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Developmental Biology

शुक्राणु के विकल्प के रूप में माउस पार्थेनोजेनेटिक हैप्लॉयड भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का आवेदन

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61999
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Molecular Health Sciences, Swiss Federal Institute of Technology, ETH Zurich

Summary

इस लेख का उद्देश्य अर्ध-क्लोन भ्रूण के निर्माण के लिए शुक्राणु के विकल्प के रूप में पार्थेनोजेनेटिक हैप्लॉयड भ्रूणस्टेम कोशिकाओं के उपयोग को प्रदर्शित करना है।

Abstract

यौन प्रजनन वाले जीवों में, रोगाणु कोशिकाएं तीक्ष्ण कोशिकाओं का स्रोत होती हैं जो नए व्यक्तियों में विकसित होती हैं। चूहों में, शुक्राणुओं द्वारा एक ओसाइट का निषेचन एक टोटिपोटेंट ज़िगोट बनाता है। हाल ही में, कई प्रकाशनों ने बताया है कि हैप्लॉयड भ्रूणस्टेम कोशिकाएं (haESCs) गेमिक जीनोम का विकल्प हो सकती हैं और भ्रूण में योगदान देती हैं, जो चूहों में विकसित होती हैं। यहां, हम ओसाइट्स में इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन द्वारा भ्रूण का निर्माण करने के लिए शुक्राणु के विकल्प के रूप में पार्थेनोजेनेटिक हैस्क्स को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल में शुक्राणु प्रतिस्थापन के रूप में haESCs तैयार करने के लिए कदम होते हैं, ऊसाइट्स में haESC गुणसूत्रों के इंजेक्शन के लिए, और अर्द्ध क्लोन भ्रूण की संस्कृति के लिए । भ्रूण हस्तांतरण के बाद उपजाऊ अर्द्ध क्लोन चूहों उपज कर सकते हैं । शुक्राणु प्रतिस्थापन के रूप में haESCs का उपयोग कर जर्मलाइन में जीनोम संपादन, भ्रूण विकास के अध्ययन, और जीनोमिक छाप की जांच की सुविधा ।

Introduction

स्तनधारियों में, गेमेस ही कोशिकाएं हैं जो अगली पीढ़ी को आनुवंशिक जानकारी प्रसारित करती हैं। एक ओसाइट और शुक्राणुओं का संलयन एक डिप्लोइड ज़िगोट बनाता है जो वयस्क जानवर में विकसित होता है। गेमिक जीनोम में उत्परिवर्तन इस प्रकार वंश द्वारा विरासत में मिला है और प्रजातियों में आनुवंशिक भिन्नता को चलाएं1. जीन समारोह और रोग मॉडलिंग के लक्षण वर्णन सहित विविध जैविक अध्ययनों के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों का उत्पादन करने के लिए जर्मलाइन में उत्परिवर्तन की शुरूआत लागू की गई है । ओसाइट्स और शुक्राणुतोजोए दोनों मरणासन्न विभेदित और अत्यधिक विशिष्ट कोशिकाएं हैं जो प्रसार बंद हो गई हैं। इसलिए, गेमेस का प्रत्यक्ष संशोधन तकनीकी रूप से कठिन है, और विशेष दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। आनुवंशिक संशोधनों को माउस जर्मलाइन में आनुवंशिक रूप से संशोधित ESCs के इंजेक्शन द्वारा ब्लास्टोसिस्ट में पेश किया जा सकता है, जहां वे विकासशील भ्रूण में एकीकृत होते हैं और जर्मलाइन को उपनिवेश करते हैं। इसके अतिरिक्त, CRISPR/Cas9 प्रणाली सहित जीनोम संपादन दृष्टिकोण का उपयोग कर जाइगोट्स के आनुवंशिक संशोधन, व्यापक रूप से अपनाया गया है2।

हाल ही में, एक उत्कृष्ट दृष्टिकोण की सूचना दीगई है, जो एक गेमिक जीनोम3, 4, 5,6,7,8के विकल्प के रूप में एचईएससी लागू करता है। एचईएससी स्टेम सेल लाइनें होती हैं जो पार्थेनोजेनेटिक या एंड्रोजेटिक हैप्लाइड ब्लास्टोसिस्ट के भीतरी कोशिका द्रव्यमान से प्राप्त होती हैं और इसमें गुणसूत्रों का एक सेट होता है4,7,9,10. यह प्रदर्शित किया गया है कि पार्थेनोजेनेटिक और एंड्रोजेनेटिक हास्क दोनों ही ओसाइट्स में इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के बाद अर्ध-क्लोन चूहों के जीनोम में योगदान दे सकते हैं। अन्य दृष्टिकोणों के विपरीत, एचईएससी के जीनोम को उनकी आत्म-नवीकरण क्षमता के कारण संस्कृति में सीधे संशोधित किया जा सकता है। शुक्राणु को एचईएससी के साथ बदलकर रोगाणु में आनुवंशिक संशोधनों का परिचय जैविक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। यह अलग से संस्कृति और मातृ या पैतृक जीनोम, जो क्रमशः पार्थेनोजेनेटिक या एंड्रोजेटिक haESCs से प्राप्त कर रहे है हेरफेर करने के लिए एक संभावना के लिए प्रदान करता है । इसके बाद एचईएससी का उपयोग गेमिक जीनोम प्रतिस्थापन के रूप में किया जा सकता है, जो जीनोमिक छाप, एलील-विशिष्ट अभिव्यक्ति और माता-पिता की विशिष्ट प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है।

चूहों में, सामान्य भ्रूण विकास11के लिए मातृ और पैतृक जीनोमिक दोनों जानकारी की आवश्यकता होती है। इसलिए, शुक्राणु जीनोम5,8को बदलने के लिए जंगली प्रकार के पार्थेनोजेनेटिक एचईएससी (PHAESCs) को इंजेक्शन दिए जाने पर पूर्ण अवधि के पिल्ले प्राप्त नहीं किए जा सके। विकास खंड को दूर करने के लिए, पार्थेनोजेनेटिक एचईएससी के मातृ जीनोम के जीनोमिक छाप को पैतृक विन्यास में ठीक करने की आवश्यकता है। इसे अंतर से मेथिलेटेड क्षेत्रों (डीएमआर) में हेरफेर करके प्राप्त किया जा सकता है। आज तक, एच19-डीएमआर, जीटीएल 2-डीएलके 1 आईजी-डीएमआर और ̈सगआरएफ1-डीएमआर के लक्षित विलोपन का अध्ययन किया गया हैताकि phaESCs3, 5,8,12में मातृ व्यक्त किए गए जीन का दमन किया जा सके। इन अध्ययनों से पता चला है कि एच19-डीएमआर और आईजी-डीएमआर दोनों के विलोपन एक मातृ को एक पैतृक छाप विन्यास में बदलने के लिए पर्याप्त हैं जो शुक्राणु गुणसूत्रों के लिए विकल्प बन सकते हैं। PHAESCs के इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन जो ओसाइट्स में दो डीएमआर विलोपन ले जाते हैं, 5.1% और 15.5% स्थानांतरित 2-सेल भ्रूण के बीच आवृत्ति के साथ अर्ध-क्लोन पिल्ले मिले।

यह प्रोटोकॉल एच19-डीएमआर और आईजी-डीएमआर दोनों के विलोपन के साथ पीएचईसी के आवेदन पर आधारित है, जिसे हम डबल-नॉकआउट फेजसी (डीसीओ-phaESCs) शब्द करते हैं। हम DKO-phaESC लाइनों की स्थापना के लिए PHAESCs में जीनोमिक छाप के संशोधन के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं, DKO-phaESCs के इंजेक्शन के लिए एक शुक्राणु जीनोम के विकल्प के रूप में oocytes में, अर्द्ध क्लोन भ्रूण की संस्कृति के लिए blastocysts के लिए, और अर्द्ध क्लोन चूहों को प्राप्त करने के लिए । यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए एक संदर्भ है जो पैतृक जीनोम और अर्द्ध क्लोन भ्रूण और चूहों की पीढ़ी के सटीक और प्रत्यक्ष हेरफेर की आवश्यकता है ।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों के मानकों और कैंटोनल नैतिकता आयोग ज्यूरिख और आणविक स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान, ईटीएच ज्यूरिख में महाकाव्य पशु सुविधा के नियमों के अनुसार लाइसेंस ZH152/17 के तहत किया गया ।

नोट: यह प्रोटोकॉल H19के हटाने के साथ शुरू होता है - और आईजी-PHAESCs में DMRs। PHAESC लाइनों को स्थापित करने के बारे में विवरण के लिए, कृपया प्रकाशित रिपोर्ट10,13का उल्लेख करें । चित्रा 1एमें इस प्रोटोकॉल (चरण 1-14) का अवलोकन और समय सीमा प्रदान की गई है; मीडिया, समाधान और बफ़र्स टेबल 1में सूचीबद्ध हैं । DKO-PHAESC लाइनों (चरण 1-6) स्थापित करने की प्रक्रिया चित्रा 1Bमें दिखाया गया है, और अर्ध-क्लोन भ्रूण (चरण 7-14) के निर्माण की रणनीति को चित्रित किया गया है चित्र 1Cमें।

1. एच19को हटाने के लिए प्लाज्मिड का ट्रांसफेक्शन- पीएचईसी में डीएमआर और आईजी-डीएमआर

  1. Cas9 नाभिकों की सह-अभिव्यक्ति के लिए CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड तैयार करें और H19-DMRऔर IG-DMRके विलोपन को लक्षित करने के लिए आरएनए का मार्गदर्शन करें । लिगेट गाइड आरएनए ओलिगोस के चार जोड़े (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, आर; आईजी-डीएमआर-gRNA1-F, आर; आईजी-डीएमआर-जीआरए 2-एफ, आर टेबल 2में सूचीबद्ध) pX330 प्लाज्मिड्स में।
    नोट: इन 4 CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड्स14की तैयारी के लिए विस्तृत प्रक्रिया पर प्रकाशित प्रोटोकॉल का उल्लेख करें । वैकल्पिक रूप से, सामान्य माउस उपभेदों के लिए उपलब्ध प्लाज्मिड भी एक भंडार(सामग्री की तालिका) केमाध्यम से सुलभ हैं।
  2. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन करके 0.2% जिलेटिन समाधान के 1 मिलील के साथ 6-अच्छी प्लेट के एक कुएं की सतह को कोट करें।
  3. प्लेट 2 × 105 वाइल्डटाइप phaESCs जिलेटिन पर लेपित अच्छी तरह से एंटीबायोटिक दवाओं के बिना haESC माध्यम में अच्छी तरह से, और 1 दिन के लिए एक 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट ।
    नोट: एंटीबायोटिक दवाओं के माध्यम से छोड़ दिया जाता है बाद lipofection की दक्षता में वृद्धि हुई है । हमने 10 मार्ग पर वाइल्डटाइप फेजसी का उपयोग किया। हम प्रारंभिक मार्ग phaESCs का उपयोग करने की सलाह देते हैं, लेकिन विभिन्न प्रकार के मार्ग संख्या का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है8। अंश संख्या और अर्द्ध क्लोन भ्रूण और चूहों को प्राप्त करने की दक्षता के बीच संबंध वर्तमान में ज्ञात नहीं है ।
  4. एक 6-अच्छी प्लेट के कुएं में phaESCs ट्रांसफेक्ट (चरण 1.3 से) 6 प्लाज्मिड के साथ एक साथ लिपोफेक्शन रीएजेंट का उपयोग कर: 50 एनजी पिग्गीबेक प्लाज्मिड एक सीएजी-ईजीएफपी ट्रांसजीन ले जा रहा है, 50 एनजी पिग्गीबाक ट्रांसपोसेस प्लाज्मिड, और 4 CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड (चरण 1.1 से) में से प्रत्येक के 600 एनजी। ट्रांसफैक्शन की विस्तृत प्रक्रिया पर निर्माता के प्रोटोकॉल को देखें।
    नोट: दो पिग्गीबेक प्लाज्मिड का उपयोग एफईएससी के जीनोम में उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति के लिए ट्रांसपोसन को एकीकृत करने के लिए किया जाता है। यदि कोशिकाओं के जीएफपी अंकन की आवश्यकता नहीं है, तो इन दो प्लाज्मिड को फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जैसे, pX458 प्लाज्मिड) की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए एक CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, बजाय PX330 प्लाज्मिड में से एक । क्षणिक ईजीएफपी अभिव्यक्ति का उपयोग संक्रमित कोशिकाओं को छांटने के लिए किया जा सकता है।
  5. ट्रांसफैक्शन के दो दिन बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें, और ट्राइपसिन के 800 माइक्रोन जोड़ें।
  6. 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। फिर, ट्रिप्सिन को बुझाने के लिए वॉश बफर के 2 एमएल जोड़ें, और एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट करें।
  7. सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें, और सुपरनेट को हटा दें।
  9. 15 माइक्रोन/एमएल होचस्ट 33342 के साथ सप्लीमेंट वाले एचईएससी मेंटेनेंस बफर के 400 माइक्रोन में सेल पेलेट को रीसुस्ट करें।
    नोट: Hoechst ३३३४२ की संभावित विषाक्तता को कम करने के लिए, 1 μg/mL Hoechst ३३३४२ और ५० μM verapamil के बजाय 15 μg/mL Hoechst ३३३४२15का इस्तेमाल किया गया है ।
  10. 15 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, सेल स्ट्रींगर कैप के माध्यम से सेल सस्पेंशन को 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और अगले चरण (धारा 2) में उपयोग करने के लिए तैयार होने तक ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

2. एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर संक्रमित phaESCs के एकल सेल चढ़ाना

  1. एक दिन संक्रमित phaESCs छंटाई से पहले, प्लेट विकिरणित माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (MEFs) जिलेटिन पर लेपित ९६-अच्छी प्लेटों 4 × १०४ कोशिकाओं/सीएम2 के घनत्व पर MEF माध्यम में । आमतौर पर, 6 प्लेटें लक्षित विलोपन के साथ एक PHAESC लाइन स्थापित करने के लिए तैयार हैं। 5% सीओ2 वातावरण में प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: विकिरणित एमईएफ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हम DR4 चूहों के E12.5 भ्रूण से प्राप्त MEFs का उपयोग करें। हालांकि एचईएससी एमईएफ के बिना जिलेटिन-लेपित प्लेटों पर बढ़ सकता है, हम सॉर्ट किए गए एकल एचईएससी की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए एमईएफ की सलाह देते हैं।
  2. छंटाई के दिन, 96-अच्छी प्लेटों से एमईएफ माध्यम को एस्पिरेट करें, और प्रति अच्छी तरह से ताजा एचईएससी माध्यम के 120 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट्स को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 100 माइक्रोन नोजल के साथ एक सेल सॉर्टर स्थापित करें। एक 355 एनएम यूवी लेजर और एक 488 एनएम ब्लू लेजर क्रमशः Hoechst 33342 और EGFP फ्लोरेसेंस के उत्तेजन के लिए उपयोग किया जाता है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, Hoechst 33342 405 एनएम के साथ उत्तेजन द्वारा पता लगाया जा सकता है।
  4. जी 1/एस चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक गेट का उपयोग करके 5 एमएल ट्यूब (चरण 1.10 से) में संक्रमित phaESCs को सॉर्ट करें जो ईजीएफपी अभिव्यक्ति दिखाता है। चरण 2.2 से 96-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में एक सेल जमा करें।
    नोट: Hoechst ३३३४२ धुंधला का पता लगाने आम तौर पर एक 1n, 2n, और 4n डीएनए सामग्री है, जो G1 चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं के अनुरूप के साथ कोशिकाओं की 3 चोटियों अलग, G2/M चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं का मिश्रण है और G1 चरण में diploid कोशिकाओं, और G2/M चरण में diploid कोशिकाओं, क्रमशः । जी1/एस चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं को होचस्ट 33342 फ्लोरेसेंस की कम तीव्रता वाले शिखर के रूप में पहचाना जाता है। एक प्रतिनिधि परिणाम और एक छंटाई गेट चित्रा 2Aमें दिखाया गया है ।
  5. चढ़ाना के बाद, 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

3. संक्रमित phaESCs की उप क्लोनिंग

  1. एकल सेल चढ़ाना के तीन दिन बाद, एक माइक्रोस्कोप के नीचे ९६-अच्छी प्लेटों के कई कुओं में कालोनियों को देखा जा सकता है । जिन कुओं में केवल एक ही कॉलोनियां उगती हैं, उन्हें चिह्नित करें।
    नोट: हमारे अनुभव में, एकल कालोनियों 96-अच्छी प्लेटों के कुओं के 20%-40% में देखा गया था।
  2. एकल सेल चढ़ाना के बाद 4 दिन पर, एकल कालोनियों के साथ कुओं में नए haESC माध्यम के साथ माध्यम के आधे की जगह ।
  3. पासिंग से एक दिन पहले (सिंगल सेल प्लेटिंग के बाद 4 या 5 दिन में), प्लेट ने एमईएफ माध्यम में 4 × 104 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर जिलेटिन-लेपित ९६-वेल प्लेटों पर एमईएफ को विकिरणित किया । प्लेट्स को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. एकल सेल चढ़ाना के 5 या 6 दिनों के बाद, 150 माइक्रोन से बड़ा व्यास के साथ एकल कालोनियों युक्त 96-अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं का चयन करें।
    नोट: लगभग 100 कुओं को लक्षित डीएमआर विलोपन के साथ एक PHAESC लाइन स्थापित करने के लिए अधिमानतः चुना जाता है।
  5. चयनित कुओं में माध्यम को एस्पिरेट करें और ट्राइपसिन के 30 माइक्रोन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-अच्छी प्लेटों को इनक्यूबेट करें। फिर, ट्रिप्पसिन को बुझाने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 30 माइक्रोन वॉश बफर जोड़ें।
  6. प्रत्येक कुएं में 140 μL haESC माध्यम जोड़ें, और एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट करें।
  7. चरण 3.3 में तैयार 96-अच्छी प्लेटों के कुओं से एमईएफ माध्यम को एस्पिरेट करें।
  8. चरण 3.6 से प्रत्येक अच्छी तरह से PHAESCs को चरण 3.7 से नए 96-अच्छी प्लेट के एक ताजा कुएं में स्थानांतरित करें।
  9. 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर phaESC उपकक्षित 96-अच्छीप्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  10. अगले दिन, प्रत्येक कुएं से सभी माध्यमों को एस्पिरेट करें, और नए एचईएससी माध्यम के 120 माइक्रोन जोड़ें। 5% सीओ2 वातावरण में प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  11. एक दिन पहले कोशिकाओं passaging के लिए ढुलमुल हो जाते हैं, जिलेटिन पर विकिरणित MEFs प्लेट-लेपित 24-अच्छी प्लेटों 4 × 104 कोशिकाओं/एमईएफ माध्यम में सेमी2 के घनत्व पर । प्लेट्स को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  12. जब phaESCs पासेजिंग के लिए संकुचित हो गए हैं, तो माध्यम को एस्पिरेट करें और ट्राइपसिन के 30 माइक्रोन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-अच्छी प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  13. ट्राइप्सिन को बुझाने के लिए प्रत्येक कुएं में 90 माइक्रोन वॉश बफर जोड़ें। एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट।
  14. चरण 3.11 से 24-अच्छी प्लेटों के कुओं से एमईएफ माध्यम को एस्पिरेट करें, और ताजा एचईएससी माध्यम के 600 माइक्रोन जोड़ें।
  15. चरण 3.13 में प्रत्येक कुएं से PHAESC उपकक्षानों के निलंबन के 60 μL को चरण 3.14 से 24-अच्छी प्लेटों के एक नए कुएं में स्थानांतरित करें। डीएनए निष्कर्षण और चरण 4 में जेनोटीपिंग के लिए प्रत्येक PHAESC उपक्लोन के शेष निलंबन रखें ।
  16. 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर PHAESC उपकक्षों के साथ24 अच्छी प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  17. एक दिन पहले सेल संस्कृतियों passaging के लिए घनत्व तक पहुंचने, जिलेटिन पर विकिरणित MEFs प्लेट-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटों 4 × 104 कोशिकाओं/एमईएफ माध्यम में सेमी2 के घनत्व पर । प्लेट्स को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  18. जब phaESCs पासेजिंग के लिए पर्याप्त रूप से संकुचित हो जाते हैं, तो माध्यम को एस्पिरेट करें और 250 माइक्रोन ट्राइपसिन जोड़ें। 24-अच्छी प्लेटों को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: चरण 4.9 में जीनोटाइपिंग के बाद, एच19-डीएमआर और आईजी-डीएमआर दोनों को हटाने के साथ केवल phaESC लाइनों को पारित करने की आवश्यकता है।
  19. ट्रिपसिन को बुझाने के लिए प्रत्येक कुएं में 750 μL वॉश बफर जोड़ें। एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट। सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  20. 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें, सुपरनैंट को हटा दें, और एचईएससी माध्यम के 2 एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  21. चरण 3.17 से 6-अच्छी प्लेटों के कुओं से एमईएफ माध्यम को एस्पिरेट करें। प्रत्येक ट्यूब से फेजसी निलंबन को चरण 3.20 से एक नए कुएं में स्थानांतरित करें। प्लेट्स को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  22. 3.17 से 3.21 चरणों को दोहराकर सेल क्लोन का विस्तार करें और प्लेट के आकार और ट्राइप्सिन, वॉश बफर और एचईएससी माध्यम की मात्रा बढ़ाएं। चरण 5 के लिए एमईएफ की प्रत्येक उप-क्लोन phaESC लाइन के लिए एक टी-25 फ्लास्क तैयार करें।
    नोट: हम प्रत्येक उप-क्लोन phaESC लाइन के एक aliquot ठंड माध्यम के ३०० μL में और 5 कदम करने के लिए आगे बढ़ने से पहले तरल नाइट्रोजन भंडारण में एक क्रायोस्टॉक रखने की सलाह देते हैं ।

4. एमईएफ के साथ उप-क्लोन phaESC लाइनों की पहली जेनोटाइपिंग

  1. चरण 3.15 से शेष सेल निलंबन से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए, 96-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में लाइसिस बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें। सेल निलंबन को 1.5 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें। शेष सभी कोशिकाओं को ठीक करने और एक ही 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए लाइसिस बफर के अतिरिक्त 200 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला।
  2. मिश्रण के साथ 3 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलील ट्यूब इनक्यूबेट करें।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब में आइसोप्रोपेनॉल के 460 माइक्रोन जोड़ें, और धीरे-धीरे मिलाएं जब तक कि डीएनए तेज़ी दिखाई न दे।
  4. 5 मिनट के लिए ≥ 10,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें और सुपरनैंट को हटा दें। डीएनए छर्रों को 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोन से धोएं।
  5. 5 मिनट के लिए ≥ 10,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें और सुपरनैंट को हटा दें।
  6. ट्यूबों को 10 मिनट तक हवा में सुखाएं और फिर डीएनए को 20 माइक्रोन पानी में रिसिपेंड करें।
  7. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलीमरेज का उपयोग करके पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) करें।
    नोट: पीसीआर के लिए प्राइमर जोड़े तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं और इस प्रकार उपयोग किए जाते हैं: एच 19-डीएमआर-पी 1 और पी 3 (हटाए गए एच 19-डीएमआर के लिए 407 बीपी); H19-DMR-P2 और P3 (वाइल्डटाइप H19-DMRके लिए ६२३ बीपी); आईजी-डीएमआर-पी 1 और पी 3 (हटाए गए आईजी-डीएमआरके लिए 319 बीपी); आईजी-डीएमआर-पी 2 और पी 3 (वाइल्डटाइप आईजी-डीएमआरके लिए ४९२ बीपी) । सभी प्राइमर जोड़े के लिए पीसीआर का तापमान प्रोफाइल इस प्रकार है- 30 एस 98 डिग्री सेल्सियस, 35 एक्स (10 एस 98 डिग्री सेल्सियस, 20 एस 56 डिग्री सेल्सियस, 30 एस 72 डिग्री सेल्सियस), 5 मिनट 72 डिग्री सेल्सियस। H19-DMRऔर IG-DMRविलोपन के लिए प्रवर्धित डीएनए टुकड़ों की लंबाई CRISPR/Cas9-मध्यस्थता संपादन से जुड़े गैर-अनुरूप अंत के कारण कुछ भिन्नता दर्शाती है । PhaESCs MEFs के साथ सुसंस्कृत थे, जिसमें वाइल्डटाइप H19-DMRऔर IG-DMRडीएनए होते हैं । इसलिए, H19-DMR-P2/P3 और आईजी-DMR-P2/P3,जो वाइल्डटाइप डीएनए टुकड़ों को बढ़ाना के प्राइमर जोड़े, जानकारीपूर्ण नहीं हैं । हालांकि, इन प्राइमर जोड़े को नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाता है और सभी प्रतिक्रियाओं में एक बैंड देना चाहिए।
  8. एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पीसीआर के टुकड़ों का विश्लेषण करें। इलेक्ट्रोफोरेसिस16की विस्तृत प्रक्रिया पर प्रकाशित प्रोटोकॉल का उल्लेख करें ।
  9. दोनों H19-DMRऔर आईजी-DMR के विलोपन के साथ सेल लाइनों कीपहचान करें । इलेक्ट्रोफोरेसिस की एक प्रतिनिधि छवि चित्र 2बीमें दिखाई गई है।
    नोट: हमारे मामले में, 135 उप-क्लोनphaESC लाइनों के बीच एच 19-डीएमआर और आईजी-डीएमआर दोनों के विलोपन के साथ आठ सेल लाइनों की पहचान की गई थी।

5. उप-क्लोन phaESC लाइनों का हैप्लॉयड सेल शुद्धिकरण

  1. जब चरण 3.22 से टी-25 फ्लास्क में उप-क्लोन phaESC संस्कृतियां पासिंग के लिए पर्याप्त घने हो जाती हैं, तो माध्यम को एस्पिरेट करें और ट्राइप्सिन के 1.5 मिलियन जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें। फिर, सिंगल-सेल सस्पेंशन प्राप्त करने के लिए कई बार वॉश बफर और पिपेट के 4.5 एमएल जोड़ें।
  2. प्रत्येक कोशिका निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैंट निकालें और 15 μg/mL Hoechst 33342 के साथ पूरक haESC रखरखाव बफर के 400 माइक्रोन में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें।
  3. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन के बाद, सेल स्ट्रींगर कैप के माध्यम से सेल सस्पेंशन को 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। एचईएससी रखरखाव बफर के अतिरिक्त 400 माइक्रोन के साथ सेल छन्नी टोपी कुल्ला, और एक ही 5 एमएल ट्यूब में शेष कोशिकाओं को इकट्ठा। ट्यूब को सॉर्ट करने के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 100 माइक्रोन नोजल के साथ एक प्रवाह साइटोमीटर सेट करें।
    नोट: Hoechst 33342 405 एनएम पर उत्तेजन द्वारा पता लगाया जा सकता है। यहां होचस्ट 33342 का पता लगाने के लिए 355 एनएम यूवी लेजर का इस्तेमाल किया जाता है।
  5. सेल निलंबन (चरण 5.3 से) और प्रवाह साइटोमीटर में सॉर्ट्ड कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 2 एमएल एचईएससी रखरखाव बफर युक्त एक नई 15 एमएल ट्यूब सेट करें।
  6. विश्लेषण शुरू करें और G1/S चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए छंटाई गेट स्थापित करें। G1/S चरण phaESC आबादी की पहचान करने के लिए चित्रा 2A में हिस्टोग्राम का उल्लेख करें ।
    नोट: कुछ उप-क्लोन phaESC लाइनों में किसी भी हैप्लॉयड कोशिकाओं को शामिल नहीं किया जा सकता है क्योंकि पूर्ण द्विविवाह या कदम 2 में डिप्लॉयड कोशिकाओं की गलत चढ़ाना । यदि जी1/एस चरण में हैप्लॉयड कोशिकाओं को नहीं देखा जाता है, तो छंटाई के बिना दूसरे नमूने में आगे बढ़ें। हमारे मामले में, 5 सेल लाइनों में हैप्लॉयड कोशिकाएं थीं और 3 सेल लाइनों में 8 उप-क्लोन phaESC लाइनों में से केवल डिप्लॉयड कोशिकाएं थीं।
  7. सेल छंटाई के बाद, 15 एमएल संग्रह ट्यूब की दीवार के साथ वॉश बफर के 5 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें। सुपरनिट निकालें।
  8. छंटाई कोशिकाओं की संख्या के आधार पर खेती के लिए उपयुक्त आकार की एक थाली का चयन करें। एक 96-अच्छी प्लेट, एक 24-अच्छी प्लेट, और संस्कृति के लिए 12-अच्छी प्लेट का उपयोग करें 1,000-40,000 कोशिकाएं, 40,000-200,000 कोशिकाएं, और 200,000-40000 कोशिकाएं, क्रमशः। सेल पेलेट को क्रमशः 120 माइक्रोल, 600 माइक्रोल और 1.2 एमएल एचईएससी माध्यम में रीसुस्पेंड करें।
    नोट: उच्च घनत्व पर कोशिकाओं की थाली क्योंकि कम संगम छंटाई के बाद कोशिकाओं की कोशिकाओं की मौत का कारण बन सकता है । इस बिंदु के बाद से, चरण 6 में जीनोटाइपिंग और स्टेप 9 से इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के लिए बाद के आवेदन की सुविधा के लिए एमईएफ के बिना जिलेटिन-लेपित कुओं पर PHAESCs को सुसंस्कृत किया जाता है।
  9. कोशिका निलंबन को उचित आकार के जिलेटिन-लेपित कुएं में स्थानांतरित करने के बाद, प्लेट को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. प्लेट आकार बढ़ाने और ट्राइप्सिन, वॉश बफर और एचईएससी माध्यम की मात्रा में वृद्धि के साथ कदम 3.18 से 3.21 तक दोहराकर PHAESC संस्कृतियों का विस्तार जारी रखें। कोशिकाओं को एमईएफ के बिना जिलेटिन-लेपित कुओं पर सुसंस्कृत किया जाता है।
  11. प्रत्येक उप क्लोन PHAESC लाइन के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से और एक अच्छी तरह से कदम 6 और 9 के लिए एक अच्छी तरह से तैयार करते हैं, क्रमशः ।
    नोट: प्रत्येक उप-क्लोन phaESC लाइन की कुछ कोशिकाओं को 9 कदम आगे बढ़ने से पहले एक तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक में क्रायोस्टॉक के रूप में ठंड माध्यम के ३०० μL में जमे हुए होना चाहिए ।

6. एमईएफ के बिना उप-क्लोन phaESC लाइनों की दूसरी जेनोटीपिंग

नोट: जेनोटीपिंग का दूसरा दौर इस बात की पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि उप-क्लोन phaESC लाइनों में एच 19-और आईजी-डीएमआरएसदोनों के विलोपन हैं, और एमईएफ को हटाने के बाद वाइल्डटाइप एलील्स अनुपस्थित हैं।

  1. माइक्रोस्कोप के तहत पुष्टि करें कि कदम 5.11 से 24-अच्छी प्लेटों के कुओं में संस्कृतियों MEFs से मुक्त हैं।
    नोट: यदि MEFs मनाया जाता है, तो संस्कृतियों को तब तक पास करना जारी रखना आवश्यक है जब तक कि एमईएफ एमईएफ से वाइल्डटाइप डीएनए के साथ पीसीआर को दूषित करने से बचने के लिए गायब न हो जाएं।
  2. संकुचित संस्कृतियों से माध्यम को आकांक्षी और 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से लाइसिस बफर के 400 माइक्रोन जोड़ें। कई बार पाइपिंग करने के बाद, सेल सस्पेंशन को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. मिश्रण के साथ 3 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलील ट्यूब इनक्यूबेट करें।
  4. इनक्यूबेशन के बाद, 1.5 एमएल ट्यूब में आइसोप्रोपेनॉल के 400 माइक्रोन जोड़ें, और धीरे-धीरे मिलाएं जब तक कि डीएनए तेज़ी दिखाई न दे।
  5. 5 मिनट के लिए ≥ 10,000 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें। डीएनए गोली को 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोन से धोएं।
  6. 5 मिनट के लिए ≥ 10,000 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
  7. ट्यूब को 10 मिनट तक हवा में सुखाएं और फिर डीएनए को 50 माइक्रोन पानी में रीसेल करें।
  8. सेल लाइनों की पहचान करने के लिए चरण 4.7 और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद जेनोटीपिंग पीसीआर करें, जिसमें एच19- और आईजी-डीएमआरएसदोनों के विलोपन हैं और वाइल्डटाइप एलील्स से मुक्त हैं।
    नोट: संदर्भ के लिए चित्र 2बी में एक विशिष्ट दूसरी जीनोटाइपिंग विश्लेषण की एक छवि दिखाई गई है। हमारे मामले में, हैप्लॉयड सेल शुद्धिकरण (चरण 5) के बाद चयनित सभी 5 सेल लाइनें वाइल्डटाइप एलील्स से मुक्त थीं और इसमें एच19के केवल विलोपन एलील्स थे - और आईजी-डीएमआरएस।
  9. DKO-phaESC लाइनों के रूप में इस दूसरी जीनोटाइपिंग के बाद चयनित उप-क्लोन phaESC लाइनों का उपयोग करें।

