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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Modèle microfluidique pour imiter l'événement initial de la néovascularisation

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62003
Automatic Translation
1, 1, 1, 4, 1, 1, 1, 3, 1,2
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

Ici, nous fournissons une puce microfluidique et un système microfluidique de circulation automatiquement contrôlé et très efficace qui récapitule le microenvironnement initial de la néovascularisation, permettant aux cellules endothéliales (CE) d'être stimulées simultanément par un stress de cisaillement luminal élevé, un niveau physiologique de flux transendothelial et diverses distributions simultanées du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF).

Abstract

La néovascularisation est habituellement paraphée à partir d'une vascularisation normale existante et le microenvironnement biomécanique des cellules endothéliales (CE) à l'étape initiale varie considérablement du processus suivant de néovascularisation. Bien qu'il existe de nombreux modèles pour simuler les différentes étapes de la néovascularisation, un modèle 3D in vitro qui capitule le processus initial de néovascularisation sous les stimulations correspondantes des microenvironnements vasculature normale fait encore défaut. Ici, nous avons reconstruit un modèle 3D in vitro qui imite l'événement initial de la néovascularisation (MIEN). Le modèle MIEN contient une puce de germination microfluidique et un système de circulation automatique et très efficace. Un microcanal fonctionnel et perfusable recouvert d'endothélium a été formé et le processus de germination a été simulé dans la puce de germination microfluidique. Le microenvironnement initialement physiologique de la néovascularisation a été récapitulé avec le système de contrôle microfluidique, par lequel les CE seraient exposés à l'effort élevé de cisaillement luminal, au flux transendothelial physiologique, et à diverses distributions vasculaires de facteur de croissance endothéliale (VEGF) simultanément. Le modèle MIEN peut être facilement appliqué à l'étude du mécanisme de néovascularisation et détient une promesse potentielle en tant que plate-forme à faible coût pour le dépistage des médicaments et les applications toxicologiques.

Introduction

La néovascularisation se produit dans de nombreux processus normaux et pathologiques1,2,3,4, qui comprennent deux processus majeurs chez les adultes, l'angiogenèse et l'artériogenèse5. Outre les facteurs de croissance les plus connus, tels que le facteur vasculaire de croissance endothéliale (VEGF)6, les stimulations mécaniques, en particulier le stress de cisaillement induit par le flux sanguin, est important dans la régulation de la néovascularisation7. Comme nous le savons, l'ampleur et les formes de stress de cisaillement varient considérablement et dynamiquement dans différentes parties de la vascularisation, entraînant des effets importants sur les cellulesvasculaires 8,9,10,11,12. Des études antérieures ont montré que le stress du cisaillement peut affecter divers aspects des CE, y compris les changements phénotypiques cellulaires, la transduction du signal, l'expression des gènes et la communicationavec les cellules murales 13,14,15,16,17,18,19,20; par conséquent, réglementer la néovascularisation21,22,23,24.

Par conséquent, pour mieux comprendre la néovascularisation, il est important de reconstruire le processus en microenvironnement cellulaire naturel in vitro. Récemment, de nombreux modèles ont été mis en place pour créer des micro-navires et fournir un contrôle précis du microenvironnement25,26,27, en profitant des progrès de la microfabrication et de la technologie microfluidique. Dans ces modèles, les micro-navires peuvent être générés par hydrogel28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) puces microfluidiques30,31,32 ou bioimpression 3D33,34. Certains aspects du microenvironnement, tels que le stress de cisaillement luminal22,23,35,36, flux transendothelial37,38,39,40, gradient biochimique des facteurs angiogéniques41,42, souche / étirement43,44,45, et co-cultivé avec d'autres types de cellules32,46 ont été imités et contrôlés. Habituellement, un grand réservoir ou une pompe à seringues était utilisé pour fournir un milieu perfusé. Le flux transendothelial dans ces modèles a été créé par la baisse de pression entre le réservoir et le micro-tube22,23,38,40. Cependant, le microenvironnement mécanique était difficile à maintenir constamment de cette façon. Le débit transendothelial augmenterait et dépasserait alors le niveau physiologique si un taux d'écoulement élevé avec le stress élevé de cisaillement a été employé pour la perfusion. L'étude précédente a prouvé qu'à la période initiale de la néovascularisation, la vitesse du flux transendothelial est très basse en raison des CE intacts et de la membrane de sous-sol, habituellement sous 0.05 μm/s8. Pendant ce temps, bien que le stress de cisaillement luminal dans le système vasculaire varie considérablement, il est relativement élevé avec des valeurs moyennes de 5-20 dyn/cm2,11,47. Pour l'instant, la vitesse du flux transendothelial dans les travaux précédents ont été généralement maintenus entre 0,5-15 μm/s22,38,39,40, et le stress de cisaillement luminal était généralement inférieure à 10 dyn/cm2 23. Il reste un sujet difficile d'exposer constamment les CE à l'effort de cisaillement luminal élevé et au niveau physiologique du flux transendothelial simultanément.

Dans la présente étude, nous décrivons un modèle 3D in vitro pour imiter l'événement initial de la néovascularisation (MIEN). Nous avons développé une puce microfluidique et un système de circulation automatique, très efficace pour former des micro-tubes de perfusion et simuler le processus de germination48. Avec le modèle MIEN, le microenvironnement des CE stimulé à la période initiale de néovascularisation est d'abord récapitulé. Les CE peuvent être stimulés par un stress de cisaillement luminal élevé, un niveau physiologique de flux transendothelial et diverses distributions de VEGF simultanément. Nous décrivons en détail les étapes de l'établissement du modèle MIEN et les points clés à prendre en compte, dans l'espoir de fournir une référence à d'autres chercheurs.

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Protocol

1. Préparation des gaufrettes

REMARQUE : Ce protocole est spécifique pour le photorésiste négatif SU-8 2075 utilisé au cours de cette recherche.

  1. Nettoyez la plaquette de silicium 3 à 5 fois avec du méthanol et de l'isopropanol sur un revêtement de spin comme suit : d'abord tourner pendant 15 s à 500 rpm, puis tourner pendant 60 s à 3 000 tours.
  2. Transférer la plaquette de silicium sur une plaque chauffante, préchauffée à 180 °C et cuire la gaufrette pendant 10 min.
  3. Retirer la plaquette de silicium de la plaque chauffante et la refroidir à température ambiante. Nettoyez à nouveau la gaufrette avec de l'air comprimé avant de procéder au revêtement de spin. Appliquer 4 mL du photorésistant SU-8 2075 au centre de la gaufrette.
  4. Obtenez une hauteur de caractéristique de 70 μm sur le revêtement de spin comme suit : première rotation pour 12 s à 500 rpm, puis tournez pendant 50 s à 2 100 rpm.
  5. Cuire doucement la gaufrette sur une plaque chauffante comme suit : cuire d'abord pendant 8 min à 65 °C, puis cuire au four pendant 20 min à 95 °C. Ensuite, retirez la plaquette de silicium de la plaque chauffante et refroidissez-la à température ambiante avant la lithographie.
  6. Placez un photomask sur le film photorésiste. Exposez la gaufrette avec un équipement de lithographie pour atteindre une exposition totale de 200 mJ/cm2.
    REMARQUE : Le photomask contient neuf ensembles de motifs de la puce, de sorte qu'il peut fabriquer neuf croustilles de germination microfluidiques à chaque fois.
  7. Poster exposer la gaufrette sur une plaque chauffante comme suit : cuire d'abord pendant 5 min à 65 °C, puis cuire au four pendant 20 min à 95 °C. Ensuite, retirez la plaquette de silicium de la plaque chauffante et refroidissez-la à température ambiante avant de la développer.
  8. Transférer la gaufrette dans une boîte de Pétri en verre remplie de développeur SU-8 (PGMEA) pour commencer à se développer.
    ATTENTION: Le développeur est irritant pour les yeux et les voies respiratoires. Effectuer le développement dans une hotte de fumée. Portez des lunettes d'éclaboussure, des gants de nitrile et un masque de compagnie aérienne pendant l'opération.
  9. Secouez doucement le plat le long de la direction du canal d'écoulement et changez le développeur après 10 min.
  10. Répétez l'étape 1.9 3-5 fois jusqu'à ce que les modèles puissent être clairement observés.
    REMARQUE : Assurez-vous qu'il n'y a plus de résidus photorésistants sur la gaufrette, sinon rincez à nouveau la gaufrette dans le développeur.
  11. Transférer la gaufrette sur une plaque chauffante préchauffée à 120 °C et cuire au four pendant 30 min.
  12. Pipet 35 μL de silane sur un coverslip, puis mettre le coverslip avec la gaufrette dans un desiccator et tirer le vide. Sceller le desiccateur et laisser la gaufrette sous vide pendant 4 h pour silanize la gaufrette pour empêcher l'adhérence de PDMS pendant les processus de lithographie douce.
    ATTENTION: La silane est toxique. Pour prévenir l'empoisonnement, effectuez une silanisation dans le capot des fumées et portez des gants de nitrile pendant la manipulation.
  13. Relâchez le vide du dessiccateur. Retirer la gaufrette silanisée sur une plaque chauffante préchauffée et cuire au four à 65 °C pendant 2 h.
  14. Conserver la gaufrette dans une boîte de Pétri propre jusqu'à ce qu'elle soit nécessaire.

2. Fabrication microfluidique de copeaux de germination

  1. Dans un bécher en plastique, mélanger 20 g d'agent de base et 2 g d'agent de séchage (rapport 10:1) et bien mélanger à l'aide d'une tige de mélange.
  2. Placez le bécher dans un dessiccateur et tirez le vide pendant 1 h pour enlever les bulles d'air dans le mélange PDMS.
  3. Verser le mélange PDMS sur la gaufrette dans la boîte de Pétri et remettre la boîte de Pétri dans le dessiccateur, en dégazant encore 30 minutes.
    REMARQUE : Il est utile d'utiliser du ruban adhésif à double face pour coller la gaufrette sur le fond de la boîte de Pétri pour s'assurer que la gaufrette est maintenue horizontale pendant le dégazage et le séchage.
  4. Retirer la boîte de Pétri du dessiccateur et la placer dans un four sec à 80 °C pendant 3 h pour la guérir.
  5. Séparez soigneusement la couche PDMS de la gaufrette et coupez la couche en neuf copeaux à l'aide d'un scalpel selon le motif.
    REMARQUE : Gardez le côté caractéristique vers le haut après la séparation.
  6. Perforez deux ports d'injection d'hydrogel et quatre ports d'injection de médias de chaque puce à l'aide d'un poinçon de biopsie de 1 mm et de 3,5 mm, respectivement.
  7. Nettoyez les copeaux perforés avec du ruban sans résidus pour éliminer les résidus de PDMS. Placez les copeaux et neuf couvercles en verre dans un nettoyeur de plasma et traitez-les avec du plasma d'oxygène pendant 30 s pour former un collage covalent à la surface.
  8. Sortez les jetons et les coverslips. Fixez le côté caractéristique des puces sur les coverslips.
  9. Placer les copeaux attachés dans un four sec à 80 °C pendant 1 h pour intensifier le collage.
  10. Autoclave les puces avant utilisation et les garder stériles pour le reste de la procédure.

3. Modification de surface et injection d'hydrogel

  1. Pour chaque puce, pipet 40 μL de 1 mg/mL poly-D-lysine (PDL) et l'injecter dans les canaux de la puce à partir du port d'injection d'hydrogel.
    REMARQUE : Assurez-vous que le PDL remplit les canaux, en particulier dans les canaux étroits près des ports.
  2. Incuber les copeaux à 37 °C pendant 4 h pour modifier la surface du PDMS.
  3. Pipet 200 μL d'eau stérile et l'injecter dans les canaux dans la puce du port d'injection d'hydrogel pour laver PDL.
  4. Retirer les copeaux dans un four sec à 120 °C pendant 3 h pour restaurer l'hydrophobicité.
  5. Placez sur la glace un tube stérile et calculez le volume de collagène de type I à utiliser comme équation suivante.
    Volume final (50 μL) x Concentration finale de collagène (3 mg/mL dans cette recherche) / Concentration en bouteille = volume de collagène à ajouter
  6. Calculez le volume de NaOH à utiliser comme équation suivante.
    (volume collagène à ajouter) x 0,023 = volume 1 N NaOH
  7. Préparer 50 μL d'hydrogel dans le tube comme protocole suivant : ajouter 5 μL de 10 x PBS, 0,5 μL de phénol rouge, volume calculé de 1 N NaOH, 4 μL de 1 mg/mL de fibronectine, volume calculé de collagène de type I à son tour. Ajouter la quantité appropriée de dH2O de sorte que le volume total atteint 50 μL. Mélanger tout le contenu dans le tube à fond.
    REMARQUE : Effectuez toutes les opérations sur la glace. Utilisez le phénol rouge comme indicateur à base d'acide pour aider à la détermination visuelle du pH de l'hydrogel. L'hydrogel final finit orange lorsque le pH est d'environ 7,4 et la rigidité est d'environ 15 kPa49.
  8. Pipet 2-3 μL d'hydrogel pour chaque puce et lentement l'injecter dans le canal hydrogel central à partir du port d'injection d'hydrogel.
  9. Incuber les copeaux à 37 °C pendant 30 min pour permettre la gelation.
    REMARQUE : Sceller les copeaux dans une boîte scellée avec 1 mL d'eau stérile s'ils ne sont pas utilisés immédiatement. Les copeaux scellés peuvent être stockés à 37 °C pendant tout au plus 24 h.

4. Ensemencement cellulaire

  1. Pipet 20 μL de 125 μg/mL Fibronectin dans un port d'injection de médias du canal de culture cellulaire.
  2. Couper une pointe de pipette pour s'adapter au port du canal de culture cellulaire avec des ciseaux.
  3. Insérez la pointe pipette dans l'autre port d'injection multimédia du canal de culture cellulaire. Ensuite, pipet l'air du canal de culture cellulaire pour le remplir de Fibronectin.
  4. Incuber les copeaux à 37 °C pendant 1 h.
  5. Avant l'ensemencement cellulaire, pipet 20 μL de supports ECM dans chaque port d'injection de médias et incuber les copeaux à 37 °C pendant 30 min.
  6. Ensuite, pipet tous les médias dans tous les ports d'injection des médias.
  7. Ensuite, pipet 5 μL de suspension cellulaire dans un port d'injection de médias de canal de culture cellulaire. Ensuite, les cellules endothéliales se propagent rapidement sur l'ensemble du canal sous pression hydrostatique différentielle.
    REMARQUE : Préparez la suspension cellulaire en trypsinisant les cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVECs) de la fiole de culture et en les centrifugant à 400 x g. Ensuite, resuspendez les cellules à 107 cellules/mL dans un tube.
  8. Ajouter environ 4-6 μL de supports ECM à l'autre port pour ajuster la pression hydrostatique et arrêter le déplacement des cellules.
  9. Retirer les copeaux à l'incubateur cellulaire. Ensuite, retournez les copeaux toutes les 30 minutes jusqu'à ce que les cellules endothéliales s'enrobent autour de la surface interne du canal de culture cellulaire 2 h plus tard (figure 1).
    REMARQUE: Pour faire la puce à l'envers, pipet un peu d'eau sur le dos de la couverture. Ensuite, la puce peut s'attacher à la couverture de la boîte de Pétri.
  10. Utilisez la pointe pipette pour enlever très soigneusement les cellules attachées dans les ports d'injection.
  11. Ensuite, insérez quatre adaptateurs Luer femelles barbelées dans les ports d'injection des médias et remplissez-les de supports ECM.
    REMARQUE : Les adaptateurs peuvent fonctionner comme des réservoirs fluides pour fournir des nutriments aux cellules du chenal.
  12. Retirer les copeaux à l'incubateur cellulaire. Changez les supports ECM dans les adaptateurs Luer toutes les 12 h.

5. Mesure de la perméabilité diffusionnelle FITC-dextran

REMARQUE : Pour évaluer la fonction de barrière du micro-vaisseau, la perméabilité diffusionnelle du canal culturel communautaire avec ou sans doublure cellulaire est évaluée.

  1. Sortez une puce de germination microfluidique avec de l'hydrogel injecté.
  2. Répétez les étapes 4.1-4.6.
  3. Retirez tous les adaptateurs Luer et retirez tous les supports dans quatre ports d'injection multimédia.
  4. Placez la puce sur le microscope à balayage laser confocal.
  5. Pipet 5 μL de supports culturels contenant 500 μg/mL 40 kDa FITC-dextran à un port de canal de culture cellulaire.
    REMARQUE: 40 kDa FITC-dextran a la taille moléculaire similaire à VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Capturez des images tous les 3 s pendant 30 s. Ainsi, la perméabilité diffusionnelle sans doublure cellulaire est mesurée.
  7. Sortez la puce de germination microfluidique après que les VHC soient confluents dans le canal de culture cellulaire.
  8. Répétez les étapes 5.3-5.5.
  9. Capturez des images tous les 3 s pendant 30 s. Ainsi, la perméabilité diffusionnelle avec doublure cellulaire est mesurée.
  10. Calculez la perméabilité diffusionnelle en quantifiant les changements d'intensité fluorescente au fil du temps à l'aide de l'équationmodifiée suivante 50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)· Δt) · S/d
    où, P d est le coefficient de perméabilité diffusionnelle, I1 est l'intensité moyenne à un point de temps initial, I 2 est l'intensité moyenne après le temps delta (Δt), je b estl'intensité de fond, S est la zone du canal dans les images de fluorescence, et d est l'intervalle total de micro-messages dans les images de fluorescence. Dans le présent ouvrage, Δt est fixé à 9 s.
    REMARQUE: L'équation actuelle est légèrement différente del'original 50, en raison de la direction de diffusion de la fluorescence dans la puce est seulement du canal EC au canal hydrogel, qui n'est pas comme le tube circulaire diffusant dans toute la direction radiale.

6. Configuration du système de contrôle microfluidique

REMARQUE : Le système de contrôle microfluidique de la présente étude est composé d'une pompe à micro-seringues, d'une valve de pincement électromagnétique, d'une puce de piège à bulles, d'une puce microfluidique, d'une pompe micro-périssaltique et d'un réservoir. Chaque partie du système peut être remplacée par des alternatives capables d'exécuter la même fonction.

