Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Modellering af brystkræft i humant brystvæv ved hjælp af et mikrofysiologisk system

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver opførelsen af et in vitro mikrofysiologisk system til undersøgelse af brystkræft ved hjælp af primært humant brystvæv med off the shelf materialer.

Abstract

Brystkræft (BC) er fortsat en førende dødsårsag for kvinder. På trods af mere end 700 millioner dollars investeret i BC forskning årligt, 97% af kandidat BC narkotika mislykkes kliniske forsøg. Derfor er der brug for nye modeller for at forbedre vores forståelse af sygdommen. NIH Microphysiological Systems (MPS) programmet blev udviklet for at forbedre den kliniske oversættelse af grundlæggende videnskabelige opdagelser og lovende nye terapeutiske strategier. Her præsenterer vi en metode til at generere MPS for brystkræft (BC-MPS). Denne model tilpasser en tidligere beskrevet tilgang til dyrkning af primært humant hvidt fedtvæv (WAT) ved at klemte WAT mellem fedtbaserede stamcelleark (ASC)s. Nye aspekter af vores BC-MPS omfatter såning BC celler i ikke-syge menneskelige brystvæv (HBT), der indeholder indfødte ekstracellulære matrix, modne adipocytter, hjemmehørende fibroblaster, og immunceller; og sandwiching bc-HBT blanding mellem HBT-afledte ASC plader. Den resulterende BC-MPS er stabil i kultur ex vivo i mindst 14 dage. Dette modelsystem indeholder flere elementer af mikromiljøet, der påvirker BC, herunder adipocytter, stromale celler, immunceller og den ekstracellulære matrix. BC-MPS kan således bruges til at studere samspillet mellem BC og dets mikromiljø.

Vi demonstrerer fordelene ved vores BC-MPS ved at studere to BC adfærd kendt for at påvirke kræft progression og metastaser: 1) BC motilitet og 2) BC-HBT metabolisk krydstale. Mens BC motilitet tidligere er blevet påvist ved hjælp af intravital billeddannelse, BC-MPS giver mulighed for høj opløsning time-lapse billeddannelse ved hjælp af fluorescens mikroskopi over flere dage. Desuden, mens metabolisk krydstale tidligere blev påvist ved hjælp af BC-celler og murin præ-adipocytter differentieret i umodne adipocytter, vores BC-MPS model er det første system til at demonstrere denne krydstale mellem primære menneskelige bryst adipocytter og BC celler in vitro.

Introduction

Hvert år, mere end 40.000 amerikanske kvinder dør af brystkræft (BC)1. På trods af mere end 700 millioner dollars investeret i BC forskning årligt, 97% af kandidat BC narkotika mislykkes kliniske forsøg2,3. Nye modeller er nødvendige for at forbedre udviklingen af lægemidler pipeline og vores forståelse af BC. NIH Microphysiological (MPS) Program afgrænsede de funktioner, der kræves for banebrydende modeller til forbedring af oversættelsen af grundlæggende videnskab til klinisk succes4. Disse omfattede brugen af primære menneskelige celler eller væv, stabil i kulturen i 4 uger, og inddragelse af indfødte væv arkitektur og fysiologisk respons.

Nuværende in vitro BC modeller, såsom to-dimensionelle kultur BC cellelinjer, membran indsætte co-kultur, og tre-dimensionelle sfæroider og organoider, ikke opfylder NIH's MPS kriterier, fordi ingen af disse opsummere indfødte brystvæv arkitektur. Når ekstracellulær matrix (ECM) tilsættes til disse systemer, anvendes bryst ECM ikke; i stedet anvendes kollagengeler og kældermembranmatrixer.

Nuværende in vivo-systemer, såsom patient afledt xenografts (PDX), ligeledes ikke opfylder NIH's MPS kriterier, fordi murine brystvæv meget forskellig fra menneskelige bryster. Desuden er immunsystemet-BC interaktioner i stigende grad anerkendt som nøglen i tumor udvikling, men immunkompromitterede murin modeller, der anvendes til at generere PDX tumorer mangler modne T-celler, B-celler, og naturlige dræberceller. Desuden, mens PDX giver mulighed for primære brysttumorer, der skal opretholdes og udvides, den resulterende PDX tumorer er infiltreret med primære murine stromale celler og ECM5.

For at overvinde disse udfordringer, har vi udviklet en roman, ex vivo, tre-dimensionelle menneskelige bryst MPS, der opfylder NIH MPS kriterier. Grundlaget for vores bryst MPS er lavet ved sandwiching primære menneskelige brystvæv (HBT) mellem to plader af fedt-afledte stamceller (ASCs), også isoleret fra HBT (Figur 1). Stempler til overførsel af cellearkene til sandwich HBT kan 3D-printes eller laves af simpel akrylplast(Figur 1H,I). Denne teknik tilpasser vores tidligere beskrevne tilgang til dyrkning af primær humant hvidt adipocytvæv6,7. Brystet MPS kan derefter være seedet af en BC model valg, lige fra standard BC cellelinjer til primære menneskelige bryst tumorer. Her viser vi, at disse BC-MPS er stabile i kulturen i flere uger (figur 2); omfatter indfødte elementer af HBT, såsom bryst adipocytter, ECM, endotel, immunceller(figur 3); og opsummere de fysiologiske interaktioner mellem BC og HBT, såsom metabolisk krydstale (figur 4). Endelig viser vi, at BC-MPS giver mulighed for undersøgelse af amoeboid bevægelse af BC celler i hele HBT (Figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle humane væv blev indsamlet i overensstemmelse med protokol #9189 som godkendt af LSUHSC's institutionelle undersøgelseskommission.

1. Såning af fedtbaserede stamceller (ASC' er) til celleark

  1. Køb ASC'er fra kommercielle kilder , eller isoler fra det primære humane brystvæv ved at følge de etablerede protokol8,9. Frø humane bryst ASCs ved 70% tæthed (~ 80.000 celler / cm2 overfladeareal) på 6-brønds standard vævskultur plader i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal kvæg serum, og 1% Penicillin / Streptomycin (BC-MPS Media). Sørg for, at de ASC'er, der skal anvendes til dannelse af cellearkene, skal være mindre end passage 10.
    1. For hver brønd af brystkræft mikrofysiologiske system (BC-MPS), der vil blive genereret, frøceller i 1 standard væv kultur godt og 1 godt af samme størrelse på poly (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm)-belagt væv kultur plast plade. En 6-brønds plade af BC-MPS vil kræve en standard vævskultur 6 godt plade (nederst) og en pNIPAAm-belagt plade (top). PNIPAAm-pladerne kan købes fra kommercielle kilder eller kan belægges i lab10,11,12.
  2. Kultur-ASC'er i en vævskulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Skift mediet hver 2-3 dage i et biosikkerhedsskab.
  3. Kultur ASCs indtil de bliver 100% sammenflydende og danner et striated mønster. Afhængigt af sammenløbet, hvor de blev seedet, vil dette tage 7-10 dage. Sammenflydende celleark er forpligtet til at forankre den flydende fedt brystvæv.

2. Forberedelse af de forsyninger, der er nødvendige for BC-MPS

  1. For at forberede gelatine til 6-brønds plader laves en 12% gelatineopløsning i destilleret H2O. Bland 19 g gelatine type B (gelstyrke på ~ 225 Bloom) og 125 ml H2O i en 250 ml glasmedieflaske. Tilsæt 1,6 ml 1 M NaOH til opløsningen for at neutralisere pH.
  2. Autoklaver opløsningen under en væskecyklus i 25 minutter for at sterilisere opløsningen.
  3. Opløsningen afkøles til 37 °C. I et sterilt biosikkerhedsskab tilsættes 16 ml steril 10x Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) til opløsningen for at opnå et endeligt volumen på 160 ml.
    BEMÆRK: Gelatineopløsningen kan bruges med det samme eller opbevares ved stuetemperatur til senere brug. Den forberedte gelatine er stabil ved stuetemperatur i 1 måned. Hvis der kun er brug for nogle få stempler, kan der laves en 10 ml opløsning og filtreres sterilt samme dag som at fremstille BC-MPS som tidligere beskrevet7.
    1. For at forberede gelatineopløsning ved filtersterilisering fortyndes 1 ml 10x HBSS med 9 ml H2O for at fremstille en 1x HBSS-opløsning i et 15 ml konisk rør. Der tilsættes 100 μL 1 M NaOH til hvert 10 ml rør, og der tilsættes derefter 0,7 g gelatine til opløsningen. Opløsningen blandes kraftigt for at opløse gelatinen.
    2. Rør i et 75 °C vandbad inkuberes i 20 minutter, der ryster hvert 5. minut. Brug en 10 ml sprøjte og et 0,22 μm sprøjtefilter til at filtrere gelatineopløsningen. Gelatineopløsningen filtreres direkte på stemplet i et biosikkerhedsskab.
  4. 3D print eller brug simpel akryl til at gøre stemplet bruges til at overføre celleark. Sørg for, at stemplet passer løst i den ønskede størrelse af brønden. Et standardudstemplet med 3D-print er vist i figur 1. Stemplerne kan designes ved hjælp af standard computer aided design software såsom TinkerCad og trykt ved hjælp af filament 3D-printere, der er kompatible med polylactic syre (PLA)13,14.
  5. For at forberede et stativ til at holde stemplet placere en 15 mL rørholder i et biosikkerhedsskab. Placer stemplet på hovedet i stativet, så bunden af stemplet vender opad. Placer en plastkasse med låg til transport af BC-MPS i biosikkerhedsskabet. Det anbefales, at kassen er mindst 35,5 cm lang x 28 cm bred x 8,25 cm højde, så den passer til 4 plader BC-MPS. Fjern låget fra kassen og spray ned rack, stemplet, og boksen med 70% EtOH.
  6. Forbered sterile barberblade og pincet ved autoklavering eller ved at placere dem i et biosikkerhedsskab og vask med 70% EtOH.
  7. Spray stemplet og kassen med 70% EtOH og tænd UV-lyset i biosikkerhedsskabet i mindst 30 minutter for at sterilisere forsyningerne.

3. Forbered gelatine stemplet og gælder for de øverste celle ark

  1. Hvis gelatineopløsningen tidligere er fremstillet, opvarmes den i et 37 ° C vandbad for at smelte det.
  2. Gelatineopløsningen pipetteres på stemplet i biosikkerhedsskabet ved hjælp af en serologisk pipette på 5 eller 10 mL. En stemplet til 1 brønd af en 6-brønds plade vil kræve ~ 2,5 ml gelatine.
  3. Når gelatinen er størknet på stemplet (~30-45 min), skal du flytte de pNIPAAm-belagte ASC-plader til biosikkerhedsskabet. Placer forsigtigt stemplerne i brøndene på de pNIPAAm-coatede ASC-plader, så gelatinen kommer i kontakt med ASC'erne. Placer en metal skive (~ 7,5 g) på stemplet til at veje ned stemplet, så gelatine er i direkte kontakt med ASC celle ark. Lad stemplet stå på ASC-cellearkene ved stuetemperatur i 30 minutter.
  4. Flyt forsigtigt pladen med stemplet ind i den sterile kasse i biosikkerhedsskabet, og læg låget på den. Flyt kassen til et køleskab på 4 °C i 30 minutter. Hvis der ikke er et køleskab på 4 °C til rådighed, anbringes pladen på is i en isspand i biosikkerhedsskabet i 30 minutter.

4. Forberedelse af kræft cellelinjer

  1. Frø kræft celle linjer i en standard T75 væv kultur parabol og holde dem i kultur, så de er ~ 80% sammenløbet på dagen BC-MPS vil blive behandlet. (~ 200.000 kræftceller vil være behov for pr BC-MPS). Vokse kræftceller i normale medier.
    BEMÆRK: For at identificere og isolere kræftcellerne anbefales det, at cellerne transceres med et fluorescerende protein for at skelne dem fra ASC'erne og brystvævet. Antallet af kræftceller er nødvendige pr BC-MPS er blevet optimeret til MCF7 og MDA-MB-231 celler. Andre cellelinjer kan kræve yderligere optimering.
  2. Den dag, BC-MPS er ved at blive udarbejdet flytte kolben indeholder kræftceller til biosikkerhed kabinet. Indsug mediet fra kolben. Kolben vaskes med 5 mL PBS.
  3. Der tilsættes 1 ml celleløsningsopløsning til kolben, der indeholder kræftcellerne, og kolben inkuberes derefter i en 37 °C inkubator, indtil cellerne er løsnet (~2-5 min.).
  4. I biosikkerhedsskabet tilsættes 9 mL PBS til kolben, overføres cellerne i PBS til et 15 mL konisk rør, og cellenummeret tælles ved hjælp af et hæmocytometer.
  5. Centrifuge kræftcellerne ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  6. Genbrug cellerne i BC-MPS-medier, så der er 2 x 106 celler/mL.
  7. Placer kræftcellerne i et 37 °C vandbad, indtil de er klar til at blive tilsat det menneskelige væv.

5. Behandling af humant brystvæv

  1. I et biosikkerhedsskab vaskes det menneskelige brystvæv (HBT) 3x med 10 mL steril PBS.
  2. Brug sterile pincet og et barberblad til groft hakke BC-MPS og forsøge at fjerne så meget fascia og bindevæv som muligt. Hvis bindevævet ikke fjernes, kan det øverste ASC-lag ikke forankre HBT korrekt.
    BEMÆRK: Fascia og bindevævet kan identificeres ved dets hvide eller klare udseende sammenlignet med den gule farve på fedtvævet.
  3. Når bindevævet er fjernet, skal du bruge et sterilt barberblad til at hakke vævet fint, indtil det har en homogen væskekonsistens. Vævet hakkes fint, når det let kan pipettes ved hjælp af en 25 mL serologisk spids.
  4. Brug et sterilt barberblad til at skære spidsen af en p1000 pipettespids for at hjælpe med at pipette den hakkede HBT.
  5. I et 1,5 mL rør blandes den hakkede HBT, kræftcellelinjer og BC-MPS-medier (for 1 brønd af en 6-brøndsplade kræver dette 200 μL hakket HBT, 100 μL BC-MPS-medier og 100 μL kræftceller).
  6. Flyt den ASC-plade, der skal bruges til det nederste celleark, fra inkubatoren til biosikkerhedsskabet. Indsug mediet fra den nederste ASC-plade. Pipetter blandingen på midten af brønden på den nederste ASC plade ved hjælp af en p1000 pipette spids, der havde distale ende afskåret fra trin 5,4
  7. Flyt kassen med den øverste ASC-plade med stemplet på til biosikkerhedsskabet. Fjern forsigtigt gelatinestænkerne fra den pNIPAAm-belagte plade og læg dem oven på HBT-blandingen. Tilføj BC-MPS medier til brønden (for 1 brønd af en 6-godt plade tilføje 2 mL medier). Flyt forsigtigt de nederste ASC-plader med BC-MPS-blandingen og stemplet til den sterile plastkasse og læg låget på kassen til transport.
    BEMÆRK: Låget på 6-brøndspladen kan ikke være tilbage på ASC-pladen, mens stemplet er tændt. Der skal udvises forsigtighed for at undgå at forurene kulturen.
  8. Inkuber bundpladen i kassen i en inkubator ved 37 ° C, indtil gelatinen er smeltet, og det øverste ASC-lag er begyndt at klæbe til det nederste lag (~ 30 min).
  9. Flyt kassen med pladerne til biosikkerhedsskabet. Fjern forsigtigt stemplet fra bundpladerne. Vævet med kræftcellerne vil blive forankret til bunden af brønden.
  10. Låget på 6-brøndspladen anbringes på bundpladen, og der inkuberes ved 37 °C for helt at smelte gelatinen, og det øverste lag kan forankres fuldstændigt i det nederste lag (~30-60 min.).
  11. Flyt forsigtigt pladerne til et biosikkerhedsskab, og indsug mediet med en 10 mL serologisk pipette. Tilføj 2 mL friske medier til hver brønd. Aspirat fra kanten af brønden og pipette på kanten af brønden for at undgå at løsne vævet.
  12. BC-MPS ved 37 °C og 5% CO2 i den ønskede tid og skift medie hver 2-3 dage.

