Summary
طريقة Updegraff هي الطريقة الأكثر استخداما لتقدير السليلوز. الغرض الرئيسي من هذا العرض هو توفير بروتوكول Updegraff مفصل لتقدير محتوى السليلوز في عينات الكتلة الحيوية النباتية.
Abstract
السليلوز هو البوليمر الأكثر وفرة على الأرض التي تم إنشاؤها بواسطة التمثيل الضوئي والمكون الرئيسي الحاملة لجدران الخلايا. جدار الخلية يلعب دورا هاما في نمو النبات والتنمية من خلال توفير القوة, صلابة, معدل واتجاه نمو الخلايا, صيانة شكل الخلية, والحماية من الضغوطات الحيوية والأحيائية. يتكون جدار الخلية في المقام الأول من السليلوز واللجنين والهيميسليلوز والبكتين. وقد استهدفت مؤخرا جدران الخلايا النباتية لإنتاج الجيل الثاني من الوقود الحيوي والطاقة الحيوية. على وجه التحديد ، يتم استخدام مكون السليلوز في جدار الخلية النباتية لإنتاج الإيثانول السليولوزي. تقدير محتوى السليلوز من الكتلة الحيوية أمر بالغ الأهمية للبحوث الأساسية والتطبيقية جدار الخلية. طريقة Updegraff بسيطة وقوية ، والأسلوب الأكثر استخداما لتقدير محتوى السليلوز البلوري للكتلة الحيوية النباتية. الكحول غير قابل للذوبان كسر جدار الخلية الخام عند العلاج مع كاشف Updegraff يزيل كسور الهيميسيللوز واللجنين. في وقت لاحق ، يتعرض كسر السليلوز المقاوم للكواشف Updegraff لعلاج حمض الكبريتيك لتحلل هوموبوليمر السليلوز إلى وحدات الجلوكوز أحادية الرقمية. يتم تطوير خط الانحدار باستخدام تركيزات مختلفة من الجلوكوز ويستخدم لتقدير كمية الجلوكوز المنبعثة من التحلل المائي للسليلوز في العينات التجريبية. وأخيرا، يقدر محتوى السليلوز على أساس كمية مونومرات الجلوكوز عن طريق فحص الألوان.
Introduction
السليلوز هو المكون الأساسي الحامل لجدران الخلايا ، والذي يوجد في جدران الخلايا الأولية والثانوية على حد سواء. جدار الخلية هو مصفوفة خارج الخلية تحيط بالخلايا النباتية وتتكون في المقام الأول من السليلوز واللجنين والهيميسليلوز والبكتين وبروتينات المصفوفة. ما يقرب من ثلث الكتلة الحيوية النباتات هو السليلوز1 ويلعب أدوارا هامة في نمو النبات والتنمية من خلال توفير القوة، والصلابة، ومعدل واتجاه نمو الخلايا، وصيانة شكل الخلية، والحماية من الضغوطات الحيوية والأحيائية. تحتوي ألياف القطن على 95٪ من محتوى السليلوز2، في حين تحتوي الأشجار على 40٪ إلى 50٪ من السليلوز اعتمادا على أنواع النباتات وأنواع الأعضاء3. ويتكون السليلوز من تكرار وحدات من cellobiose، وهو disaccharide من بقايا الجلوكوز متصلة β-1،4 السندات الجليكوسيدية4. يتم إنتاج الإيثانول السليولوزي من الجلوكوز المستمدة من السليلوز الموجودة في جدران الخلايا النباتية5. تتكون الألياف السليلوزية من عدة الفيبريلات الدقيقة التي يعمل فيها كل الفيبريل الدقيق كوحدة أساسية مع 500-15000 مونومر الجلوكوز1،6. يتم تصنيعها homopolymer السليلوز بواسطة غشاء البلازما جزءا لا يتجزأ من مجمعات synthase السليلوز (CSC)1،7. البروتينات الفردية synthase السليلوز A (CESA) توليف سلاسل الجلوكان وترتبط سلاسل الجلوكان المجاورة من قبل السندات الهيدروجين لتشكيل السليلوز البلوري1،8. السليلوز موجود في عدة أشكال بلورية مع شكلين السائدة, السليلوز Iα والسليلوز Iβ كما الأشكالالأصلية 9. في النباتات العالية، السليلوز موجود في شكل السليلوز Iβ بينما يوجد السليلوز النباتي السفلي في شكل Iα10،11. عموما، يلعب السليلوز دورا هاما في نقل القوة والصلابة إلى جدران الخلايا النباتية.
يتم إنتاج الجيل الأول من الوقود الحيوي في المقام الأول من نشا الذرة ، سكر القصب ، وسكرات البنجر ، وهي مصادر غذائية ، في حين يركز الجيل الثاني من الوقود الحيوي على إنتاج الوقود الحيوي من مواد جدار خلية الكتلة الحيوية النباتية غير الغذائية12. التقدير الدقيق لمحتوى السليلوز البلوري ليس مهما فقط للأبحاث الأساسية حول التمثيل الحيوي للسليلوز وديناميكيات جدار الخلية ولكن أيضا لأبحاث الوقود الحيوي والمنتجات الحيوية التطبيقية. وقد تم تطوير أساليب مختلفة وتحسينها لتقدير السليلوز في الكتلة الحيوية النباتية، وطريقة Updegraff هي الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقدير السليلوز. وكان أول طريقة المبلغ عنها لتقدير السليلوز من قبل الصليب وبيفان في 190813. واستندت هذه الطريقة إلى مبدأ الكلورة البديلة والاستخراج بواسطة كبريتات الصوديوم. ومع ذلك، أظهر السليلوز التي تم الحصول عليها من قبل بروتوكولات الأصلي وكذلك تعديل الصليب وطريقة بيفان تلوث أجزاء صغيرة من اللجنين بالإضافة إلى كمية كبيرة من الزيان وmannans14. على الرغم من العديد من التعديلات لإزالة اللجنين والهيميسليلوز من كسر السليلوز ، احتفظت طريقة Cross-Bevan بكمية كبيرة من المنانات جنبا إلى جنب مع السليلوز. في وقت لاحق، تم تطوير طريقة كورشنر من خلال استخدام حمض النيتريك والإيثانول لاستخراج السليلوز15. وذكرت هذه الطريقة أن مجموع اللجنين و 75٪ من البنتوسان تمت إزالتهما ولكن نتائج السليلوز الحقيقية كانت هي نفسها التي قدرت بطريقة الكلورة من الصليب وبيفان. تم تطوير طريقة أخرى (نورمان وجينكينز) من خلال استخدام الميثانول البنزين، كبريتات الصوديوم، وهيبوكلوريت الصوديوم لاستخراج السليلوز16. واحتفظت هذه الطريقة أيضا بجزء من اللجنين (3٪) وكميات كبيرة من pentosans مما يؤدي إلى تقدير دقيق للسليلوز. في وقت لاحق، استخدم كيسل وسيميجانوسكي نهجا مختلفا لتحلل السليلوز باستخدام حمض الكبريتيك المركز بنسبة 80٪، وقدرت السكريات المخفضة المتحللة بطريقةبرتراند 17. الطريقتين، واكسمان وستيفنز18 وسالو14،19 التي تم تطويرها على أساس طريقة كيسل وسيميجانوسكي، أسفرت أيضا 4-5٪ محتوى السليلوز أقل مقارنة مع الأساليب السابقة20.
طريقة Updegraff هي الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقدير محتوى السليلوز البلوري. وقد وصفت هذه الطريقة لأول مرة من قبل Updegraff لقياس السليلوز في 196921. طريقة Updegraff يدمج طريقة Kurschner (استخدام حمض النيتريك) ، Kiesel وطرق Seminowsky (التحلل المائي للسليلوز في مونومر الجلوكوز باستخدام حمض الكبريتيك) مع بعض التعديلات ، ونقيض anthrone من Viles وسيلفرمان لتقدير colorimetric بسيطة من الجلوكوز والبلورية محتوى السليلوز22. مبدأ هذه الطريقة هو استخدام حمض الخليك وحمض النيتريك (كاشف Updegraff) للقضاء على الهيميسليلوز واللجنين من الأنسجة النباتية المتجانسة ، مما يترك السليلوز المقاوم لحمض الخليك / النيتريك لمزيد من المعالجة وتقدير15. يتم التعامل مع السليلوز المقاوم لحمض الخليك / النيتريك مع حمض الكبريتيك 67٪ لكسر السليلوز إلى مونومرات الجلوكوز وتقدر مونومرات الجلوكوز الصادرة عن طريق المقايسة21،23. تم استخدام العديد من التعديلات على طريقة Updegraff الأصلية لتبسيط الإجراء وتقدير السليلوز عن طريق المقايسةanthrone 24. بشكل عام، يمكن تقسيم هذه الطريقة إلى خمس مراحل. في المرحلة الأولى، يتم إعداد المواد النباتية. في المرحلة الثانية ، يتم فصل جدار الخلية الخام عن الكتلة الحيوية الإجمالية ، حيث أن السليلوز هو المكون الرئيسي لجدران الخلايا النباتية. في وقت لاحق ، في المرحلة الثالثة ، يتم فصل السليلوز عن مكونات جدار الخلية غير السليلوزية عن طريق العلاج بكواشف Updegraff. في المرحلة الرابعة ، يتم تقسيم السليلوز المقاوم لحمض الخليك / النيتريك إلى مونومرات الجلوكوز عن طريق علاج حمض الكبريتيك. ينتج عن علاج حمض الكبريتيك للسليلوز تكوين مركبات 5-hydroxymethylfurfural من تفاعل مونومر الجلوكوز مع حمض الكبريتيك. وأخيرا، في المرحلة الأخيرة، يولد النطور مجمع أزرق مخضر عن طريق الغليان مع المركب الفروفي الذي تم إنشاؤه في المرحلة السابقة25. تم استخدام هذه الطريقة الملونة القائمة على المخلع لأول مرة في عام 1942 من قبل دريوود. Anthrone هو صبغة تحدد المركبات الفروية من المنتجات المجففة بنتوز والهيكسوز مثل 5-هيدروكسي ميثيلفورفورال، في ظل ظروف حمضية. رد فعل مع hexose تنتج لون مكثفة واستجابة أفضل بالمقارنة مع pentoses25. يتم قياس كمية الجلوكوز المقيد بامتصاص الطيف الضوئي عند 620 نانومتر وتتناسب كثافة المركب الأزرق الأخضر بشكل مباشر مع كمية السكر في العينة. تمت مقارنة قيم الامتصاص المقاسة بخط انحدار منحنى معيار الجلوكوز لحساب تركيز الجلوكوز للعينة. تم استخدام محتوى الجلوكوز المقاس لتقدير محتوى السليلوز للكتلة الحيوية النباتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد تجريبي
- طحن المواد النباتية المجففة في مسحوق ناعم.
- البروتين Solubilization العازلة (PSB): إعداد حلول المخزون من 1 M تريس (درجة الحموضة 8.8)، 0.5 M حمض الإيثيلينديامينيت تراسيتراستيك (EDTA) (درجة الحموضة 8.0) وautclave لهم. جعل العازلة PSB الطازجة من هذه الحلول الأسهم مع تركيزات النهائي من 50 متر تريس، 0.5 mM EDTA و 10٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) في الماء العقيم.
- إعداد 100 مل من الإيثانول 70٪ (v/v): 70 مل من الإيثانول 100٪ و 30 مل من الماء العقيم.
- إعداد 100 مل من الميثانول: الكلوروفورم بنسبة 1:1 (50 مل الميثانول و 50 مل كلوروفورم).
- إعداد 82.5 مل من كاشف Updegraff. إضافة 75 مل من حمض الخليك 80٪ إلى 7.5 مل من حمض النيتريك بحيث النسبة النهائية للماء: حمض الخليك: حمض النيتريك هو في 2:8:1 (v/v). لإعداد حمض الخليك 80٪، حل 80 مل من حمض الخليك الجليدي في 20 مل من الماء العقيم (v/v).
- إعداد مخزون جديد من محلول الجلوكوز 1 ملغم / مل. حل 10 ملغ من الجلوكوز في 10 مل من الماء (ث / v).
- لإعداد 100 مل من حمض الكبريتيك 67٪ (v/v)، إضافة 67 مل من حمض الكبريتيك المركز إلى 33 مل من الماء. دائما استخدام زجاجة وإضافة حمض ببطء إلى الماء. هذه الخطوة هي طارد للحرارة (النشرات الحرارة). وبالتالي، إعداد هذا الحل على الجليد وتبرد في الثلاجة لمدة 2 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
- إعداد جديدة 0.2٪ أترون (ث / الخامس) لكل دفعة من العينات التجريبية. تزن 0.2 غرام من anthrone وتذوب في 100 مل من حمض الكبريتيك المركزة المبردة مسبقا في زجاجة ملفوفة مع رقائق الألومنيوم. احتفظي به في الثلاجة لمدة 1-2 ساعة قبل الاستخدام.
ملاحظة: ينصح بشدة بحمض الكبريتيك المركز قبل القشعريرة في الثلاجة في يوم التجربة ، ويوصى بشدة بإعداد النطرون لتقدير دقيق لمحتوى الجلوكوز.
2. إعداد مواد الكتلة الحيوية النباتية
- جمع عينات الكتلة الحيوية النباتية من خطوط تجريبية القطن 2-العمر نمت في الدفيئة مع ظروف النمو نفسه، نفس مرحلة التنمية، نفس الموقف من النباتات ونفس النوع من الأنسجة (ورقة / الجذعية / الجذر).
ملاحظة: جمع ما لا يقل عن ثلاثة نسخ متماثلة البيولوجية لكل عينة. غسلها جيدا بالماء لإزالة كل الأوساخ من الأنسجة الجذرية. - أنسجة جذر جاف الهواء لمدة يومين على المناشف الورقية في درجة حرارة الغرفة لإزالة محتوى الرطوبة(الشكل 1).
ملاحظة: الهواء الجاف الأنسجة المطلوبة لتقدير السليلوز لمنع أي تلوث الفطرية. - ضع عينات الجذر في حاويات فردية. ثم تسمية وتجفيفها في الحاضنة في 49 درجة مئوية لمدة 10 أيام(جدول المواد).
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام مجفف التجميد لتجفيف الأنسجة النباتية في وقت أقل (1 أو 2 أيام) دون التسبب في أي تغييرات كيميائية في مادة الكتلة الحيوية النباتية. - قطع العينات المجففة إلى قطع صغيرة، وتجميدها في النيتروجين السائل، وطحن في مسحوق ناعم موحد باستخدام هاون والحشرات، طاحونة التجميد، أو طاحونة الكتلة الحيوية(الشكل 1).
