कोन-समृद्ध संस्कृतियों चिकन भ्रूण के रेटिना से शंकु सेलुलर इंटरैक्शन के लिए रॉड का अध्ययन करने के लिए

Summary

हम चिकन भ्रूण के रेटिना और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए इसके उपयोग से शंकु फोटोरिसेप्टर्स की प्राथमिक संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

मानव दिन की दृष्टि रेटिना, फोवे के केंद्र में शंकु फोटोरिसेप्टर्स के कार्य पर निर्भर करती है। विरासत में मिले रेटिना अध: पतन, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा के सबसे प्रचलित रूप से पीड़ित रोगी, रॉड फोटोरिसेप्टर्स के उत्परिवर्तन संचालित नुकसान के कारण रात की दृष्टि खो देते हैं, एक घटना जिसके बाद कार्य की प्रगतिशील हानि होती है और शंकु की मृत्यु होती है जिससे अंधापन होता है। आनुवंशिकीविदों ने इस बीमारी के कारण म्यूटेशन के साथ कई जीनों की पहचान की है, लेकिन पहले उत्परिवर्तनों की पहचान ने माध्यमिक शंकु अध: पतन के तंत्र पर सवाल उठाया और कैसे रोडोप्सिन जीन एन्कोडिंग में एक प्रमुख उत्परिवर्तन विशेष रूप से छड़ में व्यक्त किए गए दृश्य वर्णक के लिए शंकु अध: पतन को ट्रिगर कर सकता है।

रोग के एक आनुवंशिक मॉडल में प्रत्यारोपण के इस परिणाम ने छड़ और शंकु के बीच सेल इंटरैक्शन की अवधारणा और रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा के सभी आनुवंशिक रूपों में शंकु के गैर-सेल स्वायत्त अध: पतन की अवधारणा का नेतृत्व किया।

शंकु मनुष्यों में सभी फोटोरिसेप्टर के 5% और माउस में केवल 3% शामिल हैं, इसलिए उनका अध्ययन इन प्रजातियों में मुश्किल है, लेकिन पक्षी प्रजातियों में शंकु छड़ से अधिक है। हम अपने विकास के चरण 29 में चिकन भ्रूण के रेटिना से रेटिना अग्रदूत संस्कृति के लिए ९६ अच्छी तरह से प्लेटें अनुकूलित किया है । इन प्राथमिक संस्कृतियों में, शंकु इन विट्रो भेदभाव के बाद कोशिकाओं के 80% का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिकाएं सीरम की अनुपस्थिति में एक सप्ताह की अवधि में पतित होती हैं। यहां, हम तरीकों और इसके मानकीकरण का वर्णन करते हैं।

इस शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली का उपयोग चूहे रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम सामान्यीकृत सीडीएनए पुस्तकालय की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग द्वारा एपिथेलियम-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक (ईडीसीवीएफ) की पहचान करने के लिए किया गया था। Recombinant EdCVF शंकु के पतन को रोकता है।

Introduction

कशेरुकी प्रजातियों का रेटिना दोहरी है, मंद प्रकाश दृष्टि के लिए रॉड फोटोरिसेप्टर्स और दिन के उजाले, रंग और तीक्ष्णता दृष्टि के लिए शंकु फोटोरिसेप्टर के साथ। रहनुमा दृश्य तीक्ष्णता रेटिना के केंद्र में एक क्षेत्र पर निर्भर करती है, जिसे फोवे कहा जाता है, जो शंकु में समृद्ध होता है, लेकिन कुल मिलाकर, शंकु सभी फोटोरिसेप्टर्स का केवल 5% प्रतिनिधित्व करते हैं। नतीजतन, रहनुमा रेटिना में शंकु का विश्लेषण और विशेष रूप से शंकु की संस्कृति तकनीकी रूप से कठिन है। अन्य सभी स्तनधारी प्रजातियों में कोई फोईया नहीं है और कृंतकों के लिए शंकु का प्रतिशत कम है जो आमतौर पर रेटिना अनुसंधान में उपयोग किए जाते हैं। यह एवियन प्रजातियों के लिए मामला नहीं है, जिसके लिए शंकु इन अच्छी तरह से देखने वाली पक्षी प्रजातियों के रेटिना पर हावी हैं। डायनासोर, जो पारिस्थितिकी तंत्र पर हावी है जब स्तनधारियों पहली बार विकास के दौरान दिखाई दिया, पक्षियों के फिलोजेनेटिक मूल में हैं¹। डायनासोर और प्रारंभिक स्तनधारियों के बीच ऐसी प्रतिस्पर्धा के परिणामस्वरूप, स्तनधारियों को ज्यादातर छड़ के प्रभुत्व वाले रेटिना के साथ रात्रिभोज होता है। केवल बाद में विकास के दौरान कुछ स्तनधारी प्रजातियों की दैनिक दृष्टि थी, जिनके बीच वानरों का संबंध है, एक विकासवादी लाभ बन गया। फिर भी , पैतृक अवधि स्तनधारी दृष्टि^2,3के विकास में रात्रिभोज की अड़चन के रूप में बनी हुई है ।

रेटिना सेल भेदभाव का अध्ययन करते हुए, एडलर और हैटली ने दिखाया कि फोटोरिसेप्टर भ्रूण दिवस (ईडी) 6 या चरण 29⁴में चिकन से प्राप्त संस्कृतियों में रेटिना विभेदित कोशिकाओं का लगभग 70% प्रतिनिधित्व करते हैं। चिकन रेटिना में शंकु की व्यापकता के कारण, ED6 चिकन भ्रूण से रेटिना कोशिकाओं की संस्कृतियों को शंकु-समृद्ध संस्कृतियों के रूप में विकसित किया गया है^5।

