Een 3D Tail Explant-cultuur om gewervelde segmentatie bij zebravissen te bestuderen

Summary

Hier presenteren we het protocol voor 3D-weefselkweek van de achterste lichaamsas van zebravissen, waardoor live studie van gewervelde segmentatie mogelijk is. Dit explantmodel biedt controle over de verlenging van de as, wijziging van morfogene bronnen en live beeldvorming op weefselniveau op subcellulair resolutieniveau.

Abstract

Gewervelde embryo's patroon hun belangrijkste lichaamsas als repetitieve somieten, de voorlopers van wervels, spieren en huid. Somieten segmenteren geleidelijk van het presomitische mesoderm (PSM) terwijl het staarteinde van het embryo achterstedig verlengt. Somieten vormen zich met regelmatige periodiciteit en schaal in grootte. Zebravis is een populair modelorganisme omdat het genetisch tracteerbaar is en transparante embryo's heeft die levende beeldvorming mogelijk maken. Niettemin worden tijdens somitogenese visembryo's om een grote, rondende dooier gewikkeld. Deze geometrie beperkt de levende beeldvorming van PSM-weefsel in zebravisembryo's, met name bij hogere resoluties die een nauwe objectieve werkafstand vereisen. Hier presenteren we een afgeplatte 3D-weefselkweekmethode voor levende beeldvorming van zebravisstaart explants. Staart explants bootsen intacte embryo's na door een proportionele vertraging van de verlenging van de as en verkorting van rostrocaudal somietlengtes. We zijn verder in staat om de verlengingssnelheid van de as door de explantcultuur te vertragen. Dit stelt ons voor het eerst in staat om de chemische input van signaalgradiënten te ontwarren uit de mechanistische input van axiale rek. In toekomstige studies kan deze methode worden gecombineerd met een microfluïdische opstelling om tijdgestuurde farmaceutische verstoringen of screening van gewervelde gewervelde segmentatie mogelijk te maken zonder problemen met de penetratie van geneesmiddelen.

Introduction

Metamerische segmentatie van organismen wordt veel gebruikt in de natuur. Herhaalde structuren zijn essentieel voor de functionaliteit van laterale organen zoals wervels, spieren, zenuwen, bloedvaten, ledematen of bladeren in een lichaamsplan¹. Als gevolg van dergelijke fysiologische en geometrische beperkingen van de axiale symmetrie, de meeste phyla van Bilateria-zoals anneliden, geleedpotigen, en chordaten-vertonen segmentatie van hun embryonale weefsels (bijv. ectoderm, mesoderm) antero-posteriorly.

Gewervelde embryo's segmenteren hun paraxiale mesoderm langs de hoofdas van het lichaam achtereenvolgens in somieten met soortspecifieke intervallen, tellingen en grootteverdelingen. Ondanks deze robuustheid tussen individuele embryo's binnen een soort, is somietsegmentatie veelzijdig tussen gewervelde soorten. Segmentatie vindt plaats in een uitgebreid regime van tijdsintervallen (van 25 min in zebravissen tot 5 uur bij mensen), maten (van ~20 μm in staart somieten van zebravissen tot ~200 μm in stam somieten van muizen) en tellingen (van 32 in zebravissen tot ~300 in maïsslangen)². Interessanter is dat visembryo's zich kunnen ontwikkelen in een breed scala aan temperaturen (van ~ 20,5 °C tot 34 °C voor zebravissen) terwijl ze hun somieten intact houden met de juiste grootteverdelingen door zowel segmentatie-intervallen als axiale reksnelheden te compenseren. Naast dergelijke interessante kenmerken blijft zebravis een nuttig modelorganisme om segmentatie bij gewervelde dieren te bestuderen vanwege de externe, synchrone en transparante ontwikkeling van een plenitude van embryo's van broers en zussen en hun toegankelijke genetische hulpmiddelen. Vanuit microscopieperspectief ontwikkelen teleostembryo's zich op een omvangrijke bolvormige dooier, die het gastrulerende weefsel eromheen uitrekt en rondt (figuur 1A). In dit artikel presenteren we een afgeplatte 3D-weefsel explantcultuur voor zebravisstaarten. Dit explantsysteem omzeilt de bolvormige beperkingen van dooiermassa, waardoor toegang wordt verstondkbaar tot live beeldvorming met hoge resolutie van visembryo's voor somietpatronen.

Figuur 1: Slide Chamber Explant System for Zebrafish Embryos. (A) Zebravisembryo's hebben voordelen voor levende beeldvorming, zoals de transparantie van gastrulerend embryonaal weefsel (blauw), maar het weefsel vormt zich rond een omvangrijke bolvormige dooiermassa (geel) die beeldvorming met een hoge resolutie in intacte embryo's voorkomt. Staart explants kunnen worden ontleed beginnend met een microchirurgische mes (bruin) gesneden uit het weefsel voorste van somieten (rood) en verder op de grens met de dooier posteriorly. (B) Ontlede staart explants kunnen op een afdeklip (lichtblauw) dorsoventrally worden geplaatst; het houden van neuraal weefsel (lichtgrijs) aan de bovenkant en notochord (donkergrijs) aan de onderkant. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Protocol

Dit protocol omvat het gebruik van levende gewervelde embryo's jonger dan 1 dag na de bevruchting. Alle dierproeven werden uitgevoerd onder de ethische richtlijnen van cincinnati Children's Hospital Medical Center; dierprotocollen zijn herzien en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol # 2017-0048).

1. Embryo's verzamelen

1. Stel paren zebravissen op in kruisingstanks de avond voor de dag van de embryoverzameling. Gebruik barrières tussen paringsparen voor een nauwkeurige ensceneringscontrole van de embryoontwikkeling.
2. Hef barrières op vóór de gewenste paaitijd en verzamel eieren binnen 15 minuten in een petrischaal van 100 mm.
   1. Reinig vuil van de Petrischaal. Als meer dan 50 embryo's uit één koppeling worden verzameld, splitst u de koppeling dienovereenkomstig in meerdere Petrischalen.
3. Incubeer embryo's in vissysteemwater bij 28 °C tot ze 50% epiboly stadium bereiken (5 uur na de bevruchting). Een gestandaardiseerd embryogroeimedium zoals E3 kan ook worden gebruikt in plaats van het aquariumsysteemwater tot stap 3.2.
   1. Verwijder onbevruchte eieren onder een stereoscoop en verplaats de embryo's 's nachts naar een incubator van 23,5 °C (O/N). Embryo's moeten de ochtend na de ophaaldag om 8-10 somietenstadium zijn.

2. Gereedschapsvoorbereiding

1. Steriliseer het mes van de microchirurgie, naaldpunten (gebruikt voor dissectie van het weefsel) en glazen Pasteur pipet door 100% ethanol (EtOH) en brandbeglazing te weken.
2. Gebruik twee lagen transparante tape (~ 100-120 μm dikte) op 25 mm x 75 mm microscoopglaasjes. Snijd vierkante putten van ~ 18 mm x 18 mm in het midden van de tapebekleding van elke dia met een scalpel.
   1. Veeg de voorbereide schuifkamers af met 70% EtOH. Deze putten bevatten ~40 μL medium.

3. Monstervoorbereiding

1. Dechorionaatembryo's met behulp van de punt van twee naaldspuiten onder een stereoscoop. Breng embryo's over in een aparte petrischaal met water van het vissysteem om af te spoelen.
2. Breng embryo's met een 6 cm petrischaal met dissectiemedium (Leibovitz-15 celkweekmedium met L-Glutamine zonder fenolrood, 0,8 mM CaCl₂ en 1× antimycotische oplossing voor antibiotica over in een steriel glas met vuurglazuur(
   OPMERKING: Blijf een gesteriliseerde glazen pipet gebruiken voor alle overdrachten na deze stap.
   1. Gebruik een glazen petrischaal voor het uitplanten om polystyreenschilfers tijdens dissectie te voorkomen.
3. Plaats 50 μL weefselgroeimedium (dissectiemedium en 10% FBS) in de diakamer.
4. Stabiliseer een embryo voor dissectie onder de stereoscoop met een naaldpunt op het snijpunt van het dooierweefsel in de buurt van de achterwervel.
5. Om het embryonale weefsel stabiel te houden met een naald, gebruikt u het microchirurgische mes met het mes op 45° om het weefsel voorste naar de achterwervel uit elkaar te snijden en de dooier van het embryonale weefsel te pellen, beginnend bij de voorste en bewegend naar de staartknop (figuur 1A).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u het huidweefsel niet verliest tijdens het reinigen van de dooier. De huid zou gemakkelijk afschilferen als flankerend enkellaags elastisch weefsel rond het embryo tijdens de dissectie, dus het is gemakkelijk te herkennen.
6. Zodra de dooier volledig uit het embryonale lichaam is verwijderd, snijdt u het flankerende huidweefsel uit de staartknop. Houd de laatst gevormde 3-4 somieten intact, snijd het meer voorste weefsel eruit (full-axis explant).
   1. De dooier moet er voornamelijk intact uit komen van deze procedure. In het geval van een gescheurde dooier kunnen aanzienlijke korrels dooier aan het ventrale oppervlak van het weefsel blijven gehecht. Gebruik dan een wimpergereedschap om de resterende dooierkorrels voorzichtig af te reinigen.
      OPMERKING: Een onbalans van huidweefsels aan de zijkanten van een explant zou het weefsel niet in staat stellen een rechte groeirichting te behouden. De explant buigt in plaats daarvan naar de zijkant van een meer uitgerekte huid. Deze onbalans kan onder de stereoscope worden gecorrigeerd door de huidlaag te scheuren met behulp van een microchirurgische mes.
   2. Voor huidloze explants, druk op een punt van de huidlaag met naald en pel het weefsel explant af met het microchirurgische mes. Deze explants zullen hun lichaamsas in cultuur niet verlengen.
   3. Naast de full axis explants kunnen bij deze stap alternatieve explants worden gemaakt. Ontleed bijvoorbeeld reeds gesegmenteerde somieten met behulp van het microchirurgische mes (full-PSM explants) of ontleed de PSM in zijn halve anteroposterior (half-PSM explants). Zie punt 5.1 voor de toepassing van dergelijke alternatieve explants.
7. Breng de ontlede explant onmiddellijk over op een afdeklip van 22 mm x 22 mm waarop de beeldvorming zal worden uitgevoerd.
   1. Plaats de explant plat op de dorsoventrale as, de ventrale zijde raakt de afdeklip (Figuur 1B). Verwijder voorzichtig de overtollige media rond de weefselexplant met behulp van een 20 μL gefilterde tippipet.
      OPMERKING: Vertraagde overdracht van ontleedde explants naar de afdeklip resulteert in vervormingen van het weefsel, omdat het wordt ontlast van de geometrische beperkingen van de dooier.
8. Draai de afdeklip met de explant snel en voorzichtig over de met groeimedia gevulde schuifkamer.
   1. Om bellenvorming te voorkomen, plaatst u een kant van de vierkante afdeklip op de tapekamer en laat u de andere kant voorzichtig los. Zorg ervoor dat u de explant in deze stap niet beweegt/vervormt.
   2. Verwijder voorzichtig overtollige mediabloedingen uit de kamer door op de schuifkamer op een laboratoriumweefsel te drukken. De afdeklip zal stabiel op de schuifkamer zitten voor live beeldvorming, vanwege de oppervlaktespanning van het vloeibare medium zonder enige afdichting.
   3. Gebruik voor langdurige cultivering (>6 uur) een grotere kamer. In dergelijke gevallen kunnen rechthoekige coverslips van 22 mm x 50 mm worden gebruikt, samen met twee parallelle rijstroken van tapelagen op dia's. Tussen twee tapebanen kan een ~1 mm brede opening worden gelaten om de luchttoegang tot het groeimedium te vergemakkelijken.
9. Herhaal stap 3.3-3.8 om meer explants voor te bereiden. Voorbereide explants verlengen hun A-P lichaamsas met een gemiddelde snelheid van ~ 30 μm / h en segmenteren hun somieten met ~ 40 minuten intervallen bij 25 °C (Figuur 2A, Video 1).
   1. Voor niet-langwerpige explants, oefen zachte druk uit op de zijkanten van de dia en houd het monster in stap 3.8.2 terwijl u de overtollige media op een laboratoriumweefsel zuigt. Als alternatief kunnen explants worden gekweekt in diakamers met één tapelaag. Ook zal het chemisch activeren van het oppervlak van de diakamer met type I collageen resulteren in niet-langwerpige explants (Figuur 2B, Video 2).
      1. Voer van tevoren de coating van de kamer uit met type I-collageen door de schuifkamers volledig te bedekken met 15-20 ml prediluted collageenoplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Gebruik een laminaire stromingskap voor dit protocol om steriliteit te behouden. Spoel de kamers aan het einde voorzichtig af met dissectiemedium.
   2. Voor embryo's ouder dan 15 somietstadium monteert u het staart explantweefsel lateraal in plaats van een vlakke (dorsoventrale) mount (Video 3). Om spiertrekkingen te voorkomen, moet u 0,004% tricaïneoplossing in de cultuurmedia opnemen als verdovingsmiddel³.

4. Live beeldverwerving

1. Beeldmonsters op een dissectiebereik voor breedveldgetransmitteerde lichtbeeldvorming van somietsegmentatiegroottes en -perioden, of met gestructureerde verlichting/confocale/lichtbladmicroscopie met behulp van transgene reportervislijnen.
2. Equilibreer de temperatuur van weefsel explants met de beeldvorming kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten.
   1. Gebruik voor een nauwkeurigere temperatuurregeling een commercieel temperatuurregelingssysteem dat op een omgekeerde microscoop is gemonteerd.
3. Stel de beeldverwervingsframeintervallen in op 2 - 10 minuten, afhankelijk van het biologische proces van belang.
   OPMERKING: Zebravis somietsegmentatie is een snel proces, variërend van 20 - 55 minuten voor levensvatbare temperaturen van 30 °C tot 21,5 °C in hele embryo's. Explants zullen verlengen en segmenteren ~ 30% langzamer dan de hele embryo's.
   1. Let op om voldoende vertraging achter te laten tussen sets kanaalaanwinsten om mogelijke fototoxiciteit voor levend weefsel te voorkomen. Stel het weefsel niet meer dan de helft van de beeldvormingsduur bloot aan de excitatiestraal en verlaag de straalintensiteit zoveel mogelijk.
      OPMERKING: Accumulatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) is over het algemeen de belangrijkste oorzaak van fototoxiciteit in levende monsters⁴. Ascorbinezuur als ROS-aaseter kan worden aangevuld met groeimedium bij 4 mM-concentratie om de ROS-activiteit te bufferen en fototoxiciteit te verlichten. Nadelige effecten van fototoxiciteit kunnen moeilijk op te merken zijn tijdens live beeldvorming. Staart explants zijn voordelig in dit aspect, omdat sommige visuele markers van fototoxiciteit zoals mitotische arrestatie, belemmerde weefselontwikkeling (d.w.z. vorming van somieten, staartverlenging) en desintegrerend weefsel gemakkelijker op te merken zijn. Raadpleeg de verstrekte referentie⁴ voor een gedetailleerde bespreking.
4. Gebruik RNA in één celtraps geïnjecteerde embryo's om 4D-beelden te verkrijgen die bedoeld zijn om te worden gesegmenteerd en geanalyseerd in cellulair resolutieniveau.
   1. Gebruik 300 pg RNA uit in vitro getranscribeerd membranen en nucleaire fluorescerende reporter marker plasmiden zoals pCS-membrane-ceruleanFP (Addgene plasmide #53749) of pCS-memb-mCherry (Addgene plasmide #53750) in combinatie met pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmide #99267) of pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmide #99271) in injecties. Voor een voorbeeldfilm met celmembraan en kernmarkeringen zie Video 4.
      OPMERKING: De gemiddelde celgrootte van PSM-weefsel is ongeveer ~ 5 μm in diameter, waarvan kernen ~ 3 - 4 μm omvatten. Een pixelgrootte van ~0,5 μm en een z-doorsnede van ~1 μm moeten worden geregistreerd voor een goede celsegmentatie.

5. Immunostaining van staart explants

OPMERKING: Weefsels die zijn gekweekt na verschillende dissectiescenario's (langwerpig, niet-langwerpig, staartknop ontleed, halve PSM enz.) als plat gemonteerde staart explants⁵ kunnen worden teruggewonnen uit diakamers voor verdere immunostaining kwantificering van eiwitten van belang. Hier presenteren we het protocol dat wordt gebruikt voor di-fosforylated extracellulaire signaal gereguleerde kinase (ppERK) kleuring van explants als FGF-signalering gradiënt uitlezing.

