Summary
Die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode für die Zelluloseschätzung. Der Hauptzweck dieser Demonstration besteht darin, ein detailliertes Updegraff-Protokoll zur Schätzung des Zellulosegehalts in pflanzlichen Biomasseproben bereitzustellen.
Abstract
Cellulose ist das am häufigsten vorkommende Polymer auf der Erde, das durch Photosynthese erzeugt wird, und die Haupttragende Komponente von Zellwänden. Die Zellwand spielt eine wichtige Rolle für das Pflanzenwachstum und die Entwicklung, indem sie Kraft, Steifigkeit, Geschwindigkeit und Richtung des Zellwachstums, Zellformerhaltung und Schutz vor biotischen und abiotischen Stressoren bietet. Die Zellwand besteht hauptsächlich aus Cellulose, Lignin, Hemicellulose und Pektin. Kürzlich wurden Pflanzenzellwände für die Biokraftstoff- und Bioenergieproduktion der zweiten Generation ins Visier genommen. Insbesondere wird die Zellulosekomponente der Pflanzenzellwand zur Herstellung von Celluloseethanol verwendet. Die Abschätzung des Zellulosegehalts von Biomasse ist für die grundlagende und angewandte Zellwandforschung von entscheidender Bedeutung. Die Updegraff-Methode ist einfach, robust und die am weitesten verbreitete Methode zur Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts pflanzlicher Biomasse. Die alkoholunlösliche rohzellige Wandfraktion bei behandlung mit Updegraff-Reagenz eliminiert die Hemicellulose- und Ligninfraktionen. Später wird die Updegraff Reagenz-resistente Cellulosefraktion einer Schwefelsäurebehandlung unterzogen, um das Cellulose-Homopolymer in monomere Glukoseeinheiten zu hydrolysieren. Eine Regressionslinie wird mit verschiedenen Glukosekonzentrationen entwickelt und verwendet, um die Menge der Glukose zu schätzen, die bei der Zellulosehydrolyse in den Versuchsproben freigesetzt wird. Schließlich wird der Cellulosegehalt anhand der Menge an Glukosemonomeren durch farbmetrischen Anthronassay geschätzt.
Introduction
Cellulose ist die primäre tragende Komponente von Zellwänden, die sowohl in primären als auch in sekundären Zellwänden vorhanden ist. Die Zellwand ist eine extrazelluläre Matrix, die Pflanzenzellen umgibt und hauptsächlich aus Zellulose, Lignin, Hemicellulose, Pektin und Matrixproteinen besteht. Ungefähr ein Drittel der Pflanzenbiomasse ist Cellulose1 und sie spielt eine wichtige Rolle beim Pflanzenwachstum und der Pflanzenentwicklung, indem sie Stärke, Steifigkeit, Geschwindigkeit und Richtung des Zellwachstums, Zellformerhaltung und Schutz vor biotischen und abiotischen Stressoren bietet. Baumwollfasern enthalten 95%Cellulose-2-Gehalt, während Bäume 40% bis 50% Zellulose je nach Pflanzenart und Organtypen3enthalten. Die Cellulose besteht aus sich wiederholenden Einheiten von Cellobiose, einem Disaccharid von Glukoserückständen, die durch β-1,4 glykosidische Bindungen4verbunden sind. Cellulose-Ethanol wird aus der Glukose hergestellt, die aus der in den Pflanzenzellwänden vorhandenen Zellulose gewonnen wird5. Cellulose Faser besteht aus mehreren Mikrofibrillen, in denen jedes Mikrofibril als Kerneinheit mit 500-15000 Glukosemonomeren1,6fungiert. Das Cellulose-Homopolymer wird durch Plasmamembran-eingebettete Cellulose-Synthase-Komplexe (CSC's)1,7synthetisiert. Individuelle Cellulosesynthase A (CESA) Proteine synthetisieren Glucanketten und die angrenzenden Glucanketten sind durch Wasserstoffbindungen zu kristalliner Cellulose1,8verbunden. Cellulose existiert in mehreren kristallinen Formen mit zwei vorherrschenden Formen, Cellulose I und Cellulose I als native Formen9. In höheren Pflanzen existiert Cellulose in Zellulose-I-Form, während untere Pflanzenzellulose in I-Form10,11existiert. Insgesamt spielt die Zellulose eine wichtige Rolle bei der Stärkung und Steifigkeit der Pflanzenzellwände.
Biokraftstoffe der ersten Generation werden hauptsächlich aus Maisstärke, Rohrzucker und Rübenzucker hergestellt, die Nahrungsquellen sind, während Biokraftstoffe der zweiten Generation sich auf die Biokraftstoffproduktion aus Biomasse-Zellwandmaterial von Non-Food-Pflanzen konzentrieren12. Die genaue Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts ist nicht nur für die Grundlagenforschung zur Zellulosebiosynthese und Zellwanddynamik wichtig, sondern auch für die Forschung über angewandte Biokraftstoffe und Bioprodukte. Verschiedene Methoden wurden entwickelt und optimiert für die Abschätzung von Zellulose in der pflanzlichen Biomasse, und die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode zur Zelluloseschätzung. Die erste gemeldete Methode zur Zelluloseschätzung wurde von Cross und Bevan 190813gemeldet. Das Verfahren beruhte auf dem Prinzip der alternativen Chlorierung und Extraktion durch Natriumsulfat. Die durch die ursprüngliche sowie modifizierte Protokolle der Cross- und Bevan-Methode erhaltene Cellulose zeigte jedoch eine Kontamination kleiner Ligninfraktionen zusätzlich zu einer erheblichen Menge an Xylanen und Mannanen14. Trotz mehrerer Modifikationen zur Entfernung von Lignin und Hemicellulosen aus der Zellulosefraktion behielt die Cross-Bevan-Methode zusammen mit Cellulose eine beträchtliche Menge an Mannanen bei. Später wurde Kurschners Methode unter Verwendung von Salpetersäure und Ethanol zur Extraktion von Cellulose15entwickelt. Diese Methode besagte, dass die gesamte Lignin und 75% der Pentosane entfernt wurden, aber die wahren Cellulose-Ergebnisse waren die gleichen wie die durch Chlorierungsmethode von Cross und Bevan geschätzt. Eine andere Methode (Norman und Jenkins) wurde unter Verwendung von Methanol-Benzol, Natriumsulfat und Natriumhypochlorit zur Extraktion von Cellulose16entwickelt. Diese Methode behielt auch einen Bruchteil von Lignin (3%) und signifikante Mengen an Pentosanen, die zu einer genauen Schätzung der Zellulose führen. Später verwendeten Kiesel und Semiganowsky einen anderen Ansatz, um Cellulose mit 80% konzentrierter Schwefelsäure zu hydrolysieren, und die hydrolysierten reduzierten Zucker wurden nach Bertrands Methode17geschätzt. Die beiden Methoden, Waksman es und Stevens18 und Salo14,19, die auf der Grundlage der Kiesel- und Semiganowsky-Methode entwickelt wurden, ergaben ebenfalls 4-5% weniger Zellulosegehalt im Vergleich zu früheren Methoden20.
Die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode zur Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts. Diese Methode wurde erstmals von Updegraff für die Messung von Zellulose im Jahr 1969beschrieben 21. Die Updegraff-Methode integriert die Kurschner-Methode (Verwendung von Salpetersäure), Kiesel- und Seminowsky-Methoden (Hydrolyse von Cellulose in Glukosemonomere mit Schwefelsäure) mit einigen Modifikationen und den Anthron-Assay von Viles und Silverman zur einfachen kolorimetrischen Abschätzung des Glukose- und kristallinen Cellulosegehalts22. Das Prinzip dieser Methode ist die Verwendung von Essigsäure und Salpetersäure (Updegraff Reagenz), um Hemicellulose und Lignin aus den homogenisierten Pflanzengeweben zu entfernen, die essig/Salpetersäure-resistente Cellulose zur Weiterverarbeitung und Schätzung15zurücklassen. Die essigsäure-/salpetersäureresistente Cellulose wird mit 67% Schwefelsäure behandelt, um die Cellulose in Glukosemonomere zu brechen und die freigesetzten Glukosemonomere werden durch Anthron-Assay21,23geschätzt. Mehrere Modifikationen der ursprünglichen Updegraff-Methode wurden verwendet, um das Verfahren und die Zelluloseabschätzung durch Anthron-Assay24zu vereinfachen. Im Großen und Ganzen kann diese Methode in fünf Phasen unterteilt werden. In der ersten Phase wird das Pflanzenmaterial vorbereitet. In der zweiten Phase wird die Rohzellwand von der gesamten Biomasse getrennt, da Zellulose der Schlüsselbestandteil von Pflanzenzellwänden ist. Später, in der dritten Phase, wird die Zellulose durch Behandlung mit Updegraff-Reagenz von den nicht-zelluloseischen Zellwandkomponenten getrennt. In der vierten Phase wird die essigsäure-/stickstoffsäureresistente Cellulose durch Schwefelsäurebehandlung in Glukosemonomere gebrochen. Die Schwefelsäurebehandlung von Cellulose führt zur Bildung von 5-Hydroxymethylfurfuralverbindungen aus der Reaktion von Glukosemonomeren mit Schwefelsäure. Schließlich erzeugt der Anthron in der letzten Phase einen grünlich-blauen Komplex durch Kochen mit der furfuralen Verbindung, die in der vorherigen Phase25erzeugt wurde. Diese anthronbasierte kolorimetrische Methode wurde erstmals 1942 von Dreywood verwendet. Anthrone ist ein Farbstoff, der Furfuralverbindungen von Pentose und Hexose dehydrierte Produkte wie 5-Hydroxymethylfurfural identifiziert, unter sauren Bedingungen. Reaktion mit Hexose produziert eine intensive Farbe und bessere Reaktion im Vergleich zu Pentoses25. Die Menge der gebundenen Glukose wird durch Spektralphotometer-Absorption bei 620 nm gemessen und die Intensität des grünlich-blauen Komplexes ist direkt proportional zur Zuckermenge in der Probe. Die gemessenen Absorptionswerte wurden mit einer Regressionslinie der Glukose-Standardkurve verglichen, um die Glukosekonzentration der Probe zu berechnen. Der gemessene Glukosegehalt wurde verwendet, um den Zellulosegehalt der pflanzenden Biomasse zu schätzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimentelle Zubereitung
- Getrocknetes Pflanzenmaterial zu einem feinen Pulver mahlen.