ملاحظة: تم استخدام طاحونة التجميد بمعدل 10 cps لمدة 3 دورات. - جمع الأنسجة على الارض (الشكل 2) والمضي قدما في استخراج جدار الخلية.
ملاحظة: يمكن إيقاف العملية مؤقتا عند هذه النقطة عن طريق تخزين العينات في حاويات محكمة الإغلاق في درجة حرارة الغرفة.
3. استخراج جدران الخلايا الخام من الكتلة الحيوية النباتية
ملاحظة: جدران الخلايا النباتية تحتوي على السليلوز، اللجنين، المكونات غير السليلوز، البكتين، مصفوفة البروتينات، مركبات الفينولية، والماء26. منذ السليلوز موجود في جدران الخلية، والخطوة الأولى هي لفصل مكون جدار الخلية من مكونات الجدار غير الخلية من الكتلة الحيوية النباتية26.
- تسمية ووزن الفردية فارغة 2 مل أنابيب قبل البدء في عملية استخراج جدار الخلية.
- دون أوزان الأنبوب الفارغة في دفتر ملاحظات المختبر قبل المتابعة.
- تزن 20 ملغ من مسحوق الأنسجة من الخطوة 2.5 ونقله إلى أنابيب 2 مل وزنها مسبقا وتسميتها.
- إضافة 1 مل من البروتين solubilization العازلة (PSB) (50 mM تريس هيدروكلوريد (HCl) العازلة pH 8.8، 0.5 m EDTA، و 10٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) لslubilize البروتينات. دوامة وطرد مركزي عند 25,200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد الطرد المركزي، والتخلص من supernatant وحفظ بيليه.
ملاحظة: يمكن حفظ الناسخة الفائقة إذا كان عنصر البروتين بحاجة إلى تحليل. - كرر الخطوة 3.4 مرتين أخريين.
- إلى بيليه الاحتفاظ بها، إضافة 1 مل من الماء المقطر ودوامة. جهاز الطرد المركزي في 25200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) وإزالة supernatant.
- كرر الخطوة 3.6 مرتين أخريين.
- إضافة 1 مل من الإيثانول 70٪ إلى بيليه المحفوظة، دوامة وتسخينه في 70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حمام المياه / كتلة الحرارة لإزالة المكونات القابلة للذوبان والنشا من العينات. دوامة والطرد المركزي في 25200 × ز لمدة 5 دقائق في RT. تجاهل supernatant وحفظ بيليه.
- كرر الخطوة 3.8 مرة أخرى.
- إلى بيليه إضافة 1 مل من الميثانول 100٪ ودوامة. جهاز الطرد المركزي في 25200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) وإزالة supernatant.
- إضافة 1 مل من الكلوروفورم / الميثانول (الكلوروفورم والميثانول في نسبة 1:1) إلى بيليه ودوامة. جهاز الطرد المركزي في 25200 × غرام لمدة 5 دقائق في RT وإزالة supernatant. إضافة الميثانول والمذيب الكلوروفورم solubilizes ويزيل جزء الدهون من الكتلة الحيوية27.
- إلى بيليه، إضافة 1 مل من الأسيتون 100٪ ودوامة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. جهاز الطرد المركزي في 25200 × غرام لمدة 5 دقائق في RT وإزالة supernatant. الأسيتون يزيل أصباغ مثل الكلوروفل والأحماض الدهنية الحرة من الكتلة الحيوية28،29.
- جفف الكريات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو استمر أكثر عن طريق تجفيف الفراغ.
ملاحظة: بيليه المجففة هو جدار الخلية الخام المستخدمة لتقدير السليلوز البلورية. يمكن إيقاف العملية مؤقتا عند هذه النقطة أو المضي قدما باستخدام فراغ أكثر جفافا لتجفيف العينات.
4. العلاج مع كاشف Updegraff (حمض الخليك والنيتريك) لإزالة المكونات غير السليلوزية
ملاحظة: يتضمن البروتوكول استخدام الأحماض والمواد الكيميائية الأخرى. ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) طوال العملية.
- قياس 5 ملغ من بيليه جدار الخلية الخام المجففة في أنبوب جديد 2 مل المسمار توج. لاحظ الوزن الدقيق (الشكل 3)30.
- تضمين عنصر تحكم موجب في هذه المرحلة. استخدام 2 ملغ من ورقة تصفية(جدول المواد)كعنصر تحكم إيجابي أن تسفر عن محتوى السليلوز 80٪.
- إضافة 1.5 مل من كاشف Updegraff إلى وزنها 5 ملغ من استخراج جدار الخلية والسيطرة الإيجابية. تخلط عن طريق الدوامة.
ملاحظة: يجب معالجة عنصر التحكم الإيجابي بنفس الطريقة التي تتم بها معالجة العينات التجريبية من هذه الخطوة فصاعدا. وينبغي تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).
تنبيه: يجب تنفيذ هذه الخطوة في أنابيب غطاء المسمار لمنع رش العينة وظهرت من الأنابيب. وينبغي إدراج ثلاث نسخ بيولوجية متماثلة لكل عينة إلى جانب ثلاث نسخ متماثلة للرقابة الإيجابية. - سخني التعليق على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام ماء مغلي وبردي على مقعد لمدة 10 دقائق. جهاز الطرد المركزي في 25200 × غرام لمدة 10 دقائق في RT. إزالة supernatant عن طريق الطرد المركزي وحفظ بيليه.
ملاحظة: يجب جمع النفايات المتولدة بشكل منفصل للمذيبات العضوية وحمض الكبريتيك وكواشف Updegraff (حمض الخليك وحمض النيتريك). يجب الاحتفاظ بالنفايات مع حمض الخليك وحمض النيتريك في درجات حرارة باردة مع قبعات التهوية وعدم خلطها مع أي مذيبات عضوية أخرى وأحماض أخرى لمنع أي انفجار. - أضف 1 مل من الماء إلى بيليه. جهاز الطرد المركزي في 25,200 x g لمدة 10 دقائق في RT. إزالة 500 ميكرولتر من supernatant وإضافة 1 مل من الأسيتون إلى الأنبوب.
- جهاز الطرد المركزي عند 25,200 x g لمدة 5 دقائق في RT. إزالة 1 مل من الناسخ، وإضافة 1 مل من الأسيتون إلى الأنبوب والطرد المركزي في 25,200 × غرام لمدة 5 دقائق في RT.
- بعد الطرد المركزي، قم بإزالة كل الناطور الكريات في 1 مل من الأسيتون. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتدور في 25200 × غرام لمدة 5 دقائق في RT.
- تجاهل supernatant وحفظ بيليه. جفف الكريات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (الشكل 3).
ملاحظة: يمكن إيقاف العملية مؤقتا عند هذه النقطة أو الاستمرار في استخدام فراغ أكثر جفافا للتجفيف والمتابعة إلى الخطوة التالية.
5. التحلل المائي للسليلوز عن طريق حمض لإنتاج وحدات مونومر الجلوكوز
- إضافة 1 مل من حمض الكبريتيك 67٪ إلى بيليه المجففة. دوامة لخلط بيليه تماما في حامض.
- يهز الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة لإذابة بيليه السليلوز في حمض الكبريتيك 67٪.
ملاحظة: كبديل، يمكن تحسين solubilization من بيليه السليلوز في حمض الكبريتيك 67٪ عن طريق سونيكيشن من كل عينة لمدة 10 دقيقة بعد 30 دقيقة من الحضانة في شاكر. بعد سونيكيشن، يمكن إعادة احتضان العينات في شاكر في RT. ومع ذلك، لاحظنا الذوبان الكامل من بيليه السليلوز دون sonication عندما نبدأ مع 5 ملغ من استخراج جدار الخلية الخام(الشكل 3). هذا الإجراء يعمل بشكل جيد لمختلف عينات الكتلة الحيوية النباتية3.
6. قياس محتوى الجلوكوز عن طريق المقايسة anthrone وتقدير محتوى السليلوز
- في هذه المرحلة ، يكون السليلوز في شكل مونومرات الجلوكوز الحرة. تحديد كمية السليلوز عن طريق قياس كمية الجلوكوز الموجودة في العينة عن طريق قياس الطيف.
- خذ 10 ميكرولتر من العينة من الخطوة 5 وأضفها إلى 490 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم لجعل تخفيف كل عينة إلى 500 ميكرولتر.
- إضافة 1 مل من 0.2٪ كاشف المغنط الطازجة إلى كل أنبوب وتخلط على الفور عن طريق الدوامة.
- يغلي عينات في 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وتبريد الأنابيب على الجليد لمدة 5 دقائق. نقل 200 ميكرولتر من كل عينة في ثلاثة آبار من لوحة بئر 96. قم بتحميل لوحة البئر 96 في مطياف لقياس الامتصاص عند 620 نانومتر.
ملاحظة: للغليان في درجة حرارة عالية، استخدم أنابيب مغطاة باللولب لمنع رش المواد الكيميائية الضارة وتجنب فقدان العينات.
7. إعداد منحنى مستوى الجلوكوز
- لإعداد معيار الجلوكوز، وجعل مخزون جديد من الجلوكوز ملغم / مل 1 عن طريق حل 10 ملغ من الجلوكوز في 10 مل من الماء المقطر العقيم. أضف محلول المخزون هذا الذي تبلغ 1 ملغم/مل بزيادات 20 ميكرولتر (0، 20، 40، 60، 80،100،120،140، 160، 180 ميكرولتر) إلى الماء المقطر المعقم (إجمالي الحجم 1 مل) لإعداد معايير الجلوكوز تتراوح بين 0 ميكروغرام إلى 180 ميكروغرام / مل تركيزات(الشكل 3). دوامة كل معيار الجلوكوز بعد إضافة الماء العقيم.
- من هذه التركيزات المختلفة 10، aliquot 500 ميكرولتر من كل تركيز الجلوكوز في أنبوب برغي 2 مل الطازجة توج.
- إضافة 1 مل من الميثرون الطازج 0.2٪ إلى كل أنبوب وتخلط على الفور عن طريق الدوامة. تحتضن على الجليد وتغلي في 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تليها حضانة على الجليد لمدة 5 دقائق23.
- نقل 200 ميكرولتر من كل معيار إلى ثلاثة آبار في لوحة 96 جيدا الصغرى التيتر لثلاثة تكرارات التقنية وقياس امتصاص في 620 نانومتر (الشكل 3).
- تطوير منحنى الجلوكوز القياسية عن طريق رسم تركيزات الجلوكوز المختلفة (0 إلى 180 ميكروغرام / مل) ضد قيم امتصاص تطبيع في 620 نانومتر (الشكل 7). استخدم خط الانحدار Y = mx+c الناتج من قيم الامتصاص لحساب محتوى السليلوز في العينات المعدة.
ملاحظة: يجب إعداد معايير الجلوكوز حديثا لكل مجموعة من التجارب. يجب زيادة تركيز الجلوكوز إذا كانت قيم OD عالية جدا / منخفضة بحيث تقع هذه القيم ضمن نطاق قيم امتصاص المنحنى القياسية. يولد خط الانحدار قيم m و c مختلفة استنادا إلى معايير الجلوكوز المستخدمة لكل دفعة من العينات. مزيج أنابيب مباشرة بعد إضافة anthrone23. تم الاحتفاظ دائما Anthrone ، والعينات المخففة والمعايير المعدة الباردة حتى تم إجراء الفحص anthrone بسبب الطبيعة طاردة للحرارة من رد الفعل هذا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم اختيار نباتات القطن التي تزرع في المنزل الأخضر لهذه الدراسة. تم اختيار خطين تجريبيين مختلفين من القطن للتحليل المقارن لمحتوى السليلوز. لكل خط تجريبي، تم جمع الأنسجة الجذرية من ثلاث نسخ بيولوجية. تم تجانس ما مجموعه 500 ملغ من الأنسجة و 20 ملغ منه كان يستخدم لاستخراج جدار الخلية الخام. في وقت لاحق، تم استخدام 5 ملغ من استخراج جدار الخلية الخام لعلاج كاشف Updegraff لإزالة الهيميسيللوز واللجنين من السليلوز. تم تحلل السليلوز المنقى بالماء عن طريق علاج حمض الكبريتيك لكسر السليلوز إلى وحدات الجلوكوز. واستخدمت نتائج قراءات الامتصاص عند 620 نانومتر(الجدول التكميلي 1)لقياس تركيز الجلوكوز وتقدير محتوى السليلوز بواسطة المقايسة المخلعة. وتم تطبيع متوسط قيم الامتصاص لثلاث نسخ متماثلة تقنية عن طريق طرح قيمة الامتصاص الفارغ لتركيز الجلوكوز البالغ 0 ميكروغرام. تم إنشاء منحنى مستوى الجلوكوز باستخدام رسم بياني شريطي مبعثر(الشكل 4).
يستخدم خط الانحدار الناتج، y = mx + c من هذا المنحنى القياسي، لحساب تركيز الجلوكوز غير المعروف في عينات الاختبار المستخرجة باستخدام قراءات الامتصاص العادية. لحساب x (تركيز الجلوكوز غير معروف في ميكروغرام / ميكرولتر)، تم استخدام الصيغة (س = تطبيع امتصاص ج / م). استخدمت قيم c و m من خط الانحدار لمنحنى الجلوكوز القياسي (R2 = 0.99) لقياس تركيز الجلوكوز في ميكروغرام/ميكرولتر. ثم تقسم هذه القيمة على معامل تخفيف 2 حيث أن الحجم النهائي هو 500 ميكرولتر ويتم تقسيمه بشكل أكبر على حجم عينة 10 ميكرولتر لقياس تركيز الجلوكوز في ميكروغرام / ميكرولتر. وبما أن القيمة المحسوبة هي ل5 ملغ من استخراج جدار الخلية، يتم تقسيمه كذلك على 5 أو مع وزن جدار الخلية الخام المعنية المستخدمة لكل عينة تجريبية للحصول على تركيز الجلوكوز لكل ملغ. وتنقسم القيمة كذلك على 1.1 للتعويض عن المياه المكتسبة في عملية التحلل المائي (الجلوكوز لديه وزن جزيئي قدره 180 وجزيئ الماء له وزن جزيئي قدره 18 وبالتالي تمت إزالة الماء المتولد في عملية إطلاق مونومر الجلوكوز عن طريق تقسيم عامل الرطوبة، 1.1). سيتم ضرب القيمة الناتجة في 100 لحساب محتوى السليلوز البلوري في النسبةالمئوية (الجدول التكميلي 1).
تظهر نتائج محتوى السليلوز أنها متسقة بين التكرارات البيولوجية ، مما يشير إلى الدقة التقنية لطريقة Updegraff. علاوة على ذلك ، تم رسم الاختلافات باستخدام الرسوم البيانية 2D. وأظهرت هذه النتائج اختلافات محتوى السليلوز في أرقام العينة التجريبية المقارنة 1 و 2(الشكل 4). تظهر العينة 1 43.4٪ بينما تظهر العينة 2 28.12٪، مما يشير إلى أن هذه الطريقة يمكن أن تميز الاختلافات بين العينات التجريبية. تم تطبيق اختبار T للطالب عند مستوى أهمية 95٪ لاختبار اختلافاتهم الكبيرة.
الشكل 1:إعداد الكتلة الحيوية النباتية القطنية لتقدير محتوى السليلوز في الجذور. (أ)تم سحب النباتات المزروعة بزراعة الدفيئة بلطف من التربة وغسلها جيدا بالماء. تم فصل أنسجة جذر النبات، وأبقى على المناشف الورقية وسمح للهواء الجاف لمدة 2 أيام. (ب)ثم نقل النسيج الجذر إلى حاويات وصفت بشكل فردي وسمح لتجف في الحاضنة في 49 درجة مئوية لمدة -10 أيام. (ج) تم تقطيع الأنسجة المجففة إلى قطع صغيرة، مجمدة في النيتروجين السائل، محملة في قارورة الطحن، وأسست في مسحوق ناعم باستخدام مطحنة التجميد. (د)تم جمع مسحوق الأنسجة على الارض ناعما في أنبوب 50 مل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط تدفق الخطوات الرئيسية المتضمنة في طريقة Updegraff. (أ)التمثيل التصويري للخطوات الرئيسية في البروتوكول. (ب) يشرح الخطوات الهامة التي تم عرضها في لوحة (A). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:إعداد تركيزات مختلفة من الجلوكوز للمنحنى القياسي. (أ) إعداد محلول مخزون الجلوكوز عن طريق إذابة 10 ملغ من الجلوكوز في 10 مل من الماء المقطر العقيم بحيث يكون التركيز النهائي للمخزون 1 ملغم / مل. إضافة محلول مخزون من الجلوكوز 1 ملغم / مل في 20 μL زيادات إلى حجم النهائي من 1 مل مع الماء المقطر معقمة لإعداد تركيزات مختلفة من الجلوكوز من 0 ميكروغرام إلى 180 ميكروغرام / مل. (ب) جدول يبين كمية 1 ملغم/مل من الجلوكوز والماء المقطر المعقم لإضافتها إلى تركيزات مختلفة من الجلوكوز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:منحنى معيار الجلوكوز المتولد باستخدام قيم الامتصاص لتركيزات الجلوكوز المختلفة عند 620 نانومتر (A) جدول يظهر تركيزات مختلفة من الجلوكوز تتراوح بين 0 إلى 180 ميكروغرام / مل مع قيم الامتصاص الطبيعية ذات الصلة عند 620 نانومتر. (ب) منحنى معيار الجلوكوز المتولد باستخدام مخطط مبعثر من قيم الامتصاص (A). (ج) رسم بياني شريطي يوضح اختلافات محتوى السليلوز البلوري في العينتين التجريبيتين 1 و2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول التكميلي 1: تقدير محتوى السليلوز في العينات التجريبية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ألياف القطن هي ألياف طبيعية تنتج من بذور القطن. ألياف القطن هي خلية واحدة مع ~ 95٪ محتوى السليلوز2 مع محتوى السليلوز البلوري عالية مع تطبيقات واسعة النطاق في صناعة النسيج31. كما, ألياف القطن يحتوي على ~ 95٪ السليلوز, لقد استخدمنا القطن الأنسجة الجذرية للمظاهرة من تقدير محتوى السليلوز البلورية. أنسجة جذر القطن غنية بشكل معتدل في محتوى السليلوز البلوري وتمثل الكتلة الحيوية النباتية المتاحة بشكل شائع. كمية جدار الخلية الإجمالي المطلوبة لمحتوى السليلوز البلوري هو 5 ملغ فقط، وبالتالي يمكن استخدام هذه الطريقة لتقدير محتوى السليلوز البلوري في مراحل النمو المختلفة / تقدير محتوى السليلوز محددة الأنسجة. نسبة حمض الكبريتيك (67٪) كما يلعب دورا حاسما في كسر السليلوز إلى مونومرات الجلوكوز وحل السليلوز تماما23 دون الحاجة إلى سونيكيشن. فقدان العينة أمر شائع بعد العلاج Updegraff كما بيليه السليلوز البلورية ليست صلبة في الجزء السفلي من الأنبوب في خطوات مختلفة في عملية التقدير. ويمكن التقليل من ذلك عن طريق إزالة كميات صغيرة من supernatant في كل خطوة من الماء ويغسل الأسيتون بعد العلاج Updegraff. علاوة على ذلك ، تلعب الدوامة الفورية للعينة والمعايير ذات المذاق أدوارا كبيرة في تطوير الألوان وزيادة دقة المعايير ، مما يؤدي إلى معامل 99.5٪ من التحديد (R2) القيم (الشكل 3). منحنى مستوى الجلوكوز هو المفتاح في تحديد تركيز الجلوكوز، والذي يستخدم بدوره لتقدير محتوى السليلوز البلوري. وبالتالي، يمكن تعديل تركيزات الجلوكوز وفقا لمجموعة المطلوبة من التركيزات. اعتمادا على مجموعة من القيم لتناسب القيم التجريبية، يمكن أن تتراوح منحنى القياسية من 0 إلى 100 ميكروغرام / مل أو 0 إلى 200 ميكروغرام / مل تصل إلى تركيزات 1000 ميكروغرام / مل من الجلوكوز. وهذا يغير قيم الانحدار ج و م، وتحسين دقة تقدير السليلوز البلوري. من المهم أن تجعل دائما جديدة 0.2٪ من السوادر لكلا العينات وكذلك للمعيار. يمثل R-square، وهو قياس إحصائي، تباين جميع نقاط البيانات على خط الانحدار. من المهم أن يغلي كل من المعايير والعينات بعد إضافة anthrone لنفس القدر من الوقت. من المهم دائما تضمين عنصر تحكم إيجابي مع محتوى السليلوز المعروف. من أجل إعادة إنتاج البيانات الفعالة ، يجب اتباع الإجراء بأكمله بدقة بما في ذلك إعداد الحل (المعايير والمنحنى القياسي وكواشف Updegraff).
في الآونة الأخيرة، يتم استكشاف السليلوز لتطبيقات غير النسيج مثل الهباء الجوي السليولوزي، وقطع الكمبيوتر والإيثانول السليلوزي32،33؛ وبالتالي، سيكون لهذه الطريقة تطبيقات واسعة في المستقبل. ويتم التقدم العلمي من خلال التقدم التدريجي في فهم المفاهيم، واقتراح فرضيات بديلة وتوفير/دحض المعرفة الموجودة. ويمكن رؤية تقدم مماثل في تطوير طريقة موثوقة لتقدير محتوى السليلوز في الكتلة الحيوية النباتية. جدار الخلية هو مصفوفة معقدة وطريقة Updegraff يقضي على الكسور غير السليلوز من السليلوز النقي بطريقة متتابعة ، مما يؤدي إلى تقدير دقيق لمحتوى السليلوز في الكتلة الحيوية النباتية. علاوة على ذلك ، فإن طريقة قياس الألوان البسيطة التي تم تطويرها لتقدير محتوى السليلوز من خلال قياس تركيز الجلوكوز جعلت هذه الطريقة قابلة للتكيف للغاية ومستعملة على نطاق واسع. في الدراسة الحالية، كانت بيانات السليلوز متسقة بين التكرارات البيولوجية المختلفة للعينات التي تم جمعها من سطر واحد. وبالتالي، فإنه يشير إلى أن البيانات التي تنتجها هذه الطريقة متسقة وموثوقة وقابلة للاستنساخ وسهلة لقياس محتوى السليلوز عن طريق قياس الألوان البسيطة.
طريقة Updegraff هي الطريقة الأكثر استخداما لتقدير السليلوز. مع التوسع الأخير في التطبيق الصناعي للسليلوز مثل الغذاء والخشب والورق والألياف والوقود الحيوي والملابس ومستحضرات التجميل والمستحضرات الصيدلانية ، فإن التقدير الدقيق لمحتوى السليلوز في الكتلة الحيوية النباتية أمر بالغ الأهمية لمختلف التطبيقات. على الرغم من أن هذه هي الطريقة الأكثر استخداما لتقدير السليلوز، فمن المهم اتخاذ العديد من الاحتياطات للحصول على بيانات قابلة للاستنساخ. وينبغي أن تكون عينات الكتلة الحيوية أرضية بنفس الحجم للحصول على تقدير دقيق وقابل للاستنساخ لمحتوى السليلوز. وينبغي توخي الحذر أثناء توليد منحنى مستوى الجلوكوز. معايير الجلوكوز المستخدمة لإعداد منحنى معيار الجلوكوز ينبغي زيادة أو تخفيض استنادا إلى قراءات امتصاص العينة بحيث تركيزات غير معروف تقع ضمن نطاق تركيزات الجلوكوز التي تستخدم لإعداد منحنى القياسية. إذا لم يكن الأمر كذلك، قد تختلف قيم m و c، مما يؤدي إلى تقدير غير دقيق لمحتوى السليلوز البلوري. إعداد جديد من 0.2 ٪ من السوادرين لكل دفعة من العينات هو خطوة حاسمة أخرى من طريقة Updegraff. من الضروري استخدام 0.2 ٪ من المخلعة المعدة حديثا لتقدير دقيق لمحتوى السليلوز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر قسم علوم النبات والتربة والقطن على دعمهم الجزئي لهذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
- Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
- Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
- Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
- Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
- Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
- Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
- Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
- Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
- Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
- Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
- Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
- Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
- Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
- Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
- Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
- Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
- Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
- Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
- Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
- Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
- Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
- Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
- Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
- Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
- Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
- Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
- Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).