1. Na de vorming van somieten tot het gewenste stadium, schuift u voorzichtig de deklip halverwege naar de hoek van de schuifkamer zonder op te tillen.
2. Met behulp van ~100 μL aanvullend dissectiemedium in een glazen Pasteur pipet, haal je de explants van de glijbaan en breng je ze over in een 64-put celkweekplaat.
   OPMERKING: Vanaf deze stap kunnen alle oplossingsvervangingen worden uitgevoerd onder een dissectiebereik met een aparte glazen pipet voor vaste monsters. Dit zorgt ervoor dat er geen explantweefsels in putten verloren gaan of ze tussendoor worden overgedragen.
3. Zuig na het overbrengen van alle explants het overmatige medium één voor één uit de putten en doe 100 μL 4% paraformaldehyde in PBS (PFA) in elke put.
   LET OP: PFA is een toxische oplossing met kankerverwekkende effecten. Tijdens het gebruik moet een goede PBM worden gebruikt.
4. Bevestig explants in een 64-put plaat op kamertemperatuur gedurende 1 uur op een shaker.
   1. Weefsel explants zijn gevoeliger voor vervormingen dan hele embryo's. Pas de schudsnelheid dienovereenkomstig aan.
5. Was het fixatief drie keer uit met 150 μL PBS-Tw (0,1% Tween20 in PBS). Verzamel de eerste wasbeurt in een specifieke "PFA Waste" container.
6. Dehydrateer explant in stappen van 4×5 minuten door ~40 μL oplossing elke keer te vervangen door 100% methanol (MeOH).
   LET OP: MeOH is een giftige chemische stof die vluchtig en ontvlambaar is. Werk in een goed geventileerde ruimte en gebruik de juiste PBM voor de hantering.
7. Als laatste stap van uitdroging, verwijder alle oplossing uit putten en vervang door 100 μL MeOH. Incubeer bij -20 °C gedurende 15 min.
   OPMERKING: Gebruik een specifieke "MeOH Waste" container om de oplossingen op te halen tot stap 5.11.
8. Voeg 50 μL MeOH toe en schud 5 min op kamertemperatuur.
9. Rehydrateer explants in stappen van 4×5 minuten door ~40 μL oplossing elke keer te vervangen door PBS-T (0,1% Triton-X 100 in PBS). Gebruik een specifieke "MeOH Waste" container om de oplossingen op te halen.
10. Als laatste stap van rehydratatie, verwijder alle oplossing uit putten en vervang door 100 μL PBS-T.
11. Voor weefselpermeabilisatie explants behandelen met 1,5% Triton-X 100 in PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur op de shaker.
12. Wasmonsters met MAB-D-T (0,1% Triton-X 100 wasmiddel en 1% dimethylsulfoxide (DMSO) in 150 mM NaCl 100 mM maleïnezuurbuffer pH 7,5) 3×5 min.
    LET OP: DMSO is ontvlambaar en een giftig mutageen. Tijdens het gebruik moet een goede PBM worden gebruikt.
13. Incubeer explants in 100 μL/well serumblokkerende oplossing (2% foetale runderserum in MAB-D-T) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
14. Vervang alle blokkerende oplossing door 50-100 μL/put primaire antilichaamoplossing (1:1000 verdunning van monoklonaal muisantilichaam tegen ppERK in serumblok). Incubeer monsters O/N (>16 uur) bij 4 °C op shaker.
15. Was de primaire antilichaamoplossing met MAB-D-T 5×5 min.
16. Incubeer monsters in secundaire antilichaamoplossing (Alexa Fluor 597 geitenantimuis IgG2b (1:200) en Hoechst 33342 (1:5000) in MAB-D-T) O/N bij 4 °C op een shaker of gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Bedek vanaf deze stap de 64-putplaat met aluminiumfolie om blootstelling aan secundaire met antilichamen behandelde monsters te voorkomen.
    LET OP: Hoechst 33342 is een potentieel kankerverwekkend. Tijdens het gebruik moet een goede PBM worden gebruikt.
17. Was de secundaire antilichaamoplossing met PBS-Tw 3×5 min.
18. Bevestig monsters met PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
19. Was het fixatief met PBS-Tw en equilibreer monsters binnen 60% glycerol. Monteer explants op microscoopglaasjes met nagellak en 60% glycerol voor beeldvorming. Voor representatieve immunostaining resultaten zie figuur 3.