- Protein-Solubilisationspuffer (PSB): Bereiten Sie Lagerlösungen von 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (pH 8.0) vor und autoklavn Sie sie. Machen Sie aus diesen Lagerlösungen einen frischen PSB-Puffer mit Endkonzentrationen von 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA und 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) in sterilem Wasser.
- 100 ml 70% Ethanol (v/v): 70 ml 100% Ethanol und 30 ml steriles Wasser vorbereiten.
- 100 ml Methanol vorbereiten: Chloroform im Verhältnis 1:1 (50 ml Methanol und 50 ml Chloroform).
- 82,5 ml Updegraff-Reagenz vorbereiten. 75 ml 80% Essigsäure zu 7,5 ml Salpetersäure hinzufügen, so dass das endgültige Verhältnis von Wasser: Essigsäure: Salpetersäure in 2:8:1 (v/v) ist. Um 80% Essigsäure zuzubereiten, 80 ml Eisessigsäure in 20 ml sterilem Wasser (v/v) auflösen.
- Bereiten Sie einen frischen Vorrat von 1 mg/ml Glukoselösung vor. 10 mg Glukose in 10 ml Wasser (w/v) auflösen.
- Zur Zubereitung von 100 ml 67% Schwefelsäure (v/v) 67 ml konzentrierte Schwefelsäure zu 33 ml Wasser hinzufügen. Verwenden Sie immer eine Glasflasche und fügen Sie Säure langsam ins Wasser. Dieser Schritt ist exotherm (gibt Wärme ab). Daher bereiten Sie diese Lösung auf Eis vor und kühlen Sie im Kühlschrank für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch.
- Bereiten Sie frische 0,2% Anthronung (w/v) für jede Charge von experimentellen Proben vor. 0,2 g Anthronung wiegen und in 100 ml vorgekühlter konzentrierter Schwefelsäure in einer mit Aluminiumfolie umwickelten Glasflasche auflösen. Vor Gebrauch 1-2 Stunden im Kühlschrank aufbewahren.
HINWEIS: Vorkühlung konzentrierte Schwefelsäure im Kühlschrank am Tag des Experiments, und frische Vorbereitung von Anthronung ist sehr empfehlenswert für eine genaue Abschätzung des Glukosegehalts.
2. Aufbereitung von pflanzlichem Biomassematerial
- Sammeln Sie pflanzenbasierte Biomasseproben aus 2 Monate alten Baumwoll-Experimentallinien, die im Gewächshaus mit den gleichen Wachstumsbedingungen, der gleichen Entwicklungsstufe, der gleichen Position der Pflanzen und der gleichen Art von Gewebe (Blatt/Stamm/Wurzel) angebaut werden.
HINWEIS: Sammeln Sie mindestens drei biologische Replikationen für jede Probe. Waschen Sie sie gründlich mit Wasser, um den ganzen Schmutz aus dem Wurzelgewebe zu entfernen. - Lufttrockenes Wurzelgewebe für 2 Tage auf Papiertüchern bei Raumtemperatur, um den Feuchtigkeitsgehalt zu entfernen (Abbildung 1).
HINWEIS: Lufttrockenes Wunschgewebe zur Zelluloseschätzung, um pilzveruneite. - Platzieren Sie die Stammproben in einzelnen Containern. Dann beschriften und trocknen Sie sie im Inkubator bei 49 °C für 10 Tage (Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Alternativ kann ein Gefriertrockner verwendet werden, um das Pflanzengewebe in weniger Zeit (1 oder 2 Tage) zu trocknen, ohne chemische Veränderungen am Pflanzenbiomassematerial zu verursachen. - Die getrockneten Proben in kleine Stücke schneiden, in flüssigem Stickstoff einfrieren und mit einem Mörtel und Stößel, einer Gefriermühle oder einem Biomasseschleifer zu gleichmäßigem Feinpulver mahlen (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Gefriermühle wurde mit einer Rate von 10 cps für 3 Zyklen verwendet. - Sammeln Sie das geerdete Gewebe (Abbildung 2) und fahren Sie mit der Zellwandextraktion fort.
HINWEIS: Der Prozess kann an dieser Stelle angehalten werden, indem die Proben in luftdichten Behältern bei Raumtemperatur gelagert werden.
3. Gewinnung von Rohzellwänden aus pflanzlicher Biomasse
HINWEIS: Die Pflanzenzellwände enthalten Cellulose, Lignin, Nicht-Zellulose-Komponenten, Pektin, Matrixproteine, Phenolverbindungen und Wasser26. Da Cellulose in Zellwänden vorhanden ist, besteht der erste Schritt darin, Zellwandkomponenten von nicht-zelligen Wandkomponenten der pflanzlichen Biomasse zu trennen26.
- Beschriften und wiegen Sie einzelne leere 2 ml-Rohre, bevor Sie mit dem Extraktionsprozess der Zellwand beginnen.
- Notieren Sie sich die leerstehenden Rohrgewichte in einem Labornotizbuch, bevor Sie fortfahren.
- Wiegen Sie 20 mg pulverisiertes Gewebe ab Schritt 2.5 und übertragen Sie es in vorgewogene 2 ml-Rohre und beschriften Sie sie.
- Fügen Sie 1 ml Protein-Solubilisationspuffer (PSB) (50 mM Tris Hydrochlorid (HCl) Puffer pH 8,8, 0,5 mM EDTA und 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) hinzu, um Proteine zu slubilisieren. Vortex und Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet speichern.
HINWEIS: Der Überstand kann gespeichert werden, wenn die Proteinkomponente analysiert werden muss. - Wiederholen Sie Schritt 3.4 zwei weitere Male.
- Zum zurückgehaltenen Pellet 1 ml destilliertes Wasser und Wirbel hinzufügen. Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und entfernen Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie Schritt 3.6 zwei weitere Male.
- Fügen Sie 1 ml 70% Ethanol in das gespeicherte Pellet, Wirbel und erhitzen Sie es bei 70 °C für 1 h in einem Wasserbad / Wärmeblock, um lösliche Komponenten und Stärke aus den Proben zu entfernen. Vortex und Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und speichern Sie das Pellet.
- Wiederholen Sie Schritt 3.8 noch einmal.
- Zum Pellet 1 ml 100% Methanol und Wirbel hinzufügen. Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und entfernen Sie den Überstand.
- 1 ml Chloroform/Methanol (Chloroform und Methanol im Verhältnis 1:1) in das Pellet und den Wirbel geben. Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei RT und entfernen Sie den Überstand. Die Zugabe von Methanol und Chloroform-Lösungsmittel löst und entfernt die Lipidfraktion aus der Biomasse27.
- Zum Pellet 1 ml 100% Aceton und Wirbel hinzufügen. Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren. Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei RT und entfernen Sie den Überstand. Aceton entfernt Pigmente wie Chlorophyll und freie Fettsäuren aus der Biomasse28,29.
- Das Pellet über Nacht bei 37 °C trocknen oder durch Vakuumtrocknung weiterführen.
HINWEIS: Das getrocknete Pellet ist die rohe Zellwand, die für die Kristalline Zelluloseschätzung verwendet wird. Der Prozess kann an dieser Stelle angehalten werden oder weiter mit Vakuumtrockner zum Trocknen von Proben fortfahren.
4. Behandlung mit Updegraff-Reagenz (Essig- und Salpetersäure) zur Entfernung nicht-zellulosehaltiger Komponenten
HINWEIS: Das Protokoll beinhaltet die Verwendung von Säuren und anderen Chemikalien. Tragen Sie während des gesamten Prozesses persönliche Schutzausrüstung (PSA).
- Messen Sie 5 mg des getrockneten Rohzellwandpellets in ein frisches 2 ml Schraubrohr. Beachten Sie das genaue Gewicht (Abbildung 3)30.
- Fügen Sie an dieser Stelle eine positive Steuerung ein. Verwenden Sie 2 mg Filterpapier (Materialtabelle) als positiv zu kontrollieren, der einen Zellulosegehalt von 80 % liefert.
- 1,5 ml des Updegraff-Reagenzes zu den gewogenen 5 mg Zellwandextrakt und positiver Kontrolle hinzufügen. Mix durch Wirbel.
ANMERKUNG: Die Positivkontrolle sollte ab diesem Schritt auf die gleiche Weise wie die Versuchsproben verarbeitet werden. Dieser Schritt sollte in der Dunstabzugshaube mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung (PSA) durchgeführt werden.
VORSICHT: Dieser Schritt sollte in Schraubverschlussrohren durchgeführt werden, um das Spritzen von Proben und das Knallen der Rohre zu verhindern. Drei biologische Wiederholungen jeder Probe sowie drei Wiederholungen zur positiven Kontrolle sollten einbezogen werden. - Die Aufhängung bei 100 °C 30 min in einem kochenden Wasserbad erhitzen und auf einer Bank 10 min abkühlen lassen. Zentrifuge bei 25.200 x g für 10 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand durch Zentrifugation und speichern Sie das Pellet.
HINWEIS: Die erzeugten Abfälle sollten getrennt für organische Lösungsmittel, Schwefelsäure und Updegraff-Reagenz (Essigsäure und Salpetersäure) gesammelt werden. Abfälle mit Essigsäure und Salpetersäure sollten bei kühlen Temperaturen mit belüfteten Kappen aufbewahrt und niemals mit anderen organischen Lösungsmitteln und anderen Säuren vermischt werden, um eine Explosion zu verhindern. - 1 ml Wasser in das Pellet geben. Zentrifuge bei 25.200 x g für 10 min bei RT. 500 l des Überstandes entfernen und 1 ml Aceton in das Rohr geben.
- Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei RT. 1 ml Überstand entfernen und 1 ml Aceton in das Rohr und die Zentrifuge bei 25.200 x g für 5 min bei RT geben.
- Nach der Zentrifugation den gesamten Überstand entfernen und das Pellet in 1 ml Aceton aussetzen. Inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 5 min und drehen Sie bei 25.200 x g für 5 min bei RT.
- Entsorgen Sie den Überstand und speichern Sie das Pellet. Das Pellet über Nacht bei 37 °C trocknen (Abbildung 3).
HINWEIS: Der Prozess kann an dieser Stelle angehalten werden oder weiter vakuumtrockner zum Trocknen verwenden und mit dem nächsten Schritt fortfahren.
5. Hydrolyse von Cellulose durch Säure zur Herstellung von Glukosemonomereinheiten
- 1 ml 67% Schwefelsäure in das getrocknete Pellet geben. Wirbel, um das Pellet vollständig in der Säure zu mischen.
- Schütteln Sie Rohre bei Raumtemperatur für 1 h, um das Cellulosepellet in 67% Schwefelsäure aufzulösen.
HINWEIS: Alternativ kann die Löslichkeit des Cellulosepellets in 67% Schwefelsäure durch Beschallung jeder Probe für 10 min nach 30 min Inkubation im Shaker verbessert werden. Nach der Beschallung können Proben im Shaker bei RT erneut inkubiert werden. Jedoch, Wir beobachteten vollständige Löslichkeit von Cellulose-Pellet ohne Beschallung, wenn wir mit 5 mg rohen Zellwandextrakt beginnen (Abbildung 3). Dieses Verfahren funktionierte gut für verschiedene pflanzliche Biomasseproben3.
6. Messung des Glukosegehalts durch anthronenasund Abschätzung des Zellulosegehalts
- In diesem Stadium ist die Zellulose in Form von freien Glukosemonomeren. Bestimmen Sie die Cellulosemenge, indem Sie die in der Probe vorhandene Glukosemenge mittels Spektrophotometrie messen.
- Nehmen Sie 10 l der Probe aus dem Schritt 5 und fügen Sie sie zu 490 l sterilem destilliertem Wasser hinzu, um eine Verdünnung jeder Probe auf 500 l zu machen. Wirbel das verdünnte Gemisch aus Probe und Wasser für 10 Sekunden.
- 1 ml 0,2% frisch zubereitetes Anthronreagenz in jedes Rohr geben und sofort durch Wirbeln mischen.
- Proben bei 100 °C 10 min kochen und die Schläuche auf Eis 5 min abkühlen. Übertragen Sie 200 l jeder Probe in drei Brunnen einer 96-Well-Platte. Laden Sie die 96-Well-Platte in ein Spektralphotometer, um die Absorption bei 620 nm zu messen.
HINWEIS: Zum Kochen bei hohen Temperaturen verwenden Sie schraubkappende Rohre, um das Spritzen schädlicher Chemikalien zu verhindern und den Verlust von Proben zu vermeiden.
7. Vorbereitung der Glukose-Standardkurve
- Um den Glukosestandard vorzubereiten, machen Sie einen frischen Vorrat von 1 mg/ml Glukose, indem Sie 10 mg Glukose in 10 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen. Fügen Sie diese Stammlösung von 1 mg/ml in 20 L-Schritten (0, 20, 40, 60, 80,100,120,140, 160, 180 l) in steriles destilliertes Wasser (Gesamtvolumen 1 ml) hinzu, um Glukosestandards zwischen 0 g und 180 g/ml -Konzentrationen zu erstellen (Abbildung 3). Wirbel jeden Glukose-Standard nach Zugabe von sterilem Wasser.
- Aus diesen 10 verschiedenen Konzentrationen werden 500 l jeder Glukosekonzentration in ein frisches 2 ml Schraubrohr umgewandelt.
- 1 ml frisch zubereitete 0,2% Anthronung in jedes Rohr geben und sofort durch Wirbeln mischen. Auf Eis bebrüten und bei 100 °C 10 min kochen, gefolgt von einer Inkubation auf Eis für 5 min23.
- Übertragen Sie 200 l jeder Norm auf drei Bohrungen in einer 96-Well-Mikrotiterplatte für drei technische Replikationen und messen Sie die Absorption bei 620 nm (Abbildung 3).
- Entwickeln Sie eine Standard-Glukosekurve, indem Sie verschiedene Glukosekonzentrationen (0 bis 180 g/ml) gegen normalisierte Absorptionswerte bei 620 nm(Abbildung 7) nachzeichnen. Verwenden Sie die Regressionslinie Y= mx+c, die aus den Absorptionswerten generiert wird, um den Cellulosegehalt in den vorbereiteten Proben zu berechnen.
HINWEIS: Glukosestandards müssen für jeden Versuchssatz frisch vorbereitet werden. Die Konzentration der Glukose sollte erhöht werden, wenn die OD-Werte zu hoch/niedrig sind, so dass diese Werte in den Bereich der Standardkurvenabsorptionswerte fallen. Die Regressionslinie erzeugt unterschiedliche m- und c-Werte basierend auf den Glukosestandards, die für jede Probencharge verwendet werden. Mischen Sie Rohre unmittelbar nach dem Hinzufügen von anthrone23. Anthronung, verdünnte Proben und vorbereitete Standards wurden immer kalt gehalten, bis der Anthron-Assay wegen der exothermen Natur dieser Reaktion durchgeführt wurde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Für diese Studie wurden Baumwollpflanzen ausgewählt, die im grünen Haus angebaut wurden. Für die vergleichende Analyse des Zellulosegehalts wurden zwei verschiedene Versuchslinien aus Baumwolle ausgewählt. Für jede versuchsweise Linie wurde das Wurzelgewebe aus drei biologischen Repliken entnommen. Insgesamt 500 mg Gewebe wurde homogenisiert und 20 mg davon wurde für die Rohzellwandextraktion verwendet. Später wurden 5 mg Rohzell-Wandextrakt zur Behandlung von Updegraff-Reagenzien verwendet, um Hemicellulose und Lignin aus Zellulose zu entfernen. Die gereinigte Cellulose wurde durch Schwefelsäurebehandlung hydrolysiert, um die Cellulose in Glukoseeinheiten aufzuspalten. Die Ergebnisse der Absorptionswerte bei 620 nm (Ergänzende Tabelle 1) wurden verwendet, um die Glukosekonzentration zu messen und den Zellulosegehalt durch den Anthron-Assay zu schätzen. Die durchschnittlichen Absorptionswerte von drei technischen Replikationen wurden normalisiert, indem der Leerabsorptionswert der Glukosekonzentration 0 g subtrahiert wurde. Die Glukose-Standardkurve wurde mit hilfe eines Streubalkendiagramms erzeugt (Abbildung 4).
Die resultierende Regressionslinie y = mx + c aus dieser Standardkurve wird verwendet, um eine unbekannte Glukosekonzentration in den extrahierten Testproben unter Verwendung der normalisierten Absorptionswerte zu berechnen. Zur Berechnung von x (der unbekannten Glukosekonzentration in g/l) wurde die Formel (x = normalisierte Absorption-c/m) verwendet. Die c- und m-Werte aus der Regressionslinie der Standard-Glukosekurve(R2 = 0,99) wurden verwendet, um die Glukosekonzentration in g/l zu messen. Dann wird dieser Wert durch einen Verdünnungsfaktor von 2 geteilt, da das Endvolumen 500 l beträgt, und weiter geteilt durch ein Probenvolumen von 10 l, um die Glukosekonzentration in g/l zu messen. Da der berechnete Wert für 5 mg Zellwandextrakt liegt, wird er weiter durch 5 geteilt oder mit dem jeweiligen rohen Zellwandgewicht, das für jede Versuchsprobe verwendet wird, um eine Glukosekonzentration pro mg zu erhalten. Der Wert wird weiter durch 1,1 dividiert, um das bei der Hydrolyse gewonnene Wasser zu kompensieren (Glucose hat ein Molekulargewicht von 180 und ein Wassermolekül hat ein Molekulargewicht von 18 und daher wurde das bei der Freisetzung von Glukosemonomeren erzeugte Wasser durch Division des Feuchtigkeitsfaktors 1,1 entfernt). Der resultierende Wert wird mit 100 multipliziert, um den kristallinen Zellulosegehalt in Prozent zu berechnen (Ergänzende Tabelle 1).
Die Ergebnisse des Zellulosegehalts zeigen, dass sie unter den biologischen Replikaten konsistent sind, was auf die technische Genauigkeit der Updegraff-Methode hindeutet. Darüber hinaus wurden die Unterschiede mit 2D-Diagrammen dargestellt. Diese Ergebnisse zeigten die Zellulosegehaltsunterschiede in den verglichenen experimentellen Stichprobenzahlen 1 und 2 (Abbildung 4). Beispiel 1 zeigt 43,4 %, während Probe 2 28,12 % zeigt, was darauf hindeutet, dass diese Methode Unterschiede zwischen den Versuchsproben unterscheiden kann. Ein Student t-Test wurde mit 95% Signifikanzstufe angewendet, um ihre signifikanten Unterschiede zu testen.
Abbildung 1: Herstellung von Baumwollpflanzenbiomasse zur Schätzung des Zellulosegehalts in Wurzeln. (A) Gewächshaus angebaute Pflanzen wurden sanft aus dem Boden gezogen und gründlich mit Wasser gewaschen. Das Pflanzenwurzelgewebe wurde abgetrennt, auf den Papiertüchern aufbewahrt und 2 Tage lang trocknen lassen. B) Anschließend wurde das Wurzelgewebe in einzeln gekennzeichnete Behälter überführt und im Inkubator bei 49 °C für -10 Tage trocknen lassen. (C) Das getrocknete Gewebe wurde in kleine Stücke geschnitten, in flüssigem Stickstoff eingefroren, in die Schleiffläschchen geladen und mit Gefriermühle zu feinem Pulver gemahlen. (D) Fein gemahlenes Gewebepulver wurde in der 50 ml-Röhre gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Flussdiagramm der wichtigsten Schritte der Updegraff-Methode. (A) Bildliche Darstellung der wichtigsten Schritte im Protokoll. (B) Erläutert kritische Schritte, die im Panel (A) angezeigt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vorbereitung verschiedener Glukosekonzentrationen für die Standardkurve. (A) Bereiten Sie die Vorratslösung von Glukose vor, indem Sie 10 mg Glukose in 10 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen, so dass die Endkonzentration des Bestands 1 mg/ml beträgt. Fügen Sie eine Stammlösung von 1 mg/ml Glukose in Schritten von 20 l zu einem Endvolumen von 1 ml mit sterilem destilliertem Wasser hinzu, um verschiedene Glukosekonzentrationen von 0 g bis 180 g/ml zubereiten. (B) Tabelle mit einer Menge von 1 mg/ml Glucose und sterilem destilliertem Wasser, das zuverschiedenen Glukosekonzentrationen zugesetzt werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Glukose-Standardkurve erzeugt mit Absorptionswerten verschiedener Glukosekonzentrationen bei 620 nm. (A) Tabelle mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen von 0 bis 180 g/ml mit den jeweiligen normalisierten Absorptionswerten bei 620 nm. (B) Glukose-Standardkurve, die mit einem Streudiagramm aus den Absorptionswerten (A )erzeugt wird. (C) Balkendiagramm mit kristallinen Zellulosegehaltsunterschieden in den Versuchsproben 1 und 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Tabelle 1: Schätzung des Zellulosegehalts in den Versuchsproben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Baumwollfasern sind Naturfasern, die aus dem Baumwollsaat hergestellt werden. Baumwollfaser ist eine Einzelzelle mit einem Cellulosegehalt von95 % 2 mit hohem kristallinem Zellulosegehalt mit umfangreichen Anwendungen in der Textilindustrie31. Da Baumwollfasern 95 % Cellulose enthalten, haben wir Baumwollwurzelgewebe verwendet, um die Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts zu demonstrieren. Baumwollwurzelgewebe sind mäßig reich an kristallinem Zellulosegehalt und stellen eine allgemein verfügbare pflanzliche Biomasse dar. Die Für den kristallinen Cellulosegehalt erforderliche Gesamtzellwandmenge beträgt nur 5 mg und daher kann diese Methode zur Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts in verschiedenen Entwicklungsstadien/gewebespezifischer Zellulosegehaltsschätzung eingesetzt werden. Der Anteil an Schwefelsäure (67%) spielt auch eine entscheidende Rolle beim Abbau von Zellulose in Glukosemonomere und Auflösung von Cellulose vollständig23 ohne Notwendigkeit für Beschallung. Probenverlust ist nach der Updegraff-Behandlung üblich, da das kristalline Cellulosepellet an der Unterseite des Rohres bei verschiedenen Schritten im Schätzprozess nicht fest ist. Dies kann minimiert werden, indem kleine Mengen an Überstand in jedem Schritt von Wasser und Aceton wäressert nach Updegraff Behandlung entfernt werden. Darüber hinaus spielt die unmittelbare Auswirbelung der Probe und der Standards mit Anthroneine eine wichtige Rolle bei der Farbentwicklung und der erhöhten Genauigkeit der Standards, was zu 99,5 % Bestimmungskoeffizienten(R2) führt (Abbildung 3). Die Glukose-Standardkurve ist entscheidend für die Bestimmung der Glukosekonzentration, die wiederum zur Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts verwendet wird. Somit können die Konzentrationen der Glukose entsprechend dem erforderlichen Konzentrationsbereich angepasst werden. Je nach Wertebereich, der den experimentellen Werten entspricht, kann die Standardkurve zwischen 0 und 100 g/ml oder 0 bis 200 g/ml bis zu 1000 g/ml Glukosekonzentrationen betragen. Dies ändert die Regressionswerte c und m weiter und verbessert die Genauigkeit der kristallinen Zelluloseschätzung. Es ist wichtig, immer frische 0,2% Anthronung sowohl für Proben als auch für den Standard zu machen. R-Quadrat, eine statistische Messung, stellt die Variabilität aller Datenpunkte auf der Regressionslinie dar. Es ist wichtig, sowohl Standards als auch Proben nach dem Hinzufügen von anthrone für die gleiche Zeit zu kochen. Es ist immer wichtig, eine positive Kontrolle mit einem bekannten Zellulosegehalt einzubeziehen. Für eine effektive Datenreproduzierbarkeit muss das gesamte Verfahren genau befolgt werden, einschließlich Lösungsvorbereitung (Standards, Standardkurve und Updegraff-Reagenz).
Kürzlich wurde Cellulose für nichttextile Anwendungen wie Celluloseaerosole, Computerteile und Celluloseethanol32,33untersucht; Daher wird diese Methode in Zukunft breite Anwendungen haben. Der wissenschaftliche Fortschritt erfolgt durch schrittweise Fortschritte beim Verständnis von Konzepten, durch das Vorschlagen alternativer Hypothesen und die Bereitstellung/Widerung des vorhandenen Wissens. Ähnliche Fortschritte sind bei der Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Abschätzung des Zellulosegehalts in der pflanzlichen Biomasse zu beobachten. Die Zellwand ist eine komplexe Matrix und die Updegraff-Methode eliminiert nichtzellulose Fraktionen aus reiner Zellulose in sequenzieller Weise, was zu einer genauen Abschätzung des Zellulosegehalts in der pflanzlichen Biomasse führt. Darüber hinaus machte die einfache kolorimetrische Methode, die zur Schätzung des Zellulosegehalts durch Messung der Glukosekonzentration entwickelt wurde, diese Methode sehr anpassungsfähig und weit verbreitet. In der aktuellen Studie waren die Cellulosedaten zwischen verschiedenen biologischen Replikationen der proben, die aus einer einzigen Linie entnommen wurden, konsistent. Daher wird darauf hin, dass die mit dieser Methode erzeugten Daten konsistent, zuverlässig, reproduzierbar und einfach, den Zellulosegehalt durch einfachen kolorimetrischen Test zu messen.
Die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode für die Zelluloseschätzung. Mit der jüngsten Ausweitung der industriellen Anwendung von Zellulose wie Lebensmitteln, Holz, Papier, Fasern, Biokraftstoffen, Kleidung, Kosmetika und Pharmazeutika ist eine genaue Abschätzung des Zellulosegehalts der pflanzlichen Biomasse für verschiedene Anwendungen von entscheidender Bedeutung. Obwohl dies die am weitesten verbreitete Methode für die Zelluloseschätzung ist, ist es wichtig, mehrere Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, um reproduzierbare Daten zu erhalten. Die Biomasseproben sollten auf die gleiche Größe geerdet werden, um eine genaue und reproduzierbare Schätzung des Zellulosegehalts zu erhalten. Bei der Erzeugung der Glukose-Standardkurve ist Vorsicht geboten. Die für die Glukose-Standardkurvenvorbereitung verwendeten Glukosestandards sollten auf der Grundlage der Probenabsorptionswerte erhöht oder verringert werden, so dass die unbekannten Konzentrationen in den Bereich der Glukosekonzentrationen fallen, die zur Vorbereitung der Standardkurve verwendet werden. Andernfalls können die m- und c-Werte variieren, was zu einer ungenauen Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts führt. Die frische Zubereitung von 0,2 % Anthronung für jede Probencharge ist ein weiterer kritischer Schritt der Updegraff-Methode. Für die genaue Schätzung des Zellulosegehalts ist es wichtig, frisch zubereitete 0,2 % Anthronung zu verwenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Wir danken dem Department of Plant & Soil Science und Cotton Inc. für die teilweise Unterstützung dieser Studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
- Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
- Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
- Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
- Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
- Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
- Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
- Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
- Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
- Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
- Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
- Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
- Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
- Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
- Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
- Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
- Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
- Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
- Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
- Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
- Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
- Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
- Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
- Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
- Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
- Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
- Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
- Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).
