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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Modello microfluidico per imitare l'evento iniziale di neovascolarizzazione

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62003
Automatic Translation
1, 1, 1, 4, 1, 1, 1, 3, 1,2
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

Qui forniamo un chip microfluidico e un sistema microfluidico di circolazione automaticamente controllato e altamente efficiente che ricapitola il microambiente iniziale della neovascolarizzazione, consentendo alle cellule endoteliali (EC) di essere stimolate da elevate sollecitazioni di taglio luminali, livello fisiologico di flusso transendoteliale e distribuzione simultanea di vari fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF).

Abstract

La neovascolarizzazione viene solitamente inizializzata da una vascolarizzazione normale esistente e il microambiente biomeccanico delle cellule endoteliali (EC) nella fase iniziale varia drammaticamente dal seguente processo di neovascolarizzazione. Sebbene ci siano molti modelli per simulare diversi stadi di neovascolarizzazione, manca ancora un modello 3D in vitro che capitola il processo iniziale di neovascolarizzazione sotto le corrispondenti stimolazioni dei normali microambientati vascolari. Qui, abbiamo ricostruito un modello 3D in vitro che imita l'evento iniziale di neovascolarizzazione (MIEN). Il modello MIEN contiene un chip di germinazione microfluidico e un sistema di controllo automatico e di circolazione altamente efficiente. Si è formato un microcanale funzionale e perfusabile rivestito di endotelio e il processo di germinazione è stato simulato nel chip di germinazione microfluidico. Il microambiente inizialmente fisiologico della neovascolarizzazione è stato riassunto con il sistema di controllo microfluidico, con il quale gli EC sarebbero stati esposti contemporaneamente ad elevate sollecitazioni di taglio luminare, flusso transendoteliale fisiologico e varie distribuzioni del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Il modello MIEN può essere prontamente applicato allo studio del meccanismo di neovascolarizzazione e mantiene una potenziale promessa come piattaforma a basso costo per lo screening dei farmaci e le applicazioni tossicologiche.

Introduction

La neovascolarizzazione avviene in molti processi normali e patologici1,2,3,4,che includono due processi principali negli adulti, angiogenesi e arteriogenesi5. Oltre ai più noti fattori di crescita, come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)6, le stimolazioni meccaniche, in particolare lo stress da taglio indotto dal flusso sanguigno, è importante nella regolazione della neovascolarizzazione7. Come sappiamo, la magnitudine e le forme di sollecitazione di taglio variano drammaticamente e dinamicamente in diverse parti della vascolarizzazione, con conseguenti effetti importanti sulle cellulevascolari 8,9,10,11,12. Studi precedenti hanno dimostrato che lo stress da taglio può influenzare vari aspetti degli EC, tra cui i cambiamenti fenotipici cellulari, la trasduzione del segnale, l'espressione genica e lacomunicazione con le cellule murali 13,14,15,16,17,18,19,20; quindi, regolare laneovascolarizzazione 21,22,23,24.

Pertanto, per comprendere meglio la neovascolarizzazione, è importante ricostruire il processo nel microambiente cellulare naturale in vitro. Recentemente, sono stati istituiti molti modelli per creare micro-vasi e fornire un controllo preciso del microambiente25,26,27, sfruttando i progressi della microfabbricazione e della tecnologia microfluidica. In questi modelli, i micro-vasi possono essere generati da idrogel28,29, polidimetilsiloxano (PDMS) chip microfluidici30,31,32 o 3D biostampa33,34. Alcuni aspetti del microambiente, come la sollecitazione di taglio luminale22,23,35,36, il flusso transendoteliale37,38,39,40,il gradiente biochimico dei fattori angiogenici41,42,ceppo/stiramento43,44,45e co-coltivato con altri tipi di cellule32,46 sono stati mimicked e controllati. Di solito, un grande serbatoio o pompa per siringhe è stato utilizzato per fornire mezzo perfuso. Il flusso transendoteliale in questi modelli è stato creato dalla caduta di pressione tra il serbatoio e ilmicrotubo 22,23,38,40. Tuttavia, il microambiente meccanico era difficile da mantenere costantemente in questo modo. Il flusso trasendoteliale aumenterebbe e quindi supererebbe il livello fisiologico se per la perfusione fosse utilizzata un'elevata portata con elevate sollecitazioni di taglio. Studi precedenti hanno dimostrato che nel periodo iniziale di neovascolarizzazione, la velocità del flusso transendoteliale è molto bassa a causa degli EC intatti e della membrana basale, di solito sotto 0,05 μm/s8. Nel frattempo, sebbene la sollecitazione di taglio luminare nel sistema vascolare vari notevolmente, è relativamente alta con valori medi di 5-20 dyn / cm2,11,47. Per ora, la velocità del flusso transendoteliale nei lavori precedenti è stata generalmente mantenuta tra 0,5-15 μm/s22,38,39,40e la sollecitazione di taglio luminale era solitamente inferiore a 10 dyn/cm223. Rimane un argomento difficile esporre costantemente gli EC ad un elevato stress da taglio luminare e a un livello fisiologico di flusso transendoteliale contemporaneamente. 

