胎儿和成体神经干细胞衍生少突胶质细胞前体细胞培养物的高内涵筛选分化与成熟分析
Summary
我们描述了星形胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞的混合培养物的产生，这些细胞来自胎儿或成体神经干细胞，分化成成熟的少突胶质细胞，以及有毒刺激的体外建模。与基于细胞的高内涵筛选技术相结合，构建了一个可靠而强大的药物筛选系统。
Abstract
开发用于评估复杂疾病治疗策略有效性的药物筛选技术的主要障碍是在体外简化和重建复杂的体内环境之间取得平衡，以及所有筛选策略共享的主要目标，即获得强大而可靠的数据，高度预测体内翻译。
在脱髓鞘疾病领域，大多数药物筛选策略都是基于永生化细胞系或从新生动物中分离的原代少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的纯培养物，由于缺乏与年龄相关的差异以及任何真实的病理状况或复杂性，导致强烈的偏见。
在这里，我们展示了一个体外系统的设置，旨在模拟神经干细胞（NSC）衍生的OPCs的生理分化/成熟，易于操纵以模仿脱髓鞘疾病的典型病理状况。此外，该方法包括从胎儿和成人大脑中分离出来，从而在自发共培养物（也包括星形胶质细胞）中提供从OPC动态区分到成熟少突胶质细胞（OL）的系统。该模型在生理上类似于甲状腺激素介导的髓鞘形成和髓鞘修复过程，允许添加模拟疾病机制的病理干扰物。我们展示了如何模仿脱髓鞘疾病的两个主要成分（即缺氧/缺血和炎症），重现它们对发育性髓鞘形成和成人髓鞘修复的影响，并在整个过程中考虑系统的所有细胞成分，同时专注于分化OPCs。
这种自发的混合模型，加上基于细胞的高内涵筛选技术，可以开发一种强大而可靠的药物筛选系统，用于治疗策略，旨在对抗脱髓鞘和诱导髓鞘再生所涉及的病理过程。
Introduction
在中枢神经系统（CNS）中，髓鞘形成细胞（少突胶质细胞，OLs）及其前体（少突胶质细胞前体细胞，OPCs）负责发育髓鞘形成，该过程发生在围产期和产后期间，以及成年期髓鞘周转和修复（髓鞘再生）1。这些细胞是高度专业化的，在解剖学和功能上与所有其他神经胶质和神经元成分相互作用，使它们成为CNS结构和功能的基本组成部分。
脱髓鞘事件涉及不同的中枢神经系统损伤和疾病2，并且主要通过多因素机制作用于OPC和OL，无论是在发育过程中还是成年期。未分化的前体由分化因子驱动，主要是甲状腺激素（TH），在同步过程3 中，这导致OPC识别并响应诱导增殖的特定刺激，迁移到非髓鞘轴突，并分化成成熟的OL，从而发展髓鞘4。所有这些过程都经过精心控制，并在复杂的环境中发生。
由于髓鞘形成，髓鞘再生和脱髓鞘事件的复杂性质，因此非常需要一种简化可靠的体外方法来研究潜在的机制并开发新的治疗策略，重点关注主要细胞参与者：OPC5。
为了使体外系统可靠，需要考虑许多因素：细胞环境的复杂性，与年龄相关的细胞内在差异，生理TH介导的分化，病理机制以及数据的鲁棒性6。事实上，该领域未满足的需求是模仿体内条件复杂性的模型，而不是通过使用分离的纯OPC培养物成功实现的。此外，脱髓鞘事件的两个主要成分，炎症和缺氧/缺血（HI），直接涉及可能间接影响OPCs生理分化和成熟的其他细胞成分，这是过度简化的体外模型无法研究的一个方面。
从高度预测的培养系统开始，随后和更普遍的挑战是产生强大而可靠的数据。在这种情况下，基于细胞的高内涵筛选（HCS）是最合适的技术7，因为我们的目标首先是在自动工作流程中分析整个培养物，避免选择代表性领域的偏见，其次是获得基于成像的高内涵数据的自动和同步生成8。
鉴于主要需求是实现体外简化和体内模拟复杂性之间的最佳平衡，这里我们提出了一种高度可重复的方法，用于获得来自从胎儿前脑和成人心室下区（SVZ）分离的神经干细胞（NSC）衍生的OPCs。这种体外模型以生理TH依赖性方式涵盖了从多能NSC到成熟/髓鞘OL的整个OPC分化过程。所得培养物是一个动态分化/成熟的系统，其产生自发共培养物，主要由分化的OPC和星形胶质细胞组成，神经元百分比较低。这种原代培养物更好地模仿了复杂的体内环境，而其干细胞衍生允许进行简单的操作以获得所需的细胞谱系富集。
与使用细胞系或原代OPCs纯培养物的其他药物筛选策略相反，这里描述的方法允许研究复杂环境中病理干扰物或治疗分子的作用，而不会失去对所需细胞类型的关注。所描述的HCS工作流程允许分析细胞活力和谱系规格，以及谱系特异性细胞死亡和形态学参数。
Protocol
Representative Results
Discussion
髓鞘形成/髓鞘再生过程和脱髓鞘事件的复杂性使得预测性体外系统的开发极具挑战性。使用最广泛的体外药物筛选系统大多是人细胞系或原代纯OL培养物，并且越来越多地使用更复杂的共培养物或有机型系统15。即使这样的系统与高内涵技术相结合，纯OL培养物仍然是开发筛选平台16时的首选方法。
这里描述的自发混合培养代表了一种有用?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
由MIUR国家技术集群项目IRMI（CTN01_00177_888744）和 Regione Emilia-Romagna，Mat2Rep，POR-FESR 2014-2020提供支持。
特别感谢IRET基金会主办实验工作。
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
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