزالة جميع الحلول من الآبار واستبدالها مع 100 ميكرولتر من MeOH. حضانة عند -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: استخدام حاوية "MeOH Waste" محددة لتجميع الحلول حتى الخطوة 5.11. - أضف 50 ميكرولتر من MeOH وهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إعادة ترطيب explants في 4×5 دقيقة الخطوات عن طريق استبدال ~ 40 ميكرولتر من الحل في كل مرة مع برنامج تلفزيوني تي (0.1٪ تريتون X 100 في برنامج تلفزيوني). استخدم حاوية "MeOH Waste" محددة لجمع الحلول.
- كخطوة أخيرة للإماهة، قم بإزالة كل الحلول من الآبار واستبدالها ب 100 ميكرولتر من PBS-T.
- لبيرمابيليز الأنسجة علاج explants مع 1.5٪ تريتون X 100 في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
- غسل العينات مع MAB-D-T (0.1٪ تريتون-X 100 المنظفات و 1٪ ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO) في 150 mM NaCl 100 mM حمض ماليك العازلة درجة الحموضة 7.5) 3×5 دقيقة.
تحذير: DMSO قابلة للاشتعال ومتمرد سامة. وينبغي استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء التعامل معها. - احتضان النباتات في محلول حجب مصل 100 ميكرولتر/بئر (2٪ مصل البقر الجنيني في MAB-D-T) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
- استبدال كل حل حجب مع 50-100 ميكرولتر / جيدا حل الأجسام المضادة الأولية (1:1000 تخفيف الأجسام المضادة الماوس أحادية النسيلة ضد ppERK في كتلة المصل). احتضان عينات O / N (>16 ساعة) عند 4 درجة مئوية على شاكر.
- اغسل محلول الأجسام المضادة الأساسي باستخدام MAB-D-T 5×5 دقيقة.
- احتضان العينات في حل الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا فلور 597 الماعز المضادة للفأرة IgG2b (1:200) وهويشست 33342 (1:5000) في MAB-D-T) O / N في 4 درجة مئوية على شاكر أو لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: ابتداء من هذه الخطوة، قم بتغطية لوحة 64 جيدا مع رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء من العينات المعالجة الأجسام المضادة الثانوية.
تحذير: Hoechst 33342 هو مادة مسرطنة محتملة. وينبغي استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء التعامل معها. - غسل حل الأجسام المضادة الثانوية مع برنامج تلفزيوني-Tw 3×5 دقيقة.
- إصلاح العينات مع PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل المثبت مع برنامج تلفزيوني-Tw وعينات متساوية في غضون 60٪ الجلسرين. جبل explants على الشرائح المجهر مع طلاء الأظافر و 60٪ الجلسرين للتصوير. للحصول على نتائج مناعة تمثيلية، يرجى الاطلاع على الشكل 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول يتيح زراعة هندسية مسطحة من النباتات الحية ذيل حمار وحشي. تقدم زراعة الأنسجة ثلاث مزايا رئيسية على الأجنة الكاملة: 1) التحكم في سرعة استطالة المحور ، 2) التحكم في مصادر الإشارات المختلفة (مورفوجين) عن طريق تشريح بسيط ، و 3) شبه موضوعية ، والتكبير العالي والتصوير الحي NA عالية.
غرف الشريحة غير المعالجة كيميائيا تسمح للذيل explant لإطالة محورها الرئيسي(الشكل 2A)من قبل ectoderm الجلد التفاف حول الأنسجة تحت. عندما قمنا باستزراع النتوانات على غرف الشرائح المنشطة كيميائيا (مع نوع الكولاجين الأول) ، امتدت ectoderm الجلد والتزمت بغرفة الشريحة ، والتي أوقفت استطالة المحور للانتثار. على الرغم من هذا، واصلت somites إلى الجزء (الشكل 2B، الأفلام التكميلية S1 و S2). كما هو موضح في البروتوكول، يمكن أيضا إيقاف استطالة المحور مباشرة عن طريق تطبيق الضغط المادي أثناء عملية التركيب أو تركيب النباتات في غرفة الشريحة الضحلة. يمكن العثور على القياس الكمي لسرعة استطالة المحور تحت هذه القيود المادية في عملنا المنشور سابقا5.
