Summary
Denna artikel syftar till att demonstrera användningen av parthenogenetic haploid embryonala stamceller som ersättning för spermier för konstruktion av halvklonerade embryon.
Abstract
I organismer med sexuell reproduktion är könsceller källan till totipotenta celler som utvecklas till nya individer. Hos möss skapar befruktning av en oocyt av en spermatozoon en totipotent zygot. Nyligen har flera publikationer rapporterat att haploida embryonala stamceller (haESCs) kan ersätta gametiska genom och bidra till embryon, som utvecklas till möss. Här presenterar vi ett protokoll för att tillämpa parthenogenetic haESCs som en ersättning av spermier för att konstruera embryon genom intracytoplasmic injektion i äggceller. Detta protokoll består av steg för att förbereda haESCs som spermieersättning, för injektion av haESC-kromosomer i äggceller och för odling av halvklonerade embryon. Embryona kan ge bördiga halvklonerade möss efter embryoöverföring. Att använda haESCs som spermieersättning underlättar genomredigering i könscellen, studier av embryonal utveckling och undersökning av genomisk prägling.
Introduction
Hos däggdjur är gameter de enda cellerna som överför genetisk information till nästa generation. Fusion av en oocyt och en spermatozoon bildar en diploid zygot som utvecklas till ett vuxendjur. Mutationer i gametic genom ärvs därmed av avkomman och driver genetisk variation i art1. Införande av mutationer i könscellen har tillämpats för att producera genetiskt modifierade djur för olika biologiska studier, inklusive karakterisering av genfunktion och sjukdomsmodellering. Både äggceller och spermatozoer är terminalt differentierade och högspecialiserade celler som har upphört med spridningen. Därför är direkt modifiering av gameter tekniskt svårt, och specialiserade tillvägagångssätt har utvecklats. Genetiska modifieringar kan införas i musen genom injektion av genetiskt modifierade EIC i blastocyster, där de integreras i det utvecklande embryot och koloniserar könscellen. Dessutom har genetisk modifiering av zygoter med hjälp av genomredigeringsmetoder, inklusive CRISPR / Cas9-systemet, blivit allmänt antagen2.
Nyligen har ett enastående tillvägagångssätt rapporterats, som tillämpar haESCs som ersättning för ett gametic genom3,4,5,6,7,8. HaESCs är stamcellslinjer som härrör från den inre cellmassan hos parthenogenetiska eller androgenetiska haploida blastocyster och har en enda uppsättning kromosomer4,7,9,10. Det har visat sig att både parthenogenetiska och androgenetiska haESCs kan bidra till arvsmassan hos halvklonerade möss efter intracytoplasmisk injektion i äggceller. I motsats till andra tillvägagångssätt kan haESCs genom direkt modifieras i kulturen på grund av deras självförnyelsekapacitet. Att införa genetiska modifieringar i bakterien genom att ersätta spermier med haESCs är en viktig metod för biologiska studier. Det ger en möjlighet att separat odla och manipulera moderns eller faderliga genomet, som härrör från parthenogenetiska respektive androgenetiska haESCs. HaESCs kan sedan användas som gametic genomersättning, vilket är särskilt fördelaktigt för studier av genomisk prägling, allelspecifika uttryck och föräldraspecifika processer.
Hos möss krävs både moderns och faderliga genomisk information för normal embryoutveckling11. Därför kunde full-term valpar inte erhållas när vilda typ parthenogenetic haESCs (phaESCs) injicerades för att ersätta spermiegenomet5,8. För att övervinna utvecklingsblocket måste genomisk prägling av moderns genom av parthenogenetiska haESCs korrigeras till en faderlig konfiguration. Detta kan uppnås genom manipulering av de differentiellt metylerade regionerna (DMR). Hittills har riktade borttagningar av H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR och Rasgrf1-DMR studerats för att undertrycka moderligt uttryckta gener i phaESCs3,5,8,12. Dessa studier visade att borttagningar av både H19-DMR och IG-DMR är tillräckliga för att omvandla en moderns till en faderlig avtryckskonfiguration som kan ersätta spermier kromosomer. Intracytoplasmic injektion av phaESCs som bär de två DMR borttagningar i äggceller gav halvklonerade valpar med en frekvens mellan 5,1% och 15,5% av överförda 2-cells embryon.
Detta protokoll är baserat på tillämpningen av phaESCs med borttagningar av både H19-DMR och IG-DMR, som vi kallas dubbel-knockout phaESCs (DKO-phaESCs). Vi ger detaljerade instruktioner för modifiering av genomisk prägling i phaESCs för att upprätta DKO-phaESC linjer, för injektion av DKO-phaESCs i äggceller som ersättning för en spermier genom, för odling av halvklotade embryon till blastocyster, och för att erhålla halvklonerade möss. Detta protokoll är en referens för forskare som kräver exakt och direkt manipulering av det faderliga genomet och genereringen av halvklonerade embryon och möss.
Protocol
Alla djurförsök utfördes under licensen ZH152/17 i enlighet med standarder och förordningar från Cantonal Ethics Commission Zurich och EPIC animal facility vid Institute of Molecular Health Sciences, ETH Zurich.
OBS: Detta protokoll börjar med borttagning av H19- och IG-DMR i phaESCs. Mer information om hur du upprättar phaESC-linjer finns i publicerade rapporter10,13. En översikt och tidsram för detta protokoll (steg 1–14) finns i figur 1A. media, lösningar och buffertar visas i tabell 1. Förfarandet för att upprätta DKO-phaESC-linjer (steg 1–6) visas i figur 1B, och strategin för att konstruera halvklonerade embryon (steg 7–14) visas i figur 1C.
1. Transfection av plasmider för radering av H19-DMR och IG-DMR i phaESCs
- Förbered CRISPR/Cas9-plasmider för samuttryck av Cas9-nukleaser och vägleda RNAs för att rikta borttagningar av H19-DMR och IG-DMR. Ligate fyra par guide RNA oligos (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R listad i tabell 2) i pX330 plasmider.
OBS: Se det publicerade protokollet om det detaljerade förfarandet för beredning av dessa 4 CRISPR/Cas9-plasmider14. Alternativt är plasmider tillgängliga för allmänna musstammar också tillgängliga via ett arkiv (Materialförteckning ). - Täck ytan på en brunn på en 6-brunnsplatta med 1 ml 0,2% gelatinlösning genom inkubation vid 37 °C i 10 min.
- Platta 2 × 105 vildtypsfaser på den gelatinbelagda brunnen i haESC-medium utan antibiotika och inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär i 1 dag.
OBS: Antibiotika utelämnas från mediet för att öka effektiviteten hos den efterföljande lipofection. Vi använde wildtype phaESCs vid passage 10. Vi rekommenderar att du använder tidiga passagefaser, men en mängd olika passagenummer har framgångsrikt använts8. Sambandet mellan passagenummer och effektivitet för att erhålla halvklonerade embryon och möss är för närvarande inte känt. - Transfekta phaESCs i brunnen på en 6-brunnsplatta (från steg 1.3) med 6 plasmider samtidigt med lipofection reagens: 50 ng piggyBac plasmid som bär en CAG-EGFP transgene, 50 ng piggyBac transposase plasmid och 600 ng av var och en av de 4 CRISPR/Cas9 plasmiderna (från steg 1.1). Se tillverkarens protokoll om detaljerad procedur för transfektionen.
OBS: Två piggyBac plasmider används för att integrera en transposon för allestädes närvarande uttryck av förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP) i arvsmassan hos phaESCs. Om GFP-märkning av cellerna inte krävs kan dessa två plasmider ersättas med en CRISPR/Cas9-plasmid för övergående uttryck av fluorescensproteiner (t.ex. pX458-plasmid) i stället för en av pX330-plasmiderna. Övergående EGFP-uttryck kan sedan användas för sortering av transfekterade celler. - Två dagar efter transfekten, aspirera mediet och tillsätt 800 μL trypsin.
- Inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär i 5 min. Tillsätt sedan 2 ml tvättbuffert för att släcka trypsin och pipett flera gånger för att få en enda cellfjädring.
- Överför cellfjädringen till ett 15 ml-rör.
- Centrifugera röret vid 160 x g i 5 min och ta bort supernaten.
- Återanvänd cellpelleten i 400 μL haESC underhållsbuffert kompletterad med 15 μg/mL Hoechst 33342.
OBS: För att minska den potentiella toxiciteten hos Hoechst 33342 har 1 μg/mL Hoechst 33342 och 50 μM verapamil använts i stället för 15 μg/mL Hoechst 3334215. - Inkubera cellupphängningen vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär i 15 min. Efter inkubationen överför du cellfjädringen till ett 5 ml-rör genom ett cellsillock och håller röret vid 4 °C tills det är klart att användas i nästa steg (avsnitt 2).
2. Encellig plätering av transfekterade phaESCs med hjälp av en flödescytometer
- En dag före sortering av de transfected phaESCs, platt bestrålade mus embryonala fibroblaster (MEFs) på gelatinbelagda 96-brunnsplattor med en densitet av 4 × 104 celler/cm2 i MEF medium. Vanligtvis är 6 plattor beredda att upprätta en phaESC-linje med riktade borttagningar. Inkubera plattorna vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.
OBS: Bestrålade MEF:er är kommersiellt tillgängliga. Vi använder MEF som härrör från E12.5 embryon från DR4 möss. Även om haESCs kan växa på gelatinbelagda plattor utan MEF, rekommenderar vi MEF för att öka livskraften hos sorterade enskilda haESCs. - På sorteringsdagen aspirerar du MEF-mediet från 96-brunnsplattorna och lägger till 120 μL färskt haESC-medium per brunn. Håll plattorna på 37 °C i en 5% CO2 atmosfär.
- Ställ in en cellsorterare med ett munstycke på 100 μm enligt tillverkarens instruktioner. En 355 nm UV-laser och en 488 nm blå laser används för excitation av Hoechst 33342 respektive EGFP fluorescens.
OBS: Alternativt kan Hoechst 33342 detekteras genom excitation med 405 nm. - Sortera de transfecterade falangerna i 5 ml-röret (från steg 1.10) med hjälp av en grind för insamling av haploidceller i G1/S-fasen som visar EGFP-uttryck. Sätt in en enda cell i varje brunn på 96-brunnsplattorna från steg 2.2.
OBS: Påvisande av Hoechst 33342 färgning skiljer i allmänhet 3 toppar av celler med en DNA-halt på 1n, 2n och 4n, som motsvarar haploida celler i G1-fas, en blandning av haploida celler i G2/M-fas och difadceller i G1-fas och difadceller i G2/M-fas, respektive. Haploidceller vid G1/S fas identifieras som toppen med lägre intensitet av Hoechst 33342 fluorescens. Ett representativt resultat och en sorteringsport visas i figur 2A. - Efter plätering, inkubera 96-brunnsplattorna vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.
3. Subkloning av transfekterade phaESCs
- Tre dagar efter encellig plätering kan kolonier observeras i flera brunnar av 96-brunnsplattorna under ett mikroskop. Markera brunnarna där endast enstaka kolonier växer.
OBS: Enligt vår erfarenhet observerades enstaka kolonier i 20%-40% av brunnarna i 96-brunnsplattorna. - På dag 4 efter encellig plätering, ersätt hälften av mediet med nytt haESC-medium i brunnarna med enstaka kolonier.
- En dag före passaging (dag 4 eller 5 efter encellig plätering) bestrålade plattan MEFs på gelatinbelagda 96-brunnsplattor med en densitet av 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Håll plattorna på 37 °C i en 5% CO2 atmosfär.
- Efter 5 eller 6 dagars encellig plätering, välj brunnar av de 96-brunnsplattor som innehåller enstaka kolonier med en diameter större än 150 μm.
OBS: Cirka 100 brunnar väljs företrädesvis för att upprätta en phaESC-linje med de riktade DMR-borttagningarna. - Aspirera mediet i de valda brunnarna och tillsätt 30 μL trypsin. Inkubera 96-brunnsplattorna vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär i 5 min. Tillsätt sedan 30 μL tvättbuffert till varje brunn för att släcka trypsinet.
- Tillsätt 140 μL haESC-medium i varje brunn och pipett flera gånger för att få enstaka celler.
- Aspirera MEF-mediet från brunnarna på 96-brunnsplattorna som är beredda i steg 3.3.
- Överför phaESCs från varje brunn från steg 3.6 till en frisk brunn av den nya 96-brunnsplattan från steg 3.7.
- Inkubera 96-brunnsplattorna som innehåller phaESC-subkloner vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.
- Nästa dag aspirerar du allt medium från varje brunn och lägger till 120 μL nytt haESC-medium. Inkubera plattorna vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.
- En dag innan cellerna blir konfluenta för passaging, plätera de bestrålade MEF:erna på gelatinbelagda 24-brunnsplattor med en densitet av 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Håll plattorna på 37 °C i en 5% CO2 atmosfär.
- När phaESCs har blivit confluent för passaging, aspirera mediet och tillsätt 30 μL trypsin. Inkubera 96-brunnsplattorna vid 37 °C i 5 minuter.
- Tillsätt 90 μL tvättbuffert i varje brunn för att släcka trypsinet. Pipett flera gånger för att få enstaka celler.
- Aspirera MEF-mediet från brunnarna på 24-brunnsplattorna från steg 3.11 och tillsätt 600 μL färskt haESC-medium.
- Överför 60 μL av suspensionen av phaESC-subkloner från varje brunn i steg 3.13 till en ny brunn på 24-brunnsplattorna från steg 3.14. Förvara den återstående suspensionen av varje phaESC-subclone för DNA-extraktion och genotypning i steg 4.
- Inkubera 24-brunnsplattorna med phaESC-subdukarna vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.
- En dag innan cellkulturerna når tätheten för passaging, plätera de bestrålade MEF:erna på gelatinbelagda 6-brunnsplattor med en densitet av 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Håll plattorna på 37 °C i en 5% CO2 atmosfär.
- När phaESCs blir tillräckligt sammanflöde för passaging, aspirera mediet och tillsätt 250 μL trypsin. Inkubera 24-brunnsplattorna vid 37 °C i 5 minuter.
OBS: Efter genotypning i steg 4.9 behöver endast phaESC-linjer med borttagningar av både H19-DMR och IG-DMR passeras. - Tillsätt 750 μL tvättbuffert i varje brunn för att släcka trypsinet. Pipett flera gånger för att få en enda cellfjädring. Överför cellfjädringen till ett 15 ml-rör.
- Centrifugera röret vid 160 x g i 5 min, ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i 2 ml haESC-medium.
- Aspirera MEF-mediet från brunnarna på 6-brunnsplattorna från steg 3.17. Överför phaESC-fjädringen från varje rör från steg 3.20 till en ny brunn. Håll plattorna på 37 °C i en 5% CO2 atmosfär.
- Expandera cellklonerna genom att upprepa steg 3.17 till 3.21 och öka plåtstorleken och volymerna av trypsin, tvättbuffert och haESC-medium. Förbered en T25-kolv för varje subklonerad phaESC-linje av MEF:er för steg 5.
OBS: Vi rekommenderar att du fryser en alikvot av varje subklonerad phaESC-linje i 300 μL frysmedel och håller en kryostock i flytande kvävelagring innan du fortsätter till steg 5.
4. Första genotypningen av subklonerade phaESC-linjer med MEF
- För att extrahera genomiskt DNA från den återstående cellupphängningen från steg 3.15, tillsätt 200 μL lysbuffert till varje brunn på 96-brunnsplattorna. Överför cellfjädringen till ett 1,5 ml-rör. Skölj varje brunn med ytterligare 200 μL lysbuffert för att återställa alla återstående celler och samla i samma 1,5 ml-rör.
- Inkubera 1,5 ml-röret vid 55 °C i 3 timmar vid blandning.
- Efter inkubation tillsätt 460 μL isopropanol till varje 1,5 ml-rör och blanda försiktigt tills ett DNA-fällning blir synligt.
- Centrifugera rören ≥ 10 000 x g i 5 minuter och ta bort supernaten. Tvätta DNA-pelletsen med 200 μL 70% etanol.
- Centrifugera rören ≥ 10 000 x g i 5 minuter och ta bort supernaten.
- Torka rören i luft i 10 minuter och återanvänd sedan DNA:t i 20 μL vatten.
- Utför polymeraskedjereaktion (PCR) med hjälp av termoserbart DNA-polymeras enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Primerparen för PCR anges i tabell 2 och används enligt följande: H19-DMR-P1 och P3 (407 bp för borttagen H19-DMR); H19-DMR-P2 och P3 (623 bp för vildtyp H19-DMR); IG-DMR-P1 och P3 (319 bp för borttagen IG-DMR); IG-DMR-P2 och P3 (492 bp för wildtype IG-DMR). Temperaturprofilen för PCR för alla primerpar är följande: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. Längden på förstärkta DNA-fragment för H19- DMR-och IG-DMR-borttagningar visar viss variation på grund av icke-homolog end joining associerad med CRISPR / Cas9-medierad redigering. PhaESCs odlades med MEFs, som innehåller wildtype H19-DMR och IG-DMR DNA. Därför är primerpar av H19-DMR-P2/P3 och IG-DMR-P2/P3, som förstärker vilda DNA-fragment, inte informativa. Dessa primerpar ingår dock som kontroller och bör ge ett band i alla reaktioner. - Analysera PCR-fragmenten med agarose gel elektrofores. Se det publicerade protokollet om det detaljerade förfarandet för elektroforesen16.
- Identifiera cellinjer med borttagningar av både H19-DMR och IG-DMR. En representativ bild av elektrofores visas i figur 2B.
OBS: I vårt fall identifierades åtta cellinjer med borttagningar av både H19-DMR och IG-DMR bland 135 subklonerade phaESC linjer.
5. Haploidcellrening av subklonade phaESC-linjer
- När de subklonerade phaESC-kulturerna i T25-flaskorna från steg 3.22 blir tillräckligt täta för passaging, aspirera mediet och tillsätt 1,5 ml trypsin. Inkubera kolven vid 37 °C i 5 minuter. Tillsätt sedan 4,5 ml tvättbuffert och pipett flera gånger för att få en encellig suspension.
- Överför varje cellfjädring till ett 15 ml-rör och centrifugera röret vid 160 x g i 5 minuter. Ta bort supernatanten och återanvänd cellpelletsen i 400 μL haESC underhållsbuffert kompletterad med 15 μg/mL Hoechst 33342.
- Inkubera cellupphängningen vid 37 °C i 15 minuter. Efter inkubationen överför du cellupphängningen till ett 5 ml-rör genom ett cellsillock. Skölj cellsillocket med ytterligare 400 μL haESC underhållsbuffert och samla de återstående cellerna i samma 5 ml-rör. Håll röret vid 4 °C tills det är klart att sorteras.
- Ställ in en flödescytometer med ett munstycke på 100 μm enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Hoechst 33342 kan detekteras genom excitation vid 405 nm. Här används en 355 nm UV-laser för detektion av Hoechst 33342. - Ställ in cellfjädringen (från steg 5.3) och ett nytt 15 ml-rör som innehåller 2 ml haESC underhållsbuffert för att samla sorterade celler i flödescytometern.
- Starta analysen och ställ in sorteringsporten för att samla haploidceller i G1/S-fasen. Se histogrammet i figur 2A för identifiering av G1/S-fasfasens phaESC-population.
OBS: Vissa subklonerade phaESC-linjer kanske inte innehåller några haploidceller på grund av fullständig diploidisering eller felaktig plätering av diploidceller i steg 2. Om haploida celler inte observeras i G1/S-fasen, fortsätt till ett annat prov utan sortering. I vårt fall innehöll 5 cellinjer haploida celler och 3 cellinjer innehöll endast diploid celler av 8 sub-klonade phaESC linjer. - Efter cellsortering, tillsätt 5 ml tvättbuffert längs väggen på 15 ml uppsamlingsrör. Centrifugera röret vid 160 x g i 5 min. Ta bort supernaten.
- Välj en tallrik med lämplig storlek för odling beroende på antalet sorterade celler. Använd en enda brunn av en 96-brunnsplatta, en 24-brunnsplatta och en 12-brunnsplatta för att odla 1 000–40 000 celler, 40 000–200 000 celler respektive 200 000–400 000 celler. Återanvänd cellpelleten i 120 μL, 600 μL respektive 1,2 ml haESC-medium.
OBS: Plätera cellerna med hög densitet eftersom låg sammanflöde kan orsaka celldöd i cellerna efter sortering. Från och med nu odlas phaESCs på gelatinbelagda brunnar utan MEF för att underlätta genotypning i steg 6 och efterföljande applicering för intracytoplasmisk injektion från steg 9. - Efter överföring av cellfjädringen till en gelatinbelagd brunn av lämplig storlek, inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.
- Fortsätt att expandera phaESC-kulturerna genom att upprepa steg 3.18 till 3.21 med ökande plåtstorlekar och ökande volymer trypsin, tvättbuffert och haESC-medium. Cellerna odlas på gelatinbelagda brunnar utan MEF.
- För varje subklonerad phaESC-linje, förbered en kultur i en brunn av en 24-brunnsplatta och en brunn av en 6-brunnsplatta för steg 6 respektive 9.
OBS: Vissa celler i varje subklonerad phaESC-linje bör frysas i 300 μL frysmedel som en kryostock i en flytande kvävelagringstank innan de fortsätter till steg 9.
6. Andra genotypningen av subklonerade phaESC-linjer utan MEF
OBS: En andra omgång genotypning utförs för att bekräfta att de subklo klonade phaESC-linjerna har borttagningar av både H19- och IG-DMR, och att wildtype alleler är frånvarande efter avlägsnandet av MEF.
- Bekräfta under mikroskopet att kulturerna i brunnar på 24-brunnsplattorna från steg 5.11 är fria från MEF: er.
OBS: Om MEF observeras är det nödvändigt att fortsätta passa kulturerna tills MEF har försvunnit för att undvika att förorena PCR med vildtyps-DNA från MEF. - Aspirera mediet från konfluenta kulturer och tillsätt 400 μL lysbuffert per brunn på 24-brunnsplattan. Efter pipetting flera gånger, överför cellfjädringen till ett 1,5 ml-rör.
- Inkubera 1,5 ml-röret vid 55 °C i 3 timmar vid blandning.
- Efter inkubation tillsätt 400 μL isopropanol till 1,5 ml-röret och blanda försiktigt tills ett DNA-fällning blir synligt.
- Centrifugera röret ≥ 10 000 x g i 5 minuter och ta bort supernaten. Tvätta DNA-pelleten med 200 μL 70% etanol.
- Centrifugera röret ≥ 10 000 x g i 5 minuter och ta bort supernaten.
- Torka röret i luften i 10 minuter och återanvänd sedan DNA:t i 50 μL vatten.
- Utför genotypning PCR efter steg 4.7 och gelelektrofores i steg 4.8 för att identifiera cellinjer, som har borttagningar av både H19- och IG-DMRs och är fria från wildtype alleler.
OBS: En bild av en typisk andra genotypningsanalys visas i figur 2B som referens. I vårt fall var alla 5 cellinjer som valts efter haploid cell rening (steg 5) fria från wildtype alleler och besatt endast borttagning alleler av H19- och IG-DMRs. - Använd de subklonerade phaESC-linjerna som valts efter denna andra genotypning som DKO-phaESC-linjer.
7. Superovulation av möss
- För produktion av MII oocyter, initiera superovulation genom intraperitoneal injektion av 5 IE av gravida mare serum gonadotropin (PMSG) lösning i varje B6D2F1 kvinnliga mus (4-5 veckor gammal) 63-65 h före oocyte samling.
OBS: B6D2F1 mus stam rekommenderas för detta protokoll eftersom B6D2F1 äggceller tolerera intracytoplasmic injektion väl och visa hög utvecklingspotential efterförfarandet 17. - Fyrtioåtta timmar efter PMSG injektion, intraperitoneally injicera 5 IE av mänskliga chorionic gonadotropin lösning i varje mus.
8. Oocytsamling
- Förbered en 4-brunnsplatta som innehåller 700 μL hyaluronidase medium i en brunn och 700 μL M2-medium i de återstående 3 brunnarna. Förbered dessutom en 6 cm skål med 7 ml M2 medium och en mittbrunnsform med 900 μL M16 medium. Förvärm tallriken och disken vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.
- På dagen för intracytoplasmic injektion, avliva superovulated honor (från steg 7,2) genom antingen massundersökning förskjutning eller CO2 inandning runt 8 AM på morgonen. Dissekera ovidukterna med pincett och sax. Placera ovidukterna i 6 cm skålen med M2 medium.
- Släpp cumulus-oocytekomplexen (COC) genom att riva ampullan i äggkanalerna med en 30 G nål. Överför COC till förvärmt hyaluronidase medium och förvara vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär.
- Efter 2-3 min, samla cumulusfria äggceller med en munpipett och tvätta äggcellerna 3 gånger genom att överföra dem till färskt M2-medium i de andra 3 brunnarna på 4-brunnsplattan.
- Samla metafas II (MII) äggceller, som har första polära kroppar, i en center-well skål med M16 medium och håll plattan vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär tills den används för intracytoplasmic injektion i steg 12.
9. Behandling och insamling av DKO-phaESCs
- Förbered en DKO-phaESC-kultur i en brunn av en 6-brunnsplatta utan MEF vid 60-80% konfluency en dag före intracytoplasmic injektionen (från steg 5.11).
- För att inducera cellcykelstopp i M-fas, aspirera mediet helt och tillsätt 2 ml haESC-medium som innehåller 0,05 mg/mL demecolcine.
- Efter 8 h demecolcinebehandling, aspirera mediet och tillsätt 800 μL trypsin.
- Inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär i 5 min och tillsätt sedan 2 ml tvättbuffert för att släcka trypsin och pipett flera gånger för att få en encellig suspension.
- Överför cellfjädringen till ett 15 ml-rör. Centrifugera röret vid 160 x g i 5 min och ta bort supernaten.
- Återanvänd cellpelleten i 400 μL haESC underhållsbuffert som innehåller 15 μg/mL Hoechst 33342.
- Inkubera cellupphängningen vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär i 15 min. Efter inkubationen överför du cellfjädringen till ett 5 ml-rör genom ett cellsillock och håller röret vid 4 °C tills cellsortering i steg 10.
10. Rening av M-fas-arresterade DKO-phaESCs
- Ställ in en flödescytometer med ett munstycke på 100 μm enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Hoechst 33342 kan detekteras genom excitation vid 405 nm. Här används en 355 nm UV-laser för detektion av Hoechst 33342. - Ställ in de M-fas-arresterade DKO-falangerna från steg 9.7 och starta analysen. Välj en lämplig sorteringsport för insamling av haploid M-fasceller (2n) från provet behandlat med demecolcine.
OBS: Efter behandling med demecolcine förväntas 2 cellpopulationer, motsvarande haploida och diploid M-fas-arresterade celler som visas i figur 3B. Cellcykeln gripande efter demecolcine behandling är klar, således observeras ingen haploid 1n DNA topp. Detta är viktigt eftersom haploid M-fasceller och diploid G1-celler har samma DNA-innehåll (2n) och skulle producera överlappande toppar. - Sätt upp ett 15 ml-rör som innehåller 2 ml haESC underhållsbuffert för att samla de sorterade cellerna i flödescytometern. Starta cellsortering.
- Efter cellsortering, tillsätt 5 ml tvättbuffert längs uppsamlingsrörets vägg. Centrifugera röret vid 160 x g i 5 min och ta bort supernaten.
- Återanvänd cellerna i en lämplig volym haESC underhållsbuffert för att erhålla en slutlig koncentration på 5 x 105 celler/ml.
- Överför cellfjädringen till ett 1,5 ml-rör. Håll röret på is tills det är klart för intracytoplasmisk injektion i steg 12.
11. Beredning av jordbruks- och mikroinjektionspipetter
OBS: För att utföra den intracytoplasmiska injektionen (steg 12) krävs flera hållande och mikroinjektionspipetter (figur 4A). Dessa pipetter kan köpas på skräddarsydd efterfrågan från en kommersiell leverantör eller tillverkas av lämpliga glaskapillärer med hjälp av en mikropipettedragare och en mikroforge.
- Dra borosilikatglaskapillärer på en mikropipettedragare. För att dra borosilikatglas kapillärer utan glödtråd (0,78 x 1,00 x 80 mm) anges följande parametrar för en flammande horisontell puller(Tabell över material)som referens, men kommer att skilja sig åt för andra instrument och glas kapillärtyper: Heat 510 (Ramp test 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 och Pressure 200 för att hålla pipetter; Heat 510 (Ramptest 480), Pull 90, Velocity 140, Time 125 och Pressure 200 för mikroinjektionspipetter.
OBS: De optimala parametrarna måste definieras individuellt eftersom flera faktorer, inklusive fuktighet, modellen av en mikropipettedragare och glaskapillärernas lott kan påverka form av injektionspipetterna. En långsträckt form med en gradvis avsmalning bör riktas mot. - Beredning av hållröretter
- Ställ in en dragen kapillär beredd i steg 11.1 på en mikroforge. Placera kapillären över glaspärlan på glödtråden och sänk kapillären för att få kontakt med glaspärlan medan du värmer glödtråden.
- Bryt kapillären genom att stänga av värmen och lossna från glaspärlan så att dess ytterdiameter är 60–100 μm.
- Placera kapillärspetsen horisontellt för att möta glaspärlan på glödtråden.
- Värm glödtråden så att kapillärspetsens innerdiameter smälter till en diameter av 10–20 μm.
- Flytta kapillären så att glaspärlan placerar sig vid en punkt ~1 mm från kapillärspetsen utan kontakt. Värm glödtråden så att kapillären kan böjas i 20° vinkel. Demontera kapillären, som kallas en hållrörett, från mikroforgen.
OBS: För att mäta kapillärens storlek installeras helst en okularriktare i mikroforgen.
- Beredning av mikroinjektionspipetter
- Ställ in en dragen kapillär beredd i steg 11.1 på en mikroforge. Placera kapillären över glaspärlan på glödtråden och sänk kapillären för att få kontakt med glaspärlan medan du värmer glödtråden.
- Bryt kapillären genom att stänga av värmen och lossna från glaspärlan i ett läge där dess ytterdiameter är 6 μm.
- Flytta kapillären så att glaspärlan placerar sig vid en punkt ~1 mm från kapillärspetsen utan kontakt. Värm glödtråden så att kapillären kan böjas uppåt i 20° vinkel. Demontera mikroinjektionspipetten från mikroforgen och förvara den i en säker låda för senare användning.
OBS: Mikroinjektionspipetterna bereds med följande specifikationer: ytterdiameter, 6 μm; innerdiameter, 4,5–5 μm; böjvinkel, 20°. Att definiera den optimala utformningen av mikroinjektionspipetten är viktigt för framgången för den intracytoplasmiska injektionen. För stor innerdiameter kan förhindra att plasmamembranet hos donatorn DKO-phESCs sprintureras (se diskussionsavsnitt). Om innerdiametern är för smal kan den hindra smidig pipetting av donatorn DKO-phESCs. En böjvinkel < 30° är att föredra eftersom en hög böjvinkel hindrar effekten av piezopulser.
12. Intracytoplasmisk injektion av DKO- phaESCs
- Före den intracytoplasmiska injektionen (från steg 12.2) bered en polyvinylpyrrolidonlösning (PVP) genom att tillsätta 5 ml M2 medium i ett 50 ml-rör som innehåller 0,6 g PVP och omröra röret på en vipp vid 4 °C i 2 dagar. När PVP har lösts upp helt filtreras lösningen sterilt och förvaras vid 4 °C.
- På dagen för den intracytoplasmiska injektionen, förbered en center-well skål med 900 μL KSOM medium och förvärm skålen vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär.
- Förbered en mikromanipulationsform genom att justera droppar på 5 μL PVP-lösning och 20 μL M2-medium på ett lock av en 10 cm skål som placeras upp och ner. Täck dropparna med mineralolja och placera skålen på injektionsmikroskopets scen.
OBS: Det rekommenderade arrangemanget av mikromanipulationsskålen visas i figur 4B. - Montera en hållpipett på mikromanipulatorn. Fyll mikroinjektionspipetten med fluorkarbonoljan med hjälp av en mikrolastarspets och montera den på piezo-ställdonet.
- Sänk ner mikroinjektionspipetten i en droppe med PVP-lösning och pipett upp och ner flera gånger för att täcka glaset med PVP och gör det mindre klibbigt. Ladda en liten volym PVP-lösning i mikroinjektionspipetten och flytta pipetten till en droppe med M2-medium.
- Sänk ner hållpipetten i M2-mediet och fokusera på pipetten i botten av droppen.
- Överför cirka 2 μL DKO-phaESC-suspension från steg 10,6 till M2-mediumfallet.
- Överför 10 MII-oocyter från steg 8,5 till samma M2 medium droppe med hjälp av en munpipett.
- För injektion, rotera en oocyt i M2 medium droppe så att perivitelline utrymmet vetter mot mikroinjektionspipetten, och MII-plattan är inte placerad i vägen för mikroinjektionspipeetten (Figur 4A). Håll i äggcellen genom att trycka negativt genom håll pipetten.
OBS: En MII-platta identifieras visuellt som en utskjutning av ooplasm som kallas en "puckel" och ofta ligger bredvid den första polära kroppen. MII-plattan innehåller den meiotiska spindeln med bifogade kromosomer. Beröring av mikroinjektionspipetten och MII-plattan måste undvikas eftersom mekaniska skador på spindeln och kromosomerna kan störa embryoutvecklingen. - Ladda en DKO-phaESC i spetsen på mikroinjektionspipetten genom att applicera skonsamt undertryck. Spräck plasmamembranet i en DKO-phaESC genom pipetting för att undvika injektion av en intakt DKO-phaESC(figur 3C; se diskussion).
OBS: Om plasmamembranet i en DKO-phaESC inte spricker genom pipetting, kassera DKO-phaESC och ladda en annan DKO-phaESC. - Placera mikroinjektionspipetten i kontakt med oocytens zona pellucida och applicera en liten mängd negativt tryck i mikroinjektionspipetten.
- Applicera piezoimpulser (intensitet, 20; frekvens, 4) för att bryta igenom zonan medan du trycker spetsen på mikroinjektionspipetten mot perivitellinutrymmet. Kontrollera att MII-plattan, som innehåller en spindel och kromosomer, inte är placerad i mikroinjection-pipettens väg.
OBS: Justera inställningen empiriskt till de lägsta piezopulserna för borrning genom zona för att minimera risken för skador på oolemma. - Kassera fragmentet av zona pellucida från mikroinjektionspipetten och placera DKO-phaESC vid kanten av pipetten.
- Penetrera äggcellen med mikroinjektionspipetten så att oolemma når motsatt sida.
OBS: Rör inte vid MII-plattan för att förhindra skador på spindeln och kromosomerna. - Applicera en piezopuls (intensitet, 6; frekvens, 1) för att genomborra oolemma. Se till att oolemma slappnar av längs mikroinjection pipettens axel.
OBS: Definiera empiriskt den lägsta inställningen av piezopulsen för att bryta oolemma för att minimera skadorna på äggcellen. - Injicera DKO-phaESC med en minimal volym medium i ooplasm och dra ut mikroinjektionspipetten smidigt från äggcellen.
- Släpp den injicerade äggcellen från hållpipetten och placera den på sidan av mikrodroppen för senare insamling.
- Upprepa injektionsproceduren från steg 12,9 till 12, 17 för de andra MII-äggcellerna i M2-mediumfallet.
OBS: Undvik att hålla äggcellerna borta från inkubatorn i mer än 20 minuter. Enligt vår erfarenhet kan ett parti på 10 äggceller manipuleras bekvämt inom 15 minuter efter lämplig träning. - Överför satsen injicerade äggceller från M2 medium droppe till en förvärmd center-well maträtt med KSOM medium.
- Förvara skålen i 1 timme vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.
- Upprepa oocyte manipulation från steg 12,5 och 12,20 med ytterligare grupper av MII äggceller för att få tillräckligt injicerade äggceller.
13. Aktivering av konstruerade halvklonerade embryon
- Förbered två center-well rätter med 900 μL vardera av KSOM medium och aktiveringsmedium. Förbered en 4-brunnsplatta med 700 μL KSOM-medium i varje brunn. Förvärm disken och tallriken vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.
- Efter 1 timme i KSOM medium, överför de injicerade äggcellerna från steg 12.21 till den förvärmda mittbrunnen med aktiveringsmedium.
- Förvara skålen i 6 timmar vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär för aktivering.
- Efter aktivering bildar observera vissa halvklonerade embryon tre polära kroppar, som är de första och andra polära kropparna i äggcellen, och den pseudopolära kroppen från DKO-phaESC (Figur 3E).
- Tvätta embryona 3 gånger genom att överföra dem till nya brunnar med KSOM medium i en 4-brunnsplatta.
- Överför embryona till mittbrunnen med KSOM medium och håll skålen vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär för vidare utveckling.
14. Utveckling av konstruerade halvklonerade embryon
- Efter 1 kulturdag i KSOM-medium från steg 13,6 når flera halvklonerade embryon 2-cellsstadiet (Figur 5A).
- För vidareutveckling av embryon före implantation in vitro, fortsätt att odla de halvkloterade embryona i KSOM medium vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär. Överför de halvklonerade embryona till färskt KSOM-medium dag 2. Dag 4 når flera embryon blastocyststadiet ( figur5A).
- För härledning av halvklonerade möss, överför 2-cells embryon från steg 14,1 till äggledare av pseudo-gravida mottagare honor. Identifiera pseudogravida honor genom att para sig med vasectomiserade män en dag före embryoöverföringen och välj dem på grundval av närvaron av en tydligt synlig plugg på morgonen på dagen för embryoöverföringen (0,5 dagar efter coitum (dpc)). Omkring 19,5 dpc levereras full-term valpar naturligt från mottagarkvinnor (Figur 5B).
Representative Results
Syftet med detta protokoll är att tillämpa haESCs som ersättning för spermier för att erhålla halvklonerade embryon och möss. För detta ändamål genererades och användes en DKO- phaESC-linje som transporterar CAG-EGFP-transgenen för intracytoplasmisk injektion i MII-äggceller. För att få en lämplig phaESC-linje med en faderlig avtryckskonfiguration utförde vi genteknik med Cas9-kärnor. En haploid ESC-linje innehåller haploid- och diploidceller som uppstår på grund av en inneboende tendens hos haploid-EIC för diploidisering10. En haploid kromosomuppsättning är en förutsättning för framgångsrik ersättning av spermiegenomet. DNA-innehållsanalys genom flödescytometri visar fördelningen av haploid- och diploida celler vid G0/G1-, S- och G2/M-faser (figur 2A).
För att fastställa DKO-phaESC linjer, wildtype phaESC linjer var transfected med piggyBac transposon konstruktioner för stabil transgenic EGFP uttryck och med CRISPR/Cas9 plasmider för att erhålla borttagningar av H19- och IG-DMRs. För att utesluta diploid-EIC och isolera endast haploid-EIC som uttrycker EGFP definierades en specifik sorteringsport (figur 2A). Enstaka haploid EGFP-positiva celler pläterades sedan till enskilda brunnar av 96-brunnsplattor för att erhålla subkloner. MEF-matare användes för att öka pläteringseffektiviteten och överlevnaden hos de transfekterade phaESCs. Efter expansion av kulturerna genomfördes en första omgång genotypning av PCR för att identifiera subkloner som bär borttagningar av båda DMR. Efter det att MEF-matare hade avlägsnats från kulturerna utfördes en andra genotypning för att bekräfta frånvaron av vildtyps alleler vid H19- och IG-DMRs (Figur 2B). Från totalt 135 delkloner erhöll vi 5 haploid DKO-phESC-linjer som bar de raderade allelerna och var fria från wildtype alleler av både H19-DMR och IG-DMR.
En CAG-EGFP-transgen introducerades i DKO-phaESCs för att studera deras bidrag till halvklonerade embryon genom visualisering av grön fluorescens under ett mikroskop (figur 3A). För intracytoplasmic injektion, DKO-phaESCs behandlades med demecolcine att arrestera dem i M-fas. Således synkroniserades cell cykeln av DKO-phaESCs med MII oocytes. Flöde cytometri analys visade 2 populationer som motsvarar G2/M fas arresterade haploid (2n) och diploid celler (4n) efter behandling med demecolcine (Figur 3B). Avsaknaden av 1n haploid topp anges att cell cykel gripandet var i stort sett fullständig. M-fas haploid ESCs sorterades sedan och injiceras i äggceller. För detta laddades en enda DKO-phaESC i mikroinjektionspipetten och injicerades i cytoplasman hos en MII-oocyt (figur 3C). Plasmamembranet i DKO-phaESC spruckit genom pipetting i spetsen av microinjection pipetten.
Efter injektionen upptäcktes EGFP-uttrycket sällan i de konstruerade halvklonerade embryona eftersom cytoplasman hos DKO- phaESCs hade spridit sig i den stora cytoplasman i äggcellen (figur 3D). I sällsynta fall kunde en rund plats av intensiv EGFP uttryck observeras inom ooplasm. Denna iakttagelse orsakades sannolikt av oavsiktlig injektion av intakta DKO- phaESCs. Underlåtenhet att brista DKO- phaESC-cellmembranet är sannolikt inte kompatibelt med ytterligare embryoutveckling och bör undvikas. En timme efter injektionen aktiverades embryon genom behandling med strontiumklorid18. Sex timmar efter aktiveringen observerades upp till 3 polära kroppar under mikroskopet(figur 3E). Dessa polära kroppar motsvarar de första och andra polära kropparna i äggcellen och en pseudopolär kropp från DKO-phaESC7. Dessutom observerades två pronuclei under en differential interferens kontrast mikroskop, som liknade pronuclear scenen av zygotes efter normala befruktning med spermier.
För att påvisa utvecklingskompetens odlades halvklotade embryon till blastocyststadiet (figur 5A). Dessutom erhölls en hel terminsmus efter överföring av halvklonerade 2-cellsembryon till äggledare hos en mottagande hona (figur 5B). Som förväntat var musen som härrörde från ett halvklonerat embryo en hona eftersom varken äggceller eller oocyt-härledda phaESCs bär en Y-kromosom. Den halvklonerade musen var alltför normal och producerade friska avkommor när de parades med en vildtyp schweizisk Webster-hane. Hittills har den halvklonerade musen levt i över 600 dagar utan några uppenbara hälsoproblem.
Figur 1: Översikt över tillämpningen av DKO-phaESCs som spermieersättning. A)En tidsram för protokollets förfaranden. (B) Systemet visar stegen för att upprätta DKO-phaESC-linjer (steg 1–6). C)Systemet visar stegen för att konstruera halvklonerade embryon genom intracytoplasmisk injektion av en DKO-phaESC till en MII-oocyt (steg 7–14). Förkortningar: DKO = dubbel knockout; phaESC = delhogenetisk haploid embryonal stamcell; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; MEF = mus embryonal fibroblast. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Fastställande av DKO-phaESC-linjer genom CRISPR/Cas9-medierade borttagningar av H19- och IG-DMR. ( A) Flöde cytometri analys av phaESCs efter transfection med piggyBac plasmider för stabila EGFP uttryck och med 4 CRISPR/Cas9 plasmider. Icke-transfecterade phaESCs visas som kontroll. DNA-profilen (överst) visar cellcykelfördelningen av haploid- och diploidceller. G1/S-fas haploidceller som uttrycker EGFP indikeras av den gröna porten (botten, höger). B)Genotypning av phaESC-underkloner som odlades på MEF (första genotypningen) och efter avlägsnande av mef-fonder (andra genotypningen). Subklonerade phaESC-linjer 1, 2, 3 och 4 representerar wildtype-celler, celler med en H19-DMR-borttagning, med en IG-DMR-radering och med kombinerade H19- respektive IG-DMR-borttagningar. DKO-phaESC linjer 5-8 har både H19-DMR och IG-DMR borttagningar och är fria från wildtype alleler. Förkortningar: DKO = dubbel knockout; phaESC = delhogenetisk haploid embryonal stamcell; DMR = differentiellt metylerad region; MEF = mus embryonal fibroblast; EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; WT = vildtyp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Injektion av mitotiskt arresterade DKO- phaESCs i MII-äggceller. a)Morfologi av en DKO-phaESC-kultur som bär en CAG-EGFP-transgen och borttagningar av H19- och IG-DMR. skala bommar för = 50 μm. (B) Representativ flöde cytometry analys av DKO-phaESCs efter gripande med demecolcine för 8 h. DKO-phaESCs utan demecolcine behandling visas som kontroll. C)Morfologi av DKO-phaESCs i mikroinjektionspipetten. En enda intakt DKO-phaESC före (vänster) och efter (höger) spräckning av plasmamembranet genom pipetting visas; skala bar = 20 μm. (D) Konstruerade embryon vid 1 h efter injektion av DKO-phaESCs i MII oocyter. En sammanslagen bild av EGFP fluorescens och ljust fält visas. Svarta pilspetsar indikerar runda fläckar av intensivt EGFP-uttryck efter injektion av intakta DKO-phaESCs, vilket bör undvikas. skalstång = 50 μm. (E) En differential interferenskontrastbild av halvklonerade embryon 6 h efter aktivering med strontiumklorid visas. Vita pilspetsar indikerar embryon med 3 polära kroppar, inklusive en pseudopolär kropp från den injicerade DKO-phaESC. skalstång = 50 μm. Förkortningar: DKO = dubbel knockout; phaESC = delhogenetisk haploid embryonal stamcell; EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Inställningsschema för intracytoplasmisk injektion av DKO- phaESCs i äggceller. a)Arrangemanget av en injektionspipett, en hållrörett och en äggcell i injektionskammaren visas. α, böj vinkeln på mikroinjektionspipeetten. B)Uppställning av dropparna i mikromanipulationsskålen för intracytoplasmisk injektion. Förkortningar: DKO = dubbel knockout; phaESC = delhogenetisk haploid embryonal stamcell. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Utveckling av halvklonerade embryon. A)Utveckling före implantation av halvklonerade embryon in vitro. EGFP uttryck observeras ursprungligen i fyra-cells embryon dag 2 efter intracytoplasmic injektion. Vid dag 4 kan intensiva EGFP-uttryck observeras i blastocyster; skalstång = 100 μm. (B) En halvklonerad mus som erhållits efter 2-cells embryoöverföring till en mottagande hona. Vid 74 dpp levererade den halvklonerade musen (pilspetsen) sina första valpar (asterisk) genom naturlig födsel efter parning med en vildtyp schweizisk Webster-hane. Halvklonerade embryon och den halvklonerade musen som visas i denna siffra är identiska med de som rapporteras i Aizawa et al.3. Förkortningar: EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; .dpp, dagar efter partum. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Gelatinlösning | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| Vatten | - | 500 ml | - |
| Gelatin | - | 1 g | 0.2% |
| Haploid embryonal stamcell (HaESC) medium | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| NDiff 227 | - | 10 ml | - |
| CHIR 99021 | 10 mM | 3 μL | 3 μM |
| PD 0325901 | 10 mM | 1 μL | 1 μM |
| Lif | 1 x 106 IE/ml | 10 μL | 1 000 IE/ml |
| Penicillin-Streptomycin | 100x | 100 μL | 1x |
| HaESC underhållsbuffert | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| HaESC-medium | - | 1 ml | - |
| HEPES-lösning | 2 . | 20 μL | 20 mM |
| Tvätta buffert | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| DMEM / F-12 | - | 100 ml | - |
| BSA-fraktion | 7.5% | 7,1 ml | 0.5% |
| MEF-medium | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| DMEM (dmem) | - | 500 ml | - |
| Fbs | - | 56 ml | 10% |
| β-Mercaptoethanol | 14.3 mol/L | 3,9 μL | 100 μM |
| Penicillin-Streptomycin | 100x | 5,6 ml | 1x |
| Lysis buffert | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| Vatten | - | 8,25 ml | - |
| Tris-HCl (pH 8.5) | 2 . | 1 ml | 100 mM |
| Edta | 0,5 M | 100 μL | 5 mM |
| SDS-lösning | 10% | 200 μL | 0.2% |
| Nacl | 5 M | 400 μL | 200 mM |
| Proteinas K | 20 mg/ml | 50 μL | 100 μg/ml |
| Aktiveringsmedium | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| KSOM (KSOM) | - | 1 ml | - |
| Strontiumklorid | 2 . | 5 μL | 5 mM |
| EGTA (egta) | 0,5 M, pH 8,0 | 4 μL | 2 mM |
| PVP-lösning | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| M2 medium | - | 5 ml | - |
| Pvp | - | 0,6 g | 12% |
| PMSG-lösning | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| Pbs | - | 450 μL | - |
| PMSG (pmsg) | 500 IE/ml | 50 μL | 50 IE/ml |
| hCG-lösning | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| Pbs | - | 450 μL | - |
| Hcg | 500 IE/ml | 50 μL | 50 IE/ml |
| Hyaluronidase medium | |||
| Komponent | Lagerkoncentration | Volym/vikt | Slutlig koncentration |
| M2 medium | - | 380 μL | - |
| Hyaluronidase | 10 mg/ml | 20 μL | 0,5 mg/ml |
| Förkortningar: LIF = leukemihämmande faktor; MEF = mus embryonal fibroblast; | |||
| FBS = fetala nötkreatur serum; DMEM = Dulbeccos modifierade örnmedium; BSA = bovint serumalbumin; | |||
| EDTA = etylendiaminetetraacetsyra; SDS = natriumdcylsulfat; EGTA = etylen-bis(oxyetylennitrilo)tetraättiksyra; | |||
| PBS = fosfatbuffrad saltlösning. PVP = polyvinylpyrrolidon; hCG = humant chorionic gonadotropin; | |||
| PMSG = gravid mare serum gonadotropin. | |||
Tabell 1: Recept på medium, buffert och lösning.
| Namn | Sekvens (5'till 3') | Program | |
| H19-DMR-P1 | GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG | Genotypning | |
| H19-DMR-P2 | AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC | Genotypning | |
| H19-DMR-P3 | TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT | Genotypning | |
| IG-DMR-P1 | TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG | Genotypning | |
| IG-DMR-P2 | CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA | Genotypning | |
| IG-DMR-P3 | ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG | Genotypning | |
| H19-DMR-gRNA1-F | CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA1-R | AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA2-F | CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA2-R | AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA1-F | CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA1-R | AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA2-F | CAC CCT GCT-TAGG AGG TAC TAC GCT | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA2-R | AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG | gRNA | |
Tabell 2: Förteckning över oligonukleotider.
Discussion
Kloning av däggdjur genom somatisk cell nukleär överföring (SCNT) har varit banbrytande på 1990-talet19,20,21. Denna utveckling följde kloning studier som genomförts 30 år tidigare i amfibier22. Den avsevärda förseningen återspeglar svårigheten med embryologi och genomisk prägling hos däggdjur. Utvecklingen av däggdjur SCNT är grunden för tillämpningen av haESC för att ersätta spermier, vilket beskrivs i detta protokoll.
Cellcykelsynkronisering är en viktig faktor för framgången för SCNT23. Detta är också fallet för injektion av haESC i detta protokoll. Att införa ett donatorgenom i en mottagare kräver att cellcykelfaserna matchas för att undvika kromosombrott eller aneuploidier som skulle upphäva embryoutvecklingen. Halvkloning har den extra komplexiteten att två genom och en cytoplast måste vara kompatibla. En tidigare rapport har visat att injektion av M-fas-arresterade androgenetiska haESCs gav bättre utvecklingshastigheter av halvklonerade embryon än injektion av G1-fas haESCs i oocyter7. Detta betänkande föreslår M-fas som en lämplig synkronisering punkt för halvkloning. Följaktligen arresterades phaESCs mitotically i metafas med demecolcine och injiceras i ooplasm av MII äggceller, som arresterades naturligt i metafas II av meios. Viktigt är att M-fas arrestering kan uppnås i mus EIC med hög effektivitet, vilket ger utmärkt synkronisering mellan givare och mottagare cellcykler.
Under mitos bryts kärnmembranet ner och en spindel bildas som de replikerade kromosomerna fäster vid. Efter injektion av M-fas DKO-phaESCs, syster chromatids separeras i en pseudo polar kropp och zygote7 (Figur 3E). Följaktligen bidrar en enda uppsättning kromosomer från en DKO-phaESC till det halvklonerade embryot. Det är viktigt att systerkromatider av DKO-phaESC-kromosomer kan separeras korrekt efter injektionen. Plasma membranet i en intakt DKO-phaESC förhindrar segregering i en pseudo polar kropp. Vi observerade verkligen sällsynta fall där plasmamembranet av DKO-phaESCs inte spruckit, och embryon uppvisade intaktA DKO-phaESCs i ooplasm efter injektion (Figur 3D). Därför måste man vara noga med att ta bort plasmamembranet i DKO-phaESCs genom pipetting. Under injektionen är det lika viktigt att undvika störningar i oocytens meiotiska spindel, vilket kan leda till kromosomsegregeringsdefekter och inducera aneuploidi också.
Hos däggdjur begränsar genomisk prägling tillämpningen av phaESCs som spermieersättning. Parthenogenetic haESCs har en moderns konfiguration av genomiska avtryck, medan spermier har en faderlig konfiguration. Därför har generering av heltidsvalpar inte inträffat efter injektionen av wildtype phaESCs som spermieersättning. För att övervinna denna begränsning är borttagningar av IG- och H19-DMR konstruerade i phaESCs. Modifiering av präglade uttryck vid moderns Igf2-H19 och Gtl2-Dlk1 lokus är tillräckligt för att ändra konfigurationen av genomiska avtryck för att tillåta generering av halvklonerade möss med en frekvens av över 5,1%, baserat på överförda 2-cells embryon. Dessa observationer tyder på att inriktning på två präglade gener växlar genomet av phaESCs till en funktionell faderlig konfiguration som kan ersätta spermier hos möss. Det krävs dock en permanent genetisk modifiering av phaESCs för denna strategi. Som en alternativ strategi kan androgenetisk haESC övervägas. Androgenetiska haESCs härleds från spermiegenomet och har faderliga avtryck. Det har förekommit rapporter om att vildtyp androgenetiska haESCs bidragit som spermieersättning för att generera full-term valpar med en frekvens mellan 1,3% och 1,9% av överförda embryon4,7,24. Full-term valpar har också erhållits genom att injicera androgenetiska haESCs med borttagningar av IG- och H19-DMRs med en frekvens av 20,2% av överförda 2-cells embryon24. Den ökade effektiviteten av halvkloning med modifierade androgenetiska haESCs är sannolikt eftersom avtryck kan bli instabila i kulturen. Prägling defekter korrigeras av genetiska borttagningar av kritiska DMR.
Med tanke på svårigheten att införa genetiska modifieringar direkt i oocyt- eller spermiegenomen är haESCs ett värdefullt verktyg för att manipulera föräldragenomen separat. Att använda haESCs som ersättning för spermier ger en anmärkningsvärd fördel för genomredigering i musen. En ny studie har kombinerat CRISPR/Cas9-baserad genomredigering med tillämpning av haESCs för karakterisering av präglande regioner som är kritiska för embryonal utveckling12. Denna studie analyserade rasgrf1-DMR:s roll i kombination med H19-och IG-DMR i utvecklingen av bimaternal möss och funktionen hos 7 olika DMR i utvecklingen av bipaternal möss. Metoden för att ersätta haESCs för spermier utgjorde grunden för genetiska screeningmetoder för att identifiera viktiga aminosyror inom DND1-proteinet i primordial bakteriecellutveckling och för att identifiera gener i benutveckling24,25,26. Studier om genomisk prägling och genetisk screening för att identifiera nyckelfaktorer i embryonal utveckling är betydande metoder för tillämpning av haESCs som gametic genom.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Giulio Di Minin för härledning av phaESC linjer och Dr. Remo Freimann för flöde cytometri operation. Vi erkänner också Ms. Michèle Schaffner och Thomas M. Hennek för teknisk support med embryoöverföring. Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (grant 31003A_152814/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mLTube | Eppendorf | 0030 125.150 | haESC culture |
| 15 ml Tube | Greiner Bio-One | 188271 | haESC culture |
| 12-well plate | Thermo Scientific | 150628 | haESC culture |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | haESC culture |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | haESC culture |
| 96-well plate | Thermo Scientific | 167008 | haESC culture |
| β-Mercaptoethanol | Merck | M6250 | haESC culture |
| BSA fraction | Gibco | 15260-037 | haESC culture |
| CHIR 99021 | Axon | 1386 | haESC culture |
| Demecolcine solution | Merck | D1925 | haESC culture |
| DMEM | Gibco | 41965-039 | haESC culture |
| DMEM / F-12 | Gibco | 11320-033 | haESC culture |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | haESC culture |
| EDTA | Merck | E5134 | haESC culture |
| FBS | biowest | S1810-500 | haESC culture |
| Freezing medium | amsbio | 11897 | haESC culture |
| Gelatin | Merck | G1890 | haESC culture |
| Hepes solution | Gibco | 15630-056 | haESC culture |
| Irradiated MEF | Gibco | A34966 | haESC culture |
| LIF (Leukemia inhibitory factor) | (Homemade) | - | haESC culture |
| Lipofection reagent | Invitrogen | 11668019 | haESC culture |
| NDiff 227 | Takara | Y40002 | haESC culture |
| PD 0325901 | Axon | 1408 | haESC culture |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | haESC culture |
| piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene | Addgene | #40973 | haESC culture |
| piggyBac transposase plasmid | System Biosciences | PB210PA-1 | haESC culture |
| pX330 plasmid | Addgene | #42230 | haESC culture |
| pX458 plasmid | Addgene | #48138 | haESC culture |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | haESC culture |
| DNA polymerase | Thermo Scientific | F549S | Genotyping |
| dNTP Mix | Thermo Scientific | R0192 | Genotyping |
| Ethanol | Merck | 100983 | Genotyping |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | Genotyping |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Genotyping |
| Proteinase K | Axon | A3830 | Genotyping |
| SDS | Merck | 71729 | Genotyping |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Genotyping |
| ThermoMixer | Epeendorf | 5384000012 | Genotyping |
| Tris | Merck | T1503 | Genotyping |
| 5 mL Tube | Falcon | 352063 | Flow cytometry |
| 5 mL Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Flow cytometry |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Flow cytometry |
| MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | Flow cytometry |
| 1 mL syringe | Codan | 62.1640 | Superovulation |
| 30-gauge 1/2 inch needle | Merck | Z192362-100EA | Superovulation |
| B6D2F1 mouse | The Jackson Laboratory | 100006 | Superovulation |
| hCG | MSD animal health | 49451 | Superovulation |
| PBS | Gibco | 10010015 | Superovulation |
| PMSG | Avivasysbio | OPPA1037 5000 IU | Superovulation |
| 10-cm dish | Thermo Scientific | 150350 | Embryo manipulation |
| 4-well plate | Thermo Scientific | 179830 | Embryo manipulation |
| 50 mL tube | Greiner Bio-One | 227261 | Embryo manipulation |
| 6 cm dish | Thermo Scientific | 150288 | Embryo manipulation |
| Center-well dish | Corning | 3260 | Embryo manipulation |
| Digital rocker | Thermo Scientific | 88880020 | Embryo manipulation |
| EGTA | AppliChem | A0878 | Embryo manipulation |
| Hyaluronidase | Merck | H4272 | Embryo manipulation |
| KSOM | Merck | MR-020P-5F | Embryo manipulation |
| M16 medium | Merck | M7292 | Embryo manipulation |
| M2 medium | Merck | M7167 | Embryo manipulation |
| Mineral oil | Merck | M8410 | Embryo manipulation |
| Glass capillary | Merck | P1049-1PAK | Embryo manipulation |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | Embryo manipulation |
| Strontium chloride | Merck | 13909 | Embryo manipulation |
| 5ml syringe | Codan | 62.5607 | Microinjection |
| Borosilicate glass cappilary | Science product | GB100T-8P | Microinjection |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Microinjection |
| Fluorinert FC-770 | Merck | F3556 | Microinjection |
| Holding pipette | BioMedical Instruments | - | Microinjection |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | Microinjection |
| Microforge | Narishige | MF-900 | Microinjection |
| Microinjection pipette | BioMedical Instruments | - | Microinjection |
| Microlaoder tips | Eppendorf | 5252 956.003 | Microinjection |
| Micromanipulaor arms | Narishige | NT-88-V3 | Microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | Microinjection |
| PiezoXpert | Eppendorf | 5194000016 | Microinjection |
| PVP (Polyvinylpyrrolidine) | Merck | PVP360 | Microinjection |
| Syringe filter | SARSTEDT | 83.1826.001 | Microinjection |
References
- Ellegren, H., Galtier, N.
- Huijbers, I. J. Generating genetically modified mice: A decision guide. Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).
- Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells. PloS One. 15 (9), 0233072 (2020).
- Li, W., et al. Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice. Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).
- Li, Z., et al. Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells. Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).
- Wan, H., et al. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice. Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).
- Yang, H., et al. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell. 149 (3), 605-617 (2012).
- Zhong, C., et al. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection. Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).
- Elling, U., et al. Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).
- Leeb, M., Wutz, A. Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos. Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).
- Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).
- Li, Z. K., et al. Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions. Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).
- Elling, U., et al. Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells. Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Shuai, L., et al. Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection. Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
- O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones. Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).
- Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).
- Gurdon, J. B. Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells. Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).
- Campbell, K. H., Alberio, R. Reprogramming the genome: role of the cell cycle. Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).
- Zhong, C., et al. CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library. Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).
- Bai, M., et al. Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development. PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).
- Li, Q., et al. CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development. Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).
