Summary
Updegraff-metoden är den mest använda metoden för cellulosauppskattning. Huvudsyftet med denna demonstration är att tillhandahålla ett detaljerat Updegraff-protokoll för uppskattning av cellulosahalten i prover av växtbiomassa.
Abstract
Cellulosa är den mest rikliga polymeren på jorden som genereras av fotosyntes och den huvudsakliga bärande komponenten i cellväggar. Cellväggen spelar en viktig roll för växttillväxt och utveckling genom att ge styrka, styvhet, hastighet och riktning för celltillväxt, cellformsunderhåll och skydd mot biotiska och abiotiska stressfaktorer. Cellväggen består främst av cellulosa, lignin, hemicellulosa och pektin. Nyligen har växtcellsväggarna varit inriktade på andra generationens biobränsle- och bioenergiproduktion. Specifikt används cellulosakomponenten i växtcellväggen för produktion av cellulosaetanol. Uppskattning av cellulosahalten i biomassa är avgörande för grundläggande och tillämpad cellväggsforskning. Updegraff-metoden är enkel, robust och den mest använda metoden för uppskattning av kristallin cellulosahalt i växtbiomassa. Alkohol olösliga rå cell vägg fraktion vid behandling med Updegraff reagens eliminerar hemicellulose och lignin fraktioner. Senare utsätts Updegraff reagensresistent cellulosafraktion för svavelsyrabehandling för att hydrolysera cellulosa homopolymeren till monomeriska glukosenheter. En regressionslinje utvecklas med hjälp av olika koncentrationer av glukos och används för att uppskatta mängden glukos som frigörs på cellulosahydrolys i de experimentella proverna. Slutligen uppskattas cellulosahalten baserat på mängden glukosmonomerer genom kolorimetrisk antropenanalys.
Introduction
Cellulosa är den primära bärande komponenten i cellväggar, som finns i både primära och sekundära cellväggar. Cellväggen är en extracellulär matris som omger växtceller och består främst av cellulosa, lignin, hemicellulosa, pektin och matrisproteiner. Ungefär en tredjedel av växternas biomassa är cellulosa1 och den spelar en betydande roll i växttillväxt och utveckling genom att tillhandahålla styrka, styvhet, hastighet och riktning för celltillväxt, cellformsunderhåll och skydd mot biotiska och abiotiska stressfaktorer. Bomullsfiber innehåller 95% cellulosa2 innehåll, medan träd innehåller 40% till 50% cellulosa beroende på växtart och organtyper3. Cellulosan består av upprepade enheter av cellobiose, en disackarid av glukosrester som är anslutna β-1,4 glykosidbindningar4. Cellulosaetanol framställs av glukosen som härrör från cellulosa som finns i växtcellsväggarna5. Cellulosafiber består av flera mikrofibriller där varje mikrofibril fungerar som kärnenhet med 500-15000 glukosmonomerer1,6. Cellulosor homopolymer syntetiseras av plasmamembran inbäddade cellulosa syntas komplex (CSC)1,7. Enskilda cellulosasyntas A-proteiner (CESA) syntetiserar glukankedjor och de intilliggande glukankedjorna är sammankopplade med vätebindningar för att bilda kristallin cellulosa1,8. Cellulosa finns i flera kristallina former med två dominerande former, cellulosa Iα och cellulosa Iβ som inhemska former9. I högre växter finns cellulosa i cellulosa Iβ-form medan lägre växtcellulosa finns i Iα-form10,11. Sammantaget spelar cellulosa en viktig roll för att ge styrka och styvhet till växtcellsväggarna.
Första generationens biobränslen produceras främst av majsstärkelse, sockerrör och sockerbetor, som är livsmedelskällor, medan andra generationens biobränslen fokuserar på biobränsleproduktion från biomassacellsmaterial från andra generationens biomassa som inte är livsmedelsväxter12. Noggrann uppskattning av kristallint cellulosainnehåll är inte bara viktigt för grundforskningen om cellulosabiosyntes och cellväggsdynamik utan även för forskning om tillämpat biobränsle och bioprodukter. Olika metoder har utvecklats och optimerats för uppskattning av cellulosa i växtbiomassan, och Updegraff-metoden är den mest använda metoden för cellulosauppskattning. Den första rapporterade metoden för cellulosauppskattning var av Cross och Bevan 190813. Metoden baserades på principen om alternativ klorering och extraktion genom natriumsulfat. Cellulosan som erhållits genom originalet samt modifierade protokoll av Cross och Bevan metoden visade dock förorening av små fraktioner av lignin utöver en betydande mängd xylans och mannans14. Trots flera modifieringar för att ta bort lignin och hemicelluloser från cellulosafraktionen behöll Cross-Bevan-metoden en betydande mängd mannaner tillsammans med cellulosa. Senare utvecklades Kurschners metod genom att använda salpetersyra och etanol för att extrahera cellulosa15. Denna metod uppgav att totalt lignin och 75% av pentosanerna avlägsnades men de verkliga cellulosaresultaten var desamma som de som uppskattades med kloreringsmetod för Cross och Bevan. En annan metod (Norman och Jenkins) utvecklades genom att använda metanol-bensen, natriumsulfat och natriumhypoklorit för att extrahera cellulosa16. Denna metod behöll också en bråkdel av lignin (3%) och betydande mängder pentosaner som leder till en korrekt uppskattning av cellulosa. Senare använde Kiesel och Semiganowsky ett annat tillvägagångssätt för hydrolyscellulosa med 80% koncentrerad svavelsyra, och de hydrolyserade reducerade sockerarter uppskattades med Bertrands metod17. De två metoderna, Waksmans och Stevens18 och Salo14,19 som utvecklades baserat på Kiesel och Semiganowskys metod, gav också 4-5% mindre cellulosainnehåll jämfört med tidigare metoder20.
Updegraff-metoden är den mest använda metoden för uppskattning av kristallint cellulosainnehåll. Denna metod beskrevs först av Updegraff för mätning av cellulosa 196921. Updegraff-metoden integrerar Kurschner-metoden (användning av salpetersyra), Kiesel- och Seminowsky-metoder (hydrolys av cellulosa i glukosmonomerer med svavelsyra) med vissa modifieringar och antropisk analys av viles och silverman för enkel kolorimetrisk uppskattning av glukos och kristallin cellulosahalt22. Principen för denna metod är användningen av ättiksyra och salpetersyra (Updegraff reagens) för att eliminera hemicellulosa och lignin från de homogeniserade växtvävnaderna, vilket lämnar ättiksyrabeständig cellulosa för vidare bearbetning och uppskattning15. Den ättiksyraresistenta cellulosa behandlas med 67% svavelsyra för att bryta cellulosan i glukosmonomerer och de frigjorda glukosmonomererna uppskattas av anthrone assay21,23. Flera ändringar av den ursprungliga Updegraff-metoden användes för att förenkla förfarandet och cellulosauppskattningen med anthrone-analys24. I stort sett kan denna metod delas in i fem faser. I den första fasen bereds växtmaterialet. I den andra fasen separeras råcellväggen från den totala biomassan, eftersom cellulosa är den viktigaste komponenten i växtcellsväggar. Senare, i den tredje fasen, separeras cellulosan från de icke-cellulosa cellväggskomponenterna genom behandling med Updegraff reagens. I den fjärde fasen bryts den ättiksyraresistenta cellulosan till glukosmonomerer genom svavelsyrabehandling. Svavelsyrabehandling av cellulosa resulterar i bildandet av 5-hydroxymethylfurfural föreningar från reaktionen av glukosmonomererer med svavelsyra. Slutligen, i den sista fasen, genererar antronen ett grönblått komplex genom att koka med furfuralföreningen som genereras i föregående fas25. Denna antropbaserade kolorimetriska metod användes första gången 1942 av Dreywood. Anthrone är ett färgämne som identifierar furfuralföreningar av pentos och hexose dehydrerade produkter såsom 5-hydroxymethylfurfural, under sura förhållanden. Reaktion med hexose ger en intensiv färg och bättre svar jämfört med pentoser25. Mängden bundet glukos mäts med spektrofotometerabsorbans vid 620 nm och intensiteten hos det grönblå komplexet står i direkt proportion till mängden socker i provet. De uppmätta absorbansvärdena jämfördes med en glukosstandardkurva regressionslinje för att beräkna provet glukoskoncentration. Den uppmätta glukoshalten användes för att uppskatta cellulosahalten i växtbiomassan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimentell förberedelse
- Mala torkat växtmaterial till ett fint pulver.
- Proteinlöslighetsbuffert (PSB): Förbered stamlösningar på 1 M Tris (pH 8.8), 0,5 M etylendiaminetetraacetsyra (EDTA) (pH 8.0) och autoklavera dem. Gör färsk PSB-buffert från dessa stamlösningar med slutliga koncentrationer på 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA och 10% natriumddecylsulfat (SDS) i sterilt vatten.
- Bered 100 ml 70% etanol (v/v): 70 ml 100% etanol och 30 ml sterilt vatten.
- Bered 100 ml metanol: kloroform i ett 1:1-förhållande (50 ml metanol och 50 ml kloroform).
- Förbered 82,5 ml Updegraff-reagens. Tillsätt 75 ml ättiksyra till 7,5 ml salpetersyra så att det ultimata förhållandet mellan vatten: ättiksyra: salpetersyra är i 2:8:1 (v/v). För att förbereda 80% ättiksyra, lös upp 80 ml glacial ättiksyra i 20 ml sterilt vatten (v/v).
- Förbered ett färskt lager av 1 mg/ml glukoslösning. Lös upp 10 mg glukos i 10 ml vatten (w/v).
- För att förbereda 100 ml 67% svavelsyra (v/v), tillsätt 67 ml koncentrerad svavelsyra till 33 ml vatten. Använd alltid en glasflaska och tillsätt syra långsamt i vattnet. Detta steg är exotermt (frigör värme). Förbered därför denna lösning på is och svalna i kylskåpet i minst 2 timmar före användning.
- Förbered färsk 0,2% antrop (w/v) för varje sats av experimentella prover. Väg 0,2 g antropon och lös upp i 100 ml förkyld koncentrerad svavelsyra i en glasflaska insvept med aluminiumfolie. Förvara i kylskåp i 1-2 timmar före användning.
OBS: Förkylande koncentrerad svavelsyra i kylskåpet på dagen för försöket, och ny beredning av antropon rekommenderas starkt för noggrann uppskattning av glukoshalten.
2. Beredning av växtbiomassamaterial
- Samla in växtbiomassaprover från 2 månader gamla experimentella bomullslinjer som odlas i växthuset med samma tillväxtförhållanden, samma utvecklingsstadium, växternas samma position och samma typ av vävnad (blad/stam/rot).
OBS: Samla in minst tre biologiska replikat för varje prov. Tvätta dem noggrant med vatten för att ta bort all smuts från rotvävnaden. - Lufttorr rotvävnad i 2 dagar på pappershanddukar vid rumstemperatur för att avlägsna fukthalten (figur 1).
OBS: Lufttorka önskad vävnad för cellulosauppskattning för att förhindra svampförorening. - Placera rotproverna i enskilda behållare. Märk sedan och torka dem i inkubatorn vid 49 °C i 10 dagar(Materialförteckning).
OBS: Alternativt kan en frystork användas för att torka växtvävnaden på kortare tid (1 eller 2 dagar) utan att orsaka några kemiska förändringar av växtbiomassamaterialet. - Skär de torkade proverna i små bitar, frys dem i flytande kväve och mala i enhetligt fint pulver med hjälp av mortel och mortel, fryskvarn eller biomassakvarn (figur 1).
OBS: Fryskvarnen användes med en hastighet av 10 cps i 3 cykler. - Samla upp den jordade vävnaden (figur 2) och fortsätt med cellväggsextraktionen.
