Summary
Updegraff yöntemi selüloz tahmini için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu gösterimin temel amacı, bitki biyokütle örneklerinde selüloz içeriğinin tahmini için ayrıntılı bir Updegraff protokolü sağlamaktır.
Abstract
Selüloz, fotosentez ve hücre duvarlarının ana yük taşıyan bileşeni tarafından üretilen dünyadaki en bol polimerdir. Hücre duvarı, güç, sertlik, hücre büyüme hızı ve yönü, hücre şekli bakımı ve biyotik ve abiyotik stresörlerden korunma sağlayarak bitki büyümesinde ve gelişmesinde önemli bir rol oynar. Hücre duvarı öncelikle selüloz, lignin, hemiselüloz ve pektin oluşur. Son zamanlarda bitki hücre duvarları ikinci nesil biyoyakıt ve biyoenerji üretimi için hedeflenmiştir. Özellikle, bitki hücre duvarının selüloz bileşeni selülozik etanol üretimi için kullanılır. Biyokütlenin selüloz içeriğinin tahmini, temel ve uygulamalı hücre duvarı araştırmaları için kritik öneme sahiptir. Updegraff yöntemi basit, sağlam ve bitki biyokütlesinin kristal selüloz içeriğinin tahmin edilmesi için en yaygın kullanılan yöntemdir. Updegraff reaktifi ile tedavi üzerine alkol çözünmeyen ham hücre duvarı fraksiyonu hemiselüloz ve lignin fraksiyonlarını ortadan kaldırır. Daha sonra, Updegraff reaktif dirençli selüloz fraksiyonu, selüloz homopolimerini monomerik glikoz birimlerine hidrolleştirmek için sülfürik asit tedavisine tabi tutulur. Çeşitli glikoz konsantrasyonları kullanılarak bir gerileme hattı geliştirilir ve deneysel örneklerde selüloz hidrolizi üzerine salınan glikoz miktarını tahmin etmek için kullanılır. Son olarak, selüloz içeriği kolorimetrik anthrone testine göre glikoz monomerlerinin miktarına göre tahmin edilmektedir.
Introduction
Selüloz, hem birincil hem de ikincil hücre duvarlarında bulunan hücre duvarlarının birincil yük taşıyan bileşenidir. Hücre duvarı, bitki hücrelerini çevreleyen hücre dışı bir matristir ve öncelikle selüloz, lignin, hemiselüloz, pektin ve matris proteinlerinden oluşur. Bitki biyokütlesinin yaklaşık üçte biri selüloz1'dir ve güç, sertlik, hücre büyüme hızı ve yönü, hücre şekli bakımı ve biyotik ve abiyotik stresörlerden korunma sağlayarak bitki büyümesinde ve gelişmesinde önemli roller oynar. Pamuk lifi% 95 selüloz2 içeriği içerirken, ağaçlar bitki türlerine ve organ türlerine bağlı olarak selülozun% 40 ila% 50'sini içerir3. Selüloz, β-1,4 glikosidik bağ4ile birbirine bağlanan glikoz kalıntılarının bir disakkarit olan tekrarlayan selobioz ünitelerinden oluşur. Selülozik etanol bitki hücre duvarlarında bulunan selülozdan elde edilen glikozdan üretilir5. Selülozik lif, her mikro fibril'in 500-15000 glikoz monomerleri1,6ile çekirdek birim olarak hareket ettiği birkaç mikro fibrilden oluşur. Selüloz homopolimer plazma membran gömülü selüloz synthase kompleksleri (CSC'ler)1,7ile sentezlenmiştir. Bireysel selüloz synthase A (CESA) proteinleri glukan zincirlerini sentezler ve bitişik glukan zincirleri hidrojen bağları ile bağlanarak kristal selülozoluşturur 1,8. Selüloz, iki baskın formla çeşitli kristal formlarda bulunur, selüloz Iα ve selüloz Iβ yerel formlar olarak9. Daha yüksek bitkilerde selüloz Iβ formunda selüloz bulunurken, daha düşük bitki selülozu Iα formundabulunur 10,11. Genel olarak, selüloz bitki hücre duvarlarına güç ve sertlik vermede önemli bir rol oynar.
Birinci nesil biyoyakıtlar öncelikle gıda kaynakları olan mısır nişastası, kamış şekerleri ve pancar şekerlerinden üretilirken, ikinci nesil biyoyakıtlar gıda dışı bitki biyokütle hücre duvar malzemesinden biyoyakıt üretimine odaklanmaktadır12. Kristal selüloz içeriğinin doğru tahmini sadece selüloz biyosentezi ve hücre duvarı dinamikleri üzerine temel araştırmalar için değil, aynı zamanda uygulamalı biyoyakıt ve biyo ürünler araştırmaları için de önemlidir. Bitki biyokütlesinde selülozun tahmini için çeşitli yöntemler geliştirilmiş ve optimize edilmiştir ve Updegraff yöntemi selüloz tahmini için en yaygın kullanılan yöntemdir. Selüloz tahmini için bildirilen ilk yöntem 1908'de Cross ve Bevan tarafından13. Yöntem, sodyum sülfat ile alternatif klorlama ve ekstraksiyon prensibine dayanıyordu. Bununla birlikte, Cross ve Bevan yönteminin orijinal ve değiştirilmiş protokolleri tarafından elde edilen selüloz, önemli miktarda kslan ve mannans14'eek olarak lignin küçük fraksiyonlarının kirlenmesini gösterdi. Lignin ve hemiselülozları selüloz fraksiyonundan çıkarmak için yapılan çeşitli değişikliklere rağmen, Cross-Bevan yöntemi selülozla birