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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Modelo microfluídico para imitar el evento inicial de neovascularización

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62003
Automatic Translation
1, 1, 1, 4, 1, 1, 1, 3, 1,2
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

Aquí, proporcionamos un chip microfluídico y un sistema microfluídico de circulación automáticamente controlado y altamente eficiente que recapitula el microambiente inicial de neovascularización, permitiendo que las células endoteliales (ECs) sean estimuladas por un alto estrés esquilar luminal, nivel fisiológico de flujo transendotelial y diversa distribución del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) simultáneamente.

Abstract

La neovascularización generalmente se inicializa a partir de una vasculatura normal existente y el microambiente biomecánico de las células endoteliales (EC) en la etapa inicial varía drásticamente del siguiente proceso de neovascularización. Aunque hay un montón de modelos para simular diferentes etapas de neovascularización, todavía falta un modelo 3D in vitro que capitula el proceso inicial de neovascularización bajo las correspondientes estimulaciones de microambientes de vasculatura normales. Aquí, reconstruimos un modelo 3D in vitro que imita el evento inicial de neovascularización (MIEN). El modelo MIEN contiene un chip de brote microfluídico y un sistema de circulación de control automático y altamente eficiente. Se formó un microcanal funcional y perfusible recubierto de endotelio y se simuló el proceso de germinación en el chip de brote microfluídico. El microambiente inicialmente fisiológico de la neovascularización fue recapitulado con el sistema de control microfluídico, por el cual los ECT estarían expuestos a alto estrés de cizallamiento luminal, flujo transendotelial fisiológico y varias distribuciones de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) simultáneamente. El modelo MIEN se puede aplicar fácilmente al estudio del mecanismo de neovascularización y tiene una promesa potencial como plataforma de bajo costo para aplicaciones de detección de fármacos y toxicología.

Introduction

La neovascularización ocurre en muchos procesos normales y patológicos1,2,3,4,que incluyen dos procesos principales en adultos, angiogénesis y arteriogénesis5. Además de los factores de crecimiento más conocidos, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)6,las estimulaciones mecánicas, en particular el estrés esquilar inducido por el flujo sanguíneo, es importante en la regulación de la neovascularización7. Como sabemos, la magnitud y las formas de estrés cizallado varían dramática y dinámicamente en diferentes partes de la vasculatura, lo que resulta en efectos importantes en las células vasculares8,9,10,11,12. Estudios previos han demostrado que el estrés cizallado puede afectar a varios aspectos de los EC, incluyendo cambios fenotípicos celulares, transducción de señal, expresión génica, y la comunicación con las células murales13,14,15,16,17,18,19,20; por lo tanto, regular la neovascularización21,22,23,24.

Por lo tanto, para entender mejor la neovascularización, es importante reconstruir el proceso en microambiente celular natural in vitro. Recientemente, se han establecido muchos modelos para crear micro-recipientes y proporcionar un control preciso del microambiente25,26,27,aprovechando los avances en microfabricación y tecnología microfluídica. En estos modelos, los micro-recipientes pueden ser generados por hidrogel28,29,chips microfluídicos polidimetillesiloxano (PDMS)30,31,32 o bioimpresión 33,34. Algunos aspectos del microambiente, tales como tensión de cizallamiento luminal22,23,35,36,flujo transendotelial37,38,39,40,gradiente bioquímico de factores angiogénicos41,42,cepa / estiramiento43,44,45,y co-cultivado con otros tipos de células32,46 han sido imitados y controlados. Por lo general, se utilizó un depósito grande o una bomba de jeringa para proporcionar medio perfundido. El flujo transendotelial en estos modelos fue creado por caída de presión entre el depósito y el micro-tubo22,23,38,40. Sin embargo, el microambiente mecánico era difícil de mantener constantemente de esta manera. El flujo transendotelial aumentaría y luego superaría el nivel fisiológico si se utilizara un alto caudal con alto estrés cizallado para perfusión. Estudios previos mostraron que en el período inicial de neovascularización, la velocidad del flujo transendotelial es muy baja debido a los ECT intactos y la membrana del sótano, generalmente por debajo de 0,05 μm/s8. Mientras tanto, aunque el estrés de cizallador luminal en el sistema vascular varía mucho, es relativamente alto con valores medios de 5-20 dyn/cm2,11,47. Por ahora, la velocidad del flujo transendotelial en trabajos anteriores se ha mantenido generalmente entre 0,5-15 μm/s22,38,39,40,y la tensión de cizallación luminal era generalmente inferior a 10 dyn/cm223. Sigue siendo un tema difícil de exponer constantemente los ECT a un alto estrés de cizallación luminal y un nivel fisiológico de flujo transendotelial simultáneamente. 

