Summary
Il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima della cellulosa. Lo scopo principale di questa dimostrazione è quello di fornire un protocollo Updegraff dettagliato per la stima del contenuto di cellulosa nei campioni di biomassa vegetale.
Abstract
La cellulosa è il polimero più abbondante sulla Terra generato dalla fotosintesi e la componente portante principale delle pareti cellulari. La parete cellulare svolge un ruolo significativo nella crescita e nello sviluppo delle piante fornendo forza, rigidità, velocità e direzione della crescita cellulare, mantenimento della forma cellulare e protezione dagli stressanti biotici e abiotici. La parete cellulare è composta principalmente da cellulosa, lignina, emicellulosa e pectina. Recentemente le pareti cellulari delle piante sono state prese di mira per la produzione di biocarburanti e bioenergia di seconda generazione. In particolare, il componente di cellulosa della parete cellulare vegetale viene utilizzato per la produzione di etanolo cellulosico. La stima del contenuto di cellulosa nella biomassa è fondamentale per la ricerca fondamentale e applicata sulle pareti cellulari. Il metodo Updegraff è semplice, robusto e il metodo più utilizzato per la stima del contenuto cristallino di cellulosa della biomassa vegetale. La frazione della parete cellulare grezza insolubile alcool al momento del trattamento con reagente di Updegraff elimina le frazioni di emicellulosa e lignina. Successivamente, la frazione di cellulosa resistente al reagente updegraff viene sottoposta a trattamento con acido solforico per idrolizzare l'omopolimero di cellulosa in unità di glucosio monomerico. Una linea di regressione viene sviluppata utilizzando varie concentrazioni di glucosio e utilizzata per stimare la quantità di glucosio rilasciato sull'idrolisi della cellulosa nei campioni sperimentali. Infine, il contenuto di cellulosa è stimato in base alla quantità di monomeri di glucosio per saggio di antronrone colorimetrico.
Introduction
La cellulosa è la componente portante primaria delle pareti cellulari, presente sia nelle pareti cellulari primarie che secondarie. La parete cellulare è una matrice extracellulare che circonda le cellule vegetali ed è composta principalmente da proteine di cellulosa, lignina, emicellulosa, pectina e matrice. Circa un terzo della biomassa vegetale è la cellulosa1 e svolge ruoli significativi nella crescita e nello sviluppo delle piante fornendo forza, rigidità, velocità e direzione della crescita cellulare, mantenimento della forma cellulare e protezione dagli stressanti biotici e abiotici. La fibra di cotone contiene il 95% di contenuto di cellulosa2, mentre gli alberi contengono dal 40% al 50% di cellulosa a seconda delle specie vegetali e dei tipidi organo 3. La cellulosa è composta da unità ripetute di cellobiosio, un disaccaride di residui di glucosio collegato da β-1,4 legami glicosidici4. L'etanolo cellulosico è prodotto dal glucosio derivato dalla cellulosa presente nelle pareti cellulari delle piante5. La fibra cellulosica è composta da diverse micro fibrille in cui ogni micro fibrillazione funge da nucleo con monomeri di glucosio 500-150001,6. L'omopolimero della cellulosa è sintetizzato da complessi di cellulosa sintasi incorporati nella membrana plasmatica (CSC)1,7. Le singole proteine della cellulosa sintasi A (CESA) sintetizzano catene di glucano e le catene glucane adiacenti sono collegate da legami idrogeno per formare cellulosa cristallina1,8. La cellulosa esiste in diverse forme cristalline con due forme predominanti, la cellulosa Iα e la cellulosa Iβ come forme native9. Nelle piante superiori, la cellulosa esiste in forma di cellulosa Iβ mentre la cellulosa vegetale inferiore esiste nella forma Iα10,11. Nel complesso, la cellulosa svolge un ruolo significativo nell'impartire forza e rigidità alle pareti delle cellule vegetali.