7. चूहों का सुपरओव्यूलेशन

  1. एमआईआई ओसाइट्स के उत्पादन के लिए, ऊसाइट संग्रह से पहले प्रत्येक B6D2F1 महिला माउस (4-5 सप्ताह पुराना) 63-65 घंटे में गर्भवती घोड़ी सीरम गोंडोट्रोपिन (पीएमएसजी) समाधान के 5 आईयू के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा सुपरओव्यूलेशन शुरू करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए B6D2F1 माउस तनाव की सिफारिश की जाती है क्योंकि B6D2F1 oocytes इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन को अच्छी तरह से सहन करता है और प्रक्रिया17के बाद उच्च विकासात्मक क्षमता दिखाता है।
  2. पीएमएसजी इंजेक्शन के 48 घंटे बाद, इंट्रापेरिटोनली प्रत्येक माउस में मानव कोरियोनिक गोंडोट्रोपिन समाधान के 5 आईयू इंजेक्ट करें।

8. ऊसाइट संग्रह

  1. एक अच्छी तरह से 700 माइक्रोनल हाइलुरोनिडेस माध्यम और शेष 3 कुओं में एम2 माध्यम के 700 माइक्रोन युक्त 4-अच्छी प्लेट तैयार करें। इसके अतिरिक्त, M2 माध्यम के 7 एमएल के साथ एक 6-सेमी डिश और M16 माध्यम के 900 माइक्रोन के साथ एक केंद्र-अच्छी डिश तैयार करें। 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट और व्यंजन को पहले से गर्म करें।
  2. इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के दिन, सुबह लगभग 8 बजे सर्वाइकल अपभ्रंश या सीओ 2 साँस लेना द्वारा सुपरोव्यूलित महिलाओं (चरण7.2 से) को इच्छामृत्यु दें। चिमटी और कैंची का उपयोग करके अंडाशय को विच्छेदन करें। ओविक्ट्स को एम2 मीडियम के साथ 6 सेमी डिश में रखें।
  3. 30 जी सुई के साथ ओविडक्ट्स के एम्पुला को फाड़कर क्यूमुलस-ओसाइट परिसरों (सीओसी) को छोड़ दें। सीओसी को प्री-गर्म हाइलुरोनिडेज माध्यम में स्थानांतरित करें और 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. 2-3 मिनट के बाद, एक मुंह पिपेट के साथ क्यूमुलस-मुक्त ओसाइट्स एकत्र करें और 4-वेल प्लेट के अन्य 3 कुओं में ताजा एम 2 माध्यम में स्थानांतरित करके ऊसाइट्स को 3 बार धोएं।
  5. मेटाफेज़ II (एमआईआई) ओसाइट्स को इकट्ठा करें, जिसके पास पहले ध्रुवीय निकाय हैं, एम 16 माध्यम के साथ एक केंद्र-अच्छी डिश में और प्लेट को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि चरण 12 में इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के लिए उपयोग न हो जाए।

9. DKO-PHAESCs का उपचार और संग्रह

  1. इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन (चरण 5.11 से) से एक दिन पहले 60-80% कन्फ्लरी पर एमईएफ के बिना 6-अच्छी प्लेट के कुएं में एक DKO-phaESC संस्कृति तैयार करें।
  2. एम-चरण में सेल चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित करने के लिए, माध्यम को पूरी तरह से एस्पिरेट करें और 0.05 मिलीग्राम/एमएल डेमेकोल्सिन युक्त एचईएससी माध्यम के 2 एमएल जोड़ें।
  3. डेमेकोल्सिन उपचार के 8 घंटे के बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें और ट्राइपसिन के 800 माइक्रोन जोड़ें।
  4. 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें, फिर ट्राइप्सिन को बुझाने के लिए 2 मिलियन वॉश बफर जोड़ें, और एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट करें।
  5. सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
  6. 15 माइक्रोग्राम/एमएल होचस्ट 33342 वाले एचईएससी रखरखाव बफर के 400 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ट करें।
  7. 15 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, सेल सस्पेंशन को सेल छन्नी टोपी के माध्यम से 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और चरण 10 में सेल छंटाई तक ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

10. एम-फेज-गिरफ्तार DKO-PHAESCs का शुद्धिकरण

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 100 माइक्रोन नोजल के साथ एक प्रवाह साइटोमीटर सेट करें।
    नोट: Hoechst 33342 405 एनएम पर उत्तेजन द्वारा पता लगाया जा सकता है। यहां होचस्ट 33342 का पता लगाने के लिए 355 एनएम यूवी लेजर का इस्तेमाल किया जाता है।
  2. एम-चरण-गिरफ्तार DKO-PHAESCs कदम 9.7 से स्थापित करें और विश्लेषण शुरू करें। डेमेकोल्सिन के साथ इलाज किए गए नमूने से हैप्लॉयड एम-फेज कोशिकाओं (2n) को इकट्ठा करने के लिए एक उपयुक्त छंटाई गेट का चयन करें।
    नोट: डेमेकोल्सिन उपचार के बाद, 2 सेल आबादी की उम्मीद की जाती है, जो हैप्लॉयड और डिप्लॉयड एम-फेज-गिरफ्तार कोशिकाओं के अनुरूप है जैसा कि चित्र 3बीमें दिखाया गया है । डेमेकोसिन उपचार के बाद सेल चक्र गिरफ्तारी पूरी हो गई है, इस प्रकार, कोई हैप्लॉयड 1n डीएनए चोटी नहीं देखी जाती है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि हैप्लॉयड एम-फेज कोशिकाओं और डिप्लॉयड जी1 कोशिकाओं के पास एक ही डीएनए सामग्री (2n) है और ओवरलैपिंग चोटियों का उत्पादन होगा।
  3. प्रवाह साइटोमीटर में सॉर्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 2 एमएल एचईएससी रखरखाव बफर युक्त 15 एमएल ट्यूब सेट करें। सेल छंटाई शुरू करें।
  4. सेल छंटाई के बाद, संग्रह ट्यूब की दीवार के साथ वॉश बफर के 5 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
  5. 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एचईएससी रखरखाव बफर की उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
  6. सेल निलंबन को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 12 चरण में इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के लिए तैयार होने तक बर्फ पर ट्यूब रखें।

11. होल्डिंग और माइक्रोइंजेक्शन पिपेट की तैयारी

नोट: इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन (चरण 12) करने के लिए, कई होल्डिंग और माइक्रोइंजेक्शन पिपेट(चित्रा 4A)की आवश्यकता होती है। इन पिपेट को एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से दर्जी की मांग पर खरीदा जा सकता है या माइक्रोपिपेट पुलर और माइक्रोफॉर्ज का उपयोग करके उपयुक्त ग्लास केशिकाओं से बनाया जा सकता है।

  1. माइक्रोपिपेट पुलर पर बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाएं खींचें। फिलामेंट (0.78 x 1.00 x 80 मिमी) के बिना बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं को खींचने के लिए निम्नलिखित पैरामीटर एक ज्वलंत क्षैतिज खींचने के लिए दिए जाते हैं(सामग्री की तालिका)संदर्भ के रूप में, लेकिन अन्य उपकरणों और ग्लास केशिका प्रकारों के लिए अलग होगा: हीट 510 (रैंप टेस्ट 480), पुल 0, वेग 150, समय 175 और पिपेट रखने के लिए दबाव 200; हीट 510 (रैंप टेस्ट 480), पुल 90, वेग 140, टाइम 125 और प्रेशर 200 माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के लिए।
    नोट: इष्टतम मापदंडों को व्यक्तिगत रूप से परिभाषित करने की आवश्यकता है क्योंकि आर्द्रता सहित कई कारक, माइक्रोपिपेट पुलर का मॉडल और ग्लास केशिकाएं इंजेक्शन पिपेट के आकार को प्रभावित कर सकती हैं। एक क्रमिक टेपर के साथ एक विस्तारित आकार के उद्देश्य से किया जाना चाहिए।
  2. पिपेट रखने की तैयारी
    1. एक माइक्रोफॉर्ज के लिए कदम 11.1 में तैयार एक खींचा केशिका सेट करें। फिलामेंट पर ग्लास मनका के ऊपर केशिका रखें और फिलामेंट को गर्म करते समय ग्लास मनका के साथ संपर्क बनाने के लिए केशिका को कम करें।
    2. कांच के मनका से हीटिंग और अलग करके केशिका को तोड़ें ताकि इसका बाहरी व्यास 60-100 माइक्रोन हो।
    3. फिलामेंट पर ग्लास मनका का सामना करने के लिए केशिका टिप को क्षैतिज रूप से रखें।
    4. केशिका टिप के आंतरिक व्यास को 10-20 माइक्रोन के व्यास तक पिघलने की अनुमति देने के लिए फिलामेंट को गर्म करें।
    5. केशिका को स्थानांतरित करें ताकि बिना संपर्क के केशिका टिप से एक बिंदु ~ 1 मिमी पर ग्लास मनका की स्थिति हो। केशिका को 20 डिग्री कोण पर झुकने की अनुमति देने के लिए फिलामेंट को गर्म करें। केशिका को डिस्माउंट करें, माइक्रोफॉर्ज से एक होल्डिंग पिपेट कहा जाता है।
      नोट: केशिका के आकार को मापने के लिए, माइक्रोफॉर्ज में एक आईपीस रेटिकल अधिमानतः स्थापित किया गया है।
  3. माइक्रोइंजेक्शन पिपेट की तैयारी
    1. एक माइक्रोफॉर्ज के लिए कदम 11.1 में तैयार एक खींचा केशिका सेट करें। फिलामेंट पर ग्लास मनका के ऊपर केशिका रखें और फिलामेंट को गर्म करते समय ग्लास मनका के साथ संपर्क बनाने के लिए केशिका को कम करें।
    2. केशिका को कांच के मनका से एक स्थिति में हीटिंग और अलग करके तोड़ें कि इसका बाहरी व्यास 6 माइक्रोन है।
    3. केशिका को स्थानांतरित करें ताकि बिना संपर्क के केशिका टिप से एक बिंदु ~ 1 मिमी पर ग्लास मनका की स्थिति हो। केशिका को 20 डिग्री कोण पर ऊपर की ओर झुकने की अनुमति देने के लिए फिलामेंट को गर्म करें। माइक्रोइंजेक्शन पिपेट को माइक्रोफॉर्ज से डिमाउंट करें और बाद में इस्तेमाल के लिए सुरक्षित बॉक्स में स्टोर करें।
      नोट: माइक्रोइंजेक्शन पिपेट निम्नलिखित विशिष्टताओं के साथ तैयार किए जाते हैं: बाहरी व्यास, 6 माइक्रोन; आंतरिक व्यास, 4.5-5 माइक्रोन; मोड़ कोण, 20 डिग्री। इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन की सफलता के लिए माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के इष्टतम डिजाइन को परिभाषित करना महत्वपूर्ण है। बहुत बड़ा एक आंतरिक व्यास दाता DKO-phESCs (चर्चा अनुभाग देखें) के प्लाज्मा झिल्ली के टूटना को रोका जा सकता है । यदि आंतरिक व्यास बहुत संकीर्ण है, तो यह दाता DKO-phESCs के चिकनी पिपिंग में बाधा डाल सकता है। एक मोड़ कोण और लेफ्टिनेंट; 30 ° बेहतर है क्योंकि एक उच्च मोड़ कोण पीजो दालों के प्रभाव को बाधित करता है।

12. DKO-PHAESCs के इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन

  1. इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन (चरण 12.2 से) से पहले, पीवीपी के 0.6 ग्राम वाली 50 एमएल ट्यूब में एम2 माध्यम के 5 एमएल जोड़कर और 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर ट्यूब को उत्तेजित करके एक पॉलीविनाइलपाइरोलिओलिडोन (पीवीपी) समाधान तैयार करें। पीवीपी पूरी तरह से भंग होने के बाद, समाधान बाँझ-फ़िल्टर किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
  2. इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के दिन, केसोम माध्यम के 900 माइक्रोन के साथ एक केंद्र-अच्छी डिश तैयार करें और 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर डिश को प्री-वार्म करें।
  3. पीवीपी समाधान के 5 माइक्रोल की बूंदों और 10-सेमी डिश के ढक्कन पर एम2 माध्यम के 20 माइक्रोल को संरेखित करके माइक्रोमैनिपुलेशन डिश तैयार करें जो उल्टा रखा गया है। खनिज तेल के साथ बूंदों को कवर करें, और इंजेक्शन माइक्रोस्कोप के चरण पर पकवान रखें।
    नोट: माइक्रोमैनिमुलेशन डिश की अनुशंसित व्यवस्था चित्रा 4Bमें दिखाई गई है ।
  4. माइक्रोमैनीपुलेटर पर एक होल्डिंग पिपेट स्थापित करें। माइक्रोलोडर टिप का उपयोग करके फ्लोरोकार्बन तेल के साथ माइक्रोइंजेक्शन पिपेट भरें, और इसे पीजो एक्ट्यूएटर पर माउंट करें।
  5. पीवीपी समाधान के साथ एक बूंद में माइक्रोइंजेक्शन पिपेट विसर्जित करें और पीवीपी के साथ ग्लास को कोट करने और इसे कम चिपचिपा बनाने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। माइक्रोइंजेक्शन पिपेट में पीवीपी समाधान की एक छोटी मात्रा लोड करें, और एम 2 माध्यम के साथ पिपेट को एक बूंद पर ले जाएं।
  6. M2 माध्यम में होल्डिंग पिपेट विसर्जित करें, और ड्रॉप के नीचे में पिपेट पर ध्यान केंद्रित करें।
  7. M2 मध्यम ड्रॉप में कदम 10.6 से DKO-phaESC निलंबन के लगभग 2 μL स्थानांतरण।
  8. एक मुंह पिपेट का उपयोग करके एक ही M2 मध्यम ड्रॉप में कदम 8.5 से 10 एमआई oocytes स्थानांतरित करें।
  9. इंजेक्शन के लिए, एम 2 मध्यम बूंद में एक ओसाइट घुमाएं ताकि पेरिविटेलिन स्पेस माइक्रोइंजेक्शन पिपेट का सामना कर सके, और एमआईआई प्लेट माइक्रोइंजेक्शन पिपेट(चित्रा 4A)के रास्ते में स्थित नहीं है। होल्डिंग पिपेट के माध्यम से नकारात्मक दबाव लागू करके ओसाइट पकड़ो।
    नोट: एक एमआईआई प्लेट नेत्रहीन ooplasm के एक फलाव के रूप में पहचाना जाता है जिसे "कूबड़" के रूप में जाना जाता है और अक्सर पहले ध्रुवीय शरीर के बगल में स्थित होता है। एमआईआई प्लेट में संलग्न गुणसूत्रों के साथ मेयोटिक स्पिंडल होता है। माइक्रोइंजेक्शन पिपेट और एमआईआई प्लेट को छूने से बचा जाना चाहिए क्योंकि धुरी और गुणसूत्रों की यांत्रिक क्षति भ्रूण के विकास को बाधित कर सकती है।
  10. कोमल नकारात्मक दबाव लागू करके माइक्रोइंजेक्शन पिपेट की नोक में एक DKO-phaESC लोड करें। एक अक्षुण्ण DKO-phaESC(चित्रा 3C;चर्चा देखें) के इंजेक्शन से बचने के लिए पाइपिंग द्वारा एक DKO-phaESC की प्लाज्मा झिल्ली टूटना ।
    नोट: यदि एक DKO-phaESC की प्लाज्मा झिल्ली पाइपिंग से उठी नहीं है, DKO-phaESC त्यागें और एक और DKO-phaESC लोड ।
  11. माइक्रोइंजेक्शन पिपेट को ओसाइट के जोना पेलुसिडा के संपर्क में रखें और माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के भीतर थोड़ी मात्रा में निगेटिव प्रेशर लगाएं।
  12. पेरिविटेललाइन अंतरिक्ष की ओर माइक्रोइंजेक्शन पिपेट की नोक को धक्का देते हुए जोना के माध्यम से तोड़ने के लिए पीजो आवेगों (तीव्रता, 20; आवृत्ति, 4) लागू करें। पुष्टि करें कि एमआईआई प्लेट, जिसमें एक धुरी और गुणसूत्र होते हैं, माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के रास्ते में स्थित नहीं है।
    नोट: अनुभवजन्य रूप से ज़ोना के माध्यम से ड्रिलिंग के लिए सबसे कम पीजो दालों के लिए सेटिंग को समायोजित करने के लिए oolemma को नुकसान की संभावना को कम करने के लिए ।
  13. माइक्रोइंजेक्शन पिपेट से जोना पेलुसिडा के टुकड़े को त्यागें, और डीपीओ-phaESC को पिपेट के किनारे पर रखें।
  14. माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के साथ ओसाइट को भेदें ताकि ऊलम्मा विपरीत दिशा में पहुंचे।
    नोट: धुरी और गुणसूत्रों को नुकसान से रोकने के लिए एमआईआई प्लेट को न छुएं।
  15. ऊलम्मा को छेदने के लिए एक पीजो पल्स (तीव्रता, 6; आवृत्ति, 1) लागू करें। सुनिश्चित करें कि oolemma माइक्रोइंजेक्शन पिपेट के शाफ्ट के साथ आराम करता है।
    नोट: अनुभवजन्य रूप से ओसाइट को नुकसान को कम करने के लिए ऊलम्मा को तोड़ने के लिए पीजो पल्स की सबसे कम सेटिंग को परिभाषित करें।
  16. ओप्लास्म में मध्यम की न्यूनतम मात्रा के साथ DKO-phaESC इंजेक्ट करें, और ऊसाइट से माइक्रोइंजेक्शन पिपेट को सुचारू रूप से वापस लें।
  17. होल्डिंग पिपेट से इंजेक्शन ओसाइट जारी करें, और इसे बाद में संग्रह के लिए माइक्रोड्रॉप के किनारे रखें।
  18. एम 2 मध्यम ड्रॉप में अन्य एमआईआई ओसाइट्स के लिए 12.9 से 12.17 तक इंजेक्शन प्रक्रिया दोहराएं।
    नोट: 20 मिनट से अधिक के लिए इनक्यूबेटर से बाहर oocytes रखने से बचें । हमारे अनुभव में, उचित प्रशिक्षण के बाद 15 मिनट के भीतर 10 ओसाइट्स के एक बैच को आराम से हेरफेर किया जा सकता है।
  19. M2 मध्यम ड्रॉप से इंजेक्शन ओसाइट्स के बैच को KSOM माध्यम के साथ एक पूर्व-गर्म केंद्र-अच्छी तरह से पकवान में स्थानांतरित करें।
  20. 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर1 घंटे के लिए पकवान रखें।
  21. पर्याप्त इंजेक्शन oocytes प्राप्त करने के लिए MII oocytes के अतिरिक्त समूहों के साथ कदम 12.5 और 12.20 से oocyte हेरफेर दोहराएं।

13. निर्मित अर्ध-क्लोन भ्रूण की सक्रियता

  1. केसोम माध्यम और सक्रियण माध्यम के प्रत्येक 900 μL के साथ दो केंद्र-अच्छी व्यंजन तैयार करें। प्रत्येक कुएं में केसोम माध्यम के 700 माइक्रोन के साथ एक 4-अच्छी प्लेट तैयार करें। 5% सीओ2 वातावरण में व्यंजन और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गर्म करें।
  2. KSOM माध्यम में 1 घंटे के बाद, इंजेक्शन oocytes कदम 12.21 से पूर्व गरम केंद्र में अच्छी तरह से सक्रियण माध्यम के साथ अच्छी तरह से पकवान हस्तांतरण।
  3. एक्टिवेशन के लिए 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर6 घंटे के लिए डिश रखें।
  4. सक्रियण के बाद, कुछ अर्ध-क्लोन भ्रूण तीन ध्रुवीय निकायों का निरीक्षण करें, जो ओसाइट के पहले और दूसरे ध्रुवीय निकाय हैं, और DKO-phaESC(चित्रा 3E)से छद्म ध्रुवीय शरीर हैं।
  5. भ्रूण को 4-अच्छी प्लेट में केसोम माध्यम के साथ नए कुओं में स्थानांतरित करके 3 बार धोएं।
  6. केसोम माध्यम के साथ केंद्र-अच्छी डिश में भ्रूण स्थानांतरित करें, और आगे के विकास के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान रखें।

14. निर्मित अर्ध-क्लोन भ्रूण का विकास

  1. कदम 13.6 से KSOM माध्यम में संस्कृति के 1 दिन के बाद, कई अर्द्ध क्लोन भ्रूण 2 सेल चरण(चित्रा 5A)तक पहुंचने।
  2. विट्रो में प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण के आगे के विकास के लिए, 5% सीओ2 वायुमंडल में 37 डिग्री सेल्सियस पर केसोम माध्यम में अर्ध-क्लोन भ्रूण को तैयार करना जारी रखें। 2 दिन में ताजा KSOM माध्यम के लिए अर्द्ध क्लोन भ्रूण हस्तांतरण । 4 दिन में, कई भ्रूण ब्लास्टोसिस्ट चरण(चित्रा 5A)तक पहुंच जाएंगे।
  3. अर्ध-क्लोन चूहों के व्युत्पन्न के लिए, 2-सेल भ्रूण को 14.1 चरण से छद्म गर्भवती प्राप्तकर्ता महिलाओं के अंडाशय में स्थानांतरित करें। भ्रूण हस्तांतरण से एक दिन पहले पुरुषों को संभोग करके छद्म गर्भवती महिलाओं की पहचान करें और भ्रूण हस्तांतरण (0.5 दिन बाद कोइटम (डीपीसी)) के लिए दिन की सुबह में स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले प्लग की उपस्थिति के आधार पर उनका चयन करें। लगभग 19.5 डीपीसी, पूर्ण अवधि के पिल्ले स्वाभाविक रूप से प्राप्तकर्ता महिलाओं(चित्रा 5B)से वितरित किए जाते हैं।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अर्ध-क्लोन भ्रूण और चूहों को प्राप्त करने के लिए शुक्राणु के विकल्प के रूप में haESCs लागू करना है। इस उद्देश्य के लिए, सीएजी-ईजीएफपी ट्रांसजीन को ले जाने वाली एक डीसीओ-फेईएससी लाइन उत्पन्न की गई थी और इसका उपयोग एमआईआई ओसाइट्स में इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के लिए किया जाता था। एक पैतृक छाप विन्यास के साथ एक उपयुक्त PHAESC लाइन प्राप्त करने के लिए, हम Cas9 नाभिक का उपयोग कर आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रदर्शन किया । हैप्लॉयड ईएससी लाइन में हैप्लॉयड और डिप्लॉयड कोशिकाएं होती हैं जो डिप्लॉयाइजेशन10के लिए हैप्लॉयड ईएसएस की अंतर्निहित प्रवृत्ति के कारण उत्पन्न होती हैं । एक हैप्लॉयड गुणसूत्र सेट शुक्राणु जीनोम के सफल प्रतिस्थापन के लिए एक शर्त है। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा डीएनए सामग्री विश्लेषण G0/G1-, एस-, और G2/M-phases(चित्रा 2A)में हैप्लॉयड और डिप्लॉयड कोशिकाओं के वितरण से पता चलता है ।

