Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Konberikade kulturer från näthinnan av kycklingembryon för att studera stång till kon cellulära interaktioner

Published: March 20, 2021 doi: 10.3791/61998
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Genetics - Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision

Summary

Vi beskriver en metod för att få primära kulturer av konfotoreceptorer från näthinnan hos kycklingembryon och dess användning för screening med högt innehåll.

Abstract

Människans dagtidsvision förlitar sig på funktionen hos konfotoreceptorer i mitten av näthinnan, fovean. Patienter som lider av den vanligaste formen av ärvd retinal degeneration, retinitis pigmentosa, förlorar mörkerseende på grund av mutation driven förlust av stång fotoreceptorer, ett fenomen följt av en progressiv förlust av funktion och död av koner leder till blindhet. Genetiker har identifierat många gener med mutationer som orsakar denna sjukdom, men de första mutationerna som identifierats ifrågasatte mekanismerna för sekundär kondegeneration och hur en dominerande mutation i rhodopsin genkodning för det visuella pigmentet uttryckt uteslutande i stavar kan utlösa kon degeneration.

Detta resultat av transplantationer i en genetisk modell av sjukdomen ledde till begreppet cellinteraktioner mellan stavar och koner och av icke-cells autonom degenerering av koner i alla genetiska former av retinitis pigmentosa.

Kottar utgör 5% av alla fotoreceptorer hos människor och endast 3% i musen, så deras studie är svår i dessa arter, men koner är fler än stavar hos fågelarter. Vi har anpassat 96-brunnsplattor till kultur retinal prekursorer från näthinnan hos kycklingembryon i steg 29 av deras utveckling. I dessa primära kulturer representerar koner 80% av cellerna efter in vitro-differentiering. Cellerna degenereras under en period av en vecka i avsaknad av serum. Här beskriver vi metoderna och dess standardisering.

Detta konberikade odlingssystem användes för att identifiera epitel-härledda cone viability faktor (EdCVF) genom hög innehåll screening av en råtta retinal pigmenterade epitel normaliserade cDNA bibliotek. Rekombinant EdCVF förhindrar degenerering av konerna.

Introduction

Näthinnan hos ryggradsdjur är dubbel, med stavfotoreceptorer för dim ljusseende och konfotoreceptorer för dagsljus, färg och synskärpa. Primat synskärpa förlitar sig på en region i mitten av näthinnan, kallad fovea, som är berikad i koner, men totalt sett representerar koner endast 5% av alla fotoreceptorer. Följaktligen är analysen av konerna i primat näthinnan och särskilt konkulturen tekniskt svår. Alla andra däggdjursarter har ingen fovea och andelen koner är låg för gnagare som oftast används i näthinneforskning. Detta är inte fallet för fågelarter, för vilka koner dominerar näthinnan hos dessa välseende fågelarter. Dinosaurier, som har dominerat ekosystemet när däggdjuren först uppträdde under evolutionen, är vid fåglarnas fylogenetiska ursprung1. Som en följd av sådan konkurrens mellan dinosaurier och tidiga däggdjur är däggdjuren mestadels nattliga med näthinnor som domineras av stavar. Först senare under evolutionen blev den dagliga visionen av vissa däggdjursarter, bland vilka primater hör hemma, en evolutionär fördel. Ändå förblir förfädernas period som en atavism av den nattliga flaskhalsen i utvecklingen av däggdjursvisionen2,3.

Medan adler och hatlee studerade retinalcelldifferentiering visade de att fotoreceptorer representerar ungefär 70% av näthinnans differentierade celler i kulturer som härrör från kyckling på embryonaldagen (ED) 6 eller steg 294. På grund av prevalensen av kottar i kycklinghinnan har kulturer av näthinneceller från ED6 kycklingembryon utvecklats som konberikade kulturer5.

Vikten av konmedierad synskärpa för människan är en truism. Människor som drabbas av genetiska eller åldrande sjukdomar som förändrar konfunktionen är kraftigt handikappade. Detta har främjat en mycket stor mängd studier på ärvda retinaldegenerationer (IRD) med målet att hitta behandlingar för dessa blinda sjukdomar6,7. Den första framgången, erhölls med hjälp av en rekombinant adeno-associerade vektor (AAV) för behandling av en allvarlig form av IRD Leber medfödd amaurosis (LCA), är ett konceptbevis för genterapi8. Identifieringen av de gener vars mutationer utlöser IRD öppnar möjligheten att bota dessa sjukdomar med hjälp av genterapi. Ändå är dessa sjukdomar resultatet av mutationer i mer än 200 distinkta gener9. Även när det gäller autosomala recessiva former av IRD, när återinförandet av den normala kopian av den morbida genen kunde återställa visuell funktion, gynnar den ekonomiska kostnaden för varje enskild utveckling de vanligaste till nackdel för de mindre vanliga och till de för vilka det genetiska ursprunget fortfarande är okänt. Detta faktum fick forskare att tänka på mer allmänna terapier. Apoptotic celldöd uppträdde som en vanlig väg, och ett terapeutiskt mål för dessa sjukdomar som fortskrider genom degeneration av fotoreceptorer, inklusive för autosomala dominerande former10,11. Framgångarna med ett sådant tillvägagångssätt saknas dock. För den vanligaste formen av IRD, retinitis pigmentosa (RP), är den gemensamma vägen den sekundära funktionsförlusten som i slutändan följs av degenerering avkoner 12,13. Förhindra förlust av kon funktion kommer att bevara centrala vision av fovea oberoende av orsakssambandet mutationer14.

I början av RP utlöser förlusten av stavar en minskning av uttrycket av stång-härledd cone viability faktor (RdCVF), kodad av nucleoredoxin-liknande 1 (NXNL1) genen, som avbryter metabolisk och redox signalering mellan stavar ochkoner 15. Administrering av en rekombinant AAV kodning de två produkterna av NXNL1 genen, den trofiska faktorn RdCVF och tiooredoxin enzyme RdCVFL, kan teoretiskt förhindra kon vision förlust i alla genetiska former av RP16. Vi har visat att NXNL1 genprodukten RdCVFL uttrycks i kycklingkonberikade kulturer17 och där den spelar en skyddande roll18. RdCVF och NXNL1 genen identifierades genom hög innehåll screening av en retinal cDNA bibliotek med överlevnad av celler från en kon-berikad kultur som readout19. Vi screenade motsvarande 210 000 enskilda kloner av biblioteket med 8 parallella tester för varje klon. Detta representerar ett mycket stort antal tester som kräver enkel tillgång till det biologiska materialet, näthinnan hos kycklingembryon. Vi fann att det var relativt lätt att få embryonerade kycklingägg varje vecka eftersom de är allmänt producerade för jordbruksindustrin för äggläggande höns och köttproducerande kycklingar. Efter noggrann standardisering av de konberikade kulturerna ger systemet ett enkelt, robust och reproducerbart sätt att testa tusentals molekyler för deras förmåga att bevara konens livskraft. Dessa celler är också mottagliga för genetiska manipuleringar20 som gynnar studien av signaltransduktion och biokemiska analyser21,22,23.

Retinal forskare har utvecklat alternativa metoder som användningen av kon cellinje 661W24,25,26. Ändå är identiteten på denna cellinje fortfarande kontroversiell27,28. 661W cellerna klonades från retinal tumörer av en transgenic mus linje som uttrycker SV40 stora T antigen under kontroll av den mänskliga interphotoreceptor retinol-bindande protein promotorn. SV40 stora T antigen förmedlar cellulär omvandling och odödlighet. Som en följd av detta måste signalväg som identifieras med hjälp av 661W-celler rapporteras i samband med en transformerad och odödlig celllinje som på många sätt skiljer sig från koner på plats. I det avseendet består det konberikade kultursystemet av primära nervceller, de koner som är mer fysiologiskt relevanta.

Även om det är möjligt att få en ren kultur av fotoreceptorer med vibratome sektionering av mus näthinnan, gör den mycket låga andelen rör i den yttre näthinnan av gnagare detta tillvägagångssätt olämpligt för att producera rörberikade kulturer29. Gris näthinnan innehåller ingen fovea men har en region som kallas area centralis som är mycket berikad i koner30. Den höga andelen kottar i näthinnan dagliga gnagare, som Arvicanthis ansorgei och Psammomys obsesus31,32, erbjuder en möjlig lösning men kräver uppfödning av sådana exotiska arter. Vuxna grisögon, insamlade från lokala slakterier, kan användas för att producera en blandad kultur av stavar och koner som har använts för att studera fotoreceptoröverlevnad33. En elegant lösning är att förrena koner från gris näthinnan med panorering med jordnöts agglutinin (PNA) lectin, som selektivt binder tillkoner 34. Denna metod är dock svår att genomföra i stor skala på grund av dess komplexitet.

Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPS) erbjuder det mest lovande tillvägagångssättet för att få en konfotoreceptorcellpopulation som kan användas för retinal transplantation men som också kan anpassas till konberikad kultur35,36. Eftersom transkriptionsfaktorn NRL krävs för stavfotoreceptorer37, har Nrl-/- musen en näthinna dominerad av korta vågkoner (S-koner). Inaktiveringen skulle kunna användas för att framställa S-konberikad beredning genom differentiering av människa från iPS38,39. Ett annat möjligt tillvägagångssätt är att främja kon differentiering med sköldkörtelhormon signalering40. Medan nya metoder för att producera konberikade kulturer från mänsklig iPS växer fram, ger kycklingembryon en aktuell beprövad metod19.

Den konberikade kulturen var avgörande för identifieringen av RdCVF genom uttryck kloning19. Detta system användes också framgångsrikt för att visa att RdCVF stimulerar glukosupptag och dess metabolism genom aerob glykolys22. Dessutom användes konberikad kultur för att validera den skyddande rollen för RdCVFL, den andra produkten av NXNL1-genen 23. Mer nyligen användes detta system för att visa förekomsten av skyddande molekyler utsöndras av retinal pigmenterade epitelceller transduced med OTX241.

Protocol

Protokollet godkändes av kommittén för etik för djurförsök vid universitetet Pierre och Marie Curie och det franska forskningsministeriet (tillståndsnummer: APAFIS #1028 2015070211275177). Djurförsöken utfördes enligt följande tillstånd: "Certificat d'autorisation d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9 november 2011-8 november 2016)".

1. Inkubation av befruktade ägg

  1. Samla veckovis befruktade ägg (stam I 657, röd etikett), erhållna naturligt, vid ett industriellt kläckeri.
  2. Håll de befruktade äggen vid 17 °C (deras biologiska nolla) i laboratoriet efter att de "läggs" av hönsen.
  3. För varje kultur, inkubera sju befruktade ägg i 24 timmar vid 20 °C och sedan 136 timmar vid 37 °C med intermittent återgång till lutningen (en progressiv rörelse i 2 timmar från ena sidan till dess motsatta, en 4-timmarscykel) av ägget i en fuktad kammare.

2. Återhämtning av kycklingembryon

  1. Tvätta ytan på de sju äggen med desinfektionsmedel (t.ex. Pursept A express).
  2. För att bryta äggskalet, gör ett hål i toppen av skalet med stora raka tångar. Skär sedan skalet för att ta bort hatten från ägget som ett mjukkokt ägg.
  3. Extrahera försiktigt varje embryo från äggskalet med böjda tångar och överför det sedan till en petriskål som innehåller steril fosfatbuffert saltlösning (PBS) som tidigare värmts upp till 37 °C. Ta försiktigt bort kuvertet som omger embryona (chorion eller chorioallantoic membrane).
  4. Kontrollera utvecklingsstadiet för varje embryo genom visuell jämförelse med Hamburger och Hamilton42.
  5. Välj ut två embryon i det29:e utvecklingsstadiet (figur 1). Vingarna böjer sig vid armbågarna. Kragen sticker ut synligt. Lagförslaget är mer framträdande än på 28:e scenen.
  6. Ge dessa utvalda embryon ögonen och överför dem i CO2-oberoendemedium (Life technologies).
    VARNING: Det är mycket viktigt att embryot är i steg 29 och inte i steg 28 eller 30 (figur 1). Det är därför det är nödvändigt att inkubera minst 7 ägg, även om bara två slutligen kommer att användas. Chorion är mycket tunn, så svår att skilja, men den är mycket nära embryot, så den måste avlägsnas utan att röra embryot.

3. Dissekering av näthinnan

  1. Halshugg och rekonstruera de utvalda embryona med böjda tång.
  2. Överför de fyra ögonen till CO2-oberoendemedium. Detta medium innehåller 0,9 mM CaCl2 och 0,65 mM MgCl2.
  3. Placera ögat med hornhinnan med ansiktet nedåt, den optiska nerven vänd mot experimenteraren. Borra ett hål i synnerven med två raka tångar.
  4. För in en gren av varje tång mellan näthinnan och pigmentepiteleriet (figur 2). Dra i varje tång och vrid ögat för att lossa epitelet från näthinnan. Ta bort hornhinnan följt av linsen och glaskroppen.
  5. Överför de fyra näthinnan i en petriskål som innehåller Ringers medium vid pH 7.2.
    VARNING: Se till att endast näthinnan finns kvar och ta bort eventuella spår av glaskropp och återstående näthinnepigmenterat epitel.

4. Förbereda näthinnecellsupphängningen

  1. Skär de fyra näthinnorna i mycket små bitar med två raka tångar.
  2. Tvätta näthinnan två gånger med Ringers medium.
  3. Efter den andra tvätten med Ringers medium, låt näthinnan falla på botten av röret och ta bort Ringers medium. Behandla näthinnebitarna i 20 minuter vid 37 °C med en lösning av trypsin (0,25% w/v).
  4. Sprid lösningen efter 10 minuter genom på varandra följande sug. Ladda ur med en Pasteur-pipett och kontrollera att näthinnebitarna är dissocierade. Stoppa reaktionen genom att lägga till odlingsmedier kompletterade med 10% inaktiverat fosterkalvserum.
  5. Inkubera cellupphängningen med 0, 05 mg DNase I. Dissociera cellklustren och DNA genom successiv sug och urladdning med en Pasteur-pipett omedelbart efter tillsats av DNase.
  6. Tvätta näthinnecellsupphängningen två gånger med kemiskt definierat odlingsmedium (CDCM): en lika stor volym av Dulbeccos modifierade eaglemedium och M199-media kompletterade med 100 μg/ml linolsyra/BSA. 0,86 μM insulin, 0,07 μM transferrin, 2,0 μM progesteron, 0,28 μM prostaglandin, 0,29 μM Na2SeO3,182 μM putrescine, 3 mM taurin, 4,7 μM cytidin 5′-diphosphocholin, 2,7 μM cytidin 5′-diphosphoethanolamine, 0,55 μM hydrokortison, 0,03 μM trijodtyronin, 1 mM natriumpyuvat och 20 μM gentamycin.