6. Fordøjelse af BC-MPS til analyse

  1. Når BC-MPS er klar til at blive analyseret, skal du flytte pladen til biosikkerhedsskabet. Fjern medier med en serologisk pipette for at undgå utilsigtet afkodning af væv.
  2. Tilsæt 1 volumen PBS til hver brønd.
  3. Fjern PBS med en serologisk pipette.
  4. Der tilsættes 1 ml celleafledningsopløsning til hver brønd. Pladen flyttes tilbage til inkubatoren, og der inkuberes ved 37 °C i 5 minutter, så cellerne kan løsne sig. I et biosikkerhedsskab skal du bruge en celleskraber til helt at løsne cellerne og vævet fra kulturpladen.
  5. Opløsningen overføres med vævet til et konisk rør på 15 mL ved hjælp af en serologisk pipette. Tilsæt 2 ml PBS til hver brønd for at indsamle eventuelle resterende celler og overføre denne opløsning til konisk rør. Hvis cellerne er fluorescerende, wrap røret i aluminiumsfolie for at beskytte det mod lys.
  6. Røret inkuberes ved 37 °C under konstant omrøring i en orbital shaker ved 1 x g i 10-20 minutter for helt at adskille celler fra vævet.
  7. I et biosikkerhedsskab anvendes en serologisk pipette til at forstyrre eventuelle resterende klumper af celler i røret og filtrere prøven gennem en 250 μm vævsstien i et nyt 15 mL rør. Hæld opløsningen langsomt gennem sien, så den ikke løber over.
  8. Skyl sien med 1 mL PBS for at indsamle celler, der stadig er i sien.
  9. Centrifuge prøverne ved 500 x g ved stuetemperatur i 5 min. Efter centrifugering vil adipocytterne flyde på det øverste lag af opløsningen, mens kræftcellerne og ASC'erne blandes sammen i en pellet i bunden af røret.
  10. For at isolere adipocytterne forsigtigt hælde det øverste lag i et nyt rør eller alternativt skære spidsen af en p1000 pipette spids og overføre det øverste lag til et nyt rør. Centrifuger prøven ved 500 x g i 5 minutter igen og brug en sprøjte og nål til at fjerne opløsningen under adipocytterne, så kun adipocytterne er tilbage. Adipocytterne er nu klar til analyse
  11. Efter at have fjernet adipocytterne fra opløsningen, adskilles ASC'erne og kræftcellerne fra hinanden til analyse, hvis kræftcellerne tidligere blev transfected med et fluorescerende protein. Indsug den resterende opløsning fra røret, der indeholder ASC'er og kræftceller uden at forstyrre cellepillen. Genbrug pellet i PBS eller BC-MPS medier og bruge flow cytometry at sortere cellerne baseret på fluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stabilitet i kulturen
BC-MPS er et stabilt mikrofysiologisk system, der kan dyrkes in vitro i op til mindst 14 dage. Et lysfeltsbillede af ASC-cellearkene blev taget ved 100x forstørrelse for at vise det strierede mønster af sammenløbet ark (Figur 2A). ASC-cellearkene er stabile i kulturen i mindst 4 uger. BC-MPS på 14 dage i kultur i en brønd af en 6 godt plade blev afbildet med et farvekamera, der viser, at den livlige HBT stadig er stabilt forankret af ASC celle ark til bunden af brønden efter 14 dage (Figur 2B). Dette viser, at det celleark, der bruges til at sandwiche fedtvævet, stadig er intakt. Den tredobbelte negative BC cellelinje MDA-MB-231 udtrykke RFP blev dyrket i HBT i 14 dage og derefter afbildet med en fluorescerende mikroskop viser stabiliteten af BC-MPS med cellelinjer ud til mindst 14 dage (Figur 2C). Tilstedeværelsen af BC-celler i vævet viser kræftcellernes evne til at invadere HBT. En tredobbelt negativ PDX-explant blev fjernet fra en mus, farvet med Cell Tracker CMTPX og dyrket med HBT. Fluorescerende mikroskopi billeder blev taget på dag 6 for at vise stabiliteten af BC-MPS med tumor explants i mindst 6 dage(Figur 2D). Dette viser, at BC-MPS kan bruges til at kultur tumor explants med HBT samt cellelinjer.