मानव के लिए शंकु-मध्यस्थता दृश्य तीक्ष्णता का महत्व एक truism है । आनुवंशिक या उम्र बढ़ने की बीमारियों से प्रभावित लोग जो शंकु समारोह को बदलते हैं, बहुत विकलांग होते हैं। इससे विरासत में मिली रेटिना डिजेनरेशन (आईआरडी) पर अध्ययन के एक बहुत बडे शरीर को बढ़ावा मिला है , जिसके उद्देश्य से इन चकाचौंध करने वाली बीमारियों के लिए उपचार ढूंढना⁶,^7. पहली सफलता, आईआरडी लेबर जन्मजात अमौरोसिस (एलसीए) के एक गंभीर रूप की चिकित्सा के लिए एक पुनर्संयोजन adeno से जुड़े वेक्टर (AAV) का उपयोग कर प्राप्त, जीन थेरेपी⁸के लिए अवधारणा का एक सबूत है । जिन जीनों के उत्परिवर्तन आईआरडी को ट्रिगर करते हैं, उनकी पहचान जीन थेरेपी का उपयोग करके इन बीमारियों के इलाज की संभावना को खोलती है । फिर भी, इन बीमारियों से 200 से अधिक अलग जीन⁹में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप कर रहे हैं। यहां तक कि आईआरडी के ऑटोसोमल अप्रभावी रूपों के मामले में, जब रुग्ण जीन की सामान्य प्रति को फिर से शुरू करने से दृश्य कार्य बहाल हो सकता है, तो प्रत्येक व्यक्ति के विकास की आर्थिक लागत कम आम लोगों और उन लोगों के लिए सबसे प्रचलित लोगों के पक्ष में है जिनके लिए आनुवंशिक मूल अज्ञात रहता है। इस तथ्य के नेतृत्व में शोधकर्ताओं को और अधिक सामांय चिकित्सा के बारे में सोचना । एपोप्टोटिक सेल मृत्यु एक आम मार्ग के रूप में दिखाई दी, और इन बीमारियों का एक चिकित्सीय लक्ष्य जो फोटोरिसेप्टर्स के पतन से प्रगति करता है, जिसमें ऑटोसोमल प्रमुख रूपों^10,11शामिल हैं। हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण की सफलताएं गायब हैं । आईआरडी, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी) के सबसे आम रूप के लिए, आम मार्ग कार्य का माध्यमिक नुकसान है जिसके बाद अंततः शंकु^12,13का पतन होता है। शंकु कार्य के नुकसान को रोकने से कारक उत्परिवर्तन¹⁴से स्वतंत्र रूप से फोवेया की केंद्रीय दृष्टि संरक्षित होगी ।

आरपी के प्रारंभिक चरण में, छड़ के नुकसान से रॉड-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक (आरडीसीवीएफ) की अभिव्यक्ति में कमी शुरू हो जाती है, जो न्यूक्लियोरडोक्सिन जैसे 1(एनएक्सएनएल1)जीन द्वारा एन्कोड किया जाता है, जो छड़ और शंकु¹⁵के बीच मेटाबोलिक और रेडॉक्स सिग्नलिंग को बाधित करता है। एनएक्सएनएल1 जीन के दो उत्पादों, ट्रॉफिक फैक्टर आरडीसीवीएफ और थिओरडोक्सिन एंजाइम आरडीसीवीएफएल के दो उत्पादों को एन्कोडिंग करने वाले एक पुनर्संयोजन एएवी का प्रशासन सैद्धांतिक रूप से आरपी¹⁶के सभी आनुवंशिक रूपों में शंकु दृष्टि हानि को रोक सकता है। हमने दिखाया है कि NXNL1 जीन उत्पाद, RdCVFL, चिकन शंकु समृद्ध संस्कृतियों में व्यक्त किया जाता है¹⁷ और जहां यह एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाता है¹⁸। RdCVF और NXNL1 जीन की पहचान एक रेटिना सीडीएनए पुस्तकालय की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग द्वारा की गई थी, जो एक शंकु-समृद्ध संस्कृति से कोशिकाओं के अस्तित्व का उपयोग करके readout¹⁹के रूप में । हमने प्रत्येक क्लोन के लिए 8 समानांतर परीक्षणों का उपयोग करके पुस्तकालय के 210,000 व्यक्तिगत क्लोन के बराबर की जांच की। यह जैविक सामग्री, चिकन भ्रूण के रेटिना के लिए आसान पहुंच की आवश्यकता परीक्षणों की एक बहुत बड़ी संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । हमने पाया कि यह अपेक्षाकृत एक साप्ताहिक आधार पर भ्रूण चिकन अंडे प्राप्त करने के लिए आसान था क्योंकि वे व्यापक रूप से अंडा बिछाने मुर्गियां और मांस उत्पादन मुर्गियों के लिए कृषि उद्योग के लिए उत्पादित कर रहे हैं । शंकु-समृद्ध संस्कृतियों के सावधानीपूर्वक मानकीकरण के बाद, प्रणाली शंकु व्यवहार्यता को संरक्षित करने की क्षमता के लिए हजारों अणुओं के परीक्षण का एक आसान, मजबूत और प्रजनन योग्य तरीका प्रदान करती है। ये कोशिकाएं आनुवांशिक जोड़तोड़^के लिए भी उत्तरदायी हैं , जो सिग्नल ट्रांसडक्शन के अध्ययन और जैव रासायनिक विश्लेषण 21 ,^22,23के अध्ययन में^{लाभान्वित}होती हैं ।

रेटिना शोधकर्ताओं ने शंकु कोशिका रेखा 661W^{24 , 25,26}के उपयोग के रूप में वैकल्पिक तरीके विकसित किए^हैं। फिर भी, इस सेल लाइन की पहचान विवादास्पद बनी हुई है^,28. 661W कोशिकाओं को एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन के रेटिना ट्यूमर से क्लोन किया गया था जो मानव इंटरफोटोरिसेप्टर रेटिनोल-बाध्यकारी प्रोटीन प्रमोटर के नियंत्रण में एसवी 40 बड़े टी एंटीजन को व्यक्त करता है। SV40 बड़े टी एंटीजन सेलुलर परिवर्तन और अमरीकरण मध्यस्थता। परिणाम के रूप में, 661W कोशिकाओं का उपयोग करके पहचाने गए सिग्नलिंग मार्ग को एक रूपांतरित और अमर कोशिका रेखा के संदर्भ में सूचित किया जाना चाहिए जो सीटू में शंकु से कई मायनों में अलग है। इस संबंध में, शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली प्राथमिक न्यूरॉन्स से बना है, शंकु जो अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं।

हालांकि माउस रेटिना के वाइब्रेटम सेक्शनिंग का उपयोग करके फोटोरिसेप्टर की शुद्ध संस्कृति प्राप्त करना संभव है, कृंतक के बाहरी रेटिना में शंकु का बहुत कम प्रतिशत इस दृष्टिकोण को शंकु-समृद्ध संस्कृतियों के उत्पादन के लिए अनुपयुक्त बनाता है^29। सुअर रेटिना में कोई फोवी नहीं होता है लेकिन इसमें क्षेत्र केंद्री नामक क्षेत्र होता है जो^{शंकु 30}में बहुत समृद्ध होता है । रेटिना दैनिक कृंतक में शंकु का उच्च अनुपात, अरविकांइस एन्सोर्जी और पमोमियस ऑब्सस^{31, 32}के रूप में, एक संभावित समाधान प्रदान करता है, लेकिन ऐसी विदेशी प्रजातियों के प्रजनन की आवश्यकता होती है। स्थानीय बूचड़खानों से एकत्र वयस्क सुअर आंखों का उपयोग छड़ और शंकु की मिश्रित संस्कृति का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है जिसका उपयोग फोटोरिसेप्टर अस्तित्व³³का अध्ययन करने के लिए किया गया है। एक सुरुचिपूर्ण समाधान मूंगफली एग्लुटिनिन (पीएनए) लेक्टिन के साथ पैनिंग का उपयोग करके सुअर रेटिना से शंकु को पूर्व-शुद्ध करना है, जो चुनिंदा^{शंकु 34}को बांधता है। इसके बावजूद इस विधि को अपनी जटिलता के कारण बड़े पैमाने पर लागू करना मुश्किल है।

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) एक शंकु फोटोरिसेप्टर सेल आबादी है कि रेटिना प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी शंकु समृद्ध संस्कृति^{३५,३६}के लिए अनुकूलित किया जा सकता है प्राप्त करने के लिए सबसे आशाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है । चूंकि छड़ी-फोटोरिसेप्टर्स³⁷के लिए ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एनआरएल की आवश्यकता होती है, इसलिए एनआरएल-/-माउस में शॉर्ट वेव शंकु (एस-शंकु) का प्रभुत्व है। निष्क्रियता का उपयोग आईपीएस^{38, 39}से मानव के विभेदन द्वारा एस-शंकु-समृद्ध तैयारी का उत्पादन करने के लिए किया जा^सकताहै। एक अन्य संभव दृष्टिकोण थायराइड हार्मोन सिग्नलिंग⁴⁰का उपयोग करके शंकु भेदभाव को बढ़ावा देना है। जबकि मानव आईपीएस से शंकु समृद्ध संस्कृतियों के उत्पादन के लिए उपन्यास विधियां उभर रही हैं, चिकन भ्रूण एक वर्तमान सिद्ध विधि¹⁹प्रदान करते हैं ।

शंकु समृद्ध संस्कृति¹⁹अभिव्यक्ति क्लोनिंग द्वारा RdCVF की पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी । इस प्रणाली का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया कि आरडीसीवीएफ 22 एरोबिक ग्लाइकोलिसिस²²द्वारा ग्लूकोज तेज और उसके चयापचय को उत्तेजित करता है । इसके अलावा शंकु-समृद्ध संस्कृति का उपयोग एनएक्सएनएल1 जीन²³के दूसरे उत्पाद आरडीसीवीएफएल की सुरक्षात्मक भूमिका को मान्य करने के लिए किया गया था। हाल ही में, इस प्रणाली का उपयोग ओटीएक्स 2⁴¹के साथ स्थानांतरित रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा स्रावित अणुओं की रक्षा के अस्तित्व को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था।

Protocol

प्रोटोकॉल विश्वविद्यालय पियरे और मैरी क्यूरी और फ्रांसीसी अनुसंधान मंत्रालय (परमिट संख्या: APAFIS #1028 2015070211275177) के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । पशु प्रयोग निम्नलिखित प्राधिकरण के तहत किए गए थे: "प्रमाणित डी ऑटोराइजेशन डी'ऑटोरिमेंटर सुर लेस एनिमॉक्स वर्टेब्रेस ए-75-1863। प्रिफेक्चर डी पुलिस डी पेरिस (9 नवंबर 2011-नवंबर 8 th 2016) "।

1. निषेचित अंडों की इनक्यूबेशन

1. एक औद्योगिक हैचरी पर स्वाभाविक रूप से प्राप्त साप्ताहिक निषेचित अंडे (तनाव I 657, लाल लेबल) एकत्र करें।
2. मुर्गी द्वारा "रखी" जाने के बाद प्रयोगशाला में 17 डिग्री सेल्सियस (उनके जैविक शून्य) पर उर्वरित अंडे बनाए रखें।
3. प्रत्येक संस्कृति के लिए, 20 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सात उर्वरित अंडे इनक्यूबेट और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 136 घंटे झुकाव के आंतरायिक प्रतिवर्तन के साथ (एक तरफ से इसके विपरीत करने के लिए 2 घंटे के लिए एक प्रगतिशील आंदोलन, एक आर्द्र कक्ष में अंडों का 4 घंटे का चक्र) ।