Representative Results

Dit protocol maakt vlakke geometrische cultivering van levende zebravisstaart explants mogelijk. Weefselkweek biedt drie grote voordelen ten opzichte van hele embryo's: 1) controle van de verlengingssnelheid van de as, 2) controle over verschillende signaalbronnen (morfogene) door eenvoudige dissectie, en 3) bijna-objectieve, hoge vergroting en hoge NA live beeldvorming.

Chemisch onbehandelde schuifkamers zorgen ervoor dat de staart explant zijn hoofdas kan verlengen (figuur 2A) door de huid ectoderm wikkelen rond het weefsel eronder. Toen we de explants kweekten op de chemisch geactiveerde diakamers (met Type I Collageen), strekte het huidetoderm zich uit en hechtte zich aan de diakamer, waardoor de asverlenging van de explant werd gestopt. Desondanks bleven de somieten segmenteren (figuur 2B, Aanvullende films S1 en S2). Zoals beschreven in het protocol, kan de verlenging van de as ook direct worden gestopt door fysieke druk uit te oefenen tijdens het montageproces of door explants in een ondiepere schuifkamer te monteren. Kwantificering van de verlengingssnelheid van de as onder dergelijke fysieke beperkingen is te vinden in ons eerder gepubliceerde werk⁵.

Figuur 2: Controle van asverlenging in Explants. (A) Explanten gekweekt op een regelmatige diakamer (links) verlengen axiaal terwijl ze nieuwe somieten blijven segmenteren. Doorgezonden licht (links, grijswaarden) en transgene nucleaire marker (rechts, rood) snapshots worden getoond gedurende 2 uur van de cultuurduur. (B) Chemisch activeren van de diakamer met type I collageen voordat het cultiveren de axiale rek blokkeert, maar heeft geen invloed op de somietsegmentatiesnelheid. Schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Ten tweede kunnen explants worden gekweekt door de bronnen van morfogenen te ontleden om leerzame informatie te identificeren die ze verstrekken voor ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we drie voorbeeldige beelden die het effect van dissecties op ppERK-signaleringsniveaus laten zien (figuur 3). In het PSM-weefsel wordt een FGF-signaalgradiënt vastgesteld van posterieur naar voorste (uitgelezen door ppERK-niveaus). Alleen het staartknopweefsel transcribert actief fgf8⁶ en vormt een bron voor deze gradiënt met behulp van FGF ligand diffusiviteit⁵. Staart explants missen het staartknopgedeelte van het weefsel na dissectie (Figuur 3C) resulteert in een kortere ppERK gradiënt (Figuur 3B, 3D). Tegengesteld wordt een retinoïnezuurgradiënt vastgesteld van de voorste naar de achterste in zowel het PSM als het dorsale neurale weefsel. Onlangs gevormde somieten en het voorste uiteinde van de PSM express retinoïnezuur (RA) synthetiseren enzymen en fungeren als een bron voor de RA gradiënt⁷. Toen we het voorste PSM-weefsel in de explants ontleedden (figuur 3E), zagen we nog steeds een normale omvang van de ppERK-gradiënt (figuur 3F) zoals gevisualiseerd door immunostaining. Een gedetailleerd gebruik van deze kracht van explant methode is te vinden in onze recente studie⁵.

Ten derde zijn platgemonteerde zebravis explants optimaal voor hoge resolutie live observatie van weefselmorfogenese. Hier presenteren we een film (Video 4) genomen met een transgene explant die EGFP uitdrukt als een celmembraanmarker (vals gekleurd met rood) en gekleurd met een verrode celkernmarker (vals gekleurd met cyaan). Zonder verdere kwantificering kunnen veel processen zoals indringing van neuromesodermale voorlopers in de staartknop, hogere beweeglijkheid van achterste PSM-cellen in vergelijking met voorste, en epithelialisatie van somitische grenscellen direct in de film worden waargenomen.

Figuur 3: Immunostaining van Tail Explants. (A) Volledige PSM explants met intacte signaleringsgradiënten langs de PSM als controle. (B) Regelmatige ppERK gradiënt wordt waargenomen bij volledige PSM-explants met immunostaining. (C) Staartknop ontleed explants missen een groot deel van posterieure FGF signaleringsbron. (D) Een zeer posterieure beperkt ppERK-signaal wordt waargenomen in ontlede explants van staartknopen. (E) Anterieure PSM en somitisch weefsel kunnen worden ontleed om de bronnen voor mogelijke anterieure PSM-signaleringsfactoren zoals RA-signalering te verwijderen. (F) Voorste PSM-verwijdering verandert de normale omvang van de ppERK-gradiënt niet. Weefsels werden 2 uur na het uitplanten voor het immunostainingprotocol gefixeerd. Schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Film 1: Axis Elongation en Somite Segmentation in 3D Explants. Widefield verzonden licht (boven) en nucleaire gelokaliseerde GFP (vals gekleurd rood) epifluorescentie (onder) time-lapse beelden van een gewone diakamer flat-mounted explant. Staartweefsel werd uitgeplant uit embryo in 13 somieten stadium. Beeldverwerving wordt uitgevoerd op een omgekeerde microscoop met frame-intervallen van 3 minuten. De schaalbalk is 100 μm. Klik hier om deze Film te downloaden.

Film 2: Stalled Axis Elongation op chemisch geactiveerde diakamer. Widefield verzonden licht (boven) en nucleaire gelokaliseerde GFP (vals gekleurd rood) epifluorescentie (onder) time-lapse beelden van een flat-mounted explant. Een embryo-explant met 11 somietenfase werd gedurende 30 minuten vóór montage op een diakamer gemonteerd die was bedekt met collageenoplossing voor rattenstaarten. Beeldverwerving wordt uitgevoerd op een omgekeerde microscoop met frame-intervallen van 3 minuten. De schaalbalk is 100 μm. Klik hier om deze Film te downloaden.

Film 3: Laterale montage van late embryo-explants. Widefield verzonden licht (links) en nucleaire gelokaliseerde GFP (vals gekleurd rood) epifluorescentie (rechts) timelapse beelden van een regelmatige diakamer laterale gemonteerde explant. Staartweefsel werd uitgeplant uit embryo in 15 somieten stadium en tricaine oplossing werd gebruikt als verdoving. Beeldverwerving wordt uitgevoerd op een omgekeerde microscoop met frame-intervallen van 3 minuten. De schaalbalk is 100 μm. Klik hier om deze Film te downloaden.

Film 4: Single Cell Resolution Imaging van Tail Explants. Time-lapse confocale beeldvorming van een explant die EGFP uitdrukt als membraanmarker (vals gekleurd rood) en verrood gekleurd voor kernen in levende (vals gekleurde cyaan). Gemiddelde intensiteitsprojectie van 5 z-lagen (10 μm) wordt gedurende 1 uur in de film weergegeven. Beeldverwerving wordt uitgevoerd op een GaAsP detector omgekeerde confocale microscoop met een 40× apochromatische λS DIC-water onderdompeling 1.15 NA objectieve lens, met 4 min frame intervallen. De schaalbalk is 100 μm. Klik hier om deze Film te downloaden.

Discussion

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol van een weefselkweek explant techniek die we onlangs hebben ontwikkeld en gebruikt⁵ voor zebravis embryo's. Onze techniek bouwt voort op de vorige explantmethoden in kuiken⁸ en zebravis^9,10,11 modelorganismen. Staart explants bereid met dit protocol kunnen overleven zolang >12 uur in een eenvoudige diakamer, blijven verlengen van de belangrijkste lichaamsas en segmenteren somieten, tot het einde van somitogenese.

Er moet zorg worden besteed aan het gezond houden van explantweefsel en het succesvol verlengen voor lange duur. Ten eerste moet de weefselexplant worden ontleed zonder de intactheid van de achterste weefsels te beschadigen. We merkten op dat de huidcellen een zakje bieden voor neuromesodermale voorlopercellen die in het achterste staartje binnendringen. Als de huid van explants van deze zeer beweeglijke cellen wordt afgepeld, verlaat dan het staartmotjeweefsel en migreer posterieure over de deklip buiten de weefsellimieten. Ten tweede kan middelmatig onevenwichtige spanning van het huidweefsel resulteren in divergente asverlenging, die de as van de PSM en notochord kan buigen. Een korte snede gemaakt naar de flankerende huidcellen aan beide zijden van de explant helpt om die bezorgdheid te verlichten. Naast de huidrelevante zorgen moet extra aandacht worden besteed aan het behoud van de steriliteit van de groeimedia en dissectiemiddelen voor culturen met een langere duur.