I biocarburanti di prima generazione sono prodotti principalmente da amido di mais, zuccheri di canna e zuccheri di barbabietola, che sono fonti alimentari, mentre i biocarburanti di seconda generazione si concentrano sulla produzione di biocarburanti da materiale da parete a biomassa vegetale nonalimentare 12. Una stima accurata del contenuto cristallino di cellulosa è importante non solo per la ricerca fondamentale sulla biosintesi della cellulosa e sulla dinamica delle pareti cellulari, ma anche per la ricerca applicata sui biocarburanti e sui bio prodotti. Vari metodi sono stati sviluppati e ottimizzati per la stima della cellulosa nella biomassa vegetale, e il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima della cellulosa. Il primo metodo riportato per la stima della cellulosa fu quello di Cross e Bevan nel 190813. Il metodo si basava sul principio della clorazione alternativa e dell'estrazione mediante solfato di sodio. Tuttavia, la cellulosa ottenuta con i protocolli originali e modificati del metodo Cross e Bevan ha mostrato la contaminazione di piccole frazioni di lignina oltre a una notevole quantità di xili e mannani14. Nonostante diverse modifiche per rimuovere la lignina e le emicellulosi dalla frazione di cellulosa, il metodo Cross-Bevan mantenne una notevole quantità di mannani insieme alla cellulosa. Successivamente, il metodo di Kurschner fu sviluppato impiegando acido nitrico ed etanolo per estrarre la cellulosa15. Questo metodo affermava che la lignina totale e il 75% dei pentosani erano stati rimossi, ma i veri risultati della cellulosa erano gli stessi stimati con il metodo di clorazione di Cross e Bevan. Un altro metodo (Norman e Jenkins) è stato sviluppato impiegando metanolo-benzene, solfato di sodio e ipoclorito di sodio per estrarre la cellulosa16. Questo metodo ha anche mantenuto una frazione di lignina (3%) e quantità significative di pentosani che portano a una stima accurata della cellulosa. Più tardi, Kiesel e Semiganowsky usarono un diverso approccio alla cellulosa idrolizzata usando l'80% di acido solforico concentrato, e gli zuccheri ridotti idrolizzati furono stimati con il metodo17 diBertrand. I due metodi, Waksman's e Stevens18 e Salo14,19 chesono stati sviluppati sulla base del metodo di Kiesel e Semiganowsky, hanno anche prodotto il 4-5% in meno di contenuto di cellulosa rispetto ai metodiprecedenti 20.
Il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima del contenuto cristallino di cellulosa. Questo metodo è stato descritto per la prima volta da Updegraff per la misurazione della cellulosa nel 196921. Il metodo Updegraff integra il metodo Kurschner (uso di acido nitrico), i metodi Kiesel e Seminowsky (idrolisi della cellulosa nei monomeri di glucosio usando acido solforico) con alcune modifiche, e il saggio di antronrone di Viles e Silverman per una semplice stima colorimetrica del contenuto di glucosio e cellulosa cristallina22. Il principio di questo metodo è l'uso di acido acetico e acido nitrico (reagente di Updegraff) per eliminare l'emicellulosa e la lignina dai tessuti vegetali omogeneizzati, che lascia cellulosa acetica / nitrica resistente all'acido per un'ulteriorelavorazione e stima 15. La cellulosa acetica/nitrica resistente all'acido viene trattata con il 67% di acido solforico per rompere la cellulosa in monomeri di glucosio e i monomeri di glucosio rilasciati sono stimati per test di antronrone21,23. Diverse modifiche del metodo Updegraff originale sono state utilizzate per semplificare la procedura e la stima della cellulosa mediante test di antronrone24. In generale, questo metodo può essere suddiviso in cinque fasi. Nella prima fase, viene preparato il materiale vegetale. Nella seconda fase, la parete cellulare grezza è separata dalla biomassa totale, poiché la cellulosa è il componente chiave delle pareti cellulari delle piante. Più tardi, nella terza fase, la cellulosa viene separata dai componenti della parete cellulare non cellulosica trattando con reagente di Updegraff. Nella quarta fase, la cellulosa acetica/nitrica resistente all'acido viene suddivisa in monomeri di glucosio mediante trattamento con acido solforico. Il trattamento con acido solforico della cellulosa si traduce nella formazione di composti 5-idrossimetilfurfurali dalla reazione dei monomeri di glucosio con acido solforico. Infine, nell'ultima fase, l'antronrone genera un complesso blu verdastro bollendo con il composto furfurale generato nella faseprecedente 25. Questo metodo colorimetrico basato sull'antronrone fu usato per la prima volta nel 1942 da Dreywood. L'antronrone è un colorante che identifica composti furfurali di pentosio ed esosio disidratati come 5-idrossimetilfurfurolo, in condizioni acide. La reazione con esosio produce un colore intenso e una migliore risposta rispetto alle pentosi25. La quantità di glucosio legato viene misurata dall'assorbanza dello spettrofotometro a 620 nm e l'intensità del complesso blu verdastro è direttamente proporzionale alla quantità di zucchero nel campione. I valori di assorbanza misurati sono stati confrontati con una linea di regressione della curva standard di glucosio per calcolare la concentrazione di glucosio del campione. Il contenuto misurato di glucosio è stato utilizzato per stimare il contenuto di cellulosa della biomassa vegetale.