الشكل 2: السيطرة على محور استطالة في Explants. (أ) Explants مثقف على غرفة الشرائح العادية (يسار) استطالة axially لأنها تبقي تقسيم somites جديدة. تظهر لقطات الضوء المرسل (اليسار، الرمادي) والعلامة النووية المعدلة وراثيا (يمين، أحمر) لمدة 2 ساعة من مدة الثقافة. (ب)تفعيل كيميائيا غرفة الشريحة مع نوع I الكولاجين قبل زراعة الأكشاك استطالة المحورية ولكن لا يؤثر على سرعة تجزئة سومايت. مقياس الشريط هو 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ثانيا، يمكن استزراع النباتات الخارجية من خلال تشريح مصادر المورفوجينات لتحديد المعلومات المفيدة التي تقدمها للعمليات التنموية. هنا نقدم ثلاث صور مثالية تبين تأثير التشريح على مستويات الإشارات ppERK(الشكل 3). في أنسجة PSM يتم تأسيس تدرج إشارات FGF من الخلفي إلى الأمامي (اقرأه بمستويات ppERK). فقط أنسجة برعم الذيل ينسخ بنشاط fgf86 ويشكل مصدرا لهذا التدرج مع مساعدة من FGF ligand نشر5. tail explants مفقود الجزء برعم الذيل من الأنسجة بعد تشريح (الشكل 3C) النتائج في أقصر ppERK التدرج (الشكل 3B, 3D). على النقيض من ذلك ، يتم إنشاء تدرج حمض الريتينويك من الأمامي إلى الخلفي في كل من PSM والأنسجة العصبية الظهرية. somites شكلت مؤخرا ونهاية الأمامية من حمض الريتينويك PSM صريح (RA) توليف الإنزيمات وتعمل كمصدر للتدرج RA7. عندما قمنا بتشريح أنسجة PSM الأمامية في النباتات السابقة(الشكل 3E)، لاحظنا مدى طبيعي لتدرج ppERK(الشكل 3F)كما تصور من قبل المناعة. ويمكن الاطلاع على استخدام مفصل لهذه القوة من طريقة explant في دراستنا الأخيرة5.
ثالثا، المسطحات الخارجية حمار وحشي محمولة هي الأمثل لمراقبة عالية الدقة الحية من مورفوجينيسيس الأنسجة. هنا نقدم فيلم(فيديو 4)التي اتخذت مع expclelant المعدلة وراثيا التعبير عن EGFP كعلامة غشاء الخلية (الملونة كاذبة مع الأحمر) وملطخة مع علامة نوى الخلية الحمراء البعيدة (الملونة كاذبة مع سماوي). دون مزيد من القياس الكمي ، يمكن ملاحظة العديد من العمليات مثل دخول السلف العصبية في برعم الذيل ، وحركية أعلى لخلايا PSM الخلفية بالمقارنة مع الأمامية ، وظهارة خلايا الحدود السمية مباشرة في الفيلم.