Oprindelige HBT-elementer
BC-MPS indeholder de oprindelige elementer i HBT i kultur. BC-MPS indeholdende 100 mg HBT blev dyrket in vitro i 14 dage. Vævet blev afbildet ved hjælp af brightfield mikroskopi efter 14 dage i kultur (Figur 3A). Dette billede viser bevarelsen af klynger af modne adipocytter på 14 dage i kultur. Vævet blev derefter fastgjort med 10% formalin, paraffin indlejret, sektion på 5 μm ved hjælp af en mikrotome og derefter farves med Movats pentachrome plet ved hjælp af en standard protokol. De faste sektioner blev afbildet ved 100x (Figur 3B) eller 20x (Figur 3C). Billederne viser, at BC-MPS indeholder den indfødte kollagen (lilla), retikulære fibre (blå), og adipocytterne store enlokale form i mellem bindevævet bevares på 14 dage i kultur. For at identificere primære makrofager i systemet blev HBT dyrket i 0, 3 og 7 dage og derefter rettet og farvet med anti-CD45, anti-CD68 og anti-CD206. CD45 blev brugt som en generel leukocyt identifikator. CD68 blev brugt som en monocyt plet til at identificere makrofager, mens CD206 identificerer en fælles receptor til stede på makrofager. Farvningen af makrofagets markører blev kvantificeret ved hjælp af en billedbehandlingssoftware (Figur 3D). Dette viser bevarelsen af primære makrofager efter 3 og 7 dage i kultur. Disse data viser, at BC-MPS bevarer de oprindelige elementer i HBT i kultur. Yderligere eksperimenter kan udføres for at undersøge, hvordan BC-cellerne remodel de indfødte elementer i HBT. Dette kan omfatte vurdering af ændringer i makrofagmærker for at afgøre, om de ændres af tilstedeværelsen af BC-celler. Ændringer i ECM kan analyseres yderligere ved at sammenligne Movats pentachrom farvning af prøver, der blev dyrket med eller uden BC-celler for at afgøre, om kollagenindholdet ændres, og størrelsen af adipocytterne kan sammenlignes ved hjælp af billedanalysesoftware som Image J for at afgøre, om BC-celler ændrer adipocytstørrelsen.

Metabolisk krydstale
Adipocyt-cancer metabolisk krydstale er en vigtig vej, hvor tumor mikromiljøet påvirker BC progression. BC-celler, der akkumulerer intracellulære lipider, viser øget lægemiddelresistens og en mere invasiv fænotype15. Mens BC celler har vist sig at fremkalde lipolyse i umodne, murine adipocytter, den fysiologiske relevans af dette har været uklart, fordi metabolisk krydstale mellem BC og primære menneskelige bryst adipocytter aldrig har været vist. For at demonstrere, at BC-MPS kan modellere denne adipocyt-BC metaboliske krydstale RFP-mærket MDA-MB-231 celler blev dyrket alene eller i BC-MPS i 14 dage. Cellerne blev enzymatisk fordøjet i enkelt celle suspension, farves med neutral lipid farvestof Bodipy, og analyseret af flow cytometry (Figur 4A,B)16. Andelen af lipid-positive MDA-MB-231 celler var 26,2 gange SEM +/- 2,5 større i BC-MPS vs 2D kultur (Figur 4C). Denne stigning i lipid farvning viser, at kræftcellerne interagerer med adipocytter og optage lipider frigivet fra den modne adipocytter. Cellesortering blev udført for at vælge for RFP+ Bodipy+-celler. Efter sortering blev cellerne belagt på kollagen jeg belagt glas coverlips og lov til at vedhæfte natten over. Den følgende dag cellerne blev fastsat i 4% paraformaldehyd i 30 min og derefter afbildet på en fluorescerende mikroskop ved 100x forstørrelse. Celler dyrket i BC-MP (Figur 4E) viste øgede lipiddråber sammenlignet med celler dyrket i standard 2D-kultur (Figur 4D). Dette viser metabolisk krydstale mellem BC-cellerne og HBT og viser også, hvordan lipidakkumulering kan analyseres ved flowcytometri eller ved fluorescerende mikroskopi. Yderligere analyse af lipid ophobning i kræftceller kan gøres ved at kvantificere størrelsen af lipid dråber og antallet af lipid dråber per celle.

Amoeboid bevægelse
Metabolisk krydstale mellem BC-celler og adipocytter øger kræftens invasive evne. For at vurdere kræftcellernes øgede invasive evne, der dyrkes med HBT, blev migrationen af BC-celler i hele HBT vurderet ved fluorescensmikroskopi. Den metastatiske TNBC cellelinje MDA-MB-231 udtrykke RPF blev dyrket i BC-MPS i 4 dage for at gøre det muligt for systemet at stabilisere. Time-lapse fluorescensmikroskopi blev udført efter 4 dage for at afbilde MDA-MB-231-motiliteten med et billede taget hvert 20. minut i 19 timer ved 37 °C og 5% CO2. Den resulterende video demonstrerede amoeboid bevægelsesmønstre og en overraskende høj grad af motilitet for MDA-MB-231 celler(Figur 5 og Video 1). Dette viser en stigning i invasiv evne til BC celler og evne til BC celler til at invadere HBT. Overflytningen af BC-cellerne i HBT kan analyseres yderligere ved hjælp af tidligere offentliggjorte metoder til kvantificering af hastigheden og retningen af overflytning af celler17,18. MDA-MB-231 cellerne blev også observeret at synes at gennemgå mitose. Disse adfærdsformer er i overensstemmelse med sin aggressive fænotype, er vigtige adfærd for kræft progression og metastaser, og fremhæve nye BC adfærd, der kan målrettes mod BC behandlinger.