Nel presente studio, descriviamo un modello 3D in vitro per imitare l'evento iniziale di neovascolarizzazione (MIEN). Abbiamo sviluppato un chip microfluidico e un sistema di controllo automatico, di circolazione altamente efficiente per formare micro-tubi perfusione e simulare il processo di germinazione48. Con il modello MIEN, il microambiente degli EC stimolato nel periodo iniziale di neovascolarizzazione viene in primo luogo riassunto. I CES possono essere stimolati da un elevato stress da taglio luminare, da un livello fisiologico di flusso transendoteliale e da varie distribuzioni VEGF contemporaneamente. Descriviamo in dettaglio le fasi di definizione del modello MIEN e i punti chiave a cui prestare attenzione, sperando di fornire un riferimento per altri ricercatori.

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Protocol

1. Preparazione del wafer

NOTA: Questo protocollo è specifico per il fotoresist negativo SU-8 2075 utilizzato durante questa ricerca.

  1. Pulire il wafer di silicio da 3 a 5 volte con metanolo e isopropanolo su uno spin coater come segue: prima girare per 15 s a 500 giri/min, quindi girare per 60 s a 3.000 giri/min.
  2. Trasferire il wafer di silicio su una piastra calda, che viene preriscaldata a 180 °C e cuocere il wafer per 10 minuti.
  3. Rimuovere il wafer di silicio dalla piastra calda e raffreddarlo a temperatura ambiente. Pulire nuovamente il wafer con aria compressa prima di procedere con il rivestimento di spin. Applicare 4 mL del fotoresist SU-8 2075 al centro del wafer.
  4. Ottenere un'altezza caratteristica di 70 μm sullo spin coater come segue: prima girare per 12 s a 500 giri/min, quindi girare per 50 s a 2.100 giri/min.
  5. Cuocere il wafer morbido su una piastra calda come segue: prima cuocere per 8 minuti a 65 °C, quindi cuocere per 20 minuti a 95 °C. Quindi, rimuovere il wafer di silicio dalla piastra calda e raffreddarlo a temperatura ambiente prima della litografia.
  6. Posizionare una maschera fotografica sul film fotoresist. Esporre il wafer con un'apparecchiatura di litografia per ottenere un'esposizione totale di 200 mJ/cm2.
    NOTA: La maschera fotografica contiene nove serie di modelli del chip, in modo da poter fabbricare nove chip di germinazione microfluidici ogni volta.
  7. Post esporre il wafer su una piastra calda come segue: prima cuocere per 5 minuti a 65 °C, quindi cuocere per 20 minuti a 95 °C. Quindi, rimuovere il wafer di silicio dalla piastra calda e raffreddarlo a temperatura ambiente prima di svilupparlo.
  8. Trasferire il wafer in una piastra di Petri in vetro riempita con sviluppatore SU-8 (PGMEA) per iniziare a svilupparsi.
    ATTENZIONE: Lo sviluppatore è irritante per gli occhi e le vie respiratorie. Eseguire lo sviluppo in una cappa aspirante. Indossa occhiali da spruzzo, guanti in nitrile e maschera aerea durante l'operazione.
  9. Agitare delicatamente il piatto lungo la direzione del canale di flusso e cambiare lo sviluppatore dopo 10 minuti.
  10. Ripetere il passaggio 1,9 3-5 volte fino a quando i modelli non possono essere chiaramente osservati.
    NOTA: Assicurarsi che non siano rimasti residui di fotoresist sul wafer, altrimenti sciacquare nuovamente il wafer nello sviluppatore.
  11. Trasferire il wafer su una piastra calda preriscaldata impostata a 120 °C e cuocerla per 30 minuti.
  12. Pipetta 35 μL di silane su un coverslip, quindi mettere il coverslip insieme al wafer in un essiccatore e tirare il vuoto. Sigillare l'essiccatore e lasciare il wafer sotto vuoto per 4 ore per silanizzare il wafer per evitare l'adesione del PDMS durante i processi di litografia morbida.
    ATTENZIONE: Il silane è tossico. Per prevenire l'avvelenamento, eseguire la sillanizzazione nel cappuccio dei fumi e indossare guanti di nitrile durante la manipolazione.
  13. Rilasciare il vuoto dall'essiccatore. Rimuovere il wafer silanizzato su una piastra calda preriscaldata e cuocerlo a 65 °C per 2 ore.
  14. Conservare il wafer in una piastra di Petri pulita fino a quando necessario.