DKO-PHAESC लाइनों की स्थापना के लिए, वाइल्डटाइप phaESC लाइनों को स्थिर ट्रांसजेनिक ईजीएफपी अभिव्यक्ति के लिए पिग्गीबेक ट्रांसपोसन निर्माण से और एच19-औरआईजी-डीएमआर के विलोपन प्राप्त करने के लिए CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड के साथ संक्रमित किया गया था । डिप्लॉयड ईएसएससी को बाहर करने और ईजीएफपी व्यक्त करने वाले केवल हैप्लॉयड ईएसएक्स को अलग करने के लिए, एक विशिष्ट प्रकार के गेट को परिभाषित किया गया था(चित्रा 2 ए)। एकल हैप्लॉयड ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं को उप-क्लोन प्राप्त करने के लिए 96-अच्छी प्लेटों के व्यक्तिगत कुओं में चढ़ाया गया था। एमईएफ फीडरों का उपयोग ट्रांस संक्रमित phaESCs की प्लेटिंग दक्षता और अस्तित्व को बढ़ाने के लिए किया गया था। संस्कृतियों के विस्तार के बाद, पीसीआर द्वारा जीनोटाइपिंग का एक प्रारंभिक दौर किया गया था ताकि दोनों डीएमआर के विलोपन को अंजाम देने वाले उप-क्लोनों की पहचान की जा सके । एमईएफ फीडरों को संस्कृतियों से हटा दिए जाने के बाद, एच19- और आईजी-डीएमआर(चित्रा 2बी)में वाइल्डटाइप एलील्स की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एक दूसरा जीनोटाइपिंग किया गया था। कुल 135 उप-क्लोन से, हमने 5 हैप्लॉयड डीको-पीएचएससी लाइनें प्राप्त कीं जो हटाए गए एलील्स को ले जाती थीं और एच19-डीएमआर और आईजी-डीएमआर दोनों के वाइल्डटाइप एलील्स से मुक्त थीं।

एक CAG-EGFP ट्रांसजीन DKO-phaESCs में पेश किया गया था एक माइक्रोस्कोप(चित्रा 3A)के तहत हरी फ्लोरेसेंस के दृश्य द्वारा अर्द्ध क्लोन भ्रूण के लिए उनके योगदान का अध्ययन करने के लिए । इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के लिए, DKO-phaESCs को एम-फेज में गिरफ्तार करने के लिए डेमेकोलिन के साथ इलाज किया गया था। इस प्रकार, DKO-phaESCs के सेल चक्र को एमआईआई ओसाइट्स के साथ सिंक्रोनाइज्ड किया गया था। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चला है कि जी2/एम चरण के अनुरूप 2 आबादी ने डेमकोल्सिन(चित्रा 3B)के साथ उपचार के बाद हैप्लॉयड (2n) और डिप्लोइड कोशिकाओं (4n) को गिरफ्तार किया । 1n हैप्लॉयड चोटी की अनुपस्थिति ने संकेत दिया कि सेल चक्र गिरफ्तारी काफी हद तक पूरी हो गई थी। इसके बाद एम-फेज हैप्लॉयड ईएसएससीएस को छांटा गया और ओसाइट्स में इंजेक्ट किया गया । इसके लिए, एक ही DKO-phaESC को माइक्रोइंजेक्शन पिपेट में लोड किया गया था और एक एमआईआई ओसाइट(चित्रा 3 सी)के साइटोप्लाज्म में इंजेक्ट किया गया था। DKO-phaESC की प्लाज्मा झिल्ली माइक्रोइंजेक्शन पिपेट की नोक में पाइपिंग द्वारा उठी थी।

इंजेक्शन के बाद, EGFP अभिव्यक्ति शायद ही कभी निर्मित अर्द्ध क्लोन भ्रूण में पता चला था के रूप में DKO-phaESCs के cytoplasm oocyte(चित्रा 3 डी)के बड़े साइटोप्लाज्म में फैलाया गया था । दुर्लभ मामलों में, ओप्लाज्म के भीतर तीव्र ईजीएफपी अभिव्यक्ति का एक गोल स्थान देखा जा सकता है। यह अवलोकन बरकरार DKO-PHAESCs के अनजाने इंजेक्शन के कारण होने की संभावना थी । DKO-phaESC सेल झिल्ली टूटना विफलता की संभावना आगे भ्रूण के विकास के साथ संगत नहीं है और बचा जाना चाहिए । इंजेक्शन के एक घंटे बाद, भ्रूण स्ट्रोंटियम क्लोराइड18के साथ उपचार के द्वारा सक्रिय किया गया । सक्रियण की शुरुआत के छह घंटे बाद, माइक्रोस्कोप(चित्रा 3E)के तहत 3 ध्रुवीय निकायों को देखा गया। ये ध्रुवीय निकाय ओसाइट के पहले और दूसरे ध्रुवीय निकायों और DKO-phaESC7से एक छद्म ध्रुवीय निकाय के अनुरूप हैं । इसके अलावा, दो प्रोन्यूक्लियी को एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया, जो शुक्राणु के साथ सामान्य निषेचन के बाद जाइगोट्स के प्रोन्यूक्लियर चरण जैसा दिखता था।

विकासात्मक क्षमता प्रदर्शित करने के लिए, अर्ध-क्लोन भ्रूण को ब्लास्टोसिस्ट चरण(चित्रा 5A)में सुसंस्कृत किया गया था। इसके अलावा, एक प्राप्तकर्ता महिला(चित्रा 5B)के oviducts में अर्द्ध क्लोन 2 सेल चरण भ्रूण स्थानांतरित करने के बाद एक पूर्ण अवधि माउस प्राप्त किया गया था । जैसा कि अपेक्षित था, अर्ध-क्लोन भ्रूण से प्राप्त माउस एक मादा थी क्योंकि न तो ओसाइट और न ही ओसाइट-व्युत्पन्न phaESCs एक वाई गुणसूत्र ले जाते हैं। अर्द्ध क्लोन माउस खुलकर सामान्य था और स्वस्थ संतानों का उत्पादन किया जब एक वाइल्डटाइप स्विस वेबस्टर पुरुष के साथ मिलकर । अब तक, अर्द्ध क्लोन माउस किसी भी स्पष्ट स्वास्थ्य समस्याओं के बिना ६०० से अधिक दिनों के लिए जीवित किया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: शुक्राणु प्रतिस्थापन के रूप में DKO-phaESCs के आवेदन का अवलोकन। (क)प्रोटोकॉल की प्रक्रियाओं की एक समय सीमा। (ख)यह योजना DKO-PHAESC लाइनों (चरण 1-6) स्थापित करने के चरणों को दर्शाती है । (ग)यह योजना एक DKO-phaESC के इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन द्वारा अर्ध-क्लोन भ्रूण के निर्माण के लिए एक एमआईआई ओसाइट (चरण 7-14) में कदम दिखाती है । संक्षिप्त: DKO = डबल नॉकआउट; PHAESC = पार्थोजेनेटिक हैप्लॉयड भ्रूणस्टेम सेल; FACS = फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई; MEF = माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: CRISPR/Cas9 द्वारा DKO-phaESC लाइनों की स्थापना-H19के मध्यस्थता विलोपन-और आईजी-DMRs। (A)स्थिर ईजीएफपी अभिव्यक्ति के लिए पिग्गीबेक प्लाज्मिड्स के साथ ट्रांसफैक्शन के बाद phaESCs का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण और 4 CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड्स के साथ । गैर-संक्रमित फेजसी को नियंत्रण के रूप में दिखाया जाता है। डीएनए प्रोफाइल (ऊपर) हैप्लॉयड और डिप्लॉयड कोशिकाओं के सेल चक्र वितरण को दर्शाता है। जीजीएफपी व्यक्त करने वाली जी1/एस-फेज हैप्लॉयड कोशिकाएं हरे गेट (नीचे, दाएं) द्वारा इंगित की जाती हैं। (ख)एमईएफसी उप-क्लोनों की जेनोटीपिंग जो एमईएफ (पहली जीनोटाइपिंग) पर उगाई गई थी और एमईएफ (दूसरी जेनोटीपिंग) को हटाने के बाद। उप-क्लोन phaESC लाइनें 1, 2, 3, और 4 वाइल्डटाइप कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं, एक एच 19-डीएमआर विलोपन के साथ कोशिकाओं, एक आईजी-डीएमआरहटाने के साथ, और संयुक्त एच 19- और आईजी-डीएमआरविलोपन के साथ क्रमशः। DKO-PHAESC लाइनें 5-8 दोनों H19-DMRऔर आईजी-DMRहटाने के अधिकारी और वाइल्डटाइप alleles से मुक्त हैं । संक्षिप्त: DKO = डबल नॉकआउट; PHAESC = पार्थोजेनेटिक हैप्लॉयड भ्रूणस्टेम सेल; डीएमआर = अंतर से मिथाइलेटेड क्षेत्र; MEF = माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट; EGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; WT = वाइल्डटाइप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मिटोटली का इंजेक्शन एमआईआई ओसाइट्स में DKO-phaEsCs को गिरफ्तार किया गया। (A)एक DKO-phaESC संस्कृति की आकृति विज्ञान है कि एक CAG-EGFP ट्रांसजीन और H19 के विलोपन और आईजी-DMRsकिया जाता है; स्केल बार = 50 माइक्रोन.(ख)डीको-फेज्स का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण 8 घंटे के लिए डीमिकॉलिन के साथ गिरफ्तारी के बाद डीको-फेजसी बिना डीमेकोल्सिन उपचार के नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है। (माइक्रोइंजेक्शन पिपेट में डीसीओ-फेजसी की आकृति विज्ञान। एक बरकरार DKO-phaESC से पहले (बाएं) और बाद (दाएं) पाइपिंग द्वारा प्लाज्मा झिल्ली टूटना दिखाया गया है; स्केल बार = 20 माइक्रोन(डी)एमआईआई ओसाइट्स में DKO-phaESCs के इंजेक्शन के बाद 1 घंटे में भ्रूण का निर्माण किया । ईजीएफपी फ्लोरेसेंस और उज्ज्वल क्षेत्र की एक विलय छवि दिखाई गई है। काले तीर सिर बरकरार DKO-phaESCs, जो बचा जाना चाहिए के इंजेक्शन के बाद तीव्र EGFP अभिव्यक्ति के गोल धब्बे का संकेत मिलता है; स्केल बार = 50 माइक्रोन.(ई)स्ट्रोंटियम क्लोराइड के साथ सक्रियण की शुरुआत के बाद अर्ध-क्लोन भ्रूण 6 एच की अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवि दिखाई जाती है। सफेद तीर सिर इंजेक्शन DKO-phaESC से एक छद्म ध्रुवीय शरीर सहित 3 ध्रुवीय निकायों के साथ भ्रूण का संकेत; स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्त: DKO = डबल नॉकआउट; PHAESC = पार्थोजेनेटिक हैप्लॉयड भ्रूणस्टेम सेल; ईजीएफपी = बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: oocytes में DKO-phaESCs के इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के लिए सेटअप की योजना। }इंजेक्शन के चैंबर में एक इंजेक्शन पिपेट, होल्डिंग पिपेट और ऑसाइट की व्यवस्था दिखाई गई है। α, माइक्रोइंजेक्शन पिपेट का मोड़ कोण। (ख)इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के लिए माइक्रोमैनिपॉलेशन डिश में बूंदों का लेआउट। संक्षिप्त: DKO = डबल नॉकआउट; PHAESC = पार्थोजेनेटिक हैप्लॉयड भ्रूणस्टेम सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: अर्द्ध क्लोन भ्रूण का विकास । (A)विट्रो में अर्ध-क्लोन भ्रूण का प्रीम्लांटेशन विकास। ईजीएफपी अभिव्यक्ति शुरू में इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के बाद दूसरे दिन चार-सेल भ्रूण में देखी जाती है। 4 दिन में, ब्लास्टोसिस्ट में तीव्र ईजीएफपी अभिव्यक्ति देखी जा सकती है; स्केल बार = 100 माइक्रोन(ख)प्राप्तकर्ता महिला को 2-सेल भ्रूण हस्तांतरण के बाद प्राप्त एक अर्ध-क्लोन माउस। ७४ डीपीपी में, अर्ध-क्लोन माउस (एरोहेड) ने एक वाइल्डटाइप स्विस वेबस्टर पुरुष के साथ संभोग के बाद प्राकृतिक जन्म से अपना पहला पिल्ले (तारक) दिया । अर्द्ध क्लोन भ्रूण और अर्द्ध क्लोन माउस इस आंकड़े में दिखाया गया है Aizawa एट अल में रिपोर्ट लोगों के साथ समान हैं ।3। संक्षिप्त नाम: EGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; .dpp, दिन के बाद पार्टम । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जिलेटिन समाधान
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
पानी - 500 एमएल -
जिलेटिन - 1 ग्राम 0.2%
हैप्लॉयड भ्रूण स्टेम सेल (HaESC) माध्यम
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
NDiff 227 - 10 एमएल -
चिर 99021 10 mm 3 माइक्रोन 3 माइक्रोन
पीडी 0325901 10 mm 1 माइक्रोल 1 माइक्रोन
एलआईएफ 1 x 106 आईयू/एमएल 10 माइक्रोल 1,000 आईयू/एमएल
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 100x 100 माइक्रोल 1x
HaESC रखरखाव बफर
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
एचईएससी माध्यम - 1 एमएल -
हेपेस समाधान 1 मीटर 20 माइक्रोन 20 एमएमएम
बफर धोएं
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
डीएमईएम/एफ-12 - 100 एमएल -
बीएसए अंश 7.5% 7.1 एमएल 0.5%
एमईएफ माध्यम
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
डीएमईएम - 500 एमएल -
एफबीएस - 56 एमएल 10%
β-मर्केप्टोथेनॉल 14.3 मोल/एल 3.9 माइक्रोन 100 माइक्रोन
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 100x 5.6 एमएल 1x
लाइसिस बफर
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
पानी - 8.25 एमएल -
ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.5) 1 मीटर 1 एमएल 100 एमएमएम
एडटा 0.5 मीटर 100 माइक्रोल 5 एमएमएम
एसडीएस समाधान 10% 200 माइक्रोल 0.2%
नैक 5 मीटर 400 माइक्रोल 200 एमएमएम
प्रोटीनेज कश्मीर 20 मिलीग्राम/एमएल 50 माइक्रोन 100 माइक्रोग्राम/एमएल
सक्रियण माध्यम
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
केसोम - 1 एमएल -
स्ट्रोंटियम क्लोराइड 1 मीटर 5 माइक्रोन 5 एमएमएम
ईजीटीए 0.5 M, पीएच 8.0 4 माइक्रोन 2 mM
पीवीपी समाधान
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
एम 2 माध्यम - 5 एमएल -
पीवीपी - 0.6 ग्राम 12%
पीएमएसजी समाधान
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
पीबीएस - 450 माइक्रोल -
पीएमएसजी 500 आईयू/एमएल 50 माइक्रोन 50 आईयू/एमएल
एचसीजी समाधान
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
पीबीएस - 450 माइक्रोल -
एचसीजी 500 आईयू/एमएल 50 माइक्रोन 50 आईयू/एमएल
हायलुरोनिडासे माध्यम
घटक स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम/ अंतिम एकाग्रता
एम 2 माध्यम - 380 माइक्रोल -
हायलुरोनिडेस 10 मिलीग्राम/एमएल 20 माइक्रोन 0.5 मिलीग्राम/एमएल
संक्षिप्त रूप: एलआईएफ = ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक; MEF = माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट;
FBS = भ्रूण गोजातीय सीरम; DMEM = Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम; बीएसए = गोजातीय सीरम एल्बुमिन;
EDTA = एथिलेंडियामाइनेत्राएक एसिड; SDS = सोडियम डोडेसिल्सुफेट; ईजीटीए = एथिलीन-बीआईएस (ऑक्सीथीलेनननिट्रिलो) टेट्राएकेटिक एसिड;
पीबीएस = फॉस्फेट-बफर नमकीन; पीवीपी = पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन; एचसीजी = मानव कोरियोनिक गोंडोट्रोपिन;
पीएमएसजी = गर्भवती घोड़ी सीरम गोंडोट्रोपिन।

तालिका 1: मध्यम, बफर और समाधान का नुस्खा।

नाम अनुक्रम (5'से 3') अनुप्रयोग
H19-DMR-P1 जीटीजी जीटीटीटी एजीटी टीसीटी एटा टीजीजी GG जेनोटीपिंग
H19-DMR-P2 आगा टीजीजीटी कैट टीसीटी टीटीटी सीसी जेनोटीपिंग
H19-DMR-P3 टीसीटी टीएसी एजीटी सीटीजी जीटीसी टीटीजी जीटी जेनोटीपिंग
आईजी-डीएमआर-पी 1 टीजीटी जीसीए जीसीए जीसीए एएजी सीटीए एजी जेनोटीपिंग
आईजी-डीएमआर-पी 2 सीसीए सीएएए एएए सीसीटी सीसीसी टीटीटी सीए जेनोटीपिंग
आईजी-डीएमआर-पी 3 ATA सीजीए टीएसी जीजीसी एएसी सीएए सीजी जेनोटीपिंग
H19-DMR-gRNA1-F सीएसी सीसीए टीजीए एक्ट कैग एएजी आगा सीटीजी जीआरएनए
H19-DMR-gRNA1-R एएए सीसीए जीटीसी टीसीटी टीसीटी गैग टीटीसी एटीजी जीआरएनए
H19-DMR-gRNA2-F सीएसी कैग जीटीजी आगा एसीसी अधिनियम जीसीटी झूठ जीआरएनए
H19-DMR-gRNA2-R एएए सीसीटी कैग कैग टीजीजी टीटीसी टीसीए सीसीटी जीआरएनए
आईजी-डीएमआर-जीआरए 1-एफ सीएसी सीसीजी टीएसी आगा जीसीटी सीसीए टीजीजी सीएसी जीआरएनए
आईजी-डीएमआर-जीआरए1-आर एएए सीजीटी जीसीसी एटीजी गैग सीटीसी टीजीटी एसीजी जीआरएनए
आईजी-डीएमआर-जीआरए 2-एफ सीएसी सीसीटी जीसीटी टैग एजीजी टीएसी टीएसी जीसीटी जीआरएनए
आईजी-डीएमआर-जीआरए2-आर एएए कैग सीजीटी एजीटी एसीसी आईसीटी एएजी कैग जीआरएनए

तालिका 2: ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की सूची।

Discussion

1990के दशक में19, 20,21में दैहिक कोशिका परमाणु हस्तांतरण (एससीएनटी) द्वारा स्तनधारियों की क्लोनिंग काबीड़ा उठायागया है । इन घटनाक्रमों के बाद 30 साल पहले उभयचर22में क्लोनिंग अध्ययन किए गए . काफी देरी स्तनधारियों में भ्रूणविज्ञान और जीनोमिक छाप की कठिनाई को दर्शाता है । स्तनधारी एससीएनटी का विकास शुक्राणु के प्रतिस्थापन के लिए एचईएससी के आवेदन का आधार है, जो इस प्रोटोकॉल में विस्तृत है।

एससीएनटी23की सफलता के लिए सेल चक्र समकालिकीकरण एक महत्वपूर्ण कारक है । इस प्रोटोकॉल में एचईएससी के इंजेक्शन लगाने का भी यही मामला है। एक प्राप्तकर्ता में एक दाता जीनोम का परिचय कोशिका चक्र चरणों के लिए गुणसूत्र टूटना या aneuploidies कि भ्रूण के विकास को निरस्त होगा से बचने के लिए मिलान की आवश्यकता है । सेमी-क्लोनिंग में अतिरिक्त जटिलता होती है कि दो जीनोम और एक साइटोप्लास्ट संगत होने की आवश्यकता होती है। पिछली रिपोर्ट में यह दर्शाया गया है कि एम-फेज-गिरफ्तार एंड्रोजेटिक एचईएससी के इंजेक्शन से जी1-चरण के एचईएससी के इंजेक्शन की तुलना में अर्ध-क्लोन भ्रूण की बेहतर विकास दर ों कोओसाइट्स 7में मिले । इस रिपोर्ट में एम-फेज को सेमी-क्लोनिंग के लिए उपयुक्त सिंक्रोनाइजेशन पॉइंट के रूप में सुझाया गया है । तदनुसार, phaESCs को मेटाफेज़ में डेमेकोल्सिन के साथ गिरफ्तार किया गया था और एमआईआई ओसाइट्स के ओप्लाज्म में इंजेक्ट किया गया था, जिन्हें स्वाभाविक रूप से मेयोसिस के मेटाफेज II में गिरफ्तार किया गया था। महत्वपूर्ण बात, एम चरण गिरफ्तारी उच्च दक्षता के साथ माउस ESCs में प्राप्त किया जा सकता है, दाता और प्राप्तकर्ता सेल चक्र के बीच उत्कृष्ट तुल्यकालन प्रदान करते हैं ।

माइटोसिस के दौरान, परमाणु झिल्ली टूट जाती है और एक धुरी रूपों जिसमें दोहराए गए गुणसूत्र संलग्न होते हैं। एम-फेज DKO-PHAESCs के इंजेक्शन के बाद, सिस्टर क्रोमटिड्स को छद्म ध्रुवीय शरीर और ज़िगोट7 (चित्रा 3E)में अलग कर दिया जाता है। नतीजतन, एक DKO-phaESC से गुणसूत्रों का एक सेट अर्द्ध क्लोन भ्रूण के लिए योगदान देता है । यह महत्वपूर्ण है कि DKO-phaESC गुणसूत्रों की बहन गुणसूत्रों को इंजेक्शन के बाद सही ढंग से अलग किया जा सकता है। एक अक्षुण्ण DKO-PHAESC की प्लाज्मा झिल्ली एक छद्म ध्रुवीय शरीर में अलगाव को रोकता है । हमने वास्तव में दुर्लभ मामलों का निरीक्षण किया जहां DKO-phaESCs की प्लाज्मा झिल्ली उठी नहीं थी, और भ्रूण इंजेक्शन के बाद ooplasm में बरकरार DKO-phaESCs का प्रदर्शन(चित्रा 3 डी)। इसलिए, DKO-phaESCs की प्लाज्मा झिल्ली को पाइपिंग द्वारा हटाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इंजेक्शन के दौरान, ओसाइट के मेयोटिक स्पिंडल के व्यवधान से बचना भी उतना ही महत्वपूर्ण है, जिससे गुणसूत्र अलगाव दोष पैदा हो सकते हैं और एन्यूप्लाइडी भी प्रेरित हो सकते हैं।

स्तनधारियों में, जीनोमिक छाप शुक्राणु प्रतिस्थापन के रूप में phaESCs के आवेदन को सीमित करती है। पार्थेनोजेनेटिक एचईएससी में जीनोमिक छापों का मातृ विन्यास होता है, जबकि शुक्राणु के पास पैतृक विन्यास होता है। इसलिए, शुक्राणु प्रतिस्थापन के रूप में वाइल्डटाइप फेजसी के इंजेक्शन के बाद पूर्ण अवधि के पिल्ले की पीढ़ी नहीं हुई है। इस सीमा को दूर करने के लिए, आईजीके विलोपन - और एच 19-DMRs PHAESCs में इंजीनियर हैं। मातृ Igf2-H19 और Gtl2-Dlk1 loci पर अंकित अभिव्यक्ति का संशोधन 5.1% से अधिक की आवृत्ति के साथ अर्द्ध क्लोन चूहों की पीढ़ी की अनुमति के लिए जीनोमिक छापों के विन्यास को बदलने के लिए पर्याप्त है, स्थानांतरित 2-कोशिका भ्रूण के आधार पर। इन टिप्पणियों से पता चलता है कि दो अंकित जीन को लक्षित करने से फेजसी के जीनोम को एक कार्यात्मक पैतृक विन्यास में बदल दिया जाता है जो चूहों में शुक्राणु की जगह ले सकता है । फिर भी, इस रणनीति के लिए PHAESCs के एक स्थाई आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता है । एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में, एंड्रोजेनेटिक हैसी पर विचार किया जा सकता है। एंड्रोजेटिक एचईएससी शुक्राणु जीनोम से प्राप्त होते हैं और इसमें पैतृक निशान होते हैं। ऐसी रिपोर्टें आई हैं कि वाइल्डटाइप एंड्रोजेनेटिक एचईएससी ने शुक्राणु प्रतिस्थापन के रूप में योगदान दिया ताकि 1.3% और स्थानांतरित भ्रूण4,7,24के 1.9% के बीच आवृत्ति पर पूर्ण अवधि के पिल्ले उत्पन्न किए जा सकें। आईजी-और एच19-डीएमआरके 20.2% की आवृत्ति पर स्थानांतरित2-सेल भ्रूण 24 के विलोपन के साथ एंड्रोजेटिकएचईएससी इंजेक्शन द्वारा पूर्ण अवधि के पिल्ले भी प्राप्त किए गए हैं। संशोधित एंड्रोजेनेटिक एचईएससी का उपयोग करके अर्ध-क्लोनिंग की बढ़ी हुई दक्षता की संभावना है क्योंकि निशान संस्कृति में अस्थिर हो सकते हैं। महत्वपूर्ण डीएमआर के आनुवंशिक विलोपन द्वारा छाप दोषों को ठीक किया जाता है।

ओसाइट या शुक्राणु जीनोम में सीधे आनुवंशिक संशोधनों को शुरू करने में कठिनाई को ध्यान में रखते हुए, haESCs माता-पिता के जीनोम में अलग से हेरफेर करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं। शुक्राणु के विकल्प के रूप में एचईएससी का उपयोग माउस जर्मलाइन में जीनोम संपादन के लिए एक उल्लेखनीय लाभ प्रदान करता है। हाल के एक अध्ययन में CRISPR/Cas9-आधारित जीनोम संपादन को उन छापन क्षेत्रों के लक्षण वर्णन के लिए haESCs के अनुप्रयोग के साथ संयुक्त किया गया है जो भ्रूण विकास12के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस अध्ययन में एच 19-और आईजी-डीएमआर के साथ द्वितुष चूहों के विकास में Rasgrf1-DMR की भूमिका का विश्लेषण किया गया, और बाइपटर्नल चूहों के विकास में 7 अलग-अलग डीएमआर का कार्य किया गया। शुक्राणु के लिए एचईएससी के प्रतिस्थापन की विधि ने मौलिक रोगाणु कोशिका विकास में डीएनडी1 प्रोटीन के भीतर प्रमुख अमीनो एसिड की पहचान करने और हड्डी विकास24 , 25,26में जीन की पहचान करने के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग दृष्टिकोणों का आधारबनाया। भ्रूणीय विकास में प्रमुख कारकों की पहचान करने के लिए जीनोमिक छाप और आनुवंशिक स्क्रीनिंग पर अध्ययन गेमिक जीनोम के रूप में haESCs के आवेदन के लिए काफी दृष्टिकोण हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम फेंसेस लाइनों के व्युत्पन्न और प्रवाह साइटोमेट्री ऑपरेशन के लिए डॉ रेमो फ्रीमैन के लिए डॉ गिउलियो डि मिनिन को धन्यवाद देते हैं। हम भ्रूण हस्तांतरण के साथ तकनीकी सहायता के लिए सुश्री मिचेल श्फनर और श्री थॉमस एम हेनेक को भी स्वीकार करते हैं। इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट 31003A_152814/1) ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mLTube Eppendorf 0030 125.150 haESC culture
15 ml Tube Greiner Bio-One 188271 haESC culture
12-well plate Thermo Scientific 150628 haESC culture
24-well plate Thermo Scientific 142475 haESC culture
6-well plate Thermo Scientific 140675 haESC culture
96-well plate Thermo Scientific 167008 haESC culture
β-Mercaptoethanol Merck M6250 haESC culture
BSA fraction Gibco 15260-037 haESC culture
CHIR 99021 Axon 1386 haESC culture
Demecolcine solution Merck D1925 haESC culture
DMEM Gibco 41965-039 haESC culture
DMEM / F-12 Gibco 11320-033 haESC culture
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208 haESC culture
EDTA Merck E5134 haESC culture
FBS biowest S1810-500 haESC culture
Freezing medium amsbio 11897 haESC culture
Gelatin Merck G1890 haESC culture
Hepes solution Gibco 15630-056 haESC culture
Irradiated MEF Gibco A34966 haESC culture
LIF (Leukemia inhibitory factor) (Homemade) - haESC culture
Lipofection reagent Invitrogen 11668019 haESC culture
NDiff 227 Takara Y40002 haESC culture
PD 0325901 Axon 1408 haESC culture
Pen Strep Gibco 15140-122 haESC culture
piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene Addgene #40973 haESC culture
piggyBac transposase plasmid System Biosciences PB210PA-1 haESC culture
pX330 plasmid Addgene #42230 haESC culture
pX458 plasmid Addgene #48138 haESC culture
Trypsin Gibco 15090-046 haESC culture
DNA polymerase Thermo Scientific F549S Genotyping
dNTP Mix Thermo Scientific R0192 Genotyping
Ethanol Merck 100983 Genotyping
Hydrochloric acid Merck 100317 Genotyping
Isopropanol Merck 109634 Genotyping
Proteinase K Axon A3830 Genotyping
SDS Merck 71729 Genotyping
Sodium chloride Merck 106404 Genotyping
ThermoMixer Epeendorf 5384000012 Genotyping
Tris Merck T1503 Genotyping
5 mL Tube Falcon 352063 Flow cytometry
5 mL Tube with cell strainer cap Falcon 352235 Flow cytometry
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Flow cytometry
MoFlo Astrios EQ Beckman Coulter B25982 Flow cytometry
1 mL syringe Codan 62.1640 Superovulation
30-gauge 1/2 inch needle Merck Z192362-100EA Superovulation
B6D2F1 mouse The Jackson Laboratory 100006 Superovulation
hCG MSD animal health 49451 Superovulation
PBS Gibco 10010015 Superovulation
PMSG Avivasysbio OPPA1037 5000 IU Superovulation
10-cm dish Thermo Scientific 150350 Embryo manipulation
4-well plate Thermo Scientific 179830 Embryo manipulation
50 mL tube Greiner Bio-One 227261 Embryo manipulation
6 cm dish Thermo Scientific 150288 Embryo manipulation
Center-well dish Corning 3260 Embryo manipulation
Digital rocker Thermo Scientific 88880020 Embryo manipulation
EGTA AppliChem A0878 Embryo manipulation
Hyaluronidase Merck H4272 Embryo manipulation
KSOM Merck MR-020P-5F Embryo manipulation
M16 medium Merck M7292 Embryo manipulation
M2 medium Merck M7167 Embryo manipulation
Mineral oil Merck M8410 Embryo manipulation
Glass capillary Merck P1049-1PAK Embryo manipulation
Stereomicroscope Nikon SMZ745 Embryo manipulation
Strontium chloride Merck 13909 Embryo manipulation
5ml syringe Codan 62.5607 Microinjection
Borosilicate glass cappilary Science product GB100T-8P Microinjection
CellTram 4r Oil Eppendorf 5196000030 Microinjection
Fluorinert FC-770 Merck F3556 Microinjection
Holding pipette BioMedical Instruments - Microinjection
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti-U Microinjection
Microforge Narishige MF-900 Microinjection
Microinjection pipette BioMedical Instruments - Microinjection
Microlaoder tips Eppendorf 5252 956.003 Microinjection
Micromanipulaor arms Narishige NT-88-V3 Microinjection
Micropipette puller Sutter Instrument P-1000 Microinjection
PiezoXpert Eppendorf 5194000016 Microinjection
PVP (Polyvinylpyrrolidine) Merck PVP360 Microinjection
Syringe filter SARSTEDT 83.1826.001 Microinjection

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 165 हैप्लॉयड भ्रूणस्टेम सेल इंट्रासाइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन क्लोनिंग यूनिपेरेंटल चूहे जीनोमिकप्रिंटिंग शुक्राणु
शुक्राणु के विकल्प के रूप में माउस पार्थेनोजेनेटिक हैप्लॉयड भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का आवेदन
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Aizawa, E., Dumeau, C. E., Wutz, A. Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm. J. Vis. Exp. (165), e61999, doi:10.3791/61999 (2020).

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