Figure 1
Figur 1: Generel arbejdsgang for BC-MPS-opsætning. (A)Gelatine størknes i et opretstående stempel. (B) Stemplet med gelatine placeres på det termoresponsive øverste ASC-celleark. (C) Der anvendes en vægt til at tvinge gelatinen til at holde kontakt med cellearket, mens cellerne inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter efterfulgt af inkubation ved 4 °C i 30 min. (D) Stemplet fjernes fra den kolde skål og fjerner det intakte celleark med det. (E) Stemplet med det øverste celleark overføres til en skål, der indeholder det nederste celleark og de hakkede HBT- og BC-celler. (F) Bundcellefad med medier, stemplet, HBT, BC og begge celleark inkuberes ved 37 °C i 30-60 minutter, så gelatinen kan smelte, og cellearkene kan komme fra kontakterne. (G)Fjernelse af stemplet efterlader HBT og BC klemt inde mellem to ASC-celleark. En 3D printet stemplet blev designet ved hjælp af den gratis online software TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) og trykt på en 3D-printer. Stemplet består af polylactisk syre. (H) Dimensionerne af et stempel til 1 brønd af en 6-brønds plade er angivet. Stemplets fordybning er 2,5 mm. (I) Der vises et billede af det faktiske 3D-printede stempel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentativ stabilitet af BC-MPS i kulturen. Skala bar = 100 μm. (B) BC-MPS, der indeholder 100 mg HBT, blev dyrket i en 6 brønd plade. Efter 14 dage en farve fotografi blev taget for at vise, at HBT er forankret til bunden af brønden af en 6 godt plade. (C) Den tredobbelte negative BC celle linje MDA-MB-231 udtrykke RFP blev dyrket med HBT i 14 dage og derefter afbildet ved hjælp af fluorescerende mikroskopi ved 40x forstørrelse. Billederne viser, at MDA-MB-231 cellerne stadig var levedygtige og voksende i HBT. Scale bar = 200 μm D) PDX Tumorer af tredobbelt negativ brystkræft fra mus blev hakket i 3 cm2 stykker og mærket med Cell Tracker Red CMPTX. Stykkerne blev dyrket i HBT og den resulterende BC-MPS blev afbildet ved hjælp af en fluorescerende mikroskop på 40x forstørrelse på dag 6 viser sin stabilitet i kulturen. Skalalinje = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3:Repræsentativ bevarelse af oprindelige elementer i HBT til stede i BC-MPS. BC-MPS blev dyrket i 14 dage og derefter enten afbildet med lyse felt mikroskopi på 40x (A) og derefter fastsat med 10% formalin og farves med Movats pentachrome plet. Billeder blev taget ved 100x (B) eller 20x (C). Billeddannelse af HBT indikerer bevarelsen af store uniloculor adipocytter grupperet sammen og vævsskiver indikerer tilstedeværelsen af bevarelse af den oprindelige ECM såsom kollagen (gul) og retikulære fibre mellem adipocytterne (blå). For at demonstrere bevarelsen af makrofager i modellen HBT blev dyrket i 0, 3 eller 7 dage, farves til makrofag markører, og afbildet ved hjælp af konfokal mikroskopi (D). Den fluorescerende intensitet af farvningen af makrofaget markører blev kvantificeret ved hjælp af kommercielt tilgængelige software, der viser, at makrofager stadig er til stede i vævet efter 3 og 7 dage i kultur. Skalalinje = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativ metabolisk krydstale mellem adipocytter og kræftceller i BC-MPS. RFP-mærkede MDA-MB-231 celler blev dyrket i BC-MPS vs. 2D i 14 dage, derefter farvet med Bodipy (250 nM) og analyseret af flowcytometry. (A) Flow af Bodipy-farvede MDA-MB-231 celler efter 14 dage i 2D-kultur. Celler i B2 var Bodipy+RFP+; celler i B1 var Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3,26%, hvilket indikerer minimal lipidakkumulering. (B) Flow cytometry analyse af Bodipy-farvede MDA-MB-231 celler efter 14 dage i BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85,35%, hvilket indikerer omfattende lipidakkumulering. (C) Lipid ophobning i MDA-MB-231 celler efter 14 dage i 2D kultur vs BC-MPS. Fluorescerende mikroskopi analyse af Bodipy farvning af MDA-MB-231 dyrket i 2D (D) vs BC-MPS (E) viser øget lipid ophobning i celler dyrket i BC-MPS. Fejllinjer angivet SEM. ** p < 0,01, n = 2 biologiske replikater, Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5:Repræsentativ migrering af TNBC i BC-MPS. RFP-mærkede MDA-MB-231-celler blev dyrket i BC-MPS i 4 dage, og derefter blev sekventielle time-lapse-billeder af RFP-mærkede BC-MPS + MDA-MB-231-celler fanget ved hjælp af et fluorescensmikroskop (En ramme pr. 60 min., 100x forstørrelse.) Gule stjerner = mitotisk hændelse. Gul boks = celleaffald, der anvendes til positionsreference. Blå pile = 231 celler, der viser amoeboid bevægelse med pseudopoder og høj motilitet. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: Repræsentativ migring af TNBC i BC-MPS. BC-MPS indeholdende RFP-mærket MDA-MB-231 celler blev dyrket i 4 dage, og fluorescerende mikroskopi blev brugt til at afbilde cellerne hver 20 min ved 19 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Billederne blev samlet i en video (En ramme pr. 60 minutter, 100x forstørrelse). Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er behov for nye systemer til modellering af brystkræft hos mennesker for at udvikle en bedre forståelse af sygdommen. Udvikling af humane mikrofysiologiske systemer til modellering af sygdomsindstillinger, der omfatter indfødte ECM- og stromalceller, vil øge prækliniske undersøgelsers prækliniske effekt. BC-MPS-modellen, der præsenteres her, er et nyudviklet system, der overvinder begrænsningerne i tidligere modeller giver mulighed for evaluering af BC i sit oprindelige HBT-miljø. Dette system kan bruges med kræft cellelinjer eller med tumor explants og er stabile i mindst 14 dage. Fluorescerende mærkning af BC-cellerne gør det muligt at overvåge deres realtidsvisualisering af kræftcellemotilitet og cellecelleinteraktioner, migration, levedygtighed eller spredning, der skal overvåges enten i realtid eller på bestemte tidspunkter(figur 3 og figur 5). Dette modelsystem kan bruges til at belyse vigtige aspekter om kræftbiologi, da det vedrører samspillet mellem kræftceller og deres mikromiljø. Forhør af dette system kan informere om TME regulering af kræft progression, lægemiddelrespons, og indledningen af metastaser.