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Protocol
1. Preparazione sperimentale
- Macinare materiale vegetale essiccato in una polvere fine.
- Tampone di solubilizzazione proteica (PSB): Preparare soluzioni stock di 1 M Tris (pH 8.8), 0,5 M etilendiamminatetraacetico acido (EDTA) (pH 8.0) e autoclave. Creare tampone psb fresco da queste soluzioni stock con concentrazioni finali di Tris da 50 mM, EDTA da 0,5 mM e solfato di dodecil di sodio al 10% (SDS) in acqua sterile.
- Preparare 100 mL di etanolo al 70% (v/v): 70 mL di etanolo al 100% e 30 mL di acqua sterile.
- Preparare 100 mL di metanolo: cloroformio in un rapporto 1:1 (metanolo da 50 mL e cloroformio da 50 mL).
- Preparare 82,5 mL di reagente Updegraff. Aggiungere 75 mL di acido acetico all'80% a 7,5 mL di acido nitrico in modo che il rapporto finale tra acqua: acido acetico: acido nitrico sia in 2:8:1 (v/v). Per preparare l'80% di acido acetico, sciogliere 80 mL di acido acetico glaciale in 20 mL di acqua sterile (v/v).
- Preparare uno stock fresco di 1 mg/mL di soluzione di glucosio. Sciogliere 10 mg di glucosio in 10 mL di acqua (w/v).
- Per preparare 100 mL di acido solforico al 67% (v/v), aggiungere 67 mL di acido solforico concentrato a 33 mL di acqua. Utilizzare sempre una bottiglia di vetro e aggiungere l'acido lentamente all'acqua. Questo passaggio è esotermico (rilascia calore). Quindi, preparare questa soluzione sul ghiaccio e raffreddare in frigorifero per almeno 2 ore prima dell'uso.
- Preparare un'antronrone fresco dello 0,2% (w/v) per ogni lotto di campioni sperimentali. Pesare 0,2 g di antronrone e sciogliere in 100 ml di acido solforico concentrato prerimortato in una bottiglia di vetro avvolta con foglio di alluminio. Conservare in frigorifero per 1-2 ore prima dell'uso.
NOTA: L'acido solforico concentrato pre-agghiacciante in frigorifero il giorno dell'esperimento e la preparazione fresca dell'antronrone è altamente raccomandata per una stima accurata del contenuto di glucosio.
2. Preparazione di materiale da biomassa vegetale
- Raccogliere campioni di biomassa vegetale da linee sperimentali di cotone di 2 mesi coltivate nella serra con le stesse condizioni di crescita, la stessa fase di sviluppo, la stessa posizione delle piante e lo stesso tipo di tessuto (foglia / gambo / radice).
NOTA: Raccogliere almeno tre repliche biologiche per ciascun campione. Lavarli accuratamente con acqua per rimuovere tutto lo sporco dal tessuto radicale. - Tessuto radicale ad aria secca per 2 giorni su tovaglioli di carta a temperatura ambiente per rimuovere il contenuto di umidità (Figura 1).
NOTA: Tessuto desiderato ad asciugatura ad aria per la stima della cellulosa per prevenire qualsiasi contaminazione fungina. - Posizionare i campioni radice in singoli contenitori. Quindi etichettarli e asciugarli nell'incubatrice a 49 °C per 10 giorni(Tabella dei Materiali).
NOTA: In alternativa, un essiccatore a congelatore può essere utilizzato per asciugare il tessuto vegetale in meno tempo (1 o 2 giorni) senza causare cambiamenti chimici al materiale da biomassa vegetale. - Tagliare i campioni essiccati in piccoli pezzi, congelarli in azoto liquido e macinare in polvere fine uniforme utilizzando una malta e un pestello, un mulino congelatore o una smerigliatrice a biomassa(Figura 1).