2. चिकन भ्रूण की वसूली

1. कीटाणुनाशक (जैसे, पर्सप्ट ए एक्सप्रेस) के साथ सात अंडों की सतह को धोएं।
2. अंडे के खोल को तोड़ने के लिए, बड़े सीधे चिमटा के साथ खोल के शीर्ष में एक छेद करें। फिर अंडे से टोपी को नरम उबले अंडे के रूप में हटाने के लिए खोल काटें।
3. धीरे-धीरे घुमावदार संदंश के साथ अंडे के कोयले से प्रत्येक भ्रूण को निकालें, और फिर इसे एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें बाँझ फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है। धीरे-धीरे, भ्रूण (कोरियोलाटोनिक झिल्ली) के चारों ओर से घेरे लिफाफे को हटा दें।
4. हैम्बर्गर और हैमिल्टन⁴²से दृश्य तुलना करके प्रत्येक भ्रूण के विकास के चरण को सत्यापित करें।
5. विकास के 29^चरण में दो भ्रूण का चयन करें(चित्रा 1)। पंख कोहनी पर झुकते हैं। कॉलर दिख बाहर खड़ा है। यह विधेयक 28^चरण की तुलना में अधिक प्रमुख है ।
6. इन चयनित भ्रूणों की आंखों को नाभिित करें और उन्हें सीओ₂-स्वतंत्र माध्यम (जीवन प्रौद्योगिकियों) में स्थानांतरित करें।
   सावधानी: यह बहुत महत्वपूर्ण है कि भ्रूण 29 चरण में है, और चरण 28 या 30(चित्र 1)पर नहीं है; यही कारण है कि कम से कम 7 अंडे को कम से कम करना आवश्यक है, भले ही केवल दो का अंत में उपयोग किया जाएगा। कोरियोन बहुत पतला होता है, इसलिए भेद करना मुश्किल होता है, लेकिन यह भ्रूण से बहुत करीब होता है, इसलिए भ्रूण को छुए बिना इसे हटाना पड़ता है।

3. रेटिना का विच्छेदन

1. चयनित भ्रूणों को घुमावदार संदंश के साथ काटना और परमाणु।
2. चार आंखों को सीओ₂-स्वतंत्र माध्यम में स्थानांतरित करें। इस माध्यम में 0.9 mM CaCl₂ और 0.65 m M MgCl₂होते हैं।
3. कॉर्निया चेहरे के साथ आंख की स्थिति नीचे, ऑप्टिक तंत्रिका प्रयोगकर्ता का सामना करना पड़ रहा । दो सीधे संदंश का उपयोग कर ऑप्टिक तंत्रिका में एक छेद ड्रिल।
4. रेटिना और वर्णक एपिथेलियम(चित्रा 2)के बीच प्रत्येक संदंश की एक शाखा डालें। प्रत्येक संदंश पर खींचें और रेटिना से एपिथेलियम को अलग करने के लिए आंख घुमाएं। लेंस और विट्रियस के बाद कॉर्निया निकालें।
5. पीएच 7.2 पर रिंगर के माध्यम से युक्त पेट्री डिश में चार रेटिना स्थानांतरित करें।
   सावधानी: सुनिश्चित करें कि केवल रेटिना रहता है और विट्रियस और शेष रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम के किसी भी निशान को हटा दें।

4. रेटिना सेल निलंबन की तैयारी

1. दो सीधे चिमटा का उपयोग करते हुए चारों रेटिना को बहुत छोटे टुकड़ों में काट लें।
2. रिंगर के माध्यम से रेटिना के टुकड़ों को दो बार धोएं।
3. रिंगर के माध्यम से दूसरे धोने के बाद, रेटिना के टुकड़े ट्यूब के नीचे गिर जाते हैं और रिंगर के माध्यम को हटा दें। ट्राइप्सिन (0.25% w/v) के समाधान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए रेटिना टुकड़ों का इलाज करें।
4. लगातार सक्शन द्वारा 10 मिनट के बाद समाधान को तितर-बितर करें। एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके डिस्चार्ज करें और रेटिना टुकड़ों के वियोजन की जांच करें। 10% निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक संस्कृति मीडिया जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
5. 0.05 मिलीग्राम DNase I के साथ सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें। DNase को जोड़ने के तुरंत बाद एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके कोशिका समूहों और डीएनए को लगातार सक्शन और निर्वहन द्वारा अलग करें।
6. रासायनिक परिभाषित संस्कृति माध्यम (सीडीसीएम) के साथ दो बार रेटिना सेल निलंबन धोएं: Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम और M199 मीडिया की एक समान मात्रा १०० μg/mL लिनोलिक एसिड/बीएसए के साथ पूरक, 0.86 माइक्रोन इंसुलिन, 0.07 माइक्रोन एम ट्रांसफरिन, 2.0 माइक्रोन प्रोजेस्टेरोन, 0.28 माइक्रोन एम प्रोस्टैगलैंडिन, 0.29 माइक्रोन एनए₂एसईओ_3,182 माइक्रोन पुट्रेसिन, 3 एमएम टॉरिन, 4.7 माइक्रोनम साइटिडीन 5'-डिफोस्फोचोलिन, 2.7 माइक्रोनम साइटिडीन 5'-डिफोस्फोथेनेलामाइन, 0.55 माइक्रोन एम हाइड्रोकॉर्टिसोन, 0.03 माइक्रोन टीएम ट्राइयोडोथाइरोनिन, 1 एमएम सोडियम पाइरुवेट और 20 एम जेनेटामीसिन।