En el presente estudio, describimos un modelo 3D in vitro para imitar el evento inicial de neovascularización (MIEN). Desarrollamos un chip microfluídico y un sistema de circulación de control automático y altamente eficiente para formar microtubadores perfusión y simular el proceso de germinación48. Con el modelo MIEN, el microambiente de los ECT estimulados en el período inicial de neovascularización se recapitulan en primer lugar. Los ECT pueden ser estimulados por alto estrés de cizalladura luminal, nivel fisiológico de flujo transendotelial y varias distribuciones de VEGF simultáneamente. Describimos los pasos para establecer el modelo MIEN en detalle y los puntos clave a los que hay que prestar atención, con la esperanza de proporcionar una referencia para otros investigadores.

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Protocol

1. Preparación de obleas

NOTA: Este protocolo es específico para el fotoresista negativo SU-8 2075 utilizado durante esta investigación.

  1. Limpie la oblea de silicio de 3 a 5 veces con metanol e isopropanol en una capa de espín de la siguiente manera: primero gire durante 15 s a 500 rpm, y luego gire durante 60 s a 3.000 rpm.
  2. Transfiera la oblea de silicio a una placa caliente, que está precalentada a 180 °C y hornee la oblea durante 10 minutos.
  3. Retire la oblea de silicio de la placa caliente y enfríe a temperatura ambiente. Limpie la oblea de nuevo con aire comprimido antes de continuar con el recubrimiento de espín. Aplicar 4 ml del fotorresistista SU-8 2075 en el centro de la oblea.
  4. Obtenga una altura de operación de 70 μm en la capa de espín de la siguiente manera: primero gire durante 12 s a 500 rpm y, a continuación, gire durante 50 s a 2.100 rpm.
  5. Hornee suavemente la oblea en una placa caliente de la siguiente manera: primero hornee durante 8 minutos a 65 °C, luego hornee durante 20 minutos a 95 °C. A continuación, retire la oblea de silicio de la placa caliente y enfríe a temperatura ambiente antes de la litografía.
  6. Coloque una máscara fotográfica en la película fotorresista. Exponer la oblea con un equipo de litografía para lograr una exposición total de 200 mJ/cm2.
    NOTA: La fotomasa contiene nueve conjuntos de patrones del chip, por lo que puede fabricar nueve chips microfluídicos cada vez.
  7. Post exponga la oblea en una placa caliente de la siguiente manera: primero hornee durante 5 minutos a 65 °C, y luego hornee durante 20 minutos a 95 °C. A continuación, retire la oblea de silicio de la placa caliente y enfríe a temperatura ambiente antes de desarrollarse.
  8. Transfiera la oblea a una placa de cristal Petri llena de desarrollador SU-8 (PGMEA) para empezar a desarrollarse.
    PRECAUCIÓN: El desarrollador está irritando a los ojos y las vías respiratorias. Realizar el desarrollo en una campana de humo. Use gafas de salpicaduras, guantes de nitrilo y máscara de aerolínea durante la operación.
  9. Agitar el plato suavemente a lo largo de la dirección del canal de flujo y cambiar el desarrollador después de 10 min.
  10. Repita el paso 1,9 3-5 veces hasta que se puedan observar claramente los patrones.
    NOTA: Asegúrese de que no quede ningún residuo fotorresista en la oblea, enjuague de lo contrario la oblea en el desarrollador de nuevo.
  11. Transfiera la oblea a una placa caliente precalentada a 120 °C y hornee durante 30 minutos.
  12. Pipete 35 μL de silano en un tubo, luego coloque el tubo de cubierta junto con la oblea en un desecador y tire del vacío. Selle el desecador y deje la oblea bajo vacío durante 4 h para silanizar la oblea para evitar la adhesión de PDMS durante los procesos de litografía blanda.
    PRECAUCIÓN: El silano es tóxico. Para prevenir intoxicaciones, realice la silanización en la campana del humo y use guantes de nitrilo mientras se manipula.
  13. Suelte el vacío del desecador. Retire la oblea silanizada sobre una placa caliente precalentada y hornéela a 65 °C durante 2 h.
  14. Guarde la oblea en una placa de Petri limpia hasta que sea necesario.