2. Fabbricazione di truciolo di germinazione microfluidico

  1. Unire 20 g di agente di base e 2 g di agente polimerizzante (rapporto 10:1) in un bicchiere di plastica e mescolarli accuratamente con un'asta di miscelazione.
  2. Mettere il becher in un essiccatore e tirare il vuoto per 1 h per rimuovere le bolle d'aria nella miscela PDMS.
  3. Versare la miscela PDMS sul wafer nella piastra di Petri e riposizionare la piastra di Petri nell'essiccatore, degassando per altri 30 minuti.
    NOTA: È utile utilizzare nastro adesivo a doppia parte per incollare il wafer sul fondo della piastra di Petri per assicurarsi che il wafer sia mantenuto orizzontale durante il degassamento e la polimerizzazione.
  4. Togliere la piastra di Petri dall'essiccatore e posizionare in un forno asciutto a 80 °C per 3 ore da curare.
  5. Separare accuratamente lo strato PDMS dal wafer e tagliare lo strato a nove trucioli con un bisturi in base al modello.
    NOTA: mantenere il lato feature verso l'alto dopo la separazione.
  6. Punzonare due porte di iniezione di idrogel e quattro porte di iniezione di supporti da ogni chip utilizzando rispettivamente un punzone di biopsia da 1 mm e un punzone di biopsia da 3,5 mm.
  7. Pulire i trucioli perforati con nastro privo di residui per rimuovere i residui di PDMS. Posizionare i trucioli e nove coverlips di vetro in un detergente al plasma e trattarli con plasma di ossigeno per 30 s per formare un legame covalente sulla superficie.
  8. Eseni i trucioli e le coverlips. Attaccare il lato feature dei trucioli sui copripaspalla.
  9. Posizionare i trucioli attaccati in un forno a secco a 80 °C per 1 h per intensificare l'incollaggio.
  10. Autoclavare i trucioli prima dell'uso e mantenerli sterili per il resto della procedura.

3. Modifica della superficie e iniezione di idrogel

  1. Per ogni chip, pipettare 40 μL di 1 mg/mL di poli-D-lsina (PDL) e iniettarlo nei canali del chip dalla porta di iniezione dell'idrogel.
    NOTA: Assicurarsi che il PDL riempia i canali, specialmente nei canali stretti vicino alle porte.
  2. Incubare i trucioli a 37 °C per 4 ore per modificare la superficie del PDMS.
  3. Pipettare 200 μL di acqua sterile e iniettarlo nei canali del chip dalla porta di iniezione dell'idrogel per lavare il PDL.
  4. Rimuovere i trucioli in un forno a secco a 120 °C per 3 ore per ripristinare l'idrofobicità.
  5. Mettere sul ghiaccio un tubo sterile e calcolare il volume di collagene di tipo I da utilizzare come equazione seguente.
    Volume finale (50 μL) x Concentrazione finale di collagene (3 mg/ml in questa ricerca) / Concentrazione in bottiglia = volume collagene da aggiungere
  6. Calcolare il volume di NaOH da utilizzare come equazione seguente.
    (volume collagene da aggiungere) x 0,023 = volume 1 N NaOH
  7. Preparare 50 μL di idrogel nel tubo come seguente protocollo: aggiungere 5 μL di 10x PBS, 0,5 μL di rosso fenolo, volume calcolato di 1 N NaOH, 4 μL di 1 mg/ml fibronectina, volume calcolato di collagene di tipo I a sua volta. Aggiungere la quantità corretta di dH2O in modo che il volume totale raggiunga i 50 μL. Mescolare accuratamente tutto il contenuto nel tubo.
    NOTA: Eseguire tutte le operazioni sul ghiaccio. Utilizzare il rosso fenolo come indicatore a base acida per aiutare nella determinazione visiva del pH dell'idrogel. L'idrogel finale finisce arancione quando il pH è di circa 7,4 e la rigidità è di circa 15 kPa49.
  8. Pipettare 2-3 μL di idrogel per ogni chip e iniettarlo lentamente nel canale centrale dell'idrogel dalla porta di iniezione dell'idrogel.
  9. Incubare i trucioli a 37 °C per 30 minuti per consentire la gelazione.
    NOTA: Sigillare i trucioli in una scatola sigillata con 1 mL di acqua sterile se non vengono utilizzati immediatamente. I trucioli sigillati possono essere conservati a 37 °C per un massimo di 24 ore.

4. Semina cellulare

  1. Pipetta 20 μL di 125 μg/mL Fibronectin in una porta di iniezione mediale del canale di coltura cellulare.
  2. Tagliare una punta di pipetta per adattarla alla porta del canale di coltura cellulare con le forbici.
  3. Inserire la punta della pipetta nell'altra porta di iniezione del supporto del canale di coltura cellulare. Quindi, convogliare l'aria dal canale di coltura cellulare per riempirla con fibronectina.
  4. Incubare i trucioli a 37 °C per 1 h.
  5. Prima della semina cellulare, pipettare 20 μL di mezzi ECM in ogni porta di iniezione del supporto e incubare i trucioli a 37 °C per 30 min.
  6. Quindi, uscitare tutti i supporti in tutte le porte di iniezione dei supporti.
  7. Successivamente, pipettare 5 μL di sospensione cellulare in un'unica porta di iniezione multimediale del canale di coltura cellulare. Quindi, le cellule endoteliali si diffondono rapidamente su tutto il canale sotto pressione idrostatica differenziale.
    NOTA: Preparare la sospensione cellulare tripinando le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) dal pallone di coltura e centrifugandole a 400 x g. Quindi, resuspend le cellule a 107 celle / ml in un tubo.
  8. Aggiungere circa 4-6 μL di supporti ECM all'altra porta per regolare la pressione idrostatica e fermare lo spostamento della cella.
  9. Rimuovere i trucioli nell'incubatore di celle. Quindi, girare i trucioli ogni 30 minuti fino a quando le cellule endoteliali non si rovano intorno alla superficie interna del canale di coltura cellulare 2 ore dopo (Figura 1).
    NOTA: Per rendere il chip capovolto, pipettare un po 'd'acqua sul retro del coperchio. Quindi il chip può attaccarsi alla copertura della piastra di Petri.
  10. Utilizzare la punta della pipetta per rimuovere le celle attaccate nelle porte di iniezione con molta attenzione.
  11. Quindi, inserire quattro adattatori Luer femmina spinati nelle porte di iniezione dei supporti e riempire con supporti ECM.
    NOTA: Gli adattatori possono funzionare come serbatoi di fluido per fornire nutrienti per le cellule nel canale.
  12. Rimuovere i trucioli nell'incubatore di celle. Cambia i supporti ECM negli adattatori Luer ogni 12 ore.

5. Misurazione della permeabilità alla diffusione FITC-dextran

NOTA: Per valutare la funzione barriera del micro-recipiente, viene valutata la permeabilità di diffusione del canale di coltura CE con o senza rivestimento cellulare.

  1. Esettare un chip di germinazione microfluidico con idrogel iniettato.
  2. Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.6.
  3. Rimuovere tutti gli adattatori Luer e uscitare tutti i supporti in quattro porte di iniezione dei supporti.
  4. Posizionare il chip sul microscopio a scansione laser confocale.
  5. Pipetta 5 μL di supporti di coltura contenenti 500 μg/mL 40 kDa FITC-dextran ad una porta del canale di coltura cellulare.
    NOTA: 40 kDa FITC-dextran ha dimensioni molecolari simili a VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Cattura le immagini ogni 3 s per 30 s. Pertanto, viene misurata la permeabilità di diffusione senza rivestimento cellulare.
  7. Esenzi il chip di germinazione microfluidico dopo che gli HUFC sono confluenti nel canale di coltura cellulare.
  8. Ripetere i passaggi da 5.3 a 5.5.
  9. Cattura le immagini ogni 3 s per 30 s. Pertanto, viene misurata la permeabilità alla diffusione con rivestimento cellulare.
  10. Calcolare la permeabilità alla diffusione quantificando i cambiamenti di intensità fluorescente nel tempo utilizzando la seguente equazionemodificata 50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)· Δt) · S/d
    dove, Pd è il coefficiente di permeabilità alla diffusione, I 1 è l'intensità media in un punto di tempo iniziale, I 2 è l'intensità media dopo il tempo delta (Δt), I bè l'intensità di fondo, S è l'area del canale nelle immagini a fluorescenza, e d è l'intervallo totale di micro-post nelle immagini a fluorescenza. Nel presente lavoro, Δt è impostato come 9 s.
    NOTA: La presente equazione è leggermente diversadall'originale 50, a causa della direzione di diffusione della fluorescenza nel chip è solo dal canale EC al canale idrogel, che non è come il tubo circolare che si diffonde in tutta la direzione radiale.

6. Configurazione del sistema di controllo microfluidico

NOTA: Il sistema di controllo microfluidico nel presente studio è costituito da una pompa a microsiringa, una valvola elettromagnetica di avvicinamento delle dita, un chip a trappola a bolle, un chip microfluidico, una pompa micro-peristaltica e un serbatoio. Ogni parte del sistema può essere sostituita da alternative in grado di svolgere la stessa funzione.

  1. Fabbricazione di chip bubble trap
    NOTA: Il chip bubble trap viene utilizzato per rimuovere le bolle d'aria in circolazione. Il chip è costituito da tre strati PDMS. Lo strato superiore è costruito utilizzando litografia morbida per formare la struttura della griglia come camera liquida. Ogni canale della struttura della griglia è largo 100 μm. Lo strato inferiore è un blocco PDMS con un foro. Tra i due strati, viene posata una pellicola PDMS sottile 100 μm.
    1. Ripetere il passaggio 1 per preparare il wafer per il chip bubble trap.
    2. Ripetere i passaggi da 2.1 a 2.5 per fabbricare lo strato superiore e lo strato inferiore del chip bubble trap.
      NOTA: la fotomaschera del livello superiore contiene tre serie di motivi, quindi taglia lo strato PDMS a tre trucioli in base al modello.
    3. Perforare sei fori all'estremità dei canali di ingresso e uscita dello strato superiore utilizzando un punzone di biopsia da 3,5 mm.
    4. Perforare due fori sulla posizione corrispondente dello strato inferiore utilizzando un punzone di biopsia da 6 mm in base al modello sullo strato superiore.
    5. Ripetere i passaggi 2.1-2.2 per preparare 10 g di miscela PDMS e versarlo al centro di un wafer di silicio pulito.
    6. Fabbricare una pellicola PDMS da 100 μm applicando il seguente protocollo di spin: girare per 15 s a 500 giri/min, aumentare la velocità di rotazione a 1.300 giri/min e tenere qui per 45 s.
    7. Trasferire il wafer su una piastra calda preriscaldata impostata a 180 °C e cuocerla per 30 minuti.
    8. Pulire gli strati perforati con nastro privo di residui per rimuovere i residui di PDMS. Posizionare gli strati superiori e il wafer in un detergente al plasma e trattarli con plasma di ossigeno per 30 s per formare un legame covalente sulla superficie.
    9. Eserti i livelli superiori e il wafer. Attaccate il lato feature dei livelli superiori alla pellicola PDMS.
    10. Tagliare il film con attenzione lungo il bordo degli strati superiori con un ago.
    11. Separare lentamente il film dal wafer e capovolre i trucioli per far salire il lato del film dopo la separazione.
    12. Posizionare gli strati inferiori e i trucioli attaccati in un detergente al plasma e trattarli nuovamente con plasma di ossigeno per 30 s.
    13. Eseziona gli strati inferiori e i trucioli attaccati. Attaccare gli strati inferiori alla pellicola PDMS e i trucioli trappola a bolle sono fatti.
      NOTA: allineare i fori sul livello inferiore con i motivi sul livello superiore durante il fissaggio.
    14. Mettere i trucioli in un forno a secco a 80 °C per 1 h per intensificare l'incollaggio.
  2. Assemblare il sistema di controllo microfluidico
    NOTA: Tutte le parti del sistema, come chip a trappola a bolle, serbatoio, tubi e connettori vengono utilizzate dopo la sterilizzazione dell'autoclave, ad eccezione delle apparecchiature elettroniche. Assemblare il sistema di controllo microfluidico su un banco pulito.
    1. Per assemblare il sistema di controllo microfluidico, preparare due tubi in politetrafluoroetilene, due tubi corti in silicone, tre lunghi tubi in silicone, un adattatore Luer femmina spinato, un connettore di tipo Y e tre connettori di tipo L.
      NOTA: Il vantaggio del tubo di politetrafluoroetilene è la bassa elasticità, quindi è necessario meno mezzi in tubazione. Il tubo in silicone, al contrario, ha un'elevata elasticità, quindi è adatto per la valvola di avvicinamento delle dita e la pompa peristaltica.
    2. Riempire la siringa con 10 ml di mezzo ECM preriscaldato (37 °C).
      NOTA: Il preriscaldamento aiuta il gas disciolto a rilascio medio.
    3. Collegare un tubo di politetrafluoroetilene alla siringa da un adattatore Luer femmina spinato. Quindi, collegare l'altra estremità del tubo di politetrafluoroetilene a un connettore di tipo Y.
    4. Successivamente, collegare due lunghi tubi in silicone alle altre due estremità del connettore di tipo Y con un tubo che si collega al serbatoio e l'altro tubo che si collega al chip a bolle.
    5. Collegare un altro lungo tubo di silicone al serbatoio.
    6. Successivamente, utilizzare due tubi brevi in silicone per collegare tutti i fori di ingresso e di uscita sullo strato superiore del chip a trappola a bolle. Collegare un tubo di politetrafluoroetilene al back-end del chip.
    7. Quindi, fissare la siringa sulla pompa della micro siringa.
    8. Agganciare due lunghi tubi in silicone alla valvola elettromagnetica di avvicinamento delle dita.
    9. Quindi, cambiare la valvola di avvicinamento elettromagnetica per aprire la tubazione tra la siringa e il serbatoio. Iniettare il supporto nel serbatoio utilizzando una pompa a micro siringa per esaurire l'aria nel tubo.
    10. Quindi, cambiare di nuovo la valvola per aprire la tubazione tra la siringa e il chip trappola per bolle. Iniettare il supporto per riempire la camera liquida e il tubo di back-end del chip trappola a bolle.

7. Saggio di germinazione endoteliale

NOTA: Nel presente studio viene utilizzato un incubatore di piani assemblato con microscopio a contrasto di fase per osservare il processo di germinazione in tempo reale. L'incubatore superiore dello stadio può mantenere il controllo della temperatura, dell'umidità e della CO2 sugli stadi del microscopio, essendo buono per l'imaging di cellule vive. Ma l'attrezzatura non è necessaria per il test. I protocolli qui forniti possono anche essere lavorati in un incubatore di cellule di base.

  1. Estraere i trucioli endoteliali dall'incubatrice cellulare.
  2. Quindi, rimuovere gli adattatori Luer sul lato della coltura cellulare. Inserire due tappi di tubo nelle porte di iniezione dell'idrogel del chip di germinazione microfluidico.
    NOTA: Le spine possono trasformarsi dagli aghi e la loro funzione principale è impedire lo sversamento dei supporti.
  3. Collegare il tubo back-end del chip bubble trap a una porta del canale di coltura cellulare.
    NOTA: Assicurarsi che non ci siano bolle nel tubo prima della connessione.
  4. Inserire un connettore di tipo T all'altra porta e collegarlo a un lungo tubo di silicone collegato al serbatoio.
  5. Agganciare il lungo tubo di silicone alla pompa micro-peristaltica.
  6. Quindi, inserire un filtro dell'aria nel serbatoio.
  7. Quindi, assemblare il chip di germinazione microfluidico nell'incubatore superiore del palco.
  8. Quindi, collegare la pompa per vuoto ai fori nello strato inferiore del chip trappola a bolle con un tubo TPU.
  9. Impostare il volume di circolazione e la portata nel programma personalizzato, che controlla contemporaneamente la pompa micro-siringa e la valvola di avvicinamento delle dita elettromagnetiche (Figura 2).
    NOTA: La portata attraverso il canale di coltura cellulare endoteliale viene calcolata in base all'equazione classica.
    τ = 6μQ / Wh2
    dove, τ è sollecitazione di taglio (dyn/cm 2 ), μ è viscosità del mezzo (8,8 x 10-4 Pa•s), Q è la portataattraversoil canale di coltura cellulare endoteliale (ml/s), h è altezza canale (70 μm), e W è larghezza canale (1.000 μm). La viscosità del mezzo viene misurata utilizzando un viscometer rotazionale di tipo cilindro coassiale. L'altezza e la larghezza del canale sono predeterminate e confermano manualmente l'utilizzo di un microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 4x. Il volume di circolazione è di 5 mL e la portata è di 85 μL/min (media 0,2 m/s nel canale di coltura cellulare) per 15 dyn/cm 2 disollecitazione di taglio secondo il calcolo.
  10. Quindi, impostare la portata della pompa micro-peristaltica.
    NOTA: La portata della pompa micro-peristaltica è leggermente superiore alla pompa a microsiringa, al fine di evitare che il supporto si riversi.
  11. Accendere la pompa micro-siringa. Quindi, viene stabilito il sistema di controllo della circolazione.

8. Analisi dei dati

NOTA: Per quantificare i germogli, sono state calcolate l'area normalizzata di germogliazione, la lunghezza media del germoglio e la lunghezza del germoglio più lunga. I risultati rappresentano ± SEM ottenuto da tre studi indipendenti. La significatività statistica (P < 0,05) è valutata dal test tdello studente.

  1. Fissare le cellule e i germogli nel chip di germinazione microfluidico dopo esperimenti con paraformaldeide al 4% in PBS per 15 minuti. Nuclei di macchia con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo diidrocloruro (DAPI; 1: 1000; Sigma-Aldrich) per 10 min e poi citoscheletro di macchia con phalloidin TRITC (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) per 1 h. Lavare le celle con PBS tre volte a intervalli di 5 minuti tra ogni passaggio.
  2. Scatta immagini confocali dei chip in modalità piastrellatura e cucili utilizzando il software di modifica delle immagini.
  3. Contare il numero di pixel fluorescenti delle immagini di proiezione Z utilizzando un codice personalizzato nel software di programmazione per quantificare l'area normalizzata di germinazione (vedere File supplementare).
  4. Identificare ed etichettare manualmente ogni punta dei germogli nelle immagini a proiezione Z e calcolare le distanze tra le punte dei germogli alla membrana del seminterrato degli EC utilizzando un altro codice personalizzato per quantificare la lunghezza media del germoglio e la lunghezza del germoglio più lunga (vedere File supplementare).

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Representative Results

Il modello 3D in vitro per imitare l'evento iniziale di neovascolarizzazione (MIEN) qui presentato consisteva in un chip di germinazione microfluidico e un sistema di controllo microfluidico. Il chip di germinazione microfluidico è stato ottimizzato dalle precedentipubblicazioni 22,23,37,40,51,52,53. In breve, conteneva tre canali e sei porte: un canale di coltura cellulare endoteliale e un canale liquido con quattro porte di iniezione multimediale e un canale idrogel centrale con due porte di iniezione di idrogel (Figura 3). Il sistema di controllo microfluidico consisteva in una pompa a microsiringa, una valvola elettromagnetica di avvicinamento delle dita, un chip a trappola a bolle, una pompa micro-peristaltica e un serbatoio di mezzo di coltura (Figura 4). Un programma personalizzato è stato utilizzato per controllare contemporaneamente la pompa a micro siringa e la valvola di avvicinamento elettromagnetico delle dita, con la quale è possibile impostare la portata e il volume di circolazione. È stato introdotto un volume di compensazione per correggere la leggera variazione di volume dopo cicli multipli a causa di errori sistemici. Per ridurre al minimo il mezzo utilizzato per la perfusione, è stata introdotta una valvola di avvicinamento elettromagnetica per il riciclo medio. La valvola elettromagnetica di avvicinamento delle dita potrebbe passare da uno stato all'altro per rendere il sistema microfluidico in due fasi di un ciclo. Nella fase di iniezione, il mezzo di coltura è stato lentamente iniettato dalla pompa della microsiringa al chip di germinazione microfluidico. Mentre era in fase di riciclo, il terreno di coltura è stato estratto molto rapidamente dal serbatoio fino alla pompa micro-siringa.

La funzione barriera del micro-recipiente nel nostro modello MIEN è stata valutata misurando il coefficiente di permeabilità alla diffusione(Pd)di 40 kDa FITC-dextran. Come mostrato nella figura 5, il P ddel chip statico coltivato con rivestimento cellulare è 0,1 ± 0,3 μm/s e il P ddel canale vuoto senza rivestimento cellulare è di 5,4 ± 0,7 μm/s. Quindi, il test di germinazione endoteliale sotto statica e perfusione è stato eseguito nel modello MIEN. In condizioni statiche, la germinazione endoteliale si è verificata circa 4 ore dopo la semina e i germogli migravano attraverso il canale centrale dell'idrogel verso l'altro lato in circa 48 ore. I germogli si sono degradati gradualmente dopo 48 ore. Mentre dopo 24 ore di esposizione a sollecitazioni di taglio di 5 o 15 dyn/cm2 (media 0,07 o 0,2 m/s nel canale di coltura cellulare), gli EC si sono allineati nella direzione del flusso passando dalla forma poligonale e ciottolata al fusiforme e il grado di germogliatura è diminuito con l'aumento della sollecitazione ditaglio (figura 6). Tuttavia, i germogli in condizioni di taglio erano più stabili che in condizioni di coltura statica. Potrebbero mantenere oltre 48 ore sotto perfusione. Le statistiche quantitative hanno mostrato che la germinazione endoteliale è diminuita significativamente in termini di area di germogliazione, lunghezza media del germoglio e lunghezza del germoglio più lunga (figura 7).

Figure 1
Figura 1: Le cellule endoteliali si ricoprivano attorno alla superficie interna del canale di coltura cellulare. Gli HUVEC sono dispersi uniformemente nel canale di coltura cellulare 2 ore dopo la semina cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Programma personalizzato utilizzato per controllare simultaneamente la pompa a micro siringa e la valvola di avvicinamento elettromagnetico delle dita. Pagina principale (su) e pagina secondaria (in basso) del programma personalizzato con cui è possibile impostare la portata e il volume di circolazione. È stato introdotto un volume di compensazione per correggere la leggera variazione di volume dopo cicli multipli a causa di errori sistemici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Schema del chip di germinazione microfluidico. Il chip contiene tre canali e sei porte: un canale di coltura cellulare endoteliale e un canale liquido con quattro porte di iniezione multimediale e un canale centrale di idrogel con due porte di iniezione di idrogel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Schema del sistema di controllo microfluidico. Il sistema di controllo microfluidico è costituito da una pompa a microsiringa, una valvola elettromagnetica di avvicinamento delle dita, un chip a trappola a bolle, una pompa micro-peristaltica e un serbatoio di mezzo di coltura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Permeabilità alla diffusione (Pd) di 40 kDa FITC-dextran. Il Pd del chip statico coltivato con rivestimento cellulare è di 0,1 ± 0,3 μm/s, e il P d del canale vuoto senza rivestimento cellulare è di 5,4 ± 0,7 μm/s. **, p < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Immagini rappresentative della germinazione endoteliale in diverse condizioni di taglio. Dopo 24 ore di coltura statica, gli HUVEC invadono dal canale di coltura cellulare nel canale idrogel adiacente attraverso micro-pali e un gran numero di germogli nell'idrogel. Mentre dopo 24 ore di esposizione a 5 o 15 dyn/cm2 di sollecitazione di taglio, il grado di germogliatura diminuisce ovviamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Area quantificata di germogliazione, lunghezza media del germoglio e lunghezza del germoglio più lunga. Dopo 24 ore di coltura statica (S0) o esposizione a sollecitazioni di taglio 5 (S5) o 15 (S15) dyn/cm2, il grado di germogliazione diminuisce con l'aumento della sollecitazione di taglio. *, p < 0,05; **, p < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per molto tempo, l'osservazione in tempo reale della neovascolarizzazione è stata un problema. Recentemente sono stati sviluppati diversi approcci per creare vasi perfusi che si allineano con EC e adiacenti alla matrice extracellulare per germogliare22,32,40,46,54, ma il microambiente meccanico è ancora difficile da mantenere costantemente. Rimane un argomento difficile imitare il microambiente biomeccanico iniziale degli EC, che sono sottoposti ad elevate sollecitazioni di taglio luminali e a bassa velocità del flusso transendoteliale. Qui, abbiamo presentato un modello MIEN che simula in primo luogo l'evento iniziale di neovascolarizzazione nel microambiente fisiologico mimico. Con il modello MIEN, si ottiene una perfusione automatica, efficiente e senza bolle a lungo termine. Lo stress da taglio luminare sui CES potrebbe essere facoltativamente modificato in qualsiasi momento durante gli esperimenti con flusso transendoteliale che rimane a livello fisiologico.

La chiave del modello MIEN è il disaccoppiamento dell'effetto del flusso luminare sugli EC dal flusso transendoteliale. A tal fine, un connettore di tipo T viene inserito in modo creativo nella porta di uscita del canale delle impostazioni cultura CE. Un'estremità del connettore è collegata al serbatoio attraverso la pompa micro-peristaltica. L'altra estremità del connettore è esposta all'aria dell'incubatore. Mantiene la pressione all'interno del canale di coltura cellulare endoteliale uguale alla pressione atmosferica, poiché non c'è né un eccesso di media per aumentare la pressione né mezzi in eccesso che vengono disegnati via per formare pressione negativa nel canale. In questo modo, la resistenza al flusso dopo il chip di germinazione microfluidico è molto piccola in modo che il flusso transendoteliale possa essere mantenuto a distanza fisiologica anche sotto un'elevata sollecitazione di taglio luminare.