5. रेटिना सेल सीडिंग

1. ३२.२५ μg/सेमी 2 पर पॉली-एल-lysine के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2घंटे के लिए पारदर्शी नीचे के साथ दो काले ९६ अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों का इलाज करें ।
2. M199 संस्कृति माध्यम के साथ दो बार इन प्लेटों कुल्ला। सीडीसीएम के 1 एमएल में सेल पेलेट को रिसेक्ल करें।
3. जीवित कोशिकाओं को दाग देने के लिए कोशिका निलंबन ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन के एक एलिकोट में जोड़ें। कोशिकाओं के निलंबन का नमूना एक हीमोसाइटोमीटर (कोशिका गिनती-मलासेज़ के कक्ष) में जोड़ें।
   1. एक माइक्रोस्कोप के तहत, हीमोसाइटोमीटर (यानी, 40 वर्ग) की चार पंक्तियों के लिए दाग कोशिकाओं की गणना करें, और फिर एक पंक्ति के लिए औसत सेल संख्या की गणना करें। निम्नलिखित विधि लागू करके निलंबन की कोशिकाओं की एकाग्रता की गणना करें: निलंबन की कोशिकाओं/एमएल की संख्या = एक पंक्ति में कोशिकाओं की औसत संख्या (10 वर्ग) x 10 ट्राइपैन ब्लू एक्स 1,000 के साथ हीमोसाइटोमीटर एक्स कमजोर पड़ने के वर्गों की कुल संख्या (कोशिकाओं/एमएल के रूप में परिणाम व्यक्त करने के लिए)।
4. दो चढ़ाना घनत्व (1 x 10⁵ कोशिकाओं/सेमी 2 और 2 x 10 5 कोशिकाओं/सेमी²⁾ सीडीसीएम का उपयोग करने के लिए इसी दो सांद्रता (5.6 x 10⁴ कोशिकाओं/एमएल और 1.12 x^{10 5} कोशिकाओं/एमएल) के लिए सेल निलंबन लाओ ।
5. बीज दो पूर्वपचारित काले 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में दो सेल निलंबन के 50 μL। प्लेटों में कोशिकाओं को प्लेट के दाईं ओर से बाईं ओर एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ वितरित करें, प्रत्येक कॉलम के बीच समरूप, ताकि कोशिकाओं का वितरण सजातीय हो।
6. अणुओं के पुस्तकालय के 50 μL जोड़ें (उदाहरण के लिए, एक सीडीएनए पुस्तकालय से वातानुकूलित मीडिया, नीचे देखें) एक पूर्वनिर्धारित पैटर्न(तालिका 1)का उपयोग करके जांच की जाएगी।
7. मीडिया के कोई परिवर्तन के साथ 5% सीओ₂ के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर सात दिनों के लिए प्लेटों इनक्यूबेट ।

6. व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती

1. प्लेट के प्रत्येक कुएं में, कैल्सीन एएम के 2.7 माइक्रोनएम और 0.3 m ethidium होमोडिमर जोड़ें।
   नोट: कैल्सेइन कोशिकाओं में प्रवेश करता है जो एथिडियम होमोडिमर के रूप में बड़े अणुओं के लिए अभेद्य हैं। जीवित कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में, कैल्सीन को अंतर्जात एस्टरास द्वारा हाइड्रोलिज किया जाता है, 485 एनएम पर उत्साहित होने पर 520 एनएम पर उत्सर्जित करके फ्लोरोसेंट हो जाता है। एथिडियम होमोसैमर मृत कोशिकाओं पर डीएनए के लिए बांधते हैं। एथिडियम डीएनए-होमोडिमर बाइंडिंग के कारण 520 एनएम पर उत्तेजन के बाद 635 एनएम पर लाल फ्लोरेसेंस उत्सर्जित होता है।
2. रोशनी के अभाव में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
3. एक स्वचालित प्लेट रीडर पर फ्लोरेसेंस पढ़ें एक उल्टे माइक्रोस्कोप से लैस एक पारा दीपक से लैस ४८५ और ५२० एनएम पर दो उत्तेजन फिल्टर के साथ, ५२० और ६३५ एनएम पर उत्सर्जन के दो फिल्टर, एक उद्देश्य (x10), एक मोटर चालित एक प्रोसेसर और एक चार्ज युग्मित डिवाइस कैमरा (CCD) द्वारा नियंत्रित मंच । यह मतगणना मंच कायापलट सॉफ्टवेयर¹⁹द्वारा नियंत्रित किया जाता है । यह 96-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक साथ जीवित कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करना संभव बनाता है, जो कुओं से शुरू होता है A12, फिर बी 12 की ओर B12, C12 की ओर C12 और इसी तरह(टेबल I)।
4. नकारात्मक नियंत्रण(तालिका I)के 18 कुओं का उपयोग करके एक एकल कोशिका के औसत क्षेत्र एक की गणना करें।
5. प्लेट के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं की गणना करें और निम्नलिखित अनुभवजन्य सूत्र ए एक्स 29 /20.7 लागू करें ताकि उस सेल डबल्स (दो कोशिकाओं का समूह) गिना जा सके। 4 कुओं में औसत सेल संख्या के बीच अनुपात के रूप में अणुओं द्वारा शंकु के सुरक्षात्मक प्रभाव स्कोर जहां हम नकारात्मक नियंत्रण के 18 कुओं में औसत सेल संख्या बनाम अणु का परीक्षण किया (तालिका 1 और अनुपूरक चित्रा 1देखें) ।
6. प्रत्येक अणु द्वारा जांच किए गए संभावित संरक्षण (व्यवहार्यता अनुपात) का मूल्यांकन करने के लिए² x 10⁵ कोशिकाओं/सेमी 2 पर वरीयता प्राप्त प्लेट के परिणामों को मिलाकर 2 x^{10 5} कोशिकाओं/सेमी² पर वरीयता प्राप्त है ।

Representative Results

हम यहां वर्णन कैसे शंकु समृद्ध संस्कृति प्रणाली प्रोटीन की रक्षा उपन्यास शंकु की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग 8 सप्ताह पुराने लॉन्ग-इवांस चूहों⁴³की 400 आंखों से कोरॉयड और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम से बने एक सामान्यीकृत सीडीएनए पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए किया।