2. Fabricación de chips de brote microfluídico

  1. Combine 20 g de agente base y 2 g de agente de curado (relación 10:1) en un vaso de precipitados de plástico y mézclalos a fondo con una barra de mezcla.
  2. Coloque el vaso de precipitados en un desecador y tire del vacío durante 1 h para eliminar las burbujas de aire en la mezcla PDMS.
  3. Vierta la mezcla PDMS sobre la oblea de la placa De Petri y coloque la placa De Petri de nuevo en el desiccator, desgasificación durante otros 30 minutos.
    NOTA: Es útil utilizar cinta adhesiva de doble cara para pegar la oblea en la parte inferior de la placa Petri para asegurar que la oblea se mantenga horizontal durante el desgasificación y el curado.
  4. Retire la placa Petri del desiccator y colóquela en un horno seco de 80 °C durante 3 h para curarla.
  5. Separe cuidadosamente la capa PDMS de la oblea y corte la capa a nueve chips con un bisturí de acuerdo con el patrón.
    NOTA: Mantenga el lado de la operación hacia arriba después de la separación.
  6. Perforar dos puertos de inyección de hidrogel y cuatro puertos de inyección de medios de cada chip utilizando un punzón de biopsia de 1 mm y 3,5 mm, respectivamente.
  7. Limpie los chips perforados con cinta sin residuos para eliminar los residuos PDMS. Coloca los chips y nueve cubrecardos de vidrio en un limpiador de plasma y trátalos con plasma de oxígeno durante 30 s para formar unión covalente en la superficie.
  8. Saca las fichas y las fundas. Fije el lado de la operación de los chips a las cubiertas.
  9. Coloque las virutas conectadas en un horno seco de 80 °C durante 1 h para intensificar la unión.
  10. Autoclave los chips antes de usarlos y manténgalos estériles durante el resto del procedimiento.

3. Modificación de superficie e inyección de hidrogel

  1. Para cada chip, pipete 40 μL de 1 mg/ml de poli-D-lisina (PDL) e inyéctlo en canales en el chip del puerto de inyección de hidrogel.
    NOTA: Asegúrese de que el PDL llena los canales, especialmente en los canales estrechos cerca de los puertos.
  2. Incubar las virutas a 37 °C durante 4 h para modificar la superficie del PDMS.
  3. Pipetear 200 μL de agua estéril e inyectarlo en canales en el chip desde el puerto de inyección de hidrogel para lavar PDL.
  4. Retire las virutas en un horno seco de 120 °C durante 3 h para restaurar la hidrofobicidad.
  5. Coloque sobre hielo un tubo estéril y calcule el volumen de colágeno tipo I que se utilizará como la siguiente ecuación.
    Volumen final (50 μL) x Concentración final de colágeno (3 mg/ml en esta investigación) / Concentración en botella = colágeno de volumen a añadir
  6. Calcule el volumen de NaOH que se utilizará como la siguiente ecuación.
    (colágeno de volumen a añadir) x 0,023 = volumen 1 N NaOH
  7. Preparar 50 μL de hidrogel en el tubo como protocolo siguiente: añadir 5 μL de 10x PBS, 0,5 μL de fenol rojo, volumen calculado de 1 N NaOH, 4 μL de 1 mg/ml de fibronectina, volumen calculado de colágeno tipo I a su vez. Añadir la cantidad adecuada de dH2O para que el volumen total alcance los 50 μL. Mezcle todo el contenido del tubo a fondo.
    NOTA: Realice todas las operaciones en hielo. Utilice el fenol rojo como un indicador basado en ácido para ayudar en la determinación visual del pH del hidrogel. El hidrogel final termina naranja cuando el pH es de aproximadamente 7,4 y la rigidez es de aproximadamente 15 kPa49.
  8. Pipete 2-3 μL de hidrogel para cada chip e inyecte lentamente en el canal central de hidrogel desde el puerto de inyección de hidrogel.
  9. Incubar las virutas a 37 °C durante 30 minutos para permitir la gelación.
    NOTA: Selle las virutas en una caja sellada con 1 ml de agua estéril si no se utilizan inmediatamente. Las virutas selladas se pueden almacenar a 37 °C como máximo 24 h.

4. Siembra celular

  1. Pipete 20 μL de fibronectina de 125 μg/ml en un puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular.
  2. Corte una punta de pipeta para que se ajuste al puerto del canal de cultivo celular con tijeras.
  3. Inserte la punta de la pipeta en el otro puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular. Luego, canalice el aire del canal de cultivo celular para llenarlo con fibronectina.
  4. Incubar las virutas a 37 °C durante 1 h.
  5. Antes de la siembra celular, canaliza 20 μL de medios ECM en cada puerto de inyección de medios e incuba los chips a 37 °C durante 30 min.
  6. A continuación, canaliza todos los medios en todos los puertos de inyección de medios.
  7. A continuación, pipete 5 μL de suspensión celular en un puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular. Luego, las células endoteliales se extendieron rápidamente por todo el canal bajo presión hidrostática diferencial.
    NOTA: Preparar la suspensión celular tratando de triplicar las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) del matraz de cultivo y centrifugarlas a 400 x g. Luego, resuspend las células a 107 células/ml en un tubo.
  8. Agregue aproximadamente 4-6 μL de medios ECM al otro puerto para ajustar la presión hidrostática y detener el movimiento de la célula.
  9. Retire las virutas a la incubadora de celdas. A continuación, gire los chips cada 30 minutos hasta que las células endoteliales se cubran alrededor de la superficie interna del canal de cultivo celular 2 h más tarde (Figura 1).
    NOTA: Para hacer el chip al revés, canaliza un poco de agua en la parte posterior de la cubierta. A continuación, el chip se puede fijar a la cubierta de la placa Petri.
  10. Utilice la punta de la pipeta para extraer las celdas conectadas en los puertos de inyección con mucho cuidado.
  11. A continuación, inserte cuatro adaptadores luer hembra de púas en los puertos de inyección de medios y rellene con medios ECM.
    NOTA: Los adaptadores pueden funcionar como reservorios de fluidos para proporcionar nutrientes para las células del canal.
  12. Retire las virutas a la incubadora de celdas. Cambie los medios ECM en adaptadores Luer cada 12 h.