Un passo fondamentale all'interno del protocollo è l'iniezione riuscita di idrogel nel canale centrale dell'idrogel. ha proposto che il riempimento riuscito dei gel dipenda dal bilanciamento delle forze capillari e della tensione superficiale all'interno del canale gel microfluidico55. Hanno trovato tre diverse variabili per controllare l'equilibrio: la spaziatura tra i micro-post, le proprietà superficiali del dispositivo e la viscosità delle soluzioni precursori dell'idrogel. Nel modello attuale, il design del chip di germinazione microfluidico è ottimizzato rispetto ai lavoriprecedenti 22,23,37,40,51,52,53. La geometria e la spaziatura dei micro-post per separare tre canali sono determinate in base a calcoli precedenti e numerosi esperimenti. Inoltre, il rivestimento PDL e la cottura ad alta temperatura vengono eseguiti per modificare la superficie PDMS; quindi, regolare l'equilibrio tra idrofilia e idrofobicità prima dell'iniezione di idrogel.

L'altro passo critico del protocollo è la rimozione delle bolle. Una grande quantità di aria si dissolverà nel mezzo di circolazione durante l'esperimento a causa del connettore di tipo T e della pompa micro-peristaltica, con conseguenti bolle in circolazione e influenzando notevolmente la funzione delle cellule endoteliali. Per rimuovere le bolle, viene introdotto un chip a trappola a bolle prima del chip di germinazione microfluidico. Funziona in base all'elevata permeabilità al gas della membrana PDMS. Quando le bolle entrano nella trappola, vengono disperse dalla struttura della griglia piccola e densa e intrappolate a causa della pressione negativa generata dalla pompa per vuoto in modo che non riescano ad avanzare nel chip di germinazione microfluidico. Inoltre, le bolle trasportano attraverso la membrana PDMS nel foro di pressione negativo collegato alla pompa del vuoto e scompaiono alla fine. Anche così, si dovrebbe prestare grande attenzione alla formazione di bolle durante l'esperimento. Non appena si trovano bolle prima del chip di germinazione microfluidico nella tubazione, arrestare immediatamente la pompa della microsiringa. Sgranocchiare delicatamente la tubazione con il dito per lasciare che le bolle si spostino sul chip trappola a bolle ed essere rimosse.

Sebbene il microambiente iniziale della neovascolarizzazione sia parzialmente riassunto, ci sono alcune limitazioni a questo modello MIEN. I microambientati meccanici delle cellule endoteliali come lo stress da taglio indotto dal sangue e la rigidità della matrice extracellulare stanno cambiando durante i processi di neovascolarizzazione. Prima della neovascolarizzazione, la membrana basale endoteliale è ancora intatta con completa funzione barriera, con conseguente elevata sollecitazione di taglio luminale con bassa velocità di flusso transendoteliale e flusso interstiziale8,9. All'inizio dell'angiogenesi e dell'arteriogenesi, un evento distintivo è la mediazione delle metalloproteasi matriciali (MMP) della degradazione del seminterrato, che aumenterà la permeabilità e la matrice di rimodellamento degli EC, portando a cambiamenti nei microambientati meccanici come lo stress da taglio indotto dal sangue e la rigidità della matrice extracellulare. Nel presente lavoro, ci concentriamo sull'inizio della neovascolarizzazione in modo che gli ambienti meccanici all'interno del chip di germinazione microfluidico siano progettati per rimanere stabili per simulare le condizioni fisiologiche. Tuttavia, i cambiamenti dei microambientati meccanici si verificheranno con la germogliazione dei PAESI ELETTRICI, proprio come in vivo. Inoltre, simile a molti studi precedenti34,53,56, il modello attuale prende l'idrogel di collagene come matrice extracellulare. Mentre ci concentriamo sull'effetto della sollecitazione di taglio indotta dal flusso, viene utilizzato un solo idrogel di rigidità. Tuttavia, considerando l'importante effetto della rigidità della matrice sul comportamento cellulare e sulla neovascolarizzazione, è necessario studiare diverse rigidità del collagene e possono essere ottenute regolando il pH del collagene poiché le proprietà meccaniche del collagene dipendono dal suo pH49. Ma è importante notare che l'idrogel deve essere accuratamente risciacquato con PBS per rimuovere acidi o basi residue prima della semina cellulare per prevenire danni alle cellule. Inoltre, per imitare i componenti complessi di ECM in vivo, variidrogel come Matrigel, acido ialuronico (HA), fibrinogeno ecc. dovrebbero essere utilizzati in futuro per migliorare il modello attuale. Il ceppo ciclico indotto dalla pressione sanguigna è un'altra importante forza emodinamica che modula la morfologia e le funzioni delle cellulevascolari 57. Studi precedenti hanno dimostrato che il ceppo di trazione ha migliorato l'espressione di fattori angiogenici nelle cellule staminali mesenchimaliumane 58 e ha indotto l'angiogenesi attraverso la degradazione del collagene di tipo IV nella membrana basale endotelialevascolare 59. Questi risultati hanno indicato che il ceppo indotto dalla pressione sanguigna può influenzare anche la neovascolarizzazione. Il modello attuale si concentra sull'effetto della sollecitazione di taglio indotta dal flusso, quindi non è applicabile introdurre la deformazione in quanto l'idrogel non si attacca abbastanza strettamente al canale e cadrà quando allungato. Presteremo attenzione a superare questa difficoltà nei lavori futuri.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (grant n. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 e 32071311), Programma nazionale chiave di ricerca e sviluppo della Cina (sovvenzioni n. 2016YFC1101101 e 2016YFC1102202), il progetto 111 (B13003) e la Beijing Natural Science Foundation (4194079).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285

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Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).

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