الشكل 3: مناعة من النباتات السابقة الذيل. (أ) النباتات الكاملة PSM مع تدرجات الإشارات سليمة على طول PSM كعنصر تحكم. (ب)لوحظ التدرج ppERK العادية في النباتات الكاملة PSM مع الاحتواء المناعي. (C) ذيل برعم تشريح explants مفقودون جزء كبير من الخلفي FGF مصدر الإشارات. (د)لوحظت إشارة ppERK مقيدة للغاية في برعم الذيل تشريح explants. (ه)يمكن تشريح PSM الأمامي والأنسجة السوميتيكية لإزالة المصادر لعوامل الإشارة الأمامية المحتملة PSM مثل إشارات RA. (F)إزالة PSM الأمامي لا يغير المدى الطبيعي للتدرج ppERK. تم إصلاح الأنسجة 2 ساعة بعد اللانا لبروتوكول المناعة. مقياس الشريط هو 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1: محور استطالة وتجزئة سومايت في Explants 3D. ضوء واسع النطاق المنقولة (أعلى) والنووية المترجمة GFP (أحمر ملون زائف) epifluorescence (أسفل) صور الفاصل الزمني لغرفة الشريحة العادية شقة محمولة على explant. تم استئصال أنسجة الذيل من الجنين في مرحلة 13 سوميتس. يتم إجراء اكتساب الصورة على مجهر مقلوب مع فترات إطار 3 دقائق. مقياس الشريط هو 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
الفيلم 2: توقف محور استطالة على غرفة الشريحة تنشيط كيميائيا. ضوء واسع النطاق المنقول (أعلى) ونووية مترجمة GFP (أحمر ملون زائف) epifluorescence (أسفل) صور الفاصل الزمني للexplant مسطحة محمولة. تم تركيب 11 سومتس مرحلة اكسبلانت الجنين على غرفة الشريحة المغلفة مع محلول الكولاجين ذيل الفئران لمدة 30 دقيقة قبل تصاعد. يتم إجراء اكتساب الصورة على مجهر مقلوب مع فترات إطار 3 دقائق. مقياس الشريط هو 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
الفيلم 3 : تصاعد الجانبية من النباتات الجنين في مرحلة متأخرة. ضوء واسع النطاق المنقول (يسار) وصور GFP المترجمة النووية (أحمر ملون زائف) (يمين) صور الفاصل الزمني لغرفة الشرائح العادية الجانبية المركبة. تم استئصال أنسجة الذيل من الجنين في مرحلة 15 سوميتس واستخدم محلول tricaine كمخددات. يتم إجراء اكتساب الصورة على مجهر مقلوب مع فترات إطار 3 دقائق. مقياس الشريط هو 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
الفيلم 4 : خلية واحدة القرار التصوير من Explants الذيل. التصوير الكونفوشيكال الفاصل زمنيا لإكسبلانت التعبير عن EGFP كعلامة غشاء (أحمر ملون زائف) وأحمر بكثير ملطخة للنوى في العيش (سماوي ملون زائف). يظهر متوسط إسقاط الكثافة من 5 طبقات z (10 ميكرومتر) في الفيلم على مدار ساعة واحدة. يتم إجراء اقتناء الصورة على مجهر غاسب كاشف كونفوجكال مقلوب مع 40× apochromatic λS DIC-المياه الغمر 1.15 NA الهدف العدسة، مع فترات الإطار 4 دقيقة. مقياس الشريط هو 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتقنية زراعة الأنسجة التي طورناها واستخدمناها مؤخرا5 لأجنة حمار وحشي. تقنيتنا يبني على أساليب explant السابقة في الفرخ8 وسمك الحمار الوحشي9،10،11 نموذج الكائنات الحية. يمكن explants الذيل أعدت مع هذا البروتوكول البقاء على قيد الحياة طالما >12 ساعة في غرفة الشريحة بسيطة، والاستمرار في استطالة محور الجسم الرئيسي وتقسيم somites، حتى نهاية somitogenesis.
وينبغي إيلاء الرعاية للحفاظ على الأنسجة explant صحية وإطالة بنجاح لفترات طويلة. أولا، يجب تشريح زراعة الأنسجة دون الإضرار بسلامة الأنسجة الخلفية. لاحظنا أن خلايا الجلد توفر الحقيبة لخلايا السلف العصبية التي تدخل في ذيل الخلفي. إذا كان الجلد من النباتات يحصل مقشر قبالة هذه الخلايا المتحركة للغاية، وترك الأنسجة tailbud وتهاجر الخلفي على coverslip خارج حدود الأنسجة. ثانيا، يمكن أن يؤدي التوتر غير المتوازن بشكل متوسط في أنسجة الجلد إلى استطالة محور متباينة، والتي يمكن أن تثني محور PSM وnochord. قطع قصير الشق المحرز لخلايا الجلد المحيطة على جانبي explant يساعد على تخفيف هذا القلق. وإلى جانب الشواغل المتعلقة بالبشرة، ينبغي إيلاء اهتمام إضافي للحفاظ على عقم وسائط النمو وأدوات التشريح للثقافات الأطول أمدا.