For at konfigurere systemet er der et par kritiske trin, der skal følges. Det første kritiske skridt er dyrkning og overførsel af ASC-cellerne. De pNIPAAm-coatede plader er temperaturfølsomme. Når pladerne er over 32 °C, er overfladen hydrofobisk, og ASC'erne klæber til overfladen. Overfladen bliver hydrofil under denne temperatur, og cellerne begynder at løsne19. Således er det nødvendigt at bestemme, hvor hurtigt en given celletype begynder at løsne sig fra disse overflader. For HBT-afledte ASC'er tager dette > 30 min. hvis cellerne er sammenflydende. For at forhindre, at cellerne løsner sig under normal vedligeholdelse, skal mediet forvarmes til 37 °C, og vævskulturpladerne bør ikke opbevares ved stuetemperatur for længe for at forhindre pladerne i at køle af, og cellerne løsner sig. Det er også vigtigt at bestemme den optimale tid for gelatinestænkerne at være på pNIPAAm-belagte plader for at overføre hele cellearket. ASC'erne skal være sammenficerende, og hele arket skal overføres. Hvis det øverste celleark ikke har tid til helt at løsne og binde sig til gelatinen, vil cellearket blive brudt under overførslen. Hvis hele cellearket ikke er helt overført, vil ASC'erne ikke være i stand til at kleme det flydende brystvæv.

ASC'erne, der bruges til at sandwiche HBT, er normale stromale celler i brystmikromiljøet, der udskiller ECM, vækstfaktorer og cytokiner, der påvirker BC20. For at kleme HBT mellem to celleark overføres ASC-arkene ved hjælp af termoresponsive vævskulturplader. Dette gør det muligt for den indfødte ECM udskilles af ASCs at være intakt og tjener til at forankre den livlige adipocytter i væv. Ved at bruge ASC'er afledt af humant brystvæv sikrer dette, at de interaktioner, som ASC'erne har med kræftcellerne, vil efterligne, hvad der sker i brystkræft, da ASC'er fra forskellige depoter viser forskellige genekspressioner og ECM remodeling21.

Det andet kritiske skridt er behandlingen af HBT. Det er nødvendigt at bruge frisk isoleret HBT for at bevare vævets levedygtighed. Ved behandling af HBT er det vigtigt at hakke vævet fint og fjerne så meget af fasciaen som muligt. Hvis der er store stykker fascia tilbage i HBT, vil dette forhindre cellearkene i korrekt forankring af det flydende væv. Derudover kan fascia tilbage i vævet adskille sig fra pladen, og det vil trække flere klynger af HBT med det gør brønden ubrugelig for yderligere eksperimenter. HBT skal placeres i midten af brønden, før den tilføjer det øverste celleark, ellers vil ASC'erne ikke være i stand til at kleme HBT tilstrækkeligt, og vævet på kanten af brøndene vil ikke blive forankret. Hvis disse kritiske trin følges, er processen med at producere BC-MPS ligetil at konfigurere.

Modellen beskrevet her er et forbedret system til at studere BC i sin naturlige mikromiljø af primære HBT, der bevarer den modne adipocytter, ECM, og hjemmehørende immunceller (Figur 4). Prækliniske modeller, der efterligner fedtmikromiljøet, mangler flere elementer i mikromiljøet, såsom modne adipocytter, immunceller, fibroblaster og ECM. Brug af fuldt moden HBT giver mulighed for samtidig og gensidig forhør af dette komplekse miljø, der omfatter flere elementer, der påvirker kræft udvikling, lægemiddelrespons, og invasivitet gennem parakrine og juxtacrine signalering22,23,24,25. Resident fibroblaster og ASC'er påvirker kræftmetastase gennem ombygning af ECM i væv og gennem parakrine signalering26,27. ECM og ombygningen heraf er afgørende for påbegyndelsen af metastaser. Ændringer i ECM af tumormikromiljøet påvirker migration og metastaser af BC, men de fleste BC-undersøgelser inkorporerer ikke indfødte ECM i deres undersøgelser og bruger i stedet forenklede modeller sammensat af kollagen I eller matrigel28,29. ECM i BC-MPS er fra HBT og fra ASC'erne. Således, den måde, at den indfødte ECM er ombygget i tumor mikromiljø i brystvæv og påvirkninger metastaser kan studeres. Således indeholder denne BC-MPS-model flere elementer af tumormikromiljøet, som tidligere modelsystemer ikke havde.