Met de juiste zorg vat de explantcultuur de gezonde groei van hele embryo's samen. We waargenomen spiertrekkingen in de explants vanaf 20 somieten stadium zoals in hele embryo's¹². Hoewel we ons richtten op het PSM-weefsel voor studie van somietsegmentatie, blijven aangrenzende weefsels zoals huidetoderm, neurale kiel (later neurale staaf en neurale buis), notochord, intermediair en laterale plaatmesoderm ook intact onder de beschreven cultiveringsomstandigheden (Figuur 1B). Dit is vooral voordelig voor weefsels verduisterd door de dooier die in hoge resolutie kan worden afgebeeld bij ventrally gemonteerde explants, zoals notochord, Kupffer's blaasje en andere weefsels die zich ontwikkelen in segmentatiestadia¹². Er moet worden benadrukt dat het explantsysteem niet zo snel groeit als hele embryo's en somieten niet in hetzelfde tempo segmenteert als hele embryo's. Deze beperking voor het explantsysteem kan ook de temporele dynamiek van andere gebeurtenissen veranderen die hier niet worden waargemerkt.

Hier presenteerden we representatieve resultaten die drie grote voordelen van het staart explant systeem ten opzichte van hele embryo-experimenten benadrukken. We hebben deze methode onlangs gebruikt om leerzame rollen van asverlenging te ontwarren uit morfogene gradiënten voor somietsegmentatie⁵. Late vooruitgang in lichtbladmicroscopie heeft hele embryo levende beeldvorming mogelijk gemaakt¹³ voor verschillende modelorganismen. Maar de meeste van deze methoden missen nog steeds de juiste subcellulaire resolutie en zijn nauwelijks toegankelijk voor de bredere onderzoeksgemeenschap. Het hier beschreven staart explant model maakt subcellulaire resolutie weefsel-niveau live beeldvorming toegankelijk met eenvoudige omgekeerde of confocale microscopen. Afgezien van methodologische voordelen, kan een dergelijke live beeldvorming inzicht geven in segmentatie van de achterste gewervelde lichaamsas. Door het protocol zo direct en toegankelijk mogelijk te houden, kan het explantsysteem ook ten goede komen aan het bredere ontwikkelingsbiologieveld van zebravissen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Co.	REF 309597	for dechorionating embryos and manipulations
200 Proof Ethanol, Anhydrous	Decon Labs	2701	for immunostaining
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955	for tissue dissection media
Calcium Chloride Anhydrous, Powder	Sigma-Aldrich	499609	for tissue dissection media
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	for immunostaining
Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel	Integra-Miltex	MIL4-411	for preparing tape slide wells
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	886-86-2	(optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	A3160601	additional for tissue culture media
Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594	Invitrogen	Cat#A-21145; RRID: AB_2535781	secondary antibody for immunostaining
L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red	GIBCO	21083-027	for tissue dissection media
Methanol	Sigma-Aldrich	179337	for immunostaining
Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade	Surgical Specialties	72-2863	for tissue dissection
Mouse monoclonal anti-ppERK	Sigma-Aldrich	Cat#M8159; RRID:AB_477245	for ppERK immunostaining
NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent	Invitrogen	R37106	(optional) for live staining of cell nuclei
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127	for fixation of samples for immunostaining
Rat Tail Collagen Coating Solution	Sigma-Aldrich	122-20	(optional) for chemically activating slide chambers
Stage Top Incubator	Tokai Hit	tokai-hit-stxg	(optional) for temperature control during live imaging
Transparent Tape 3/4''	Scotch	S-9782	for preparing tape slide wells
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	for immunostaining
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	for immunostaining
Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)	Campbell et al., 2015	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4	transgenic fish with nuclear localized EGFP
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)	Cooper et al., 2005	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75	transgenic fish with cell membrane localized EGFP