مع الرعاية المناسبة، والثقافة explant يلخص النمو الصحي للأجنة بأكملها. لاحظنا ارتعاشات عضلية في النباتات السابقة تبدأ من 20 مرحلة somites كما هو الحال في الأجنة الكاملة12. على الرغم من أننا ركزنا على أنسجة PSM لدراسة تجزئة السوسميت ، إلا أن الأنسجة المجاورة مثل ectoderm الجلد ، العارضة العصبية (القضيب العصبي في وقت لاحق وأنبوب عصبي) ، notochord ، الوسيطة وال الجانبية لوحة mesoderm تبقى سليمة أيضا في ظل ظروف الزراعة الموصوفة(الشكل 1B). هذا مفيد بشكل خاص للأنسجة التي يحجبها الصفار التي يمكن تصويرها بدقة عالية في النباتات المثبتة في البطن ، مثل نوتوشورد ، الحويئط كوبفر وغيرها من الأنسجة النامية في مراحل التقسيم12. وينبغي التأكيد على أن نظام الزرع لا ينمو بالسرعة التي تنمو بها الأجنة بأكملها، ولا يقسم السخام بنفس وتيرة الأجنة الكاملة. هذا القيد لنظام explant يمكن أيضا تغيير الديناميات الزمنية للأحداث الأخرى غير مراقب هنا.
هنا، قدمنا نتائج تمثيلية تسلط الضوء على ثلاث مزايا رئيسية لنظام زراعة الذيل على تجارب الأجنة بأكملها. لقد استخدمنا هذه الطريقة مؤخرا لفك الأدوار المفيدة للاستطالة المحور من تدرجات مورفوجين للتجزئة سومايت5. جعلت التقدم المتأخر في المجهر ورقة خفيفة الجنين كله التصوير الحي ممكن13 لعدة كائنات نموذجية. ولكن معظم هذه الأساليب لا تزال تفتقر إلى الدقة دون الخلوية المناسبة وبالكاد يمكن الوصول إليها من قبل مجتمع البحوث الأوسع. نموذج explant الذيل الموصوفة هنا يجعل دون الخلوية دقة الأنسجة على مستوى التصوير الحي يمكن الوصول إليها مع المجاهر مقلوبة بسيطة أو confocal. وبصرف النظر عن المزايا المنهجية، يمكن لمثل هذا التصوير الحي أن يوفر رؤى حول تجزئة محور الجسم الفقاري الخلفي. الحفاظ على البروتوكول مباشرة ويمكن الوصول إليها قدر الإمكان، ونظام explant يمكن أن تستفيد أيضا مجال البيولوجيا التنموية حمار وحشي أوسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه ولا يعلنان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر مرفق AECOM Zebrafish Core والخدمات البيطرية للأطفال في سينسيناتي على صيانة الأسماك ، وجوهر تصوير الأطفال في سينسيناتي للمساعدة التقنية ، وديدار ساباروف للمساعدة في إنتاج الفيديو وهانا سيوال لتحرير المخطوطة. تم دعم الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم R35GM140805 إلى E.M.Ö. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | for dechorionating embryos and manipulations |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | for immunostaining |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | for tissue dissection media |
| Calcium Chloride Anhydrous, Powder | Sigma-Aldrich | 499609 | for tissue dissection media |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | for immunostaining |
| Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel | Integra-Miltex | MIL4-411 | for preparing tape slide wells |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | additional for tissue culture media |
| Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | secondary antibody for immunostaining |
| L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red | GIBCO | 21083-027 | for tissue dissection media |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | for immunostaining |
| Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade | Surgical Specialties | 72-2863 | for tissue dissection |
| Mouse monoclonal anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | for ppERK immunostaining |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (optional) for live staining of cell nuclei |
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | for fixation of samples for immunostaining |
| Rat Tail Collagen Coating Solution | Sigma-Aldrich | 122-20 | (optional) for chemically activating slide chambers |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (optional) for temperature control during live imaging |
| Transparent Tape 3/4'' | Scotch | S-9782 | for preparing tape slide wells |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | for immunostaining |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunostaining |
| Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
References
- Assheton, R. Growth in length: Embryological Essays. , Cambridge University Press. Cambridge. (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , University of Oregon Press. Oregon. (1995).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (1700003), (2017).
- Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish. Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).
- Dubrulle, J., Pourquié, O. fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo. Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).
- Diez del Corral, R., et al. Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension. Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).
- Stern, H. M., Hauschka, S. D. Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants. Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).
- Manning, A. J., Kimelman, D. Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors. Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