  1. Fabrication de copeaux de piège à bulles
    REMARQUE : La puce de piège à bulles est utilisée pour éliminer les bulles d'air en circulation. La puce se compose de trois couches PDMS. La couche supérieure est construite en utilisant la lithographie douce pour former la structure de grille comme chambre liquide. Chaque canal de la structure du réseau est de 100 μm de large. La couche inférieure est un morceau PDMS avec un trou. Entre les deux couches, un film PDMS mince de 100 μm est posé.
    1. Répétez l'étape 1 pour préparer la gaufrette à la puce du piège à bulles.
    2. Répétez les étapes 2.1-2.5 pour fabriquer la couche supérieure et la couche inférieure de la puce de piège à bulles.
      REMARQUE : Le masque photo de la couche supérieure contient trois ensembles de motifs, alors coupez la couche PDMS en trois puces selon le motif.
    3. Perforer six trous à l'extrémité des canaux d'entrée et de sortie de la couche supérieure à l'aide d'un poinçon de biopsie de 3,5 mm.
    4. Perforer deux trous sur la position correspondante de la couche inférieure à l'aide d'un poinçon biopsie de 6 mm selon le motif sur la couche supérieure.
    5. Répétez les étapes 2.1-2.2 pour préparer 10 g de mélange PDMS et versez-le au centre d'une gaufrette de silicium nettoyée.
    6. Fabriquez un film PDMS de 100 μm en appliquant le protocole de spin suivant : tournez pendant 15 s à 500 tours, augmentez la vitesse de rotation à 1 300 tours et maintenez ici pendant 45 s.
    7. Transférer la gaufrette sur une plaque chauffante préchauffée à 180 °C et cuire au four pendant 30 min.
    8. Nettoyez les couches perforées avec du ruban sans résidus pour éliminer les résidus de PDMS. Placez les couches supérieures et la gaufrette dans un nettoyant plasmatique et traitez-les avec du plasma d'oxygène pendant 30 s pour former une liaison covalente à la surface.
    9. Sortez les couches supérieures et la gaufrette. Fixez le côté long métrage des couches supérieures sur le film PDMS.
    10. Couper soigneusement le film le long du bord des couches supérieures à l'aide d'une aiguille.
    11. Séparez lentement le film de la gaufrette et retournez les copeaux pour faire le côté film vers le haut après la séparation.
    12. Placez les couches inférieures et les copeaux attachés dans un nettoyeur de plasma et traitez-les avec du plasma d'oxygène pendant 30 s à nouveau.
    13. Sortez les couches inférieures et les copeaux attachés. Fixez les couches inférieures sur le film PDMS et les puces de piège à bulles sont faites.
      REMARQUE : Alignez les trous sur la couche inférieure avec les motifs sur la couche supérieure lors de l'attachement.
    14. Placer les copeaux dans un four sec à 80 °C pendant 1 h pour intensifier le collage.
  2. Assembler le système de contrôle microfluidique
    REMARQUE : Toutes les parties du système, telles que la puce de piège à bulles, le réservoir, les tubes et les connecteurs sont utilisées après stérilisation automatique, à l'exception de l'équipement électronique. Assembler le système de contrôle microfluidique sur un banc propre.
    1. Pour assembler le système de commande microfluidique, préparez deux tubes en polytétrafluoroéthylène, deux tubes courts en silicone, trois longs tubes en silicone, un adaptateur Luer femelle barbelé, un connecteur de type Y et trois connecteurs de type L.
      REMARQUE : L'avantage du tube de polytétrafluoroéthylène est une faible élasticité, par conséquent, moins de médias sont nécessaires dans le pipeline. Tube de silicone, en revanche, a une élasticité élevée, par conséquent, il convient à la valve de pincement et pompe périssaltique.
    2. Remplir la seringue de 10 mL de milieu ECM préchauffé (37 °C).
      REMARQUE : Le préchauffement aide le gaz dissous à libération moyenne.
    3. Connectez un tube de polytétrafluoroéthylène à la seringue par un adaptateur Luer femelle barbelé. Ensuite, connectez l'autre extrémité du tube de polytétrafluoroéthylène à un connecteur de type Y.
    4. Ensuite, connectez deux longs tubes de silicone aux deux autres extrémités du connecteur de type Y avec un tube se connectant au réservoir et l'autre tube se connectant à la puce de piège à bulles.
    5. Connectez un autre long tube de silicone au réservoir.
    6. Ensuite, utilisez deux courts tubes en silicone pour connecter tous les trous d'entrée et de sortie sur la couche supérieure de la puce piège à bulles. Connectez un tube de polytétrafluoroéthylène à l'arrière de la puce.
    7. Ensuite, fixez la seringue sur la pompe à micro-seringues.
    8. Clip deux longs tubes de silicone dans la valve de pincement électromagnétique.
    9. Ensuite, passez la valve de pincement électromagnétique pour ouvrir le pipeline entre la seringue et le réservoir. Injecter le média dans le réservoir à l'aide d'une pompe à micro-seringues pour épuiser l'air dans le tube.
    10. Ensuite, changez à nouveau la vanne pour ouvrir le pipeline entre la seringue et la puce du piège à bulles. Injectez le média pour remplir la chambre liquide et le tube de backend de la puce de piège à bulles.

7. Essai de germination endothéliale

REMARQUE : Un incubateur de dessus de scène assemblé avec le microscope de contraste de phase est employé dans la présente étude pour observer le processus de germination en temps réel. L'incubateur supérieur de scène peut maintenir le contrôle de température, d'humidité, et de CO2 sur des étapes de microscope, étant bon pour l'imagerie de cellules vivantes. Mais l'équipement n'est pas nécessaire pour l'essai. Les protocoles fournis ici peuvent également être travaillés dans un incubateur de cellules de base.

  1. Sortez les croustilles de germination endothéliale de l'incubateur cellulaire.
  2. Ensuite, retirez les adaptateurs Luer du côté de la culture cellulaire. Insérez deux bouchons de tuyau dans les ports d'injection d'hydrogel de la puce de germination microfluidique.
    REMARQUE : Les bouchons peuvent se transformer à partir d'aiguilles et leur fonction principale est d'empêcher les médias de se renverser.
  3. Connectez le tube de backend de puce de piège à bulles à un port de canal de culture cellulaire.
    REMARQUE : Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles dans le tube avant la connexion.
  4. Insérez un connecteur de type T à l'autre port et connectez-le à un long tube de silicone relié au réservoir.
  5. Couper le long tube de silicone dans la pompe micro-périssaliste.
  6. Ensuite, insérez un filtre à air dans le réservoir.
  7. Ensuite, assemblez la puce de germination microfluidique à l'incubateur supérieur de scène.
  8. Ensuite, connectez la pompe à vide aux trous dans la couche inférieure de la puce de piège à bulles avec un tube TPU.
  9. Configurer simultanément le volume de circulation et le débit dans le programme personnalisé, qui contrôle simultanément la pompe à micro-seringues et la soupape électromagnétique de pincement (figure 2).
    REMARQUE : Le débit à travers le canal de culture cellulaire endothéliale est calculé en fonction de l'équation classique.
    = 6μQ / Wh2
    où, τ est le stress de cisaillement (dyn/cm2),μ est viscosité du milieu (8,8 x 10-4 Pa•s), Q est le débit à travers le canal de culture cellulaire endothéliale (ml/s), h est la hauteur du canal (70 μm), et W est la largeur du canal (1000 μm). La viscosité du milieu est mesurée à l'aide d'un viscomètre rotatif de type cylindre coaxial. La hauteur et la largeur du chenal sont prédéterminées et confirment manuellement à l'aide d'un microscope à contraste de phase au grossissement 4x. Le volume de circulation est de 5 mL et le débit est de 85 μL/min (moyenne de 0,2 m/s dans le canal de culture cellulaire) pour un stress decisaillement de 15 dyn/cm 2 selon le calcul.
  10. Ensuite, configurer le débit de la pompe micro-périssaltique.
    REMARQUE : Le débit de la pompe micro périssaliste est légèrement plus élevé que celui de la pompe à micro-seringues, afin d'empêcher les médias de se renverser.
  11. Allumez la pompe à micro-seringues. Ensuite, le système de contrôle de la circulation est établi.

8. Analyse des données

REMARQUE : Pour quantifier les germes, la zone normalisée de germination, la longueur moyenne des pousses et la longueur de germination la plus longue ont été calculées. Les résultats représentent une ± sem obtenue à partir de trois études indépendantes. La signification statistique (P < 0,05) est évaluée par t-testde l'étudiant.

  1. Fixer les cellules et les germes dans la puce de germination microfluidique après des expériences avec 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 15 min. Noyaux de tache avec 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI ; 1 : 1000 ; Sigma-Aldrich) pendant 10 min, puis tacher le cytosquelette avec la phalloidine TRITC (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) pour 1 h. Laver les cellules avec PBS trois fois à intervalles de 5 min entre chaque étape.
  2. Prenez des images confoccales des puces en mode carrelage et cousez-les à l'aide d'un logiciel d'édition d'images.
  3. Comptez le nombre de pixels fluorescents d'images de projection Z à l'aide d'un code personnalisé dans un logiciel de programmation pour quantifier la zone normalisée de germination (Voir fichier supplémentaire).
  4. Identifiez et étiquetez manuellement chaque pointe de germes dans les images de projection Z et calculez les distances entre les pointes des germes à la membrane du sous-sol des CE à l'aide d'un autre code personnalisé pour quantifier la longueur moyenne des germes et la plus longue longueur des germes (voir fichier supplémentaire).

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Representative Results

Le modèle 3D in vitro pour imiter l'événement initial de néovascularisation (MIEN) présenté ici se composait d'une puce de germination microfluidique et d'un système de contrôle microfluidique. La puce de germination microfluidique a été optimisée à partir des publicationsprécédentes 22,23,37,40,51,52,53. En bref, il contenait trois canaux et six ports : un canal de culture cellulaire endothéliale et un canal liquide avec quatre ports d'injection de médias, et un canal hydrogel central avec deux ports d'injection d'hydrogel (figure 3). Le système de commande microfluidique se composait d'une pompe à micro-seringues, d'une valve électromagnétique de pincement, d'une puce de piège à bulles, d'une pompe micro-périssaliste et d'un réservoir moyen de culture (figure 4). Un programme personnalisé a été utilisé pour contrôler simultanément la pompe à micro-seringues et la valve électromagnétique de pincement, avec lesquelles le débit et le volume de circulation peuvent être mis en place. Un volume de compensation a été introduit pour corriger le léger changement de volume après plusieurs cycles en raison d'une erreur systémique. Afin de minimiser le milieu utilisé pour la perfusion, une soupape électromagnétique de pincement a été introduite pour le recyclage moyen. La valve de pincement électromagnétique pourrait basculer entre deux états pour fabriquer le système microfluidique en deux phases d'un cycle. Dans la phase d'injection, le milieu de culture a été lentement injecté de la pompe de micro-seringue à la puce de germination microfluidique. Pendant la phase de recyclage, le milieu de culture a été très rapidement extrait du réservoir jusqu'à la pompe à micro-seringues.

La fonction barrière du micro-navire de notre modèle MIEN a été évaluée en mesurant le coefficient de perméabilité diffusionnelle (Pd) de 40 kDa FITC-dextran. Comme il est indiqué dans la figure 5, le P dde la puce de culture statique avec doublure cellulaire est de 0,1 ± 0,3 μm/s, et le P jdu canal vide sans doublure cellulaire est de 5,4 ± 0,7 μm/s. Puis, l'essai endothélial de germination sous statique et perfusion a été exécuté dans le modèle mien. Dans des conditions statiques, la germination endothéliale s'est produite environ 4 h après l'ensemencement et les germes migreraient à travers le canal hydrogel central de l'autre côté en environ 48 h. Les pousses se sont dégradées progressivement après 48 h. Alors qu'après 24 h d'exposition à un stress decisaillement de 5 ou 15 dyn/cm 2 (moyenne de 0,07 ou 0,2 m/s dans le canal de culture cellulaire), les CE alignés dans la direction du débit sont passé de la forme polygonale et pavée au fusiforme, et le degré de germination a diminué avec l'augmentation du stress du cisaillement (figure 6). Cependant, les pousses dans des conditions de cisaillement étaient plus stables que dans des conditions de culture statique. Ils pouvaient maintenir plus de 48 h sous perfusion. Les statistiques quantitatives ont montré que la germination endothéliale a diminué de façon significative en termes de superficie de germination, de longueur moyenne des germes et de longueur de pousse la pluslongue (figure 7).

Figure 1
Figure 1 :Les cellules endothéliales s'enrobent autour de la surface interne du canal de culture cellulaire. Les HUVECs sont uniformément dispersés dans le canal de culture cellulaire 2 h après l'ensemencement cellulaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 :Le programme personnalisé utilisé pour contrôler simultanément la pompe à micro-seringues et la soupape électromagnétique de pincement. Page principale (vers le haut) et sous-page (vers le bas) du programme personnalisé avec lequel le débit et le volume de circulation peuvent être mis en place. Un volume de compensation a été introduit pour corriger le léger changement de volume après plusieurs cycles en raison d'une erreur systémique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: Schéma de la puce germinante microfluidique. La puce contient trois canaux et six ports : un canal de culture cellulaire endothéliale et un canal liquide avec quatre ports d'injection de médias, et un canal hydrogel central avec deux ports d'injection d'hydrogel. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Schéma du système de contrôle microfluidique. Le système de commande microfluidique se compose d'une pompe à micro-seringues, d'une valve électromagnétique de pincement, d'une puce de piège à bulles, d'une pompe micro-périssaliste et d'un réservoir moyen de culture. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: Perméabilité diffusionnelle (Pd) de 40 kDa FITC-dextran. Le Pd de la puce de culture statique avec doublure cellulaire est de 0,1 ± 0,3 μm/s, et le P j du canal vide sans doublure cellulaire est de 5,4 ± 0,7 μm/s. **, p < 0,01. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 :Images représentatives de la germination endothéliale dans différentes conditions de cisaillement. Après 24 h de culte statique, les HUVECs envahissent du canal de culture cellulaire dans le canal hydrogel adjacent par des micro-poteaux et un grand nombre de pousses dans l'hydrogel. Alors qu'après 24 h d'exposition à 5 ou 15 dyn/cm2 stress cisaillement, le degré de germination diminue évidemment. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 :Zone quantifiée de germination, longueur moyenne des pousses et longueur de pousse la plus longue. Après 24 h de culture statique (S0) ou d'exposition à 5 (S5) ou 15 (S15) dyn/cm2 de tension de cisaillement, le degré de germination diminue avec l'augmentation du stress de cisaillement. *, p < 0,05; **, p < 0.01. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Pendant longtemps, l'observation en temps réel de la néovascularisation a été un problème. Plusieurs approches ont été développées récemment pour créer des vaisseaux perfusés tapissant avec des CE et adjacents à la matrice extracellulairepour germer 22,32,40,46,54, mais le microenvironnement mécanique est encore difficile à maintenir constamment. Il reste un sujet difficile à imiter le microenvironnement biomécanique initial des CE, qui sont soumis à un stress de cisaillement luminal élevé et à une faible vitesse de flux transendothelial. Ici, nous avons présenté un modèle MIEN qui simule d'abord l'événement initial de la néovascularisation en imitant le microenvironnement physiologique. Avec le modèle MIEN, la perfusion à long terme automatique, efficace et sans bulles est réalisée. Le stress de cisaillement luminal sur les CE pourrait être modifié en option à tout moment au cours d'expériences avec le flux transendothelial restant au niveau physiologique.

La clé du modèle MIEN est de dissocier l'effet du flux luminal sur les CE du flux transendothelial. À cette fin, un connecteur de type T est inséré de façon créative au port de sortie du canal culturel communautaire. Une extrémité du connecteur est reliée au réservoir par la pompe micro-périssaliste. L'autre extrémité du connecteur est exposée à l'air de l'incubateur. Il maintient la pression à l'intérieur du canal de culture cellulaire endothéliale de la même manière que la pression atmosphérique, puisqu'il n'y a ni rassemblement de médias excédentaires pour augmenter la pression ni excès de médias étant tirés pour former la pression négative dans le canal. De cette façon, la résistance au débit après la puce germinante microfluidique est très faible de sorte que le flux transendothelial peut être maintenu à portée physiologique, même sous un stress de cisaillement luminal élevé.

Une étape critique dans le protocole est l'injection réussie d'hydrogel dans le canal hydrogel central. Huang et coll. ont proposé que le remplissage réussi des gels dépende de l'équilibre des forces capillaires et de la tension de surface dans le canal de gel microfluidique55. Ils ont trouvé trois variables différentes pour contrôler l'équilibre : l'espacement entre les micro-poteaux, les propriétés de surface de l'appareil et la viscosité des solutions précurseurs de l'hydrogel. Dans le modèle actuel, la conception de la puce de germination microfluidique est optimisée à partirdes travaux précédents 22,23,37,40,51,52,53. La géométrie et l'espacement des micro-poteaux pour séparer trois canaux sont déterminés sur la base de calculs antérieurs et de nombreuses expériences. De plus, le revêtement PDL et la cuisson à haute température sont effectués pour modifier la surface du PDMS; par conséquent, ajuster l'équilibre entre l'hydrophilie et l'hydrophobicité avant l'injection d'hydrogel.

L'autre étape critique du protocole est l'élimination des bulles. Une grande quantité d'air se dissoudra dans le milieu de circulation au cours de l'expérience en raison du connecteur de type T et de la pompe micro-périssaliste, entraînant des bulles en circulation et affectant considérablement la fonction des cellules endothéliales. Pour enlever les bulles, une puce de piège à bulles est introduite avant la puce de germination microfluidique. Il fonctionne en fonction de la perméabilité élevée du gaz de la membrane PDMS. Lorsque les bulles entrent dans le piège, elles sont dispersées par la structure de grille petite et dense et piégées en raison de la pression négative générée par la pompe à vide afin qu'elles ne se déplacent pas vers l'avant dans la puce de germination microfluidique. De plus, les bulles se transportent à travers la membrane PDMS dans le trou de pression négatif relié à la pompe à vide et disparaissent éventuellement. Néanmoins, une grande attention devrait être accordée à la formation de bulles au cours de l'expérience. Dès que des bulles sont trouvées avant la germination microfluidique dans le pipeline, arrêtez immédiatement la pompe à micro-seringues. Faites glisser doucement le pipeline avec le doigt pour laisser les bulles se déplacer vers la puce de piège à bulles et être enlevées.

Bien que le microenvironnement initial de la néovascularisation soit partiellement récapitulé, il y a certaines limites à ce modèle mien. Les microenvironnements mécaniques des cellules endothéliales telles que l'effort induit par le sang de cisaillement et la rigidité extracellulaire de matrice changent pendant les processus de néovascularisation. Avant la néovascularisation, la membrane du sous-sol endothélial est toujours intacte avec une fonction de barrière complète, ce qui entraîne un stress de cisaillement luminal élevé avec une faible vitesse d'écoulement transendothelial et un débit interstitiel8,9. Au début de l'angiogenèse et de l'artériogenèse, un événement caractéristique est la médiation des métalloproteases matricielles (MPG) de la dégradation du sous-sol, qui augmentera la perméabilité des CE et remodelera la matrice, conduisant à des changements dans les microenvironnements mécaniques tels que le stress de cisaillement induit par le sang et la rigidité extracellulaire de matrice. Dans le présent travail, nous nous concentrons sur l'initiation de la néovascularisation afin que les environnements mécaniques dans la puce de germination microfluidique sont conçus pour rester stables pour simuler les conditions physiologiques. Cependant, des changements de microenvironnements mécaniques se produiront avec la germination des CE, tout comme in vivo. En outre, semblable à de nombreuses étudesprécédentes 34,53,56, le modèle actuel prend hydrogel collagène comme une matrice extracellulaire. Comme nous nous concentrons sur l'effet du stress de cisaillement induit par le débit, un seul hydrogel rigidité est utilisé. Cependant, considérant l'effet important de la rigidité de matrice sur le comportement cellulaire et la néovascularisation, différentes rigidités du collagène devraient être étudiées et peuvent être réalisées en réglementant le pH du collagène puisque les propriétés mécaniques du collagène dépendent de son pH49. Mais il est important de noter que l'hydrogel doit être soigneusement rincé avec PBS pour enlever les acides résiduels ou les bases avant l'ensemencement cellulaire pour éviter les dommages aux cellules. En outre, pour imiter les composants complexes de l'ECM in vivo,divers hydrogels tels que Matrigel, acide hyaluronique (HA), et fibrinogen etc devraient être utilisés à l'avenir pour améliorer le modèle actuel. La tension cyclique induite par la pression artérielle est une autre force hémodynamique importante qui module la morphologie et les fonctions des cellules vasculaires57. Des études antérieures ont montré que la souche tensile a augmenté l'expression des facteurs angiogéniques dans les cellules souches mésenchymaleshumaines 58 et induit l'angiogenèse par la dégradation du collagène de type IV dans la membrane vasculaire du sous-sol endothélial59. Ces résultats ont indiqué que la tension induite par la pression artérielle peut affecter la néovascularisation aussi. Le modèle actuel met l'accent sur l'effet du stress de cisaillement induit par le débit de sorte qu'il n'est pas applicable d'introduire la souche que l'hydrogel ne colle pas assez étroitement au canal et tombera lorsqu'il est étiré. Nous prêterons attention à surmonter cette difficulté dans les travaux futurs.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été appuyés par la National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (subvention nos 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 et 32071311), Programme national clé de recherche et développement de la Chine (subvention nos 2016YFC1101101 et 2016YFC1102202), le projet 111 (B13003), et la Fondation des sciences naturelles de Beijing (4194079).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285

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Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).

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