5. Medición de la permeabilidad diffusional FITC-dextran

NOTA: Para evaluar la función de barrera del micro-recipiente, se evalúa la permeabilidad diffusional del canal de cultivo CE con o sin revestimiento celular.

  1. Saca un chip microfluídico con hidrogel inyectado.
  2. Repita los pasos 4.1-4.6.
  3. Retire todos los adaptadores Luer y canaliza todos los medios en cuatro puertos de inyección de medios.
  4. Coloque el chip en el microscopio de escaneo láser confocal.
  5. Pipete 5 μL de medios de cultivo que contienen 500 μg/mL 40 kDa FITC-dextran a un puerto de canal de cultivo celular.
    NOTA: 40 kDa FITC-dextran tiene un tamaño molecular similar al VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Captura imágenes cada 3 s durante 30 s. Por lo tanto, se mide la permeabilidad diffusional sin revestimiento celular.
  7. Saque el chip de brote microfluídico después de que los HUVECs sean confluentes en el canal de cultivo celular.
  8. Repita los pasos 5.3-5.5.
  9. Captura imágenes cada 3 s durante 30 s. Por lo tanto, se mide la permeabilidad diffusional con revestimiento celular.
  10. Calcular la permeabilidad diffusional cuantificando los cambios de intensidad fluorescente a lo largo del tiempo utilizando la siguiente ecuación modificada50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)· Δt) · S/d
    donde, Pd es el coeficiente de permeabilidad diffusional, I1 es la intensidad media en un punto de tiempo inicial, I2 es la intensidad media después del tiempo delta(Δt), Ib es la intensidad de fondo, S es el área del canal en imágenes de fluorescencia, y d es el intervalo total de micro-postes en imágenes de fluorescencia. En la obra actual, Δt se establece como 9 s.
    NOTA: La ecuación actual es ligeramente diferente de laoriginal 50,debido a la dirección de difusión de la fluorescencia en el chip es sólo desde el canal EC hasta el canal hidrogel, que no es como el tubo circular que se difumina en toda la dirección radial.

6. Configuración del sistema de control microfluídico

NOTA: El sistema de control microfluídico en el presente estudio consiste en una bomba de micro-jeringa, una válvula de pellizco electromagnético, un chip trampa de burbujas, un chip microfluídico, una bomba micro-peristáltica y un depósito. Cada parte del sistema se puede sustituir por alternativas capaces de realizar la misma función.

  1. Fabricación de chips trampa de burbujas
    NOTA: El chip trampa de burbujas se utiliza para eliminar burbujas de aire en circulación. El chip consta de tres capas PDMS. La capa superior se construye utilizando litografía suave para formar la estructura de la rejilla como la cámara líquida. Cada canal de la estructura de la cuadrícula tiene 100 μm de ancho. La capa inferior es un fragmento PDMS con un taladro. Entre las dos capas, se coloca una película PDMS delgada de 100 μm.
    1. Repita el paso 1 para preparar la oblea para el chip trampa de burbujas.
    2. Repita los pasos 2.1-2.5 para fabricar la capa superior y la capa inferior del chip trampa de burbujas.
      NOTA: La fotomasa de la capa superior contiene tres conjuntos de patrones, así que corta la capa PDMS en tres chips según el patrón.
    3. Perfora seis agujeros en el extremo de los canales de entrada y salida de la capa superior usando un punzón de biopsia de 3,5 mm.
    4. Perfora dos agujeros en la posición correspondiente de la capa inferior usando un punzón de biopsia de 6 mm según el patrón en la capa superior.
    5. Repita los pasos 2.1-2.2 para preparar 10 g de mezcla PDMS y vierta en el centro de una oblea de silicio limpiada.
    6. Fabrica una película PDMS de 100 μm aplicando el siguiente protocolo de giro: gira durante 15 s a 500 rpm, aumenta la velocidad de giro a 1.300 rpm y espera aquí durante 45 s.
    7. Transfiera la oblea a una placa de cocción precalentada a 180 °C y hornee durante 30 minutos.
    8. Limpie las capas perforadas con cinta sin residuos para eliminar los residuos PDMS. Coloque las capas superiores y la oblea en un limpiador de plasma y trátalas con plasma de oxígeno durante 30 s para formar unión covalente en la superficie.
    9. Saca las capas superiores y las obleas. Conecte el lado de entidades de las capas superiores a la película PDMS.
    10. Corte la película cuidadosamente a lo largo del borde de las capas superiores con una aguja.
    11. Separa lentamente la película de la oblea y gira las fichas para hacer que el lado de la película se levante después de la separación.
    12. Coloque las capas inferiores y las virutas conectadas en un limpiador de plasma y trátelas con plasma de oxígeno durante 30 s de nuevo.
    13. Saque las capas inferiores y los chips conectados. Conecte las capas inferiores a la película PDMS y los chips trampa de burbujas están hechos.
      NOTA: Alinee los taladros de la capa inferior con los patrones de la capa superior al conectarlos.
    14. Coloque las virutas en un horno seco de 80 °C durante 1 h para intensificar la unión.
  2. Montar el sistema de control microfluídico
    NOTA: Todas las partes del sistema, como el chip trampa de burbujas, el depósito, los tubos y los conectores se utilizan después de la esterilización autoclave, excepto el equipo electrónico. Monte el sistema de control microfluídico en un banco limpio.
    1. Para ensamblar el sistema de control microfluídico, prepare dos tubos de politetrafluoroetileno, dos tubos cortos de silicona, tres tubos largos de silicona, un adaptador Luer hembra de púas, un conector tipo Y y tres conectores tipo L.
      NOTA: La ventaja del tubo de politetrafluoroetileno es baja elasticidad, por lo tanto, se necesitan menos medios en tubería. El tubo de silicona, en cambio, tiene alta elasticidad, por lo tanto, es adecuado para la válvula de pellizcar y la bomba peristáltica.
    2. Llene la jeringa con 10 ml de medio ECM precalentado (37 °C).
      NOTA: El precalentamiento ayuda al gas disuelto de liberación media.
    3. Conecte un tubo de politetrafluoroetileno a la jeringa mediante un adaptador luer hembra de púas. A continuación, conecte el otro extremo del tubo de politetrafluoroetileno a un conector de tipo Y.
    4. A continuación, conecte dos tubos largos de silicona a los otros dos extremos del conector tipo Y con un tubo que se conecta al depósito y el otro tubo que se conecta al chip trampa de burbujas.
    5. Conecte otro tubo largo de silicona al depósito.
    6. A continuación, utilice dos tubos cortos de silicona para conectar todos los orificios de entrada y salida en la capa superior del chip trampa de burbujas. Conecte un tubo de politetrafluoroetileno al back-end del chip.
    7. A continuación, fije la jeringa en la bomba de micro-jeringa.
    8. Recorte dos tubos largos de silicona en la válvula de pellizco electromagnético.
    9. A continuación, cambie la válvula de pellizco electromagnético para abrir la tubería entre la jeringa y el depósito. Inyecte el soporte en el depósito utilizando una bomba de micro jeringa para agotar el aire en el tubo.
    10. A continuación, vuelva a cambiar la válvula para abrir la tubería entre la jeringa y el chip trampa de burbujas. Inyecte los medios para llenar la cámara líquida y el tubo back-end del chip trampa de burbujas.

7. Ensayo de brotes endoteliales

NOTA: En el presente estudio se utiliza una incubadora superior de etapa montada con microscopio de contraste de fase para observar el proceso de brotes en tiempo real. La incubadora de la parte superior del escenario puede mantener el control de temperatura, humedad y CO2 en etapas del microscopio, siendo bueno para imágenes de células vivas. Pero el equipo no es necesario para el ensayo. Los protocolos proporcionados aquí también se pueden trabajar en una incubadora de células básica.

  1. Saca chips de brotes endoteliales de la incubadora celular.
  2. A continuación, retire los adaptadores Luer en el lado del cultivo celular. Inserte dos tapones de tubería en los puertos de inyección de hidrogel del chip de brote microfluídico.
    NOTA: Los enchufes pueden transformarse de agujas y su función principal es evitar que los medios se derramen.
  3. Conecte el tubo back-end del chip trampa de burbujas a un puerto del canal de referencia celular.
    NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas en el tubo antes de la conexión.
  4. Inserte un conector tipo T en el otro puerto y conéctelo a un tubo de silicona largo conectado con el depósito.
  5. Corta el tubo largo de silicona en la bomba micro-peristáltica.
  6. A continuación, inserte un filtro de aire en el depósito.
  7. A continuación, ensambla el chip microfluídico para la incubadora de la parte superior del escenario.
  8. A continuación, conecte la bomba de vacío a los agujeros de la capa inferior del chip trampa de burbujas con un tubo TPU.
  9. Configure el volumen de circulación y el caudal en el programa personalizado, que controla simultáneamente la bomba de micro jeringa y la válvula de pellizcar electromagnética(Figura 2).
    NOTA: El caudal a través del canal de referencia cultural de celda endotelial se calcula según la ecuación clásica.
    τ = 6μQ / Wh2
    donde, τ es tensión de cizalla (dyn/cm2),μ es viscosidad del medio (8,8 x 10-4 Pa•s), Q es el caudal a través del canal de cultivo celular endotelial (ml/s), h es altura del canal (70 μm) y W es ancho del canal (1.000 μm). La viscosidad del medio se mide utilizando un viscosímetro rotacional tipo cilindro coaxial. La altura y la anchura del canal están predeterminadas y se confirman manualmente utilizando un microscopio de contraste de fase a una ampliación de 4x. El volumen de circulación es de 5 ml y el caudal es de 85 μL/min (promedio 0,2 m/s en el canal de cultivo celular) para 15 disñido/cm2 de tensión cizallada según el cálculo.
  10. A continuación, configure el caudal de la bomba micro-peristáltica.
    NOTA: El caudal de la bomba micro-peristáltica es ligeramente superior a la bomba de micro-jeringa, con el fin de evitar que los medios se derramen.
  11. Encienda la bomba de micro jeringa. A continuación, se establece el sistema de control de circulación.

8. Análisis de datos

NOTA: Para cuantificar los brotes, se calculó el área normalizada de brotes, la longitud promedio del brote y la longitud más larga del brote. Los resultados representan ± SEM obtenidos de tres estudios independientes. La importancia estadística (P < 0,05) se evalúa por la pruebat del estudiante.

  1. Fijar células y brotes en el chip microfluídico después de experimentos con 4% paraformaldehído en PBS durante 15 min. Nuclei de manchas con dihidrocloruro de 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:1000; Sigma-Aldrich) durante 10 min y luego manchar citoesqueleto con fhalloidina TRITC (P5285, 1:100; Sigma-Aldrich) por 1 h. Lave las células con PBS tres veces a intervalos de 5 minutos entre cada paso.
  2. Tome imágenes confocales de los chips en un modo de mosaico y coselos usando el software de edición de imágenes.
  3. Cuente el número de píxeles fluorescentes de imágenes de proyección Z utilizando un código personalizado en el software de programación para cuantificar el área normalizada de la germinación (Ver archivo suplementario).
  4. Identifique y etiquete manualmente cada punta de brotes en imágenes de proyección Z y calcule las distancias entre las puntas de los brotes a la membrana del sótano de los EC utilizando otro código personalizado para cuantificar la longitud media del brote y la longitud de brote más larga (Ver archivo suplementario).

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Representative Results

El modelo 3D in vitro para imitar el evento inicial de neovascularización (MIEN) presentado aquí consistía en un chip de brote microfluídico y un sistema de control microfluídico. El chip de germinación microfluídica fue optimizado de publicaciones anteriores22,23,37,40,51,52,53. Brevemente, contenía tres canales y seis puertos: un canal de cultivo celular endotelial y un canal líquido con cuatro puertos de inyección de medios, y un canal central de hidrogel con dos puertos de inyección de hidrogel(Figura 3). El sistema de control microfluídico consistía en una bomba de micro-jeringa, una válvula de pellizcar electromagnética, un chip trampa de burbujas, una bomba micro-peristáltica y un depósito medio de cultivo(Figura 4). Se utilizó un programa personalizado para controlar simultáneamente la bomba de micro jeringa y la válvula de pellizcar electromagnética, con la que se puede configurar el caudal y el volumen de circulación. Se introdujo un volumen de compensación para corregir el ligero cambio de volumen después de varios ciclos debido a un error sistémico. Para minimizar el medio utilizado para perfusión, se introdujo una válvula de pellizcar electromagnética para el reciclaje medio. La válvula de pellizco electromagnético podría cambiar entre dos estados para hacer el sistema microfluídico en dos fases en un ciclo. En la fase de inyección, el medio de cultivo se inyectó lentamente de la bomba de micro-jeringa al chip microfluídico para brotar. Mientras que en la fase de reciclaje, el medio de cultivo se extrajo muy rápidamente del depósito de vuelta a la bomba de micro-jeringa.

La función de barrera del micro-recipiente en nuestro modelo MIEN se evaluó midiendo el coeficiente de permeabilidad diffusional(Pd)de 40 kDa FITC-dextran. Como se muestra en la Figura 5,el Pd de chip cultivado estático con revestimiento celular es 0,1 ± 0,3 μm/s, y el Pd de canal vacío sin revestimiento de celda es de 5,4 ± 0,7 μm/s. A continuación, se realizó ensayo de brotes endoteliales bajo estática y perfusión en el modelo MIEN. En condiciones estáticas, el brote endotelial se produjo alrededor de 4 h después de la siembra y los brotes migrarían a través del canal central de hidrogel al otro lado en aproximadamente 48 h. Los brotes se degradaron gradualmente después de las 48 h. Mientras que después de 24 h de exposición a 5 o 15 dyn/cm2 de tensión cizalla (promedio de 0,07 o 0,2 m/s en el canal de cultivo celular), los ECT alineados en la dirección de flujo cambiando de forma poligonal y empedrada a fusible, y el grado de brote disminuyó con el aumento del estrés cizallado(Figura 6). Sin embargo, los brotes en condiciones de cizallación eran más estables que en condiciones de cultivo estático. Podrían mantener más de 48 h bajo perfusión. Las estadísticas cuantitativas mostraron que la germinación endotelial disminuyó significativamente en términos de área de brotes, longitud media de brotes y longitud de brote más larga(Figura 7).

Figure 1
Figura 1: Las células endoteliales se cubren alrededor de la superficie interna del canal de cultivo celular. Los HUVECs se dispersan uniformemente en el canal de cultivo celular 2 h después de la siembra celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: El programa personalizado utilizado para controlar la bomba de micro-jeringa y la válvula de pellizcar electromagnética simultáneamente. Página principal (arriba) y subpágina (abajo) del programa personalizado con el que se puede configurar el caudal y el volumen de circulación. Se introdujo un volumen de compensación para corregir el ligero cambio de volumen después de varios ciclos debido a un error sistémico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El esquema del chip de brote microfluídico. El chip contiene tres canales y seis puertos: un canal de cultivo celular endotelial y un canal líquido con cuatro puertos de inyección de medios, y un canal central de hidrogel con dos puertos de inyección de hidrogel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: El esquema del sistema de control microfluídico. El sistema de control microfluídico consiste en una bomba de micro-jeringa, una válvula de pellizco electromagnético, un chip trampa de burbujas, una bomba micro-peristáltica y un depósito medio de cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Permeabilidad diffusional (Pd) de 40 kDa FITC-dextran. El Pd de chip cultivado estático con revestimiento celular es de 0,1 ± 0,3 μm/s, y el Pd de canal vacío sin revestimiento de celda es de 5,4 ± 0,7 μm/s. **, p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Imágenes representativas de brotes endoteliales en diferentes condiciones de cizallamiento. Después de 24 h de cultivo estático, los HUVECs invaden desde el canal de cultivo celular hasta el canal de hidrogel adyacente a través de micro postes y un gran número de brotes en el hidrogel. Mientras que después de 24 h de exposición a 5 o 15 dyn/cm2 de tensión de cizallamiento, el grado de brote disminuye obviamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Área cuantificada de brotes, longitud media del brote y longitud de brote más larga. Después de 24 h de cultivo estático (S0) o exposición a 5 (S5) o 15 (S15) de tensión de cizallamiento/cm2, el grado de brote disminuye con el aumento del estrés de cizallamiento. *, p < 0,05; **, p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Durante mucho tiempo, la observación en tiempo real de la neovascularización ha sido un problema. Recientemente se han desarrollado varios enfoques para crear revestimientos de recipientes perfundidos con EC y adyacentes a matriz extracelular para brotar22,32,40,46,54,pero el microambiente mecánico todavía es difícil de mantener constantemente. Sigue siendo un tema difícil de imitar el microambiente biomecánico inicial de los ECT, que están sometidos a un alto estrés de cizallamiento luminal y baja velocidad de flujo transendotelial. Aquí, presentamos un modelo MIEN que simula en primer lugar el evento inicial de neovascularización en microambiente fisiológico imitador. Con el modelo MIEN, se logra una perfusión automática, eficiente y sin burbujas a largo plazo. El estrés de cizalladura luminal en los ECT podría cambiarse opcionalmente en cualquier momento durante los experimentos con el flujo transendotelial que se mantiene a nivel fisiológico.

La clave del modelo MIEN es desacoplar el efecto del flujo luminal en los ECT del flujo transendotelial. Para ello, se inserta creativamente un conector de tipo T en el puerto de salida del canal de referencia cultural EC. Un extremo del conector está conectado al depósito a través de la bomba micro-peristáltica. El otro extremo del conector está expuesto al aire de la incubadora. Mantiene la presión dentro del canal de cultivo celular endotelial lo mismo que la presión atmosférica, ya que no hay recolección de medios excedentes para aumentar la presión ni el exceso de medios que se extraen para formar presión negativa en el canal. De esta manera, la resistencia al flujo después de la viruta microfluídica es muy pequeña para que el flujo transendotelial se pueda mantener en el rango fisiológico incluso bajo alto estrés de cizallamiento luminal.

Un paso crítico dentro del protocolo es la inyección exitosa de hidrogel en el canal central de hidrogel. Huang et al. propusieron que el llenado exitoso de los geles depende del equilibrio de las fuerzas capilares y la tensión superficial dentro del canal de gel microfluídico55. Encontraron tres variables diferentes para controlar el equilibrio: el espaciado entre micro postes, las propiedades superficiales del dispositivo y la viscosidad de las soluciones precursoras del hidrogel. En el modelo actual, el diseño del chip de germinación microfluídica está optimizado a partir de trabajos anteriores22,23,37,40,51,52,53. La geometría y el espaciado de micro postes para separar tres canales se determinan en función de cálculos anteriores y numerosos experimentos. Además, se realizan recubrimientos PDL y horneado a alta temperatura para modificar la superficie PDMS; por lo tanto, ajustar el equilibrio entre la hidrofilia y la hidrofobicidad antes de la inyección de hidrogel.

El otro paso crítico del protocolo es la eliminación de burbujas. Una gran cantidad de aire se disolverá en medio de circulación durante el experimento debido al conector tipo T y la bomba micro-peristáltica, lo que resulta en burbujas en circulación y afecta en gran medida la función de las células endoteliales. Para eliminar burbujas, se introduce un chip trampa de burbujas antes de que el chip de brote microfluídico. Funciona en función de la alta permeabilidad al gas de la membrana PDMS. Cuando las burbujas entran en la trampa, son dispersadas por la estructura de la cuadrícula pequeña y densa y atrapadas debido a la presión negativa generada por la bomba de vacío para que no avancen hacia el chip microfluídico. Además, las burbujas transportan a través de la membrana PDMS en el agujero de presión negativa conectado a la bomba de vacío y desaparecen eventualmente. Aun así, se debe prestar gran atención a la formación de burbujas durante el experimento. Tan pronto como se encuentren burbujas antes de que el chip microfluídico para brotar en la tubería, detenga la bomba de micro-jeringa inmediatamente. Revolotee suavemente la tubería con el dedo para permitir que las burbujas se muevan al chip trampa de burbujas y se retiren.

Aunque el microambiente inicial de neovascularización se recapitula parcialmente, hay algunas limitaciones a este modelo MIEN. Las microambientes mecánicas de las células endoteliales, como el estrés de cizallamiento inducido por la sangre y la rigidez de la matriz extracelular, están cambiando durante los procesos de neovascularización. Antes de la neovascularización, la membrana endotelial del sótano sigue intacta con función de barrera completa, lo que resulta en un alto estrés de cizallador luminal con baja velocidad de flujo transendotelial y flujo intersticial8,9. Al inicio de la angiogénesis y la arteriogénesis, un evento distintivo es la mediación de metaloproteasas matriciales (MMPs) de degradación del sótano, lo que aumentará la permeabilidad de los EC y la matriz de remodelación, lo que conducirá a cambios en los microambientes mecánicos como el estrés de cizallamiento inducido por la sangre y la rigidez de la matriz extracelular. En el presente trabajo, nos centramos en el inicio de la neovascularización por lo que los ambientes mecánicos dentro del chip microfluídico de germinación están diseñados para mantenerse estables para simular las condiciones fisiológicas. Sin embargo, los cambios en los microambientes mecánicos se producirán con los EC brotando, al igual que in vivo. Además, al igual que muchos estudios previos34,53,56, el modelo actual toma hidrogel de colágeno como una matriz extracelular. A medida que nos centramos en el efecto del estrés de cizallación inducido por el flujo, sólo se utiliza un hidrogel de rigidez. Sin embargo, teniendo en cuenta el importante efecto de la rigidez matricial en el comportamiento celular y la neovascularización, diferentes rigideces del colágeno deben ser estudiados y se pueden lograr mediante la regulación del pH de colágeno ya que las propiedades mecánicas del colágeno depende de su pH49. Pero es importante tener en cuenta que el hidrogel necesita ser enjuagado a fondo con PBS para eliminar los ácidos residuales o bases antes de la siembra celular para evitar daños a las células. Además, para imitar los componentes complejos de ECM in vivo, varios hidrogeles como Matrigel, ácido hialurónico (HA), y fibrinógeno, etc. deben utilizarse en el futuro para mejorar el modelo actual. La tensión cíclica inducida por la presión arterial es otra fuerza hemodinámica importante que modula la morfología y las funciones de las células vasculares57. Estudios previos han demostrado que la tensión de tracción mejoró la expresión de factores angiogénicos en las células madre mesenquimales humanas58 e indujo angiogénesis a través de la degradación del colágeno tipo IV en la membrana del sótano endotelial vascular59. Estos resultados indicaron que la tensión inducida por la presión arterial también puede afectar la neovascularización. El modelo actual se centra en el efecto del estrés de cizallador inducido por el flujo por lo que no es aplicable para introducir la tensión, ya que el hidrogel no se pega lo suficientemente fuerte al canal y se caerá cuando se estira. Prestaremos atención para superar esta dificultad en futuras obras.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (subvención nº 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 y 32071311), Programa Nacional clave de investigación y desarrollo de China (subvención Nº 2016YFC1101101 y 2016YFC1102202), el Proyecto 111 (B13003) y la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (4194079).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285

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Modelo microfluídico para imitar el evento inicial de neovascularización
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Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang,… More

Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).

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