OBS: Processen kan pausas vid denna tidpunkt genom att förvara proverna i lufttäta behållare vid rumstemperatur.
3. Utvinning av råcellsväggar från växtbiomassa
OBS: Växtcellväggarna innehåller cellulosa, lignin, icke-cellulosakomponenter, pektin, matrisproteiner, fenolföreningar ochvatten 26. Eftersom cellulosa finns i cellväggar är det första steget att separera cellväggskomponenten från icke-cellväggskomponenter i växtbiomassan26.
- Etikett och väg enskilda tomma 2 ml-rör innan cellväggsutsugningsprocessen påbörjas.
- Notera tomma rörvikter i en labbanteckningsbok innan du fortsätter vidare.
- Väg 20 mg pulveriserad vävnad från steg 2,5 och överför den till förvägda 2 ml-rör och märk dem.
- Tillsätt 1 ml proteinlöslighetsbuffert (PSB) (50 mM Tris hydrokloridbuffert (HCl) pH 8,8, 0,5 mM EDTA och 10% natriumddecylsulfat (SDS) för att lösligisera proteiner. Virvel och centrifugera vid 25 200 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT). Efter centrifugation, kassera supernatanten och spara pelleten.
OBS: Supernatanten kan sparas om proteinkomponenten behöver analyseras. - Upprepa steg 3.4 två gånger till.
- Tillsätt 1 ml destillerat vatten och virvel till den bevarade pelleten. Centrifug vid 25 200 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT) och ta bort supernaten.
- Upprepa steg 3.6 två gånger till.
- Tillsätt 1 ml 70% etanol till den sparade pelleten, virveln och värm den vid 70 °C i 1 timme i ett vattenbad/värmeblock för att avlägsna lösliga komponenter och stärkelse från proverna. Virvel och centrifugera vid 25 200 x g i 5 min på RT. Kassera supernaten och spara pelleten.
- Upprepa steg 3.8 en gång till.
- Tillsätt 1 ml 100% metanol och virvel till pelleten. Centrifug vid 25 200 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT) och ta bort supernaten.
- Tillsätt 1 ml kloroform/metanol (kloroform och metanol i förhållandet 1:1) till pelleten och virveln. Centrifugera vid 25 200 x g i 5 min på RT och ta bort supernaten. Tillsats av metanol och kloroform lösningsmedel lösliga och tar bort lipidfraktionen från biomassan27.
- Tillsätt 1 ml 100% aceton och virvel till pelleten. Inkubera i rumstemperatur i 5 min. Centrifugera vid 25 200 x g i 5 min på RT och ta bort supernaten. Aceton tar bort pigment som klorofyll och fria fettsyror från biomassan28,29.
- Torka pelleten vid 37 °C över natten eller fortsätt med vakuumtorkning.
OBS: Den torkade pelleten är den råcellvägg som används för kristallin cellulosauppskattning. Processen kan pausas vid denna tidpunkt eller fortsätta med vakuumtork för torkning av prover.
4. Behandling med Updegraff reagens (ättiksyra och salpetersyra) för att avlägsna icke-cellulosakomponenter
PROTOKOLLET omfattar användning av syror och andra kemikalier. Använd personlig skyddsutrustning (PPE) under hela processen.
- Mät 5 mg av den torkade råcellsväggpelleten i ett färskt 2 ml skruvbespapplat rör. Observera den exakta vikten (figur 3)30.
- Inkludera en positiv kontroll i det här läget. Använd 2 mg filterpapper (Table of Materials) som en positiv kontroll som ger 80% cellulosainnehåll.
- Tillsätt 1,5 ml Updegraff-reagenset till vägt 5 mg cellväggsextrakt och positiv kontroll. Blanda genom att virvla.
OBS: Den positiva kontrollen bör bearbetas på samma sätt som försöksproverna från och med detta steg. Detta steg bör utföras i rökhuven med lämplig personlig skyddsutrustning (PPE).
VARNING: Detta steg bör utföras i skruvlocksrör för att förhindra stänk av prov och poppning av rören. Tre biologiska replikat av varje prov tillsammans med tre replikat för positiv kontroll bör inkluderas. - Värm suspensionen vid 100 °C i 30 min i ett kokande vattenbad och svalna på en bänk i 10 minuter. Centrifugera vid 25 200 x g i 10 min vid RT. Ta bort supernaten genom centrifugering och spara pelleten.
OBS: Det avfall som genereras ska samlas in separat för organiska lösningsmedel, svavelsyra och Updegraff-reagens (ättiksyra och salpetersyra). Avfall med ättiksyra och salpetersyra bör förvaras vid svala temperaturer med ventilerade lock och aldrig blandas med andra organiska lösningsmedel och andra syror för att förhindra explosion. - Tillsätt 1 ml vatten till pelleten. Centrifugera vid 25 200 x g i 10 min vid RT. Ta bort 500 μL av supernatanten och tillsätt 1 ml aceton till röret.
- Centrifugera vid 25 200 x g i 5 min vid RT. Ta bort 1 ml supernatant och tillsätt 1 ml aceton till röret och centrifugera vid 25 200 x g i 5 minuter på RT.
- Efter centrifugation, ta bort all supernatant och suspendera pelleten i 1 ml aceton. Inkubera rören vid rumstemperatur i 5 min och snurra vid 25 200 x g i 5 minuter på RT.
- Kassera supernaten och spara pelleten. Torka pelleten vid 37 °C över natten (figur 3).
OBS: Processen kan pausas vid denna tidpunkt eller fortsätta att använda vakuumtork för torkning och gå vidare till nästa steg.
5. Hydrolys av cellulosa med syra för att producera glukosmonomerenheter
- Tillsätt 1 ml 67% svavelsyra till den torkade pelleten. Vortex för att blanda pelleten helt i syran.
- Skaka rören i rumstemperatur i 1 timme för att lösa upp cellulosaspelletsen i 67% svavelsyra.
OBS: Som ett alternativ kan lösligheten av cellulosapelletsen i 67% svavelsyra förbättras genom ultraljudsbehandling av varje prov i 10 min efter 30 min inkubation i skakapparaten. Efter ultraljudsbehandling kan prover återinkuberas i skakapparaten på RT. Vi observerade dock fullständig löslighet av cellulosa pellet utan ultraljudsbehandling när vi börjar med 5 mg rå cell vägg extrakt (Figur 3). Detta förfarande fungerade bra för olika prover av växtbiomassa3.
6. Mätning av glukoshalten genom antropanalys och uppskattning av cellulosahalten
- I detta skede är cellulosan i form av fria glukosmonomererer. Bestäm mängden cellulosa genom att mäta mängden glukos som finns i provet genom spektrofotometri.
- Ta 10 μL av provet från steg 5 och tillsätt det till 490 μL sterilt destillerat vatten för att göra en utspädning av varje prov till 500 μL. Virvel den utspädda blandningen av prov och vatten i 10 sekunder.
- Tillsätt 1 ml 0,2% nylagat antropene-reagens till varje rör och blanda omedelbart genom virvel.
- Koka proverna vid 100 °C i 10 min och kyl rören på is i 5 minuter. Överför 200 μL av varje prov i tre brunnar på en 96 brunnsplatta. Ladda 96 brunnsplattan i en spektrofotometer för att mäta absorbansen vid 620 nm.
OBS: För kokning vid hög temperatur, använd skruvbeklädda rör för att förhindra stänk av skadliga kemikalier och för att undvika förlust av prover.
7. Beredning av glukosstandardkurva
- För att förbereda glukosstandarden, gör ett färskt lager av 1 mg/ml glukos genom att lösa upp 10 mg glukos i 10 ml sterilt destillerat vatten. Tillsätt denna stamlösning på 1 mg/ml i steg om 20 μL (0, 20, 40, 60, 80 100 120,140, 160, 180 μL) för sterilt destillerat vatten (total volym 1 ml) för att förbereda glukosstandarder från 0 μg till 180 μg/ml -koncentrationer(figur 3). Virvel varje glukosstandard efter tillsats av sterilt vatten.
- Från dessa 10 olika koncentrationer, alikvot 500 μL av varje glukoskoncentration till ett friskt 2 ml skruvbestinnat rör.
- Tillsätt 1 ml nylagad 0,2% antropron till varje rör och blanda omedelbart genom virvel. Inkubera på is och koka vid 100 °C i 10 min följt av inkubation på is i 5 min23.
- Överför 200 μL av varje standard till tre brunnar i en 96 brunns micro titer-platta för tre tekniska replikat och mät absorbansen vid 620 nm (figur 3).
- Utveckla en vanlig glukoskurva genom att plotta olika glukoskoncentrationer (0 till 180 μg/ml) mot normaliserade absorbansvärden vid 620 nm (figur 7). Använd regressionslinjen Y= mx+c som genereras från absorbansvärdena för att beräkna cellulosahalten i de beredda proverna.
OBS: Glukosstandarderna måste vara nyberedda för varje uppsättning experiment. Glukoskoncentrationen bör ökas om OD-värdena är för höga/ låga så att dessa värden faller inom intervallet för standardvärdena för kurvabsorbans. Regressionslinjen genererar olika m- och c-värden baserat på de glukosstandarder som används för varje sats av prover. Blanda rör omedelbart efter tillsats av antropron23. Antrop, utspädda prover och beredda standarder hölls alltid kalla tills anthrone-analysen utfördes på grund av den exotermiska karaktären hos denna reaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bomullsplantor som odlades i det gröna huset valdes ut för denna studie. Två olika experimentella linjer av bomull valdes för jämförande analys av cellulosa innehåll. För varje experimentell linje samlades rotvävnaden in från tre biologiska replikat. Totalt 500 mg vävnad homogeniserades och 20 mg av det användes för rå cellvägg utvinning. Senare, 5 mg rå cell vägg extrakt användes för Updegraff reagens behandling för att ta bort hemicellulose och lignin från cellulosa. Den renade cellulosa hydrolyserades av svavelsyra behandling för att bryta ner cellulosan i glukos enheter. Resultaten av absorbansavläsningar vid 620 nm(tilläggstabell 1)användes för att mäta glukoskoncentrationen och uppskatta cellulosahalten med antropostestet. De genomsnittliga absorbansvärdena för tre tekniska replikat normaliserades genom att subtrahera det blanka absorbansvärdet för glukoskoncentrationen på 0 μg. Glukosstandardkurvan genererades med hjälp av ett spridda stapeldiagram (figur 4).
Den resulterande regressionslinjen, y = mx + c från denna standardkurva, används för att beräkna en okänd glukoskoncentration i de extraherade testproverna med hjälp av de normaliserade absorbansavläsningarna. För att beräkna x (den okända glukoskoncentrationen i μg/μL) användes formeln (x = normaliserad absorbans-c/m). C- och m-värdena från regressionslinjen i standardsockerkurvan (R2 = 0,99) användes för att mäta glukoskoncentrationen i μg/μL. Därefter divideras detta värde med en utspädningsfaktor på 2 eftersom den slutliga volymen är 500 μL och ytterligare divideras med en provvolym på 10 μL för att mäta glukoskoncentrationen i μg/μL. Eftersom det beräknade värdet är för 5 mg cellväggsextrakt divideras det ytterligare med 5 eller med respektive råcellväggsvikt som används för varje experimentellt prov för att få glukoskoncentration per mg. Värdet divideras ytterligare med 1,1 för att kompensera för vattnet som erhållits i hydrolysprocessen (glukos har en molekylvikt på 180 och en vattenmolekyl har en molekylvikt på 18 och därför avlägsnades vattnet som genererades i processen att frigöra glukosmonomerer genom att dela fuktfaktorn, 1,1). Det resulterande värdet multipliceras med 100 för att beräkna den kristallina cellulosahalten i procent (kompletterande tabell 1).
Resultaten av cellulosainnehållet visar att de är konsekventa bland de biologiska replikaterna, vilket tyder på den tekniska noggrannheten hos Updegraff-metoden. Dessutom ritades skillnaderna med hjälp av 2D-grafer. Dessa resultat visade cellulosainnehållsskillnaderna i de jämförda experimentella provnumren 1 och 2 (figur 4). Prov 1 visar 43,4% medan prov 2 visar 28,12%, vilket tyder på att denna metod kan skilja skillnader mellan försöksproverna. Ett student t-test tillämpades på 95% signifikansnivå för att testa deras betydande skillnader.
Figur 1: Beredning av biomassa av bomullsväxter för uppskattning av cellulosainnehåll i rötter. (A) Växthusodlade växter drogs försiktigt upp ur jorden och tvättades noggrant med vatten. Växtrotvävnaden separerades, hölls på pappershanddukarna och fick lufttorka i 2 dagar. B)Sedan överfördes rotvävnaden till individuellt märkta behållare och tilläts torka i inkubatorn vid 49 °C i -10 dagar. C)Den torkade vävnaden skars i små bitar, frystes i flytande kväve, lastades i slipflaskan och maldes till fint pulver med fryskvarn. (D) Fingrundat vävnadspulver samlades in i 50 ml-röret. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Flödesschema över de viktigaste stegen i Updegraff-metoden. A)Bildrepresentation av viktiga steg i protokollet. (B) Förklarar kritiska steg som visades i panel (A). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Beredning av olika glukoskoncentrationer för standardkurvan. (A) Bered beståndslösningen av glukos genom att lösa upp 10 mg glukos i 10 ml sterilt destillerat vatten så att den slutliga koncentrationen av beståndet är 1 mg/ml. Tillsätt stamlösning på 1 mg/ml glukos i steg om 20 μL till en slutlig volym på 1 ml med sterilt destillerat vatten för att förbereda olika glukoskoncentrationer från 0 μg till 180 μg/ml. B)Tabell som visar en mängd av 1 mg/ml glukos och sterilt destillerat vatten som skall tillsättas för att göra olika koncentrationer av glukos. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Glukosstandardkurva som genereras med hjälp av absorbansvärden för olika glukoskoncentrationer vid 620 nm. (A) Tabell som visar olika glukoskoncentrationer från 0 till 180 μg/ml med respektive normaliserade absorbansvärden vid 620 nm. B)Glukosstandardkurva som genereras med hjälp av ett punktdiagram från absorbansvärdena (A). C)Stapeldiagram som visar skillnader i kristallin cellulosahalt i försöksproverna 1 och 2. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Tilläggstabell 1: Uppskattning av cellulosahalten i försöksproverna. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bomullsfibrer är naturliga fibrer som produceras av bomullsfed. Bomullsfiber är en enda cell med ~95% cellulosainnehåll2 med hög kristallint cellulosainnehåll med omfattande tillämpningar inom textilindustrin31. Eftersom bomullsfiber innehåller ~ 95% cellulosa har vi använt bomullsrotvävnader för att demonstrera uppskattningen av kristallint cellulosainnehåll. Bomullsrotvävnader är måttligt rika på kristallint cellulosainnehåll och representerar en allmänt tillgänglig växtbiomassa. Den mängd totalcellvägg som krävs för den kristallina cellulosahalten är endast 5 mg och därför kan denna metod användas för att uppskatta kristallint cellulosainnehåll i olika utvecklingsstadier/vävnadsspecifika cellulosainnehållsuppskattningar. Andelen svavelsyra (67 %) spelar också en avgörande roll för att bryta cellulosa i glukosmonomerer och lösa cellulosahelt 23 utan behov av ultraljudsbehandling. Provförlust är vanligt efter Updegraff-behandlingen eftersom den kristallina cellulosapelletsen inte är fast i botten av röret i olika steg i uppskattningsprocessen. Detta kan minimeras genom att ta bort små volymer av supernatant i varje steg av vatten och aceton tvättar efter Updegraff behandling. Vidare spelar omedelbar virvel av provet och standarderna med antropen betydande roller i färgutvecklingen och ökad noggrannhet i standarderna, vilket leder till 99,5 % bestämningskoefficient (R2)(figur 3). Glukosstandardkurvan är avgörande för att bestämma glukoskoncentrationen, som i sin tur används för att uppskatta det kristallina cellulosainnehållet. Därför kan glukoskoncentrationerna justeras enligt det önskade koncentrationsområdet. Beroende på antalet värden som passar de experimentella värdena kan standardkurvan variera från 0 till 100 μg/ml eller 0 till 200 μg/ml upp till 1000 μg/ml glukoskoncentrationer. Detta ändrar ytterligare regressionsvärdena c och m, vilket förbättrar noggrannheten hos kristallin cellulosauppskattning. Det är viktigt att alltid göra färska 0,2% anthrone för båda proverna och samt för standarden. R-kvadrat, ett statistiskt mått, representerar variabiliteten för alla datapunkter på regressionslinjen. Det är viktigt att koka både standarder och prover efter att ha tillsyt anthrone under samma tid. Det är alltid viktigt att inkludera en positiv kontroll med ett känt cellulosainnehåll. För effektiv data reproducerbarhet måste hela förfarandet följas noggrant inklusive lösningsberedning (standarder, standardkurva och Updegraff-reagens).
Nyligen utforskas cellulosa för icke-textila applikationer som cellulosa aerosoler, datordelar och cellulosaetanol32,33; Därför kommer denna metod att ha breda tillämpningar i framtiden. Vetenskapliga framsteg görs genom stegvisa framsteg när det gäller att förstå begrepp, föreslå alternativa hypoteser och tillhandahålla/motbevisa den befintliga kunskapen. Liknande framsteg kan ses i utvecklingen av en tillförlitlig metod för uppskattning av cellulosahalten i växtbiomassan. Cellväggen är en komplex matris och Updegraff-metoden eliminerar icke-cellulosafraktioner från ren cellulosa på ett sekventiellt sätt, vilket leder till noggrann uppskattning av cellulosahalten i växtbiomassan. Vidare gjorde den enkla kolorimetriska metoden utvecklad för uppskattning av cellulosainnehåll genom att mäta glukoskoncentrationen denna metod mycket anpassningsbar och allmänt använd. I den aktuella studien var cellulosadata konsekventa mellan olika biologiska replikat av de prover som samlats in från en enda rad. Således föreslår det att de data som produceras av denna metod är konsekventa, tillförlitliga, reproducerbara och lätta att mäta cellulosahalten genom enkel kolorimetrisk analys.
Updegraff-metoden är den mest använda metoden för cellulosauppskattning. Med den senaste tidens expansion av den industriella tillämpningen av cellulosa som mat, trä, papper, fibrer, biobränslen, kläder, kosmetika och läkemedel är korrekt uppskattning av cellulosahalten i växtbiomassan avgörande för olika tillämpningar. Även om detta är den mest använda metoden för cellulosauppskattning, är det viktigt att vidta flera försiktighetsåtgärder för att få reproducerbara data. Biomassaproverna bör slipas till samma storlek för att erhålla exakt och reproducerbar uppskattning av cellulosahalten. Var försiktig när du genererar glukosstandardkurvan. Glukosstandarder som används för glukosstandardkurvberedningen bör ökas eller minskas baserat på provabsorbansavläsningarna så att de okända koncentrationerna faller inom intervallet glukoskoncentrationer som används för att förbereda standardkurvan. Om inte, m och c värden kan variera, vilket resulterar i felaktig uppskattning av kristallina cellulosa innehåll. Ny beredning av 0,2 % antrop för varje parti prover är ytterligare ett kritiskt steg i Updegraff-metoden. Det är viktigt att använda nyberedda 0,2 % antropon för korrekt uppskattning av cellulosahalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Institutionen för växt- och markvetenskap och bomull Inc. för deras partiella stöd för denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
- Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
- Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
- Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
- Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
- Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
- Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
- Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
- Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
- Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
- Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
- Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
- Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
- Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
- Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
- Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
- Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
- Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
- Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
- Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
- Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
- Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
- Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
- Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
- Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
- Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
- Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
- Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).