Denne model kan bruges til at studere metabolisk krydstale mellem fuldt modne adipocytter og BC-celler. Tidligere modeller, der studerer samspillet mellem adipocytter og kræftceller, bruger præ-adipocytter, der er differentieret in vitro. Præ-adipocytter , der er differentierede in vitro , modnes ikke fuldt ud i samme omfang som adipocytter differentieret in vivo30,31. For at forstå, hvordan adipocytterne påvirker kræftsprogression og lægemiddelrespons, er det vigtigt at efterligne den komplekse molekylære og kemiske sammensætning af indfødte adipocytter korrekt. Her har vi vist, at vores system gør det muligt at vurdere den metaboliske krydstale, der opstår mellem adipocytter og BC-celler (Figur 4).

BC-MPS kan også bruges til at udføre in vitro-undersøgelse af, hvordan tilstande som fedme, som ikke kan modelleres korrekt ved hjælp af standardcellelinjer, påvirker udviklingen af kræft. Fedme er forbundet med ændring af HBT's mikromiljø og en stigning i metastaser i BC, selvom de nøjagtige mekanismer ikke er fuldt forstået32,33,34. Fibroblaster, ASC'er, adipocytter og ECM ændres under fedme og fremmer yderligere progression og metastaser af kræft25,35,36. Det er derfor vigtigt at bruge indfødte stromale celler og ECM fra overvægtigt væv til at forstå, hvordan disse ændringer i de stromale celler og ECM påvirker BC. Ved at udnytte HBT og ASCs fra overvægtige eller magre patienter i BC-MPS model de mekanismer, som fedme fremme en metastatisk fænotype kan belyses.

Den metode, der præsenteres her, er til dyrkning af brystkræftceller i en kultur, der omfatter ASC'er, modne adipocytter og indfødt ECM. Tidligere modeller af co-kulturer systemer har undersøgt, hvordan disse individuelle forskellige elementer i det stromale miljø påvirker kræft. Da ASC'erne og adipocytterne begge påvirker BC-progressionen, kan det være kompliceret at bestemme, hvilken celletype der er ansvarlig for at påvirke BC. Dette kan dog bestemmes ved at sammenligne BC-MPS med enklere co-culture-modeller med én celletype. En af fordelene ved dette system sammenlignet med on-a-chip eller bioprinting systemer er, at der ikke er behov for særligt udstyr til at oprette systemet ud over pNIPAAm belagte plader, som er kommercielt tilgængelige. Modelsystemer af brystvæv er tidligere blevet beskrevet ved hjælp af bioprint til at deponere ASC'er i stilladser, der derefter differentieres i kultur22. Dette kræver yderligere 2-3 uger for cellerne at differentiere og ASCs differentieret i kultur ikke fuldt ud differentiere til modne adipocytter. De modne adipocytter fra HBT i BC-MPS er klar til at blive brugt i det øjeblik, de fjernes fra en patient.

Modelsystemet, der er beskrevet her, er nyttigt system til at studere krydstale mellem kræftceller og mikromiljøet, men det har nogle begrænsninger. En af de største begrænsninger er tilgængeligheden af primære menneskelige brystvæv. Humant fedtvæv kan ikke kryopræserveres uden tab af levedygtighed, og det væv, der anvendes til fremstilling af BC-MPS, skal derfor nyfreklædes og anvendes37. En anden begrænsning er, at modellen som præsenteret her er et statisk system, der er dyrket i almindelige 6 brøndplader. Systemet mangler det mikrofluidiske flow, der er til stede i organer-on-a-chip, som kan påvirke ilt og næringsstof tilgængelighed, ren og skær stress, og narkotika distribution38,39. En tredje begrænsning er behovet for, at cellerne adskilles fra hinanden i slutningen af eksperimentet, hvis de forskellige celletyper skal analyseres individuelt. Dette kræver, at det er nødvendigt at mærke cellerne, så de kan adskilles fra hinanden.

Inkorporeringen af mange elementer i tumormikromiljøet producerer en fysiologisk model til undersøgelse af kræftsprogression og indledning af metastaser. Ud over at være i stand til at studere kræftceller i en mere fysiologisk model, BC-MPS kan også bruges til at studere de enkelte elementer i mikromiljøet, og hvordan de er påvirket af kræft. Mens de data, der er repræsenteret her, viser, hvordan BC-MPS kan bruges med en cellelinje, kan BC-MPS let tilpasses til en forskers særlige eksperimentelle behov. For eksempel kan overvægtige HBT sammenlignes med lean HBT at afgøre, hvordan fedme påvirker kræft metastaser og progression. Forskellige undertyper af BC kan sås i BC-MPS at undersøge, hvordan undertyper af kræft interagerer forskelligt med mikromiljøet. Genredigeringsteknikker kan anvendes til at bestemme, hvordan specifikke gener påvirker samspillet mellem BC og mikromiljøet. Denne model og dens applikationer vil give mulighed for en mere præcis forståelse af, hvordan det stromale miljø og brystkræft interagerer for at fremme kræft progression og metastaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Tulane Flow Cytometry og Cell Sortering Core samt Tulane Histology Core for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant og National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020).
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

Kræftforskning Problem 170 brystkræft mikrofysiologisk system humant brystvæv fedt-afledte stamceller primær kultur lægemiddeludvikling metabolisk krydstale
Modellering af brystkræft i humant brystvæv ved hjælp af et mikrofysiologisk system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. M., Hebert, K. L.,… More

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter