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Bioengineering

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62003
Automatic Translation
1, 1, 1, 4, 1, 1, 1, 3, 1,2
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

Abstract

신생 혈관화는 일반적으로 초기 단계에서 내피 세포 (EC)의 기존 정상 혈관 및 생체 역학 미세 환경에서 초기화되어 신생아 혈관화의 다음 과정으로부터 크게 다릅니다. 신생 혈관화의 다른 단계를 시뮬레이션하는 모델이 많이 있지만, 정상적인 혈관 미세 환경의 해당 자극하에서 신생 혈관화의 초기 과정을 항복하는 시험관 내 3D 모델은 여전히 부족합니다. 여기서 는 신생 혈관화(MIEN)의 초기 이벤트를 모방한 체외 3D 모델을 재구성했습니다. MIEN 모델에는 미세 유체 발아 칩과 자동 제어, 고효율 순환 시스템이 포함되어 있습니다. 내피로 코팅된 기능적이고 난설성이 있는 마이크로채널이 형성되었고, 발아 공정은 미세유체 발아 칩에서 시뮬레이션되었다. 초기 생리학적 미세환경은 미세유체 조절 시스템으로 회수되었으며, 이 시스템은 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 경전혈, 다양한 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 분포에 동시에 노출될 것이다. MIEN 모델은 신생아 혈관화 메커니즘의 연구에 쉽게 적용 될 수 있으며 약물 선별 및 독성 응용 프로그램을위한 저렴한 플랫폼으로 잠재적 인 약속을 보유합니다.

Introduction

신생 혈관 화는성인,혈관 신생 및 동맥 발생5에서두 가지 주요 과정을 포함하는 많은 정상 및 병리학 적 과정1,2,3,4에서발생합니다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)6,기계적 자극, 특히 혈류 유도 전단 응력과 같은 가장 잘 알려진 성장 인자 외에, 신생혈관화7의 조절에 중요하다. 우리가 알다시피, 전단 응력의 크기와 형태는 혈관 세포의 다른 부분에서 극적으로 그리고 동적으로 변화하여 혈관 세포8,9,10,11,12에중요한 영향을 미칩니다. 이전 연구는 전단 스트레스가 세포 표현성 변화, 신호 변환, 유전자 발현 및 벽화 세포와의통신(13,14,16, 17,17,18,19,20)을포함한 EC의 다양한 측면에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 따라서, 신생 혈관화를 조절21,22,23,24.

따라서, 신생 혈관화를 더 잘 이해하기 위해, 시험관 내의자연 세포 미세 환경에서 공정을 재구성하는 것이 중요하다. 최근에는 마이크로선박을 만들고 미세한 조형 및 미세유체 기술의 발전을 활용하여마이크로환경 25,26,27을정밀하게 제어하기 위해 많은 모델이 설립되었습니다. 이들 모델에서, 마이크로용기는하이드로겔(28,29),폴리디메틸실록산(PDMS) 미세유체칩30,31, 32또는3D 바이오프린팅33,34에의해 생성될 수 있다. 발광 전단 응력(22,23,35,36,경전 유동37,38,39,40,혈관신생 인자41,42,균주/스트레치43,44, 45)및 다른 유형의세포32,46k와공동 배양등의 미세 환경의 일부 측면이 대조되었다. 일반적으로 대형 저수지 또는 주사기 펌프를 사용하여 퍼퓨즈 배지를 제공하였다. 이들 모델의 환원유량은 저수지와마이크로튜브(22,23,38,40)사이의 압력 강하에 의해 만들어졌다. 그러나 기계적 미세 환경은 이러한 방식으로 지속적으로 유지하기 어려웠습니다. 전단 응력이 높은 높은 유속이 관류에 사용되는 경우 Transendothelial 흐름이 증가하고 생리 수준을 초과할 것입니다. 이전 연구는 신생아 혈관화의 초기 기간에, 경피성 흐름의 속도는 일반적으로 0.05 μm/ s8이하의 그대로 있는 IC 및 지하 막 때문에 아주 낮다는 것을 보여주었습니다. 한편, 혈관 계통의 발광 전단 응력은 크게 다르지만 평균 값인 5-20 dyn/cm2,11,47로비교적 높다. 현재, 전작의 경피흐름의 속도는 일반적으로 0.5-15 μm/s22,38,39,40사이로 유지되었으며, 발광 전단 응력은 보통 10dyn/cm222미만이었다. 높은 발광 전단 스트레스와 생리학적 수준의 경내 흐름을 동시에 지속적으로 노출시키기가 어려운 대상으로 남아 있습니다. 

본 연구에서는, 우리는 신생 혈관화 (MIEN)의 초기 사건을 모방하는 시험관 내 3D 모델을 설명합니다. 우리는 관류 마이크로 튜브를 형성하고48발아과정을 시뮬레이션하기 위해 미세 유체 칩과 자동 제어, 고효율 순환 시스템을 개발했습니다. MIEN 모델을 사용하면 신생 혈관화의 초기 기간에 자극된 EC의 미세 환경이 먼저 다시 회수됩니다. EC는 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 수준의 경위 흐름 및 다양한 VEGF 분포에 의해 동시에 자극될 수 있다. 우리는 MIEN 모델을 구체적으로 설정하는 단계와 다른 연구자에게 참조를 제공하기를 희망하여 주의를 기울여야 할 핵심 사항을 설명합니다.

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Protocol

1. 웨이퍼 준비

참고: 이 프로토콜은 이 연구 중에 사용되는 SU-8 2075 네거티브 포토레지스트에 특이적입니다.

  1. 다음과 같이 스핀 코터에 메탄올과 이소프로파놀로 실리콘 웨이퍼를 3~5회 청소합니다: 첫 번째 스핀은 500rpm에서 15s, 그리고 3,000rpm에서 60s로 회전합니다.
  2. 실리콘 웨이퍼를 180°C로 예열된 핫플레이트로 옮기고 웨이퍼를 10분 동안 굽습니다.
  3. 핫플레이트에서 실리콘 웨이퍼를 제거하고 실온으로 식힙니다. 스핀 코팅을 진행하기 전에 압축 공기로 웨이퍼를 다시 청소하십시오. 웨이퍼의 중앙에 SU-8 2075 포토레지스트의 4mL를 적용합니다.
  4. 스핀 코터에서 70 μm의 피처 높이를 다음과 같이 얻습니다 : 500 rpm에서 12 s에 대한 첫 번째 스핀, 그리고 2,100 rpm에서 50 s로 회전하십시오.
  5. 다음과 같이 핫플레이트에 웨이퍼를 부드럽게 구우세요: 먼저 65°C에서 8분간 구운 다음 95°C에서 20분간 구워줍니다. 다음으로, 핫플레이트에서 실리콘 웨이퍼를 제거하고 리소그래피 전에 실온으로 냉각시하십시오.
  6. 포토레지스트 필름에 포토마스크를 놓습니다. 200 mJ /cm2의 총 노출을 달성하기 위해 리소그래피 장비와 웨이퍼를 노출.
    참고: 포토마스크에는 칩 패턴9세트가 포함되어 있어 매번 9개의 미세유체 발아 칩을 제작할 수 있습니다.
  7. 포스트는 다음과 같이 핫플레이트에 웨이퍼를 노출 : 먼저 65 °C에서 5 분 동안 구운 다음 95 ° C에서 20 분 동안 구워줍니다. 다음으로, 핫플레이트에서 실리콘 웨이퍼를 제거하고 개발하기 전에 실온으로 냉각합니다.
  8. 웨이퍼를 SU-8 개발자(PGMEA)로 채워진 유리 페트리 접시로 옮겨 개발을 시작합니다.
    주의: 개발자는 눈과 호흡기에 자극적입니다. 연기 후드에서 개발을 수행합니다. 작업 중에 스플래시 고글, 니트릴 장갑 및 항공사 마스크를 착용하십시오.
  9. 흐름 채널의 방향을 따라 부드럽게 접시를 흔들고 10 분 후 개발자를 변경합니다.
  10. 패턴을 명확하게 관찰 할 때까지 단계를 1.9 3-5 번 반복하십시오.
    참고: 웨이퍼에 포토저항 잔류물이 남아 있지 않은지 확인하고 개발자의 웨이퍼를 다시 헹구십시오.
  11. 웨이퍼를 예열된 핫플레이트로 120°C로 옮기고 30분 동안 굽습니다.
  12. 피펫 35 μL의 시레인은 커버슬립에, 다음 건조기에 웨이퍼와 함께 커버 슬립을 넣어 진공을 당깁니다. 건조기를 밀봉하고 웨이퍼를 진공 상태로 4시간 동안 방치하여 연약한 리소그래피 공정 중에 PDMS의 접착을 방지합니다.
    주의: 사일레인은 독성이 있습니다. 중독을 방지하기 위해 연기 후드에서 사일란화를 수행하고 취급하는 동안 니트릴 장갑을 착용하십시오.
  13. 건조기에서 진공을 놓습니다. 예열된 핫플레이트에 사일란화 웨이퍼를 제거하고 65°C에서 2시간 동안 굽습니다.
  14. 필요한 때까지 깨끗한 페트리 접시에 웨이퍼를 보관하십시오.

2. 미세 유체 발아 칩 제작

  1. 기본 제20 g의 베이스 에이전트와 2 g의 경화제 (10:1 비율)를 플라스틱 비커에 섞어 혼합 막대와 철저히 섞습니다.
  2. 비커를 건조기에 넣고 1h의 진공을 당겨 PDMS 혼합물의 기포를 제거합니다.
  3. 페트리 접시의 웨이퍼에 PDMS 혼합물을 붓고 페트리 접시를 다시 건조기에 넣고 30분 동안 탈가스를 뿌린다.
    참고: 양면 접착 테이프를 사용하여 웨이퍼를 페트리 접시 바닥에 붙여 서 웨이퍼가 탈유 및 경화 중에 수평으로 유지되도록 하는 것이 좋습니다.
  4. 건조기에서 페트리 접시를 제거하고 3 시간 동안 80 °C 건조 오븐에 배치하여 치료하십시오.
  5. PDMS 층을 웨이퍼에서 조심스럽게 분리하고 패턴에 따라 메스로 레이어를 9 개의 칩으로 자른다.
    참고: 분리 후 피쳐 측면을 위로 유지합니다.
  6. 각각 1mm와 3.5mm 생검 펀치를 사용하여 각 칩에서 2개의 하이드로겔 사출 포트와 4개의 미디어 사출 포트를 펀치합니다.
  7. PDMS 잔류물을 제거하기 위해 잔류 테이프로 펀치 칩을 청소하십시오. 칩과 9개의 유리 커버립을 플라즈마 클리너에 넣고 30s용 산소 플라즈마로 처리하여 표면에 공유 결합을 형성합니다.
  8. 칩과 커버립을 꺼내. 칩의 피쳐 측면을 커버립에 부착합니다.
  9. 부착된 칩을 80°C 드라이 오븐에 넣고 1h의 접합을 강화합니다.
  10. 사용하기 전에 칩을 자동 복제하고 나머지 시술동안 멸균상태로 유지합니다.

3. 표면 개조 및 하이드로겔 주입

  1. 각 칩에 대해, 파이펫 40 μL 1 mg/mL 폴리-D-리신 (PDL)하 고 하이드로겔 주입 포트에서 칩의 채널에 주입.
    참고: 특히 포트 근처의 좁은 채널에서 PDL이 채널을 채웁니다.
  2. 칩을 37°C에서 4h로 배양하여 PDMS의 표면을 수정한다.
  3. 멸균물의 파이프 200 μL을 하이드로겔 사출 포트의 칩에 있는 채널에 주입하여 PDL을 씻어내도록 한다.
  4. 칩을 120°C 드라이 오븐에 3시간 동안 제거하여 소수성을 회복합니다.
  5. 얼음에 멸균 튜브를 놓고 다음 방정식으로 사용할 타입 I 콜라겐의 부피를 계산합니다.
    최종 부피 (50 μL) x 최종 콜라겐 농도 (본 연구에서 3 mg / mL) / 병의 농도 = 부피 콜라겐을 첨가할
  6. 다음 방정식으로 사용할 NaOH의 볼륨을 계산합니다.
    (부피 콜라겐을 첨가할) x 0.023 = 부피 1 N NaOH
  7. 다음 프로토콜로 튜브에 하이드로겔 50 μL을 준비: 10x PBS의 5 μL, 페놀 레드의 0.5 μL, 1 N NaOH의 계산된 부피, 1 mg/mL Fibronectin의 4 μL, 차례로 타입 I 콜라겐의 계산된 부피를 추가합니다. 총 부피가 50 μL에 도달할 수 있도록 적절한 양의 dH2O를 추가합니다.
    참고: 얼음에서 모든 작업을 수행합니다. 페놀 레드를 산성 지표로 사용하여 하이드로겔의 pH의 시각적 측정을 돕습니다. 최종 하이드로겔은 pH가 약 7.4이고 강성은 약 15 kPa 49일 때 주황색으로끝납니다.
  8. 각 칩에 대한 하이드로겔의 파이프 2-3 μL을 천천히 하이드로겔 주입 포트에서 중앙 하이드로겔 채널에 주입한다.
  9. 젤레이션을 허용하기 위해 37°C에서 30분 동안 칩을 배양합니다.
    참고: 칩을 즉시 사용하지 않을 경우 멸균 수 1mL로 밀봉된 상자에 밀봉된 상자에 밀봉하십시오. 밀봉 된 칩은 37 °C에서 24 시간동안 보관 할 수 있습니다.

4. 셀 시드

  1. 125 μg/mL Fibronectin의 파이프 20 μl을 세포 배양 채널의 하나의 배지 주입 포트로 한다.
  2. 파이펫 팁을 잘라 세포 배양 채널의 포트에 가위를 넣습니다.
  3. 피펫 팁을 세포 배양 채널의 다른 배지 주입 포트에 삽입합니다. 그런 다음, 세포 배양 채널에서 공기를 피우어 섬유네틴으로 채웁니다.
  4. 칩을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  5. 세포 파종 전에, 각 미디어 주입 포트에 ECM 미디어의 파이프 20 μL을 30 분 동안 37 °C에서 칩을 배양.
  6. 그런 다음 모든 미디어 사출 포트의 모든 미디어를 피펫합니다.
  7. 다음으로, 세포 배양 채널의 하나의 배지 주입 포트로 세포 현탁액의 파이펫 5 μL. 그런 다음 내피 세포는 차동 유수압하에서 전체 채널에 빠르게 확산됩니다.
    참고: 배양 플라스크에서 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC)를 시도하고 400 x g에서원심분리하여 세포 현탁액을 준비한다. 그런 다음, 튜브에서 세포를 107 세포/mL로 재보선한다.
  8. 다른 포트에 ECM 매체의 약 4-6 μL을 추가하여 정압 압력을 조정하고 셀 이동을 중지합니다.
  9. 셀 인큐베이터에 칩을 제거합니다. 이어서, 내피 세포가 세포 배양 채널 2h 의 내부 표면 주위에 코팅될 때까지 30분마다 칩을 뒤집는다(도1).
    참고 : 칩을 거꾸로 만들려면 커버 슬립 의 뒷면에 약간의 물을 파이프. 그런 다음 칩이 페트리 접시의 표지에 부착 할 수 있습니다.
  10. 파이펫 팁을 사용하여 사출 포트에 부착된 셀을 매우 신중하게 제거합니다.
  11. 그런 다음 4개의 가시 암컷 루어 어댑터를 미디어 사출 포트에 삽입하고 ECM 매체로 채웁니다.
    참고: 어댑터는 유체 저장소로 작동하여 채널의 세포에 영양분을 제공할 수 있습니다.
  12. 칩을 분리하여 인큐베이터를 셀수 있습니다. Luer 어댑터에서 ECM 미디어를 12시간마다 변경합니다.

5. FITC-dextran 확산 투과성 측정

참고: 마이크로 용기의 장벽 기능을 평가하기 위해 세포 안대기 유무에 관계없이 EC 배양 채널의 확산 투과성을 평가한다.

  1. 하이드로겔을 주입한 미세유체 발아 칩을 꺼내라.
  2. 4.1-4.6 단계를 반복합니다.
  3. 모든 Luer 어댑터를 제거하고 4개의 미디어 사출 포트에서 모든 미디어를 피펫합니다.
  4. 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 칩을 놓습니다.
  5. 500 μg/mL 40 kDa FITC-dextran을 포함하는 배양 매체의 파이프 5 μL은 세포 배양 채널의 한 포트에.
    참고: 40 kDa FITC-dextranVEGF-165 (39-45 kDa)와 유사한 분자 크기를 가지고 있습니다.
  6. 3s마다 30s의 이미지를 캡처합니다. 따라서, 세포 안대기 없이 확산 투과성을 측정한다.
  7. HUVECs가 세포 배양 채널에 수렴된 후에 미세유체 발아 칩을 꺼내십시오.
  8. 5.3-5.5 단계를 반복합니다.
  9. 3s마다 30s의 이미지를 캡처합니다. 따라서, 세포 안대기를 가진 확산 투과성을 측정한다.
  10. 다음 수정된방정식(50)을사용하여 시간이 지남에 따라 형광 강도의 변화를 정량화하여 확산 투과성을 계산한다.
    PD= (I2- I1)/ ((I1- Ib)· Δt) · S/d
    여기서, Pd는 확산 투과성 계수이고, I1은 초기 시점에서 평균 강도이고, I2는 델타 시간(Δt) 이후평균 강도이며, 나는 b는 배경 강도이고, S는 형광 이미지에서 채널의 영역이며, D는 형광 이미지에서 마이크로포스트의 총 간격이다. 본 작품에서 Δt는 9s로 설정됩니다.
    참고: 본 방정식은 원래50과약간 다르며, 칩내형광의 확산 방향으로 인해 EC 채널에서 하이드로겔 채널로만, 이는 모든 방사형 방향으로 확산되는 원형 튜브와 는 다릅니다.

6. 미세 유체 제어 시스템 설정

참고: 본 연구의 미세 유체 제어 시스템은 마이크로 주사기 펌프, 전자기 핀치 밸브, 버블 트랩 칩, 미세 유체 칩, 미세 연동 펌프 및 저수지로 구성됩니다. 시스템의 각 부분은 동일한 기능을 수행할 수 있는 대안으로 대체될 수 있습니다.

  1. 버블 트랩 칩 제작
    참고: 버블 트랩 칩은 순환시 기포를 제거하는 데 사용됩니다. 칩은 세 개의 PDMS 층으로 구성됩니다. 상단 층은 소프트 리소그래피를 사용하여 액체 챔버로서 그리드 구조를 형성합니다. 그리드 구조의 각 채널은 폭이 100 μm입니다. 아래쪽 레이어는 구멍이 있는 PDMS 청크입니다. 두 층 사이에 는 100 μm 의 얇은 PDMS 필름이 배치됩니다.
    1. 버블 트랩 칩용 웨이퍼를 준비하기 위해 1단계를 반복합니다.
    2. 2.1-2.5 단계를 반복하여 버블 트랩 칩의 상단 레이어와 하단 레이어를 조작합니다.
      참고: 맨 위 레이어의 포토마스크에는 세 가지 패턴 세트가 포함되어 있으므로 패턴에 따라 PDMS 레이어를 세 개의 칩으로 자른다.
    3. 3.5mm 생검 펀치를 사용하여 상단 층의 입구 와 콘센트 채널의 끝에 6 구멍을 펀치.
    4. 상단 층의 패턴에 따라 6mm 생검 펀치를 사용하여 바닥 층의 해당 위치에 두 개의 구멍을 펀치.
    5. 2.1-2.2 단계를 반복하여 PDMS 혼합물 10g을 준비하고 세척 된 실리콘 웨이퍼의 중앙에 붓습니다.
    6. 다음 스핀 프로토콜을 적용하여 100 μm PDMS 필름을 제작: 500 rpm에서 15s에 대한 스핀, 스핀 속도를 1,300 rpm으로 늘리고 45s를 위해 여기에 보관하십시오.
    7. 웨이퍼를 예열된 핫플레이트로 180°C로 옮기고 30분 동안 굽습니다.
    8. PDMS 잔류물을 제거하기 위해 잔류 테이프로 펀치 레이어를 청소합니다. 상단 층과 웨이퍼를 플라즈마 클리너에 넣고 표면에 공유 결합을 형성하기 위해 30 s용 산소 플라즈마로 처리합니다.
    9. 상단 레이어와 웨이퍼를 꺼내. 상단 레이어의 피쳐 면을 PDMS 필름에 부착합니다.
    10. 바늘로 상단 레이어의 가장자리를 따라 필름을 조심스럽게 잘라냅니다.
    11. 필름을 웨이퍼에서 천천히 분리하고 칩을 뒤집어 분리 후 필름 측면을 위로 만듭니다.
    12. 바닥 층과 부착 된 칩을 플라즈마 클리너에 넣고 산소 플라즈마로 다시 30 s로 처리하십시오.
    13. 하단 레이어와 연결된 칩을 꺼내십시오. 아래쪽 레이어를 PDMS 필름에 부착하고 버블 트랩 칩이 수행됩니다.
      참고: 아래쪽 레이어의 구멍을 부착할 때 맨 위 레이어의 패턴과 정렬합니다.
    14. 칩을 80°C 드라이 오븐에 넣고 1h의 접합을 강화합니다.
  2. 미세 유체 제어 시스템 조립
    참고: 버블 트랩 칩, 저수지, 튜브 및 커넥터와 같은 시스템의 모든 부분은 전자 장비를 제외한 자동 복제 살균 후 사용됩니다. 깨끗한 벤치에 미세 유체 제어 시스템을 조립합니다.
    1. 미세 유체 제어 시스템을 조립하려면 폴리테트라플루오로틸렌 튜브 2개, 짧은 실리콘 튜브 2개, 긴 실리콘 튜브 3개, 가시 암컷 루어 어댑터 1개, Y형 커넥터 1개, L형 커넥터 3개를 준비합니다.
      참고: 폴리테트라플루오로틸렌 튜브의 장점은 신축성이 낮기 때문에 파이프라인에 미디어가 덜 필요합니다. 반면 실리콘 튜브는 신축성이 높기 때문에 핀치 밸브및 연동 펌프에 적합합니다.
    2. 주사기를 예열된 (37°C) ECM 배지의 10mL로 채웁니다.
      참고: 예열은 중간 방출용해유동가스를 방출하는 데 도움이 됩니다.
    3. 철제 여성 루어 어댑터로 폴리테트라플루오로틸렌 튜브를 주사기에 연결합니다. 그런 다음 폴리테트라플루오로틸렌 튜브의 다른 끝을 Y 형 커넥터에 연결합니다.
    4. 다음으로, 두 개의 긴 실리콘 튜브를 Y형 커넥터의 다른 두 단에 연결하여 저수지에 연결되는 튜브와 다른 튜브를 버블 트랩 칩에 연결합니다.
    5. 또 다른 긴 실리콘 튜브를 저수지에 연결합니다.
    6. 다음으로, 두 개의 짧은 실리콘 튜브를 사용하여 버블 트랩 칩의 상단 층에 있는 모든 입구와 콘센트 구멍을 연결합니다. 폴리테트라플루오로틸렌 튜브를 칩의 백엔드에 연결합니다.
    7. 다음으로 주사기를 마이크로 주사기 펌프에 고정합니다.
    8. 전자기 핀치 밸브에 두 개의 긴 실리콘 튜브를 클립.
    9. 다음으로 전자기 핀치 밸브를 전환하여 주사기와 저수지 사이의 파이프라인을 엽니다. 마이크로 주사기 펌프를 사용하여 튜브의 공기를 배출하기 위해 용지를 저수지에 주입합니다.
    10. 그런 다음 밸브를 다시 전환하여 주사기와 버블 트랩 칩 사이의 파이프라인을 엽니다. 거품 트랩 칩의 액체 챔버와 백 엔드 튜브를 채우기 위해 미디어를 주입합니다.

7. 내피 발아 분석

참고: 위상 대비 현미경으로 조립된 스테이지 탑 인큐베이터는 본 연구에서 실시간으로 발아 과정을 관찰하는 데 사용된다. 스테이지 탑 인큐베이터는 현미경 단계에 대한 온도, 습도 및 CO2 제어를 유지할 수 있으며 라이브 세포 이미징에 적합합니다. 그러나 장비는 분석에 필요하지 않습니다. 여기에 제공된 프로토콜은 기본 셀 인큐베이터에서도 작동할 수 있습니다.

  1. 셀 인큐베이터에서 내피 발아 칩을 꺼내십시오.
  2. 그런 다음 세포 배양 측에서 Luer 어댑터를 제거합니다. 미세 유체 발아 칩의 하이드로겔 사출 포트에 두 개의 파이프 플러그를 삽입합니다.
    참고: 플러그는 바늘에서 변형될 수 있으며 주요 기능은 미디어가 유출되는 것을 방지하는 것입니다.
  3. 버블 트랩 칩의 백엔드 튜브를 세포 배양 채널의 한 포트에 연결합니다.
    참고: 연결 하기 전에 튜브에 거품이 없는 지 확인 합니다.
  4. T 형 커넥터를 다른 포트에 삽입하고 저장소와 연결된 긴 실리콘 튜브에 연결합니다.
  5. 긴 실리콘 튜브를 마이크로 연동 펌프에 잘라냅니다.
  6. 그런 다음 공기 필터를 저수지에 삽입합니다.
  7. 다음으로, 미세 유체 발아 칩을 스테이지 탑 인큐베이터에 조립합니다.
  8. 다음으로 진공 펌프를 TPU 튜브와 버블 트랩 칩의 하단 층의 구멍에 연결합니다.
  9. 마이크로 주사기 펌프 및 전자기 핀치 밸브를 동시에 제어하는 사용자 정의 프로그램에서 순환 부피 및 유량을 설정합니다(그림2).
    참고: 내피 세포 배양 채널의 유량은 고전적인 방정식에 따라 계산됩니다.
    θ = 6μQ / Wh2
    여기서, θ는 전단 응력(dyn/cm2),μ 매체(8.8 x10-4 Pa•s)의 점도이며, Q는 내피 세포 배양 채널(ml/s)을 가로지르는 유량이며, h는 채널 높이(70 μm), W채널 폭(1,000 μm)이다. 매체의 점도는 동축 실린더 형 회전 점파를 사용하여 측정된다. 채널의 높이와 폭은 소정의 4배 배율에서 위상 대비 현미경을 사용하여 수동으로 확인한다. 순환 부피는 5mL이고 유량은 계산에 따라 15 dyn/cm 2 전단 응력에 대해 85 μL/min(세포 배양 채널의 평균0.2 m/s)이다.
  10. 다음으로, 마이크로 연동 펌프의 유량을 설정합니다.
    참고: 마이크로 연동 펌프의 유량은 용지가 유출되는 것을 방지하기 위해 마이크로 주사기 펌프보다 약간 높습니다.
  11. 마이크로 주사기 펌프를 켭니다. 이어서 순환 제어 시스템이 구축된다.

8. 데이터 분석

참고: 새싹을 정량화하기 위해 발아의 정규화된 면적, 평균 새싹 길이 및 가장 긴 새싹 길이가 계산되었다. 결과는 3개의 독립적인 연구 결과에서 얻은 ± SEM을 나타냅니다. 통계적 유의(P < 0.05)는 학생의 t-test에 의해 평가됩니다.

  1. PBS에서 4% 파라포름알데히드를 15분 동안 실험한 후 미세유체 발아 칩에 세포와 새싹을 고정합니다. 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌 디하이드로클로리드 (DAPI; 1: 1000; 시그마 알드리히) 10 분 후 TRITC 펠로이드 (P5285, 1 : 100)와 스테인 사이토 스켈레톤; 시그마 알드리히) 1시간. 각 단계 사이에 5 분 간격으로 PBS로 셀을 세 번 세척하십시오.
  2. 타일링 모드에서 칩의 공초점 이미지를 가져 와서 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 스티치하십시오.
  3. 프로그래밍 소프트웨어의 사용자 지정 코드를 사용하여 Z 프로젝션 이미지의 형광 픽셀 수를 계산하여 발아의 정규화된 영역을 정량화합니다(보충 파일참조).
  4. Z 프로젝션 이미지에서 새싹의 각 끝을 수동으로 식별하고 레이블을 지정하고 평균 새싹 길이와 가장 긴 새싹 길이를 정량화하기 위해 다른 사용자 정의 코드를 사용하여 전자 지하실 멤브레인에 새싹 팁 사이의 거리를 계산합니다 (보충 파일참조).

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Representative Results

여기에 제시된 신생혈관화(MIEN)의 초기 이벤트를 모방하는 시험관 내 3D 모델은 미세유체 발아 칩과 미세유체 제어 시스템으로 구성되었다. 미세유체 발아 칩은 이전 간행물22,23,37,40,51,52, 53에서최적화되었다. 간략하게, 그것은 3 개의 채널및 6 개의 포트를 포함: 내피 세포 배양 채널 과 4 개의 미디어 주입 포트와 액체 채널, 그리고 두 개의 하이드로겔 주입 포트와 중앙 하이드로겔 채널(그림 3). 미세유체 제어 시스템은 마이크로 주사기 펌프, 전자기 핀치 밸브, 버블 트랩 칩, 마이크로 연동 펌프 및 배양 매체저수지(도 4)로구성되었습니다. 마이크로 주사기 펌프와 전자기 핀치 밸브를 동시에 제어하는 맞춤형 프로그램을 사용했으며, 이 밸브는 유량과 순환 부피를 설정할 수 있습니다. 전신 오류로 인해 여러 사이클 후 약간의 볼륨 변경을 보정하기 위해 보상 볼륨이 도입되었습니다. 관류에 사용되는 매체를 최소화하기 위해 중간 재활용을 위해 전자기 핀치 밸브가 도입되었습니다. 전자기 핀치 밸브는 두 상태 사이를 전환하여 주기에서 두 단계로 미세 유체 시스템을 만들 수 있습니다. 사출 단계에서 배양 배지는 마이크로 주사기 펌프에서 미세 유체 발아 칩으로 천천히 주입되었다. 재활용 단계에서 는 배양 배지가 저수지에서 마이크로 주사기 펌프로 매우 빠르게 추출되었습니다.

MIEN 모델에서 마이크로 용기의 장벽 기능은 40kDa FITC-dextran의 확산 투과성 계수(Pd)를측정하여 평가하였다. 도 5에도시된 바와 같이, 세포 안대기를 가진 정적 배양 칩의 Pd는 0.1 ± 0.3 μm/s이며, 세포 안대기가 없는 빈 채널의 PD는 5.4 ± 0.7 μm/s이다. 이어서, 내피 발아 분석은 MIEN 모델에서 정전기 및 관류하에서 수행되었다. 정적 조건에서, 내피 발아는 파종 후 약 4 시간 발생하 고 새싹은 약 48 시간에서 다른 쪽으로 중앙 하이드로겔 채널을 가로 질러 마이그레이션 할 것이다. 새싹은 48 시간 후에 점차적으로 저하됩니다. 24시간 노출 후 5 또는 15dyn/cm2 전단 응력(세포 배양 채널의 평균 0.07 또는 0.2 m/s), EC는 다각형, 자갈 모양에서 fusiform으로 변화하는 흐름 방향으로 정렬되고, 전단 응력의 증가와 함께 발아 정도가 감소하였다(도6). 그러나 전단 조건 하에서 새싹은 정적 배양 조건보다 더 안정적이었다. 그(것)들은 관혈에서 48 시간 이상 유지할 수 있었습니다. 정량적 통계에 따르면 내피 발아부위는 발아 부위, 평균 새싹 길이 및 가장 긴 새싹길이(도 7)로크게 감소했습니다.

Figure 1
도 1: 내피 세포는 세포 배양 채널의 내부 표면 주위에 코팅. HUVECs는 세포 배양 채널 2 h에서 세포 파종 후 균등하게 분산된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 마이크로 주사기 펌프와 전자기 핀치 밸브를 동시에 제어하는 데 사용되는 사용자 정의 프로그램입니다. 유량 및 순환 볼륨을 설정할 수 있는 사용자 지정 프로그램의 메인 페이지(위) 및 하위 페이지(down)입니다. 전신 오류로 인해 여러 사이클 후 약간의 볼륨 변경을 보정하기 위해 보상 볼륨이 도입되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 미세 유체 발아 칩의 회로도. 칩에는 내피 세포 배양 채널과 4개의 미디어 사출 포트가 있는 액체 채널, 2개의 하이드로겔 사출 포트가 있는 중앙 하이드로겔 채널의 3개의 채널과 6개의 포트가 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 미세 유체 제어 시스템의 회로도. 미세 유체 제어 시스템은 마이크로 주사기 펌프, 전자기 핀치 밸브, 버블 트랩 칩, 마이크로 연동 펌프 및 배양 매체 저수지로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 40 kDa FITC-dextran의 확산 투과성(Pd) 세포 안감이 있는 정적 배양 칩의 PD는 0.1 ± 0.3 μm/s이며, 세포 안대기가 없는 빈 채널의 PD는 5.4 ± 0.7 μm/s입니다. **, p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 다른 전단 조건에서 내피 발아의 대표적인 이미지. 24h의 정적 배양 후, HUVECs는 하이드로겔내의 많은 수의 새싹을 통해 세포 배양 채널에서 인접한 하이드로겔 채널로 침입한다. 5 또는 15 dyn /cm2 전단 응력에 노출 24 시간 후, 발아의 정도는 분명히 감소합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 발아의 정량화 영역, 평균 새싹 길이, 그리고 가장 긴 새싹 길이. 24h의 정적 배양(S0) 또는 5(S5) 또는 15(S15) 다인/cm2 전단 응력에 노출된 후, 전단 응력의 증가와 함께 발아 정도가 감소한다. *, p < 0.05; **, p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

오랜 시간 동안, 신생아의 실시간 관찰은 문제가되었습니다. 최근22, 32,40,46,54의발아을 위해 EC와 인접한 중전성 선박을 만들기 위해 여러 가지 접근법이 개발되었지만 기계적 미세 환경은 여전히 지속적으로 유지되기 어렵다. 높은 발광 전단 응력과 경도 유동의 낮은 속도를 받는 EC의 초기 생체 역학 적 미세 환경을 모방하는 것은 어려운 대상입니다. 여기에서, 우리는 먼저 생리적 미세 환경을 모방한 신생혈관화의 초기 사건을 시뮬레이션하는 MIEN 모델을 제시했습니다. MIEN 모델을 사용하면 자동적이고 효율적이며 거품이 없는 장기 관류가 달성됩니다. IC에 광막 전단 응력은 생리적 수준에 머무르는 경내 흐름실험 중에 언제든지 선택적으로 변경될 수 있습니다.

MIEN 모델의 핵심은 광막 유동에서 전자에 대한 발광 흐름의 효과를 분리하는 것입니다. 이를 위해 T형 커넥터는 EC 배양 채널의 콘센트 포트에 창의적으로 삽입됩니다. 커넥터의 한쪽 끝은 마이크로 연동 펌프를 통해 저수지에 연결됩니다. 커넥터의 다른 쪽 끝은 인큐베이터의 공기에 노출됩니다. 그것은 내피 세포 배양 채널 내부의 압력을 대기압과 동일하게 유지, 압력을 증가시키기 위해 잉여 미디어 수집도 없고 과잉 매체가 채널에서 부정적인 압력을 형성하기 위해 멀리 그려지지 않기 때문에. 이러한 방식으로, 미세유체 발아 칩 후의 유동 저항은 매우 작기 때문에 높은 발광 전단 응력 하에서도 생리적 범위에서 경위 흐름을 유지할 수 있다.

프로토콜 내에서 중요한 한 단계는 중앙 하이드로겔 채널에서 하이드로겔을 성공적으로 주입하는 것입니다. 황 외. 젤의 성공적인 충전은 미세 유체 겔 채널 내에서 모세관 력과 표면 장력의 균형에 따라 달라집니다 제안(55). 그(것)들은 균형을 통제하는 세 가지 다른 변수를 찾아냈습니다: 마이크로 포스트 사이 간격, 장치의 표면 속성 및 하이드로겔 전구체 용액의 점도. 본 모델에서, 미세유체 발아 칩의 설계는 전작으로부터 최적화되어있다 22,23,37,40,51,52,53. 세 개의 채널을 분리하기 위해 마이크로 포스트의 형상및 간격은 이전 계산 및 수많은 실험에 따라 결정됩니다. 또한, PDL 코팅 및 고온 베이킹은 PDMS 표면을 수정하기 위해 수행됩니다. 따라서 하이드로겔 주입 전에 소수성 과 소수성 사이의 균형을 조정합니다.

프로토콜의 다른 중요한 단계는 거품제거입니다. T형 커넥터와 마이크로 연동 펌프로 인해 실험 중에 다량의 공기가 순환 매체로 용해되어 혈액 순환의 거품이 발생하고 내피 세포의 기능에 큰 영향을 미칩니다. 거품을 제거하기 위해, 거품 트랩 칩은 미세 유체 발아 칩 전에 도입된다. 그것은 PDMS 멤브레인의 높은 가스 투과성에 따라 작동합니다. 버블이 트랩에 들어가면 작고 조밀한 그리드 구조에 의해 분산되고 진공 펌프에 의해 생성된 음압으로 인해 갇혀 미세 유체 발아 칩으로 전진하지 못합니다. 또한, 기포는 PDMS 멤브레인을 통해 진공 펌프에 연결된 음압 구멍으로 운반되고 결국 사라집니다. 그럼에도 불구하고 실험 중 거품의 형성에 큰 주의를 기울여야합니다. 파이프라인에서 미세 유체 발아 칩 앞에 거품이 발견되자마자 마이크로 주사기 펌프를 즉시 중지하십시오. 거품이 버블 트랩 칩으로 이동하고 제거 할 수 있도록 손가락으로 파이프 라인을 부드럽게 움츠럽습니다.

신생 혈관화의 초기 미세 환경은 부분적으로 다시 수피되지만,이 MIEN 모델에는 몇 가지 제한이 있습니다. 혈액 유도 전단 응력 및 세포 외 매트릭스 강성과 같은 내피 세포의 기계적 미세 환경은 신생 혈관화 과정에서 변화하고 있습니다. 신생 혈관화 전에, 내피 지하 막은 여전히 완전한 장벽 기능으로 손상되지 않아, 경피 흐름과 간질 흐름의 낮은 속도와 높은 발광 전단 응력의 결과로8,9. 혈관 신생 및 동맥 발생의 발병시, 특징 이벤트는 혈중 전단 응력 및 세포외 매트릭스 강성과 같은 기계적 미세 환경의 변화로 이어지는 폐열성 및 리모델링 매트릭스의 매트릭스 메탈로테아제(MmPs) 중재입니다. 본 작업에서, 우리는 미세 유체 발아 칩 내의 기계적 환경이 생리적 조건을 시뮬레이션하기 위해 안정적으로 유지되도록 설계되도록 신생 혈관화의 개시에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 기계적 미세 환경의 변화는 생체 내에서와 마찬가지로 EC발아로 발생합니다. 게다가, 많은 이전 연구와 유사34,53,56,본 모델은 세포외 매트릭스로서 콜라겐 하이드로겔을 취한다. 유동 유도 전단 응력의 효과에 초점을 맞추면서, 하나의 강성 하이드로겔만 사용됩니다. 그러나, 세포 거동 및 신생혈관화에 대한 매트릭스 강성의 중요한 효과를 고려할 때, 콜라겐의 상이한 강성을 연구하고 콜라겐의 기계적 성질이 pH49에따라 다르기 때문에 콜라겐의 pH를 조절함으로써 달성될 수 있다. 그러나 하이드로겔은 세포 파종 전에 잔류산이나 염기를 제거하기 위해 PBS로 철저히 헹구어 세포에 손상을 방지해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 생체 내에서ECM의 복잡한 성분을 모방하기 위해, 현재 모델을 개선하기 위해 미래에 는 마트리겔, 히알루론산(HA), 피브리노겐 등다양한 하이드로겔을 사용해야 한다. 혈압 유도 순환 균주는 혈관 세포의 형태와 기능을 조절하는 또 다른 중요한혈역학력(57)이다. 이전 연구는 인장 균주가 혈관 내피 지하 막(59)에서타입 IV 콜라겐의 저하를 통해 인간 중간 엽 줄기 세포(58)에서 혈관 신생 인자의 발현을 향상 것으로 나타났습니다. 이러한 결과 혈압 유도 된 긴장 너무 neovascularization에 영향을 미칠 수 있습니다 표시. 현재 모델은 유체 유도 전단 응력의 효과에 초점을 맞추므로 하이드로겔이 채널에 충분히 단단히 붙어 있지 않고 늘어나면 떨어질 것이므로 변형을 도입할 수 없습니다. 우리는 미래의 작품에서 이러한 어려움을 극복하기 위해주의를 기울일 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 중국 보조금 지원의 국립 자연 과학 연구 재단에 의해 지원되었다 (보조금 Nos. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 및 32071311), 중국의 국가 주요 연구 개발 프로그램 (2016YFC101110101 및 2016YFC102202), 111 프로젝트 (B130039), 111 프로젝트 (B130039), 111 프로젝트 (B130039)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285

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생명 공학 문제 170 신생 혈관화 미세 유체 전단 응력 미세 환경 경내 흐름 3D 배양
뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델
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Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang,… More

Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).

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