NOTA: Il congelatore è stato utilizzato ad una velocità di 10 cps per 3 cicli. - Raccogliere il tessuto a terra (Figura 2) e procedere con l'estrazione della parete cellulare.
NOTA: Il processo può essere messo in pausa a questo punto immagazzinando i campioni in contenitori ermetici a temperatura ambiente.
3. Estrazione di pareti di cellule grezze dalla biomassa vegetale
NOTA: Le pareti cellulari vegetali contengono cellulosa, lignina, componenti non cellulosa, pectina, proteine matriciale, composti fenolici e acqua26. Poiché la cellulosa è presente nelle pareti cellulari, il primo passo è separare il componente della parete cellulare dai componenti della parete non cellulare della biomassa vegetale26.
- Etichettare e pesare singoli tubi vuoti da 2 ml prima di iniziare il processo di estrazione della parete cellulare.
- Prendere nota dei pesi dei tubi vuoti in un quaderno da laboratorio prima di procedere ulteriormente.
- Pesare 20 mg di tessuto in polvere dal passo 2.5 e trasferirlo in tubi pre-pesati da 2 ml ed etichettarli.
- Aggiungere 1 mL di tampone di solubilizzazione proteica (PSB) (50 mM Tris cloridrato (HCl) tampone pH 8.8, 0,5 mM EDTA e 10% sodio dodecil solfato (SDS) per solubilizzare le proteine. Vortice e centrifuga a 25.200 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT). Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e salvare il pellet.
NOTA: Il supernatante può essere salvato se è necessario analizzare il componente proteico. - Ripetere il passaggio 3.4 altre due volte.
- Al pellet trattenuto aggiungere 1 mL di acqua distillata e vortice. Centrifugare a 25.200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e rimuovere il supernatante.
- Ripetere il passaggio 3.6 altre due volte.
- Aggiungere 1 mL di etanolo al pellet, al vortice e scaldarlo a 70 °C per 1 h in un bagno d'acqua/blocco di calore per rimuovere i componenti solubili e l'amido dai campioni. Vortice e centrifuga a 25.200 x g per 5 min a RT. Scartare il supernatante e salvare il pellet.
- Ripetere il passaggio 3.8 un'altra volta.
- Al pellet aggiungere 1 mL di metanolo e vortice al 100%. Centrifugare a 25.200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e rimuovere il supernatante.
- Aggiungere 1 mL di cloroformio/metanolo (cloroformio e metanolo in rapporto 1:1) al pellet e al vortice. Centrifugare a 25.200 x g per 5 minuti a RT e rimuovere il supernatante. L'aggiunta di metanolo e solvente cloroformio solubilizza e rimuove la frazione lipidica dalla biomassa27.
- Al pellet aggiungere 1 mL di acetone e vortice al 100%. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Centrifugare a 25.200 x g per 5 minuti a RT e rimuovere il supernatante. L'acetone rimuove pigmenti come la clorofilla e gli acidi grassi liberi dalla biomassa28,29.
- Asciugare il pellet a 37 °C durante la notte o procedere ulteriormente mediante essiccazione sottovuoto.
NOTA: Il pellet essiccato è la parete cellulare grezza utilizzata per la stima della cellulosa cristallina. Il processo può essere messo in pausa a questo punto o procedere ulteriormente utilizzando l'essiccatore sottovuoto per l'essiccazione dei campioni.
4. Trattamento con reagente updegraff (acido acetico e nitrico) per rimuovere componenti non cellulosici
NOTA: Il protocollo prevede l'uso di acidi e altre sostanze chimiche. Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) durante tutto il processo.
- Misurare 5 mg del pellet di parete a celle grezze essiccate in un tubo chiuso a vite fresco da 2 ml. Si noti il peso esatto (Figura 3)30.
- Includere un controllo positivo a questo punto. Utilizzare 2 mg di carta da filtro (Tabella dei materiali) come controllo positivo che produce l'80% di contenuto di cellulosa.
- Aggiungere 1,5 mL del reagente Updegraff ai 5 mg pesati di estratto di parete cellulare e controllo positivo. Mescolare con il vortice.
NOTA: Il controllo positivo deve essere elaborato allo stesso modo dei campioni sperimentali a partire da questa fase. Questo passaggio deve essere effettuato nella cappa aspirante con adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI).
ATTENZIONE: Questo passaggio deve essere eseguito in tubi a vite per evitare spruzzi di campione e spruzzi dei tubi. Devono essere incluse tre repliche biologiche di ciascun campione insieme a tre repliche per il controllo positivo. - Scaldare le sospensioni a 100 °C per 30 minuti in un bagno d'acqua bollente e raffreddare su una panchina per 10 minuti. Centrifugare a 25.200 x g per 10 min a RT. Rimuovere il supernatante mediante centrifugazione e salvare il pellet.
NOTA: I rifiuti generati devono essere raccolti separatamente per solventi organici, acido solforico e reagente di Updegraff (acido acetico e acido nitrico). I rifiuti con acido acetico e acido nitrico devono essere conservati a temperature fredde con tappi ventilati e mai mescolati con altri solventi organici e altri acidi per evitare qualsiasi esplosione. - Aggiungere 1 mL di acqua al pellet. Centrifuga a 25.200 x g per 10 min a RT. Rimuovere 500 μL del supernatante e aggiungere 1 ml di acetone al tubo.
- Centrifugare a 25.200 x g per 5 min a RT. Rimuovere 1 ml di supernatante e aggiungere 1 ml di acetone al tubo e centrifuga a 25.200 x g per 5 minuti a RT.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere tutto il supernatante e sospendere il pellet in 1 mL di acetone. Incubare i tubi a temperatura ambiente per 5 minuti e girare a 25.200 x g per 5 minuti a RT.
- Scartare il supernatante e salvare il pellet. Asciugare il pellet a 37 °C durante la notte(figura 3).
NOTA: Il processo può essere messo in pausa a questo punto o continuare ulteriormente utilizzando l'essiccatore sottovuoto per l'asciugatura e procedere al passaggio successivo.
5. Idrolisi della cellulosa per acido per produrre unità monomero di glucosio
- Aggiungere 1 mL di acido solforico al 67% al pellet essiccato. Vortice per mescolare completamente il pellet nell'acido.
- Agitare i tubi a temperatura ambiente per 1 h per sciogliere il pellet di cellulosa nel 67% di acido solforico.
NOTA: In alternativa, la solubilizzazione del pellet di cellulosa nel 67% di acido solforico può essere migliorata mediante sonicazione di ciascun campione per 10 minuti dopo 30 minuti di incubazione nello shaker. Dopo la sonicazione, i campioni possono essere ri-incubati nello shaker a RT. Tuttavia, abbiamo osservato una completa solubilità del pellet di cellulosa senza sonicazione quando iniziamo con 5 mg di estratto grezzo di parete cellulare (Figura 3). Questa procedura ha funzionato bene per vari campioni di biomassavegetale 3.
6. Misurazione del contenuto di glucosio mediante il dosaggio dell'antronrone e stima del contenuto di cellulosa
- In questa fase, la cellulosa è sotto forma di monomeri di glucosio liberi. Determinare la quantità di cellulosa misurando la quantità di glucosio presente nel campione mediante spettrofotometria.
- Prendere 10 μL del campione dal passaggio 5 e aggiungerlo a 490 μL di acqua distillata sterile per effettuare una diluizione di ciascun campione a 500 μL.
- Aggiungere 1 ml di reagente di antronrone appena preparato allo 0,2% ad ogni tubo e mescolare immediatamente con vortice.
- Far bollire i campioni a 100 °C per 10 minuti e raffreddare i tubi sul ghiaccio per 5 minuti. Trasferire 200 μL di ogni campione in tre pozzali di una piastra di 96 pozza. Caricare la piastra del pozzo 96 in uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza a 620 nm.
NOTA: Per l'ebollizione ad alta temperatura, utilizzare tubi con tappo a vite per prevenire spruzzi di sostanze chimiche nocive ed evitare la perdita di campioni.
7. Preparazione della curva standard del glucosio
- Per preparare lo standard di glucosio, fare uno stock fresco di 1 mg/mL di glucosio sciogliendo 10 mg di glucosio in 10 mL di acqua distillata sterile. Aggiungere questa soluzione stock di 1 mg/mL in incrementi di 20 μL (0, 20, 40, 60, 80.100.120.140, 160, 180 μL) all'acqua distillata sterile (volume totale 1 mL) per preparare standard di glucosio che vanno da 0 μg a 180 μg/mL di concentrazione(figura 3). Vortice ogni standard di glucosio dopo l'aggiunta di acqua sterile.
- Da queste 10 diverse concentrazioni, aliquota 500 μL di ogni concentrazione di glucosio in un tubo chiuso a vite fresco da 2 ml.
- Aggiungere 1 ml di antronrone allo 0,2% appena preparato ad ogni tubo e mescolare immediatamente con vortice. Incubare sul ghiaccio e far bollire a 100 °C per 10 minuti seguito da incubazione sul ghiaccio per 5 min23.
- Trasferire 200 μL di ogni norma in tre pozzi in una piastra di 46 micro titer a 96 pozzetti per tre repliche tecniche e misurare l'assorbanza a 620 nm(Figura 3).
- Sviluppare una curva standard del glucosio tracciando diverse concentrazioni di glucosio (da 0 a 180 μg/mL) rispetto ai valori di assorbanza normalizzati a 620 nm(figura 7). Utilizzare la linea di regressione Y= mx+c generata dai valori di assorbanza per calcolare il contenuto di cellulosa nei campioni preparati.
NOTA: Le norme sul glucosio devono essere preparate al momento per ogni serie di esperimenti. La concentrazione del glucosio dovrebbe essere aumentata se i valori di OD sono troppo alti/ bassi in modo che questi valori rientrano nell'intervallo dei valori standard di assorbanza della curva. La linea di regressione genera diversi valori m e c in base agli standard di glucosio utilizzati per ogni lotto di campioni. Mescolare i tubi subito dopo l'aggiunta diantronrone 23. L'antronrone, i campioni diluiti e gli standard preparati sono sempre stati tenuti freddi fino a quando il dosaggio di antronrone non è stato eseguito a causa della natura esotermica di questa reazione.
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Representative Results
Per questo studio sono state selezionate piante di cotone coltivate nella casa verde. Per l'analisi comparativa del contenuto di cellulosa sono state selezionate due diverse linee sperimentali di cotone. Per ogni linea sperimentale, il tessuto radicale è stato raccolto da tre repliche biologiche. Un totale di 500 mg di tessuto è stato omogeneizzato e 20 mg di esso è stato utilizzato per l'estrazione di pareti cellulari grezze. Successivamente, 5 mg di estratto grezzo di parete cellulare sono stati utilizzati per il trattamento reagente Updegraff per rimuovere l'emicellulosa e la lignina dalla cellulosa. La cellulosa purificata è stata idrolizzata mediante trattamento con acido solforico per scomporre la cellulosa in unità di glucosio. I risultati delle letture di assorbanza a 620 nm(tabella complementare 1)sono stati utilizzati per misurare la concentrazione di glucosio e stimare il contenuto di cellulosa mediante il saggio di antronrone. I valori medi di assorbanza di tre repliche tecniche sono stati normalizzati sottraendo il valore di assorbanza in bianco della concentrazione di glucosio di 0 μg. La curva standard del glucosio è stata generata utilizzando un grafico a barre sparse (Figura 4).
La linea di regressione risultante, y = mx + c da questa curva standard, viene utilizzata per calcolare una concentrazione di glucosio sconosciuta nei campioni di test estratti utilizzando le letture di assorbanza normalizzate. Per calcolare x (la concentrazione sconosciuta di glucosio in μg/μL), è stata utilizzata la formula (x = assorbanza normalizzata-c/m). I valori c e m della linea di regressione della curva standard del glucosio (R2 = 0,99) sono stati utilizzati per misurare la concentrazione di glucosio in μg/μL. Quindi questo valore è diviso per un fattore di diluizione di 2 poiché il volume finale è di 500 μL e ulteriormente diviso per un volume del campione di 10 μL per misurare la concentrazione di glucosio in μg/μL. Poiché il valore calcolato è di 5 mg di estratto di parete cellulare, esso è ulteriormente diviso per 5 o con il rispettivo peso grezzo della parete cellulare utilizzato per ogni campione sperimentale per ottenere concentrazione di glucosio per mg. Il valore è ulteriormente diviso per 1,1 per compensare l'acqua acquisita nel processo di idrolisi (il glucosio ha un peso molecolare di 180 e una molecola d'acqua ha un peso molecolare di 18 e quindi l'acqua generata nel processo di rilascio dei monomeri di glucosio è stata rimossa dividendo il fattore di umidità, 1.1). Il valore risultante sarà moltiplicato per 100 per calcolare il contenuto cristallino di cellulosa in percentuale (tabella complementare 1).
I risultati del contenuto di cellulosa mostrano che sono coerenti tra le repliche biologiche, suggerendo l'accuratezza tecnica del metodo Updegraff. Inoltre, le differenze sono state tracciate utilizzando grafici 2D. Questi risultati hanno mostrato le differenze di contenuto di cellulosa nei numeri campione sperimentali confrontati 1 e 2 (figura 4). Il campione 1 mostra il 43,4% mentre il campione 2 mostra il 28,12%, suggerendo che questo metodo può distinguere le differenze tra i campioni sperimentali. Un test t student è stato applicato al livello di significatività del 95% per testare le loro differenze significative.
Figura 1: Preparazione della biomassa vegetale di cotone per la stima del contenuto di cellulosa nelle radici. (A) Le piante coltivate in serra sono state delicatamente estratte dal terreno e accuratamente lavate con acqua. Il tessuto radicale della pianta è stato separato, tenuto sugli asciugamani di carta e lasciato asciugare all'aria per 2 giorni. (B) Quindi il tessuto radicale è stato trasferito in contenitori etichettati individualmente e lasciato asciugare nell'incubatrice a 49 °C per -10 giorni. (C)Il tessuto essiccato è stato tagliato in piccoli pezzi, congelato in azoto liquido, caricato nei flaconcini di macinazione e macinato in polvere fine utilizzando il frantoio. (D) Nel tubo da 50 ml è stata raccolta polvere di tessuto finemente macinata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagramma di flusso dei passaggi principali coinvolti nel metodo Updegraff. (A) Rappresentazione pittorica dei passaggi chiave del protocollo. (B) Spiega i passaggi critici visualizzati nel pannello (A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Preparazione di diverse concentrazioni di glucosio per lacurva standard. (A) Preparare la soluzione stock di glucosio sciogliendo 10 mg di glucosio in 10 mL di acqua distillata sterile in modo che la concentrazione finale dello stock sia di 1 mg/mL. Aggiungere una soluzione stock di 1 mg/mL di glucosio in incrementi di 20 μL ad un volume finale di 1 mL con acqua distillata sterile per preparare diverse concentrazioni di glucosio da 0 μg a 180 μg/mL. (B) Tabella che indica la quantità di glucosio da 1 mg/mL e di acqua distillata sterile da aggiungere per effettuare diverse concentrazioni di glucosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Curva standard del glucosio generata utilizzando valori di assorbanza di diverse concentrazioni di glucosio a620 nm. (A) Tabella che mostra diverse concentrazioni di glucosio che vanno da 0 a 180 μg/mL con i rispettivi valori di assorbanza normalizzati a 620 nm. (B) Curva standard di glucosio generata utilizzando un grafico a dispersione dai valori di assorbanza (A). (C) Grafico a barre che mostra le differenze cristalline di contenuto di cellulosa nei campioni sperimentali 1 e 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella complementare 1: Stima del contenuto di cellulosa nei campioni sperimentali. Clicca qui per scaricare questa Tabella.
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Discussion
Le fibre di cotone sono fibre naturali prodotte dal semi di cotone. La fibra di cotone è una singola cella con ~95% di contenuto di cellulosa2 con alto contenuto cristallino di cellulosa con ampie applicazioni nell'industriatessile 31. Poiché, la fibra di cotone contiene ~ 95% di cellulosa, abbiamo usato tessuti di radice di cotone per la dimostrazione della stima del contenuto cristallino di cellulosa. I tessuti di radice di cotone sono moderatamente ricchi di contenuto cristallino di cellulosa e rappresentano una biomassa vegetale comunemente disponibile. La quantità totale di parete cellulare richiesta per il contenuto cristallino di cellulosa è di soli 5 mg e quindi questo metodo può essere utilizzato per stimare il contenuto cristallino di cellulosa in diversi stadi di sviluppo / stima del contenuto di cellulosa specifica del tessuto. La percentuale di acido solforico (67%) svolge anche un ruolo fondamentale nel rompere la cellulosa in monomeri di glucosio e sciogliere completamente la cellulosa23 senza bisogno di sonicazione. La perdita del campione è comune dopo il trattamento updegraff in quanto il pellet cristallino di cellulosa non è solido nella parte inferiore del tubo in diversi passaggi del processo di stima. Questo può essere ridotto al minimo rimuovendo piccoli volumi di supernatante in ogni fase di lavaggi di acqua e acetone dopo il trattamento di Updegraff. Inoltre, il vortice immediato del campione e gli standard con antronrone svolgono un ruolo significativo nello sviluppo del colore e in una maggiore accuratezza degli standard, portando a valori di determinazione del 99,5% (R2)(figura 3). La curva standard del glucosio è fondamentale per determinare la concentrazione di glucosio, che a sua volta viene utilizzata per stimare il contenuto cristallino di cellulosa. Pertanto, le concentrazioni del glucosio possono essere regolate in base all'intervallo di concentrazioni richiesto. A seconda dell'intervallo di valori per adattarsi ai valori sperimentali, la curva standard può variare da 0 a 100 μg/mL o da 0 a 200 μg/mL fino a 1000 μg/mL di concentrazione di glucosio; questo cambia ulteriormente i valori di regressione c e m, migliorando l'accuratezza della stima della cellulosa cristallina. È importante fare sempre antronrone fresco dello 0,2% sia per i campioni che per lo standard. R-quadrato, una misurazione statistica, rappresenta la variabilità di tutti i punti dati sulla linea di regressione. È importante far bollire sia gli standard che i campioni dopo aver aggiunto l'antronrone per la stessa quantità di tempo. È sempre importante includere un controllo positivo con un contenuto noto di cellulosa. Per un'efficace riproducibilità dei dati, l'intera procedura deve essere seguita con precisione, compresa la preparazione della soluzione (standard, curva standard e reagente Updegraff).
Recentemente, la cellulosa viene esplorata per applicazioni non tessili come aerosol cellulosici, parti di computer ed etanolo cellulosico32,33; quindi, questo metodo avrà ampie applicazioni in futuro. Il progresso scientifico viene fatto attraverso progressi incrementali nella comprensione dei concetti, proponendo ipotesi alternative e fornendo / confutando le conoscenze esistenti. Progressi analoghi si possono constatare nello sviluppo di un metodo affidabile per la stima del contenuto di cellulosa nella biomassa vegetale. La parete cellulare è una matrice complessa e il metodo Updegraff elimina le frazioni non cellulosa dalla cellulosa pura in modo sequenziale, portando a una stima accurata del contenuto di cellulosa nella biomassa vegetale. Inoltre, il semplice metodo colorimetrico sviluppato per la stima del contenuto di cellulosa misurando la concentrazione di glucosio ha reso questo metodo altamente adattabile e ampiamente utilizzato. Nello studio attuale, i dati sulla cellulosa erano coerenti tra le diverse repliche biologiche dei campioni raccolti da una singola linea. Pertanto, suggerisce che i dati prodotti da questo metodo sono coerenti, affidabili, riproducibili e facili da misurare il contenuto di cellulosa mediante un semplice saggio colorimetrico.
Il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima della cellulosa. Con la recente espansione dell'applicazione industriale della cellulosa come cibo, legno, carta, fibre, biocarburanti, vestiti, cosmetici e farmaceutici, una stima accurata del contenuto di cellulosa della biomassa vegetale è fondamentale per varie applicazioni. Sebbene questo sia il metodo più utilizzato per la stima della cellulosa, è importante prendere diverse precauzioni per ottenere dati riproducibili. I campioni di biomassa devono essere macinati alla stessa dimensione per ottenere una stima precisa e riproducibile del contenuto di cellulosa. Fare attenzione durante la generazione della curva standard del glucosio. Gli standard di glucosio utilizzati per la preparazione della curva standard del glucosio devono essere aumentati o diminuiti in base alle letture di assorbanza del campione in modo che le concentrazioni sconosciute rientrano nell'intervallo di concentrazioni di glucosio utilizzate per preparare la curva standard. In caso meno, i valori m e c potrebbero variare, con conseguente stima imprecisa del contenuto cristallino di cellulosa. Un'altra fase critica del metodo Updegraff è la preparazione fresca dell'antronrone allo 0,2 % per ogni lotto di campioni. È essenziale utilizzare antronrone allo 0,2 % preparato al momento per una stima accurata del contenuto di cellulosa.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dipartimento di Plant & Soil Science and Cotton Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
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