इस पुस्तकालय में 6.0 x 10⁶ स्वतंत्र कॉलोनियां इकाइयां (सीएफयू) बनाती हैं और इसमें 2.1 किलोबेस (केबी) का औसत क्लोन डालने का आकार है, जिसमें 99% से अधिक पुनर्संयोजन क्लोन हैं। उस पुस्तकालय से १०० क्लोन के पूल क्षणिक रूप से संक्रमित थे (प्लाज्मिड डीएनए के ०.१ माइक्रोन) को COS-1 कोशिकाओं में और COS-1 के वातानुकूलित माध्यम (सीएम) को सीरम के बिना डीएमईएम में ४८ घंटे के लिए इनक्यूबेशन के बाद काटा गया था । अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन द्वारा झिल्ली या एक्सोसोम नहीं हटाए गए थे। प्रत्येक सीएम के ५० माइक्रोलीटर को दो ९६-वेल प्लेटों के 4 कुओं में जोड़ा गया: एक 2 x 10⁵ कोशिकाओं/सेमी²पर वरीयता प्राप्त, दूसरा 4 x 10⁵ कोशिकाओं/सेमी²पर । पुस्तकालय के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले खाली वेक्टर पीसीडीएनए3.1 से संक्रमित COS-1 कोशिकाओं से सीएम का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण(तालिका 1)के रूप में किया जाता था। २११,२०० व्यक्तिगत क्लोन के अनुरूप १०० क्लोन के कुल २,११२ सेट चार संस्कृति कुओं में और शंकु समृद्ध संस्कृतियों की दो सीडिंग शर्तों के लिए मूल्यांकन किया गया । दो स्थितियां दो थोड़ा अलग टीका घनत्व के अनुरूप हैं जो कुल 1,689,600 संस्कृति कुओं के लिए सुरक्षात्मक गतिविधि का अधिक सटीक आकलन करना संभव बनाती हैं।

2 से अधिक अनुपात वाले क्लोन के 42 पूलों में, पूल 0080 और 0073 में नकारात्मक नियंत्रण, pcDNA3.1(अनुपूरक चित्रा1) की तुलना में संस्कृति के 7 दिनों के बाद व्यवहार्यता अनुपात 16 और 14 गुना अधिक है। यह विश्लेषण ब्याज के पूल की पहचान करने के लिए आवश्यक है । 100 क्लोन के प्रत्येक चयनित पूल को उनके ग्लिसरोल स्टॉक से 10 क्लोन के 16 सेटों में विभाजित किया गया था। इन उप-पूलों को स्क्रीनिंग के दूसरे दौर (यानी कुल 3,200 संस्कृति कुओं) में एक ही विधि के अनुसार तैयार और परीक्षण किया गया था। उप-पूल 0073-09 ने सबसे मजबूत व्यवहार्यता अनुपात(अनुपूरक चित्रा 2 ए)दिया और 16 व्यक्तिगत क्लोन का उत्पादन करने के लिए विभाजित किया गया था जिनका परीक्षण शंकु-समृद्ध संस्कृतियों पर स्क्रीनिंग के तीसरे दौर में किया गया था । क्लोन 0073-09-37 क्लोन स्पष्ट रूप से 2.5(अनुपूरक चित्रा 2B)के बराबर व्यवहार्यता अनुपात के साथ दूसरों से बाहर खड़ा है। वाई एक्सिस का एक अलग पैमाना है, भले ही सीडिंग घनत्व अनुपूरक आंकड़ा 2A की तुलना में समान था। हमने इसे आमतौर पर तब देखा है जब परखों को महीनों तक साप्ताहिक रूप से दोहराया जाता है । विश्लेषण के बाद, इन परिणामों की पुष्टि करते है कि क्लोन 0073-09-37 शंकु अस्तित्व पर एक मजबूत और प्रजनन प्रभाव पड़ता है । परीक्षण स्वतंत्र रूप से दोहराया गया था(चित्रा 3A),और 1.8 kb के सम्मिलित अनुक्रम(चित्रा 3B)था।

एक जैव सूचना विश्लेषण से पता चला है कि क्लोन 0073-09-37, कि हमने एपिथेलियम-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक (ईडीसीवीएफ) का नाम दिया, जिसमें तीन ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) शामिल हैं, जो चूहा प्रोटीन जिंक फिंगर प्रोटीन-180 (ZFP180, NP_653358) के 727 अमीनो एसिड⁴⁴के सी-टर्मिनल भाग के 84 अवशेषों के लिए सबसे ऊपर (ओआरएफ1) एन्कोड करता है। अन्य दो ORFs (ORF2 और ORF3) चूहों में बहुत कम अच्छी तरह से संरक्षित और अन्य स्तनधारियों में अनुपस्थित हैं। जब स्वतंत्र रूप से परीक्षण किया जाता है, तो केवल ORF1 शंकु(अनुपूरक चित्र 3)पर सुरक्षात्मक प्रभाव डालती है। ओआरएफ1 को ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेज (जीएसटी) फ्यूजन प्रोटीन(चित्रा 4A) केरूप में उत्पादित किया गया था। एडसीवीएफ प्रोटीन को शुद्ध किया गया और जीएसटी टैग हटा दिया गया(चित्रा 4B)। EdCVF शंकु समृद्ध संस्कृति प्रणाली(चित्रा 4C)में शंकु पतन को रोकने में सक्षम है ।

चित्रा 1:28,²⁹और विकास के 30^{चरणों} में चिकन भ्रूण। तीर डब्ल्यू: विंग, सी: कॉलर और बी: बिल। स्केल बार 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2:चिकन भ्रूण के रेटिना का विच्छेदन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 3:एपिथेलियम-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक (EdCVF), क्लोन 0073-09-37 । A. शंकु-समृद्ध संस्कृति पर व्यवहार्यता में वृद्धि। B. सीडीएनए क्लोन 0073-09-37 का क्रम । रेखांकित अनुक्रम GAATTC EcoRI प्रतिबंध पुस्तकालय के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया साइट है । बोल्ड में दो codons GTG वेक्टर से निकलने वाले एडसीवीएफ के लिए असामान्य अनुवाद दीक्षा साइटें हैं। छात्र के परीक्षण द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4-रीकॉम्बिनेंट एडसीवीएफ एक्टिविटी। A. ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेज (जीएसटी) के साथ फ्यूजन में एडसीवीएफ का सीक्वेंस। B. शुद्ध रिकॉम्बिनेंट एडसीवीएफ प्रोटीन। सी. संस्कृति में शंकु पर जीएसटी-EdCVF की ट्रॉफिक गतिविधि। तुकी के परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: सीडीएनए पूल के लिए औसत सेल संख्या का अनुपात और नकारात्मक नियंत्रण, स्क्रीनिंग के पहले दौर के दौरान खाली वेक्टर पीसीडीएनए3.1 से संक्रमित COS-1 कोशिकाओं का वातानुकूलित माध्यम। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। 

अनुपूरक चित्रा 2: जीवित कोशिकाओं की संख्या। A. 0073 पूल के उप पूल के साथ स्क्रीनिंग का दूसरा दौर। B. इक्का-दुक्का क्लोन के साथ स्क्रीनिंग का तीसरा दौर । सीएन: खाली वेक्टर, pcDNA3.1 से संक्रमित COS-1 कोशिकाओं का वातानुकूलित माध्यम। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्र3: अलग क्लोन 0073-09-37 के तीन खुले पढ़ने के फ्रेम की ट्रॉफिक गतिविधि। डननेट के परीक्षण का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय विश्लेषण। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
एक	1	1	1	1	2	नेकां	2	2	2	3	3	नेकां
बी	नेकां	3	3	4	4	4	नेकां	4	5	5	5	5
सी	6	नेकां	6	6	6	7	7	नेकां	7	7	8	8
डी	8	8	नेकां	9	9	9	9	10	नेकां	10	10	10
ई	11	11	11	नेकां	11	12	12	12	12	नेकां	13	13
एफ	13	13	14	14	नेकां	14	14	15	15	15	नेकां	15
जी	16	16	16	16	17	नेकां	17	17	17	18	18	नेकां
एच	18	18	19	19	19	19	नेकां	20	20	20	नेकां	20
नेकां नकारात्मक नियंत्रण
चौगुनी में परीक्षण किए गए पूल के 1-20 पदों

तालिका 1: उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए ९६-अच्छी तरह से थाली की योजना

Discussion

कई मापदंडों है कि चिकन भ्रूण से एक शंकु समृद्ध संस्कृति के उत्पादन को सीमित हो सकता है में, पहला महत्वपूर्ण कदम के लिए सही रची अंडे में भ्रूण के विकास के चरण की पहचान है । यह देखा गया है कि ED8 (34^वें चरण) में भ्रूण के रेटिना से कोशिकाओं की संस्कृति केवल 35% फोटोरिसेप्टर पैदा करती है, शेष 65% अन्य न्यूरॉन्स⁴से बने होते हैं। जो कुछ भी रसद रची अंडे पाने के लिए लागू किया, यह ठीक करने के लिए आवश्यक है तापमान और इनक्यूबेशन समय धुन, और ध्यान से भ्रूण की जांच के रूप में विकास के सभी चरणों के संदर्भ चित्रों की तुलना में^{४२,४५}।

मूल रूप से, शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली को व्हाइट लेगहॉर्न^{स्ट्रेन 4}का उपयोग करके विकसित किया गया था। उस तनाव के अंडों का सफेद रंग फ्रांस में विशेष रूप से सराहना नहीं की जाती है, इसलिए हमने चिकन के एक तनाव का उपयोग किया जो भूरे रंग के अंडे का उत्पादन करता है। हम मैं 657 तनाव है, जो JA57 मुर्गियां 5 के साथ मैं 66 मुर्गा पार करके किया^जाताहै का उपयोग किया. हम मूल संस्कृतियों की विशेषताओं को पुन: पेश करने में सक्षम थे। इससे पता चलता है कि चिकन की आनुवंशिक पृष्ठभूमि शंकु-समृद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है।

हमने संस्कृति माध्यम में पूरक के व्यक्तिगत निष्कासन के प्रभाव का परीक्षण नहीं किया है, लेकिन यह देखा है कि इंसुलिन आरडी1 माउस में शंकु के अस्तित्व पर इंसुलिन के प्रभाव के अनुसार एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो ऑटोसोमल अप्रभावी आरपी⁴⁶का एक मॉडल है। त्रियोडोथाइरोनिन (टी 3) विकास⁴⁰के दौरान रेटिना सेल भाग्य में थायराइड हार्मोन रिसेप्टर की भूमिका के अनुसार चिकन भ्रूण की रेटिना अग्रदूत कोशिकाओं के भेदभाव में भी भाग ले सकता है। नतीजतन, शंकु समृद्ध संस्कृति प्रणाली^४६क्लोनिंग द्वारा इंसुलिन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है ।

शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली प्राथमिक न्यूरॉन्स की संस्कृति पर निर्भर करती है और यह कोशिका रेखा 661W^{24, 25, 26}के रूप में अमर कोशिकाओं के उपयोग पर निर्भर है^औरअधिक उपयुक्त था विधियां हैं।

यहां वर्णित विधि को प्लाज्मिड डीएनए²⁰के साथ पूर्व विद्युत प्रवयन करके संशोधित किया जा सकता है । रेटिना सेल निलंबन तैयार करने से पहले, पूरे रेटिना को कस्टम-निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटर के कक्ष में रखा जाता है जिसमें 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 1 एमएमएम ईडीटीए में प्लाज्मिड डीएनए के 0.5 माइक्रोन/माइक्रोन के 120 माइक्रोन के साथ रखा जाता है। 50 एमएस के लिए 15 वी की पांच दालें 950 एमएस अंतराल²²से अलग होती हैं । कोन-समृद्ध संस्कृतियों में प्रतिकृति सक्षम एवियन स्प्लिस (आरसीएएएस) रेट्रोवायरस का उपयोग करके हस्तक्षेप आरएनए (आरएनएआई) देने के प्रयास असफल⁴⁷थे। यह निश्चित रूप से इस तथ्य के कारण है कि सीरम की अनुपस्थिति में और कम घनत्व की संस्कृतियों में, रेटिना अग्रदूत कोशिकाएं प्रतिकृति नहीं हैं, रेट्रोवायरस के प्रचार के लिए एक अपेक्षित है।