5. Sådd av näthinneceller

  1. Behandla två svarta 96-brunns odlingsplattor med genomskinlig botten i 2 timmar vid 37 °C med poly-L-lysin vid 32,25 μg/cm2.
  2. Skölj dessa tallrikar två gånger med M199 kulturmedium. Återanvänd cellpelleten i 1 ml CDCM.
  3. Tillsätt till en alikvot på 10 μL av cellupphängningen trypan blå för att färga de levande cellerna. Tillsätt cellupphängningsprovet i en haemocytometer (Malassez cellräkningskammare).
    1. Under ett mikroskop räknar du de färgade cellerna för fyra rader av haemocytometern (dvs. 40 rutor) och beräknar sedan det genomsnittliga cellnumret för en rad. Beräkna koncentrationen av celler i suspensionen med hjälp av följande metod: Antal celler/ml suspension = genomsnittligt antal celler i rad (10 kvadrater) x 10 det totala antalet kvadrater av haemocytometer x utspädning med trypanblå x 1 000 (för att uttrycka resultatet som celler/ml).
  4. För cellfjädringen till två koncentrationer (5,6 x 104 celler/ml och 1,12 x 105 celler/ml) som motsvarar de två pläteringstätheterna (1 x 105 celler/cm2 och 2 x 105 celler/cm2) med CDCM.
  5. Frö 50 μL av de två cellupphängningar i de två förbehandlade svarta 96-brunns odlingsplattorna. Fördela cellerna i plattorna med en flerkanalspipett från plattans högra sida till vänster, homogenisera mellan varje kolumn, så att cellernas fördelning är homogen.
  6. Tillsätt 50 μL av molekylernas bibliotek (t.ex. de konditionerade medierna från ett cDNA-bibliotek, se nedan) som ska screenas med ett fördefinierat mönster (tabell 1).
  7. Inkubera plattorna i sju dagar vid 37°C under 5% CO2 utan byte av media.

6. Räkna livskraftiga celler

  1. Tillsätt 2,7 μM kalcein AM och 0,3 mM ethidium homodimer till varje brunn på plattan.
    OBS: Calcein tränger in i de celler som är ogenomträngliga för stora molekyler som ethidium homodimer. I cytoplasman hos levande celler hydrolyseras calcein av endogena esteraser, blir fluorescerande genom att avge vid 520 nm när den är upphetsad vid 485 nm. Ethidium homodimer binder till DNA på döda celler. Ethidium DNA-homodimerbindning orsakar röd fluorescens som avges vid 635 nm efter excitation vid 520 nm.
  2. Inkubera plattorna i 1 timme vid rumstemperatur i avsaknad av ljus.
  3. Läs fluorescensen på en automatiserad plåtläsare som består av ett inverterat mikroskop utrustat med en kvicksilverlampa med två excitationsfilter vid 485 och 520 nm, två utsläppsfilter vid 520 och 635 nm, ett mål (x10), ett motoriserat steg som styrs av en processor och en laddningsankparad enhetskamera (CCD). Denna räkneplattform styrs av Metamorph-programvaran19. Det gör det möjligt att förvärva fluorescensbilder av levande celler och döda celler samtidigt i varje brunn på 96-brunnsplattan, från brunnar A1 mot brunn A12, sedan B12 mot B1, C1 mot C12 och så vidare (Tabell I).
  4. Beräkna medelområdet A för en enskild cell med hjälp av de 18 brunnarna i de negativa kontrollerna (tabell I).
  5. Räkna cellerna i varje brunn på plattan och använd följande empiriska formel A x 29 / 20,7 för att förhindra att celldubbel (gruppering av två celler) räknas. Poängskart den skyddande effekten av konerna med molekyler som förhållandet mellan det genomsnittliga cellnumret i de 4 brunnarna där vi testade molekylen jämfört med det genomsnittliga cellnumret i de 18 brunnarna i den negativa kontrollen (se tabell 1 och kompletterande figur 1).
  6. Kombinera resultaten av plattan sådd vid 1 x 105 celler/cm2 med den som sås vid 2 x 105 celler/cm2 för att utvärdera det potentiella skyddet (livskraftsförhållandet) med varje molekyl som screenas.

Representative Results

Vi beskriver här hur det konberikade kultursystemet kan användas för att identifiera nya konskyddande proteiner. Vi använde detta protokoll för att screena ett normaliserat cDNA-bibliotek av choroid och retinal pigmenterat epitel från 400 ögon av 8 veckor gamla Long-Evans råttor43.