हमने ट्रॉफिक कारकों की पहचान करने के लिए शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो अभिव्यक्ति क्लोनिंग¹⁹का उपयोग करके शंकु के अस्तित्व को बढ़ावा देती है। इसे व्यवहार्य बनाने के लिए, हमने 100 क्लोन के पूल से वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करके उच्च सामग्री स्क्रीनिंग का पहला कदम किया। यहां तक कि अगर पुस्तकालय से सीडीएनए COS-1 कोशिकाओं के ट्रांसफैक्शन के बाद एक मजबूत सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किए जाते हैं, तो यह एक गारंटी प्रदान नहीं करता है कि व्यक्तिगत सीडीएनए द्वारा एन्कोड किए गए सभी प्रोटीन व्यवहार्यता परख द्वारा सकारात्मक बनाए जाने के लिए पर्याप्त एकाग्रता तक पहुंचते हैं। यह एक बड़ी सीमा है । इस अर्थ में, किसी भी स्क्रीनिंग वास्तव में संपूर्ण नहीं है । इसके अलावा, भले ही वातानुकूलित माध्यम से झिल्लीदार प्रोटीन को नहीं हटाया गया हो, लेकिन परख का विन्यास गैर-विसारक कारकों की पहचान के लिए प्रतिकूल है। एक विकल्प के लिए सीडीएनए के अनुक्रम प्राप्त करने के बाद व्यक्तिगत क्लोन स्क्रीन के लिए कई बार एक ही उंमीदवार प्रोटीन परख में दोहराव से बचने के लिए किया जाएगा । यह रेटिना सीडीएनए पुस्तकालयों हम⁴³इस्तेमाल अनुक्रमण द्वारा शुरू किया गया था. तर्कसंगत रहते हुए इस दृष्टिकोण की भी अपनी सीमाएं हैं । सीडीएनए दृश्यों का जैव सूचना विश्लेषण अपरिवर्तनीयता में कमी के अलावा, ज्ञान के आधार पर कुछ क्लोन स्क्रीनिंग की प्राथमिकता को अनूठा रूप से लागू करेगा। यह हानिकारक नहीं होगा अगर अंत में, पूरी लाइब्रेरी की जांच की जाएगी, भले ही ऐसा करने के लिए आवश्यक समय काफी लंबा हो जाएगा। लेकिन निरपवाद रूप से, अनुक्रम की पहचान परिणामों को देखने के हमारे तरीके को प्रभावित करेगी। यह तटस्थ नहीं होगा क्योंकि अनुक्रम की व्याख्या स्वाभाविक रूप से प्रायोगिक आंकड़ों के साथ प्रतिस्पर्धा में होगी ।

एडसीवीएफ की पहचान से यह भी पता चलता है कि उच्च सामग्री स्क्रीनिंग में तकनीकी सीमाएं आवश्यक हैं । स्क्रीनिंग के पहले दौर से, हम उच्च गतिविधि(अनुपूरक चित्रा 1)के साथ दो पूल की पहचान की । पूल 0073 ने ईडीसीवीएफ की सफल पहचान की, जबकि पूल 0080 ने इस तरह की खोज का संचालन नहीं किया। हमने उस समस्या का समाधान नहीं किया है जो उप-पूल तैयार करने के दौरान सक्रिय क्लोन के नुकसान से परिणाम दे सकती है। वैकल्पिक रूप से, इसे बाहर नहीं रखा गया है, भले ही सांख्यिकीय रूप से अनुकूल न हो, कि पूल 0080 के सीडीएनए के बीच, दो प्रोटीन सहक्रियात्मक रूप से कार्य कर रहे थे और उनकी गतिविधि को व्यक्तिगत क्लोन के रूप में नहीं देखा जा सकता था।

छोटे अणुओं की स्क्रीनिंग द्वारा शंकु की रक्षा करने वाले अणुओं की पहचान शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली का भविष्य का अनुप्रयोग है । ऐसे अणु रेटिना विकृतियों के उपचार के लिए अमूल्य होंगे जिनके लिए जीन थेरेपी उम्र से संबंधित मैकुलर अध: पतन के रूप में सबसे उपयुक्त दृष्टिकोण नहीं है ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated)	Corning	3603
Calcein AM	Thermo-Fisher scientific	C1430
CCD Camera	Photometrics	CoolSnap  FX HQ
CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate)	Sigma-Aldrich	C0256
CO2 Independant	Thermo-Fisher scientific	18045-054
Curved forceps	Dutscher	005093
DMEM Media	Thermo-Fisher scientific	41966-029
DNAse	Sigma-Aldrich	D4263
Eggs incubator	FarmLine	M08 01 3100
Ethidium Homodimer	Thermo-Fisher scientific	E1169
Fœtal bovine serum	Thermo-Fisher scientific	10270-098
Gentamycin	Thermo-Fisher scientific	15710-049
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0880
ITS (insulin Transferine selenium)	Sigma-Aldrich	I1884
large straight pliers	Dutscher	005074
Linoleic acid	Sigma-Aldrich	L8384
M199 medium	Thermo-Fisher scientific	31150-022
Metamorph software	Metamorph
Microscope	NIKON	Eclipse TE2000
Motorized stage	Martzauzer	Mutlicontrol 2000
Optical filter switch	Shutter Instrument company	Lambda 10-2
PBS 1X	Thermo-Fisher scientific	14190-086
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P6282
Progesterone	Sigma-Aldrich	P7556
Pursept A express	Fisher scientific	11814110
Putriscine	Sigma-Aldrich	P5780
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
straight forceps	Dutscher	005092
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan blue	Thermo-Fisher scientific	15250-061
Trypsine 0.25 %	Thermo-Fisher scientific	25200-056