Detta bibliotek innehåller 6,0 x 106 oberoende kolonier som bildar enheter (CFUs) och har en genomsnittlig klonad skärstorlek på 2,1 kilobas (kb), med större än 99% av rekombinanta kloner. Pooler av 100 kloner från det biblioteket transiently transfected (0.1 μg av plasmid DNA) till COS-1 celler och det konditionerade mediet (CM) av COS-1 skördades efter inkubation i 48 timmar i DMEM utan serum. Membran eller exosomer togs inte bort genom ultracentrifugation. Femtio mikroliter av varje CM lades till 4 brunnar av två 96-brunnsplattor: en sådd vid 2 x 105 celler / cm2, den andra vid 4 x 105 celler / cm2. CM från COS-1-celler som transfecterats med den tomma vektorn pcDNA3.1 som användes för att konstruera biblioteket användes som negativ kontroll (tabell 1). Totalt 2 112 uppsättningar av 100 kloner motsvarande 211 200 enskilda kloner utvärderades i fyra kulturbrunnar och för två såddförhållanden av konberikerade kulturer. De två villkoren motsvarar två något olika inokuleringstätheter vilket gör det möjligt att bedöma skyddsaktiviteten mer exakt, för totalt 1 689 600 kulturbrunnar.

Bland de 42 klonpoolerna med ett förhållande som är större än 2 har poolerna 0080 och 0073 lönsamhetsförhållandet 16 och 14 gånger högre efter 7 dagars kultur än den negativa kontrollen, pcDNA3.1 (Kompletterande figur 1). Denna analys är nödvändig för att identifiera intressepoolerna. Varje vald pool med 100 kloner delades in i 16 uppsättningar av 10 kloner från deras glycerolbestånd. Dessa delpooler utarbetades och testades enligt samma metod i en andra screeningomgång (dvs. totalt 3 200 kulturbrunnar). Delpoolen 0073-09 gav det starkaste lönsamhetsförhållandet(kompletterande figur 2A)och delades upp för att producera 16 enskilda kloner som testades i en tredje omgång screening på konberikade kulturer. Klonen 0073-09-37 klonen sticker tydligt ut från de andra med ett lönsamhetsförhållande som motsvarar 2,5(kompletterande figur 2B). Y-axeln har en annan skala även om såddtätheten var densamma än i kompletterande figur 2A. Vi har sett detta ofta när analyserna upprepas varje vecka i månader. Efter analys bekräftar dessa resultat att klon 0073-09-37 har en robust och reproducerbar effekt på konens överlevnad. Testet upprepades oberoende av detta (figur 3A), och insatsen på 1,8 kb sekvenserades (figur 3B).

En bioinformatisk analys visade att klonen 0073-09-37, att vi namngav epitel-härledda kon vibilitetsfaktor (EdCVF), innehåller tre öppna läsramar (ORF), den som är den mest uppströms (ORF1) kodar för 84 rester av C-terminaldelen av råttproteinet zinkfingerprotein-180 (ZFP180, NP_653358) av 727 aminosyror44. De andra två ORF (ORF2 och ORF3) är mycket mindre väl bevarade hos möss och frånvarande hos andra däggdjur. När orf1 testas självständigt har den endast en skyddande effekt på konerna(kompletterande figur 3). ORF1 producerades som ett glutation S-transferase (GST) fusionsprotein(figur 4A). EdCVF-proteinet renades och GST-taggen togs bort (figur 4B). EdCVF kan förhindra kondegeneration i det konberikade kultursystemet(figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Kycklingembryoni etapper 28,29 och 30utveckling. Pilar W: vinge, C: krage och B: räkning. Skala stapel 1 cm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: Dissekering av kycklingembryonts näthinna Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Epitel-härledd koneta lönsamhetsfaktor (EdCVF), klon 0073-09-37. A. Ökad livskraft på konberikad kultur. B. Jag är inte så bra på Sekvensen av cDNA klon 0073-09-37. Den understrukna sekvensen GAATTC är EcoRI-begränsningsplatsen som används för att konstruera biblioteket. De två kodon GTG i fetstil är ovanliga översättning initiation webbplatser för EdCVF som härstammar från vektorn. Statistisk analys genom Studentprov. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Rekombinant EdCVF-aktivitet. A. Sekvens av EdCVF i fusionen med glutation S-transferase (GST). B. Jag är inte så bra på Det renade rekombinanta EdCVF-proteinet. C. Trofisk aktivitet av GST-EdCVF på kon i kultur. Statistisk analys med Tukeys test. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1: Förhållandet mellan det genomsnittliga cellnumret för en cDNA-pool och den negativa kontrollen, det konditionerade mediet för COS-1-celler som transfecterades med den tomma vektorn pcDNA3.1 under den första screeningomgången. Klicka här för att ladda ner den här filen. 

Kompletterande Figur 2: Antal celler som lever. A. Den andra omgången av screening med underpooler på 0073 pool. B. Jag är inte så bra på Den tredje screeningomgången med isolerade kloner. CN: Det konditionerade mediet av COS-1-celler som transfecteras med den tomma vektorn, pcDNA3.1. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Trofisk aktivitet hos de tre öppna läsramarna i den isolerade klonen 0073-09-37. Statistisk analys med Dunnetts test. Klicka här för att ladda ner den här filen.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1 1 1 1 2 Nc 2 2 2 3 3 Nc
B Nc 3 3 4 4 4 Nc 4 5 5 5 5
C 6 Nc 6 6 6 7 7 Nc 7 7 8 8
D 8 8 Nc 9 9 9 9 10 Nc 10 10 10
E 11 11 11 Nc 11 12 12 12 12 Nc 13 13
f 13 13 14 14 Nc 14 14 15 15 15 Nc 15
G 16 16 16 16 17 Nc 17 17 17 18 18 Nc
H 18 18 19 19 19 19 Nc 20 20 20 Nc 20
NC negativa kontroller
1-20 positioner av poolerna testade i fyrdubbelt

Tabell 1: Plan för 96-brunnsplattan för screening med högt innehåll

Discussion

Bland de många parametrar som kan begränsa produktionen av en konberikad kultur från kycklingembryon är det första kritiska steget att noggrant identifiera utvecklingsstadiet för embryona i de kläckta äggen. Det har observerats att cellkulturen från näthinnan av embryon i ED8 (34: estadiet) producerar endast 35% fotoreceptorer, med de återstående 65% är gjorda av andra nervceller4. Oavsett den logistiska applicerad för att få de kläckta äggen är det nödvändigt att finjustera temperaturen och inkubationstiden och noggrant undersöka embryona jämfört med referensbilderna av alla utvecklingsstadier42,45.

Ursprungligen utvecklades det konberikade kultursystemet med hjälp av White Leghorn-stammen4. Den vita färgen på äggen av den stammen uppskattas inte särskilt i Frankrike, så vi använde en stam av kyckling som producerar bruna ägg. Vi använde I 657-stammen, som görs genom att korsa I 66 tuppar med JA57 höns5. Vi kunde reproducera egenskaperna hos de ursprungliga kulturerna. Detta visar att kycklingens genetiska bakgrund inte är avgörande för att få konberikade kulturer.

Vi har inte testat effekten av individuellt avlägsnande av kosttillskott i odlingsmediet, men har observerat att insulin spelar en avgörande roll i enlighet med effekten av insulin på överlevnaden av koner i rd1 musen, en modell av autosomal recessiv RP46. Trijodtyronin (T3) kan också delta i differentiering av retinala prekursorceller i kycklingembryon i koner enligt sköldkörtelhormonreceptorns roll i näthinnecellens öde under utveckling40. Följaktligen kan det konberikade kultursystemet inte användas för att identifiera insulin genom uttryckskloning46.

Det konberikade kultursystemet förlitar sig på kulturen hos primära nervceller och är mycket lämpligare tha-metoder som förlitar sig på användningen av odödliga celler som cellinjen 661W24,25,26.

Metoden som beskrivs här kan modifieras genom att utföra en tidigare elektroporation med plasmid DNA20. Innan näthinnans cellupphängning bereds placeras hela näthinnan i kammaren hos en specialtillverkad elektroporator med 120 μL 0,5 μg/μL plasmid-DNA i 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA. Fem pulser på 15 V för 50 ms vardera appliceras åtskilda med 950 ms intervall22. Försök att leverera störande RNA (RNAi) med hjälp av replikering kompetent aviär skarv (RCAS) retrovirus till kon-berikade kulturer misslyckades47. Detta beror säkert på det faktum att i avsaknad av serum och i kulturer med låg densitet är retinala prekursorceller inte replikatoriska, en nödvändiga för spridning av retrovirus.

Vi utvecklade konberikat kultursystem för att identifiera trofiska faktorer som främjar konöverlevnad med uttryckskloning19. För att göra det möjligt utförde vi ett första steg med screening med högt innehåll med konditionerat medium från pooler med 100 kloner. Även om cDNAs från biblioteket uttrycks under kontroll av en stark CMV-promotor efter transfection av COS-1-celler, erbjuder det inte en garanti för att alla proteiner som kodas av enskilda cDNAs når en koncentration som är tillräcklig för att poängsägas positivt genom lönsamhetsanalysen. Detta är en stor begränsning. I den meningen är all screening inte riktigt uttömmande. Dessutom, även om membranösa proteiner inte avlägsnades från det konditionerade mediet, är analysens konfiguration ogynnsam för identifiering av icke-diffusiva faktorer. Ett alternativ skulle vara att screena enskilda kloner efter att ha erhållit sekvensen av cDNAs för att undvika dubbleringar i analysen många gånger samma kandidatprotein. Detta initierades genom att sekvensera retinal cDNA-biblioteken vi använde43. Även om detta tillvägagångssätt är rationellt har det också sina begränsningar. Den bioinformatiska analysen av cDNA-sekvenserna kommer oemotståndligt att införa, förutom minskningen av redundansen, prioriteringen av screening av vissa kloner baserat på kunskap. Detta kommer inte att vara skadligt om slutligen hela biblioteket skulle screenas även om den tid som krävs för att göra det kommer att förlängas avsevärt. Men alltid kommer sekvensens identitet att påverka vårt sätt att se på resultaten. Detta kommer inte att vara neutralt eftersom tolkningen av sekvensen naturligtvis kommer att konkurrera med experimentella data.

Identifieringen av EdCVF visar också att screening med högt innehåll medför tekniska begränsningar. Från den första screeningomgången identifierade vi två pooler med hög aktivitet(kompletterande figur 1). Poolen 0073 ledde till en framgångsrik identifiering av EdCVF, medan pool 0080 inte gjorde något sådant konstaterande. Vi har inte löst det problem som kan bli följden av förlusten av den aktiva klonen under utarbetandet av underpooler. Alternativt är det inte uteslutet, även om det inte är statistiskt gynnsamt, att bland cDNAs i pool 0080 agerade två proteiner synergistiskt och deras aktivitet kunde inte observeras som enskilda kloner.

Identifiering av molekyler som skyddar koner genom screening av små molekyler är en framtida tillämpning av det konberikade odlingssystemet. Sådana molekyler kommer att vara ovärderliga för behandling av retinala patologier för vilka genterapi inte är det lämpligaste tillvägagångssättet som åldersrelaterad makuladegeneration.

Disclosures

TL, J-AS och VF innehar ett patent på användningen av EdCVF för att behandla retinaldegenerationer [WO2009071659 (A1). Jun. 12 2007].

Acknowledgments

Författarna tackar Jacques Bellalou, Lorelei Fournier, Emmanuelle Clérin, Frédéric Blond och entreprise agricole à responsabilité limitée (EARL Morizeau Dangers, Frankrike) för deras ovärderliga hjälp. Detta arbete stöddes av Inserm, Sorbonne University, Agence Nationale pour la Recherche (ANR, Labex Lifesenses), Foundation Fighting Blindness (USA) och IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] med stöd av franska statliga medel som förvaltas av ANR inom Investissements d'Avenir-programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) Corning 3603
Calcein AM Thermo-Fisher scientific C1430
CCD Camera Photometrics CoolSnap  FX HQ
CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) Sigma-Aldrich C0256
CO2 Independant Thermo-Fisher scientific 18045-054
Curved forceps Dutscher 005093
DMEM Media Thermo-Fisher scientific 41966-029
DNAse Sigma-Aldrich D4263
Eggs incubator FarmLine M08 01 3100
Ethidium Homodimer Thermo-Fisher scientific E1169
Fœtal bovine serum Thermo-Fisher scientific 10270-098
Gentamycin Thermo-Fisher scientific 15710-049
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0880
ITS (insulin Transferine selenium) Sigma-Aldrich I1884
large straight pliers Dutscher 005074
Linoleic acid Sigma-Aldrich L8384
M199 medium Thermo-Fisher scientific 31150-022
Metamorph software Metamorph
Microscope NIKON Eclipse TE2000
Motorized stage Martzauzer Mutlicontrol 2000
Optical filter switch Shutter Instrument company Lambda 10-2
PBS 1X Thermo-Fisher scientific 14190-086
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P6282
Progesterone Sigma-Aldrich P7556
Pursept A express Fisher scientific 11814110
Putriscine Sigma-Aldrich P5780
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
straight forceps Dutscher 005092
Taurine Sigma-Aldrich T8691
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T6397
Trypan blue Thermo-Fisher scientific 15250-061
Trypsine 0.25 % Thermo-Fisher scientific 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brownstein, C. D. The Implicit Mind. , Oxford University Press. (2019).
  2. Heesy, C. P., Hall, M. I. The nocturnal bottleneck and the evolution of mammalian vision. Brain, Behavior and Evolution. 75 (3), 195-203 (2010).
  3. Borges, R., et al. Adaptive genomic evolution of opsins reveals that early mammals flourished in nocturnal environments. BMC Genomics. 19 (1), 121 (2018).
  4. Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
  5. Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 818-825 (2003).
  6. Roska, B., Sahel, J. A. Restoring vision. Nature. 557 (7705), 359-367 (2018).
  7. Duncan, J. L., et al. Inherited Retinal Degenerations: Current Landscape and Knowledge Gaps. Translational Vision Science & Technology. 7 (4), 6 (2018).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. RetNet. Retinal Information Network. , (2020).
  10. Doonan, F., Donovan, M., Cotter, T. G. Activation of multiple pathways during photoreceptor apoptosis in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (10), 3530-3538 (2005).
  11. Comitato, A., et al. Dominant and recessive mutations in rhodopsin activate different cell death pathways. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2801-2812 (2016).
  12. Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Current Gene Therapy. 7 (2), 121-129 (2007).
  13. Baumgartner, W. A., Baumgartner, A. M. Accounting for disagreements on average cone loss rates in retinitis pigmentosa with a new kinetic model: Its relevance for clinical trials. Medical Hypotheses. 89, 107-114 (2016).
  14. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), (2010).
  15. Leveillard, T., Sahel, J. A. Metabolic and redox signaling in the retina. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (20), 3649-3665 (2017).
  16. Clerin, E., Marussig, M., Sahel, J. A., Leveillard, T. Metabolic and Redox Signaling of the Nucleoredoxin-Like-1 Gene for the Treatment of Genetic Retinal Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), (2020).
  17. Fridlich, R., et al. The Thioredoxin-like Protein Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVFL) Interacts with TAU and Inhibits Its Phosphorylation in the Retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
  18. Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants, Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
  19. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nature Genetics. 36 (7), 755-759 (2004).
  20. Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. Journal of Visualized Experiments. (105), e52002 (2015).
  21. Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
  22. Ait-Ali, N., et al. Rod-derived cone viability factor promotes cone survival by stimulating aerobic glycolysis. Cell. 161 (4), 817-832 (2015).
  23. Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
  24. Tan, E., et al. Expression of cone-photoreceptor-specific antigens in a cell line derived from retinal tumors in transgenic mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 764-768 (2004).
  25. Wang, X. W., Tan, B. Z., Sun, M., Ho, B., Ding, J. L. Thioredoxin-like 6 protects retinal cell line from photooxidative damage by upregulating NF-kappaB activity. Free Radical Biology and Medicine. 45 (3), 336-344 (2008).
  26. Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
  27. Krishnamoorthy, R. R., Clark, A. F., Daudt, D., Vishwanatha, J. K., Yorio, T. A forensic path to RGC-5 cell line identification: lessons learned. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5712-5719 (2013).
  28. Al-Ubaidi, M. R. RGC-5: are they really 661W? The saga continues. Experimental Eye Research. 119, 115 (2014).
  29. Clerin, E., et al. Vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Hendrickson, A., Hicks, D. Distribution and density of medium- and short-wavelength selective cones in the domestic pig retina. Experimental Eye Research. 74 (4), 435-444 (2002).
  31. Bobu, C., Craft, C. M., Masson-Pevet, M., Hicks, D. Photoreceptor organization and rhythmic phagocytosis in the nile rat Arvicanthis ansorgei: a novel diurnal rodent model for the study of cone pathophysiology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 3109-3118 (2006).
  32. Saidi, T., Mbarek, S., Chaouacha-Chekir, R. B., Hicks, D. Diurnal rodents as animal models of human central vision: characterisation of the retina of the sand rat Psammomys obsesus. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249 (7), 1029-1037 (2011).
  33. Traverso, V., Kinkl, N., Grimm, L., Sahel, J., Hicks, D. Basic fibroblast and epidermal growth factors stimulate survival in adult porcine photoreceptor cell cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (10), 4550-4558 (2003).
  34. Balse, E., et al. Purification of mammalian cone photoreceptors by lectin panning and the enhancement of their survival in glia-conditioned medium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (1), 367-374 (2005).
  35. Gagliardi, G., et al. Characterization and Transplantation of CD73-Positive Photoreceptors Isolated from Human iPSC-Derived Retinal Organoids. Stem Cell Reports. 11 (3), 665-680 (2018).
  36. Gagliardi, G., Ben M'Barek, K., Goureau, O. Photoreceptor cell replacement in macular degeneration and retinitis pigmentosa: A pluripotent stem cell-based approach. Progress in Retinal and Eye Research. 71, 1-25 (2019).
  37. Mears, A. J., et al. Nrl is required for rod photoreceptor development. Nature Genetics. 29 (4), 447-452 (2001).
  38. Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
  39. Kallman, A., et al. Investigating cone photoreceptor development using patient-derived NRL null retinal organoids. Nature Communications. 3 (1), 82 (2020).
  40. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  41. Kole, C., et al. Otx2-Genetically Modified Retinal Pigment Epithelial Cells Rescue Photoreceptors after Transplantation. Molecular Therapy. 26 (1), 219-237 (2018).
  42. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  43. Kole, C., et al. Identification of an Alternative Splicing Product of the Otx2 Gene Expressed in the Neural Retina and Retinal Pigmented Epithelial Cells. PLoS One. 11 (3), 0150758 (2016).
  44. Shannon, M., Hamilton, A. T., Gordon, L., Branscomb, E., Stubbs, L. Differential expansion of zinc-finger transcription factor loci in homologous human and mouse gene clusters. Genome Research. 13 (6), 1097-1110 (2003).
  45. Stern, C. D., Holland, P. W. Essential developmental biology: a practical approach. , (1993).
  46. Punzo, C., Kornacker, K., Cepko, C. L. Stimulation of the insulin/mTOR pathway delays cone death in a mouse model of retinitis pigmentosa. Nature Neuroscience. 12 (1), 44-52 (2009).
  47. Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).

Tags

Neurovetenskap utgåva 169 fotoreceptorer ärvda retinaldegenerationer screening med högt innehåll cellöverlevnad rod-härledd kon livskraftsfaktor terapi.
Konberikade kulturer från näthinnan av kycklingembryon för att studera stång till kon cellulära interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Millet-Puel, G., Pinault, M.,… More

Millet-Puel, G., Pinault, M., Cordonnier, M., Fontaine, V., Sahel, J. A., Léveillard, T. Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (169), e61998, doi:10.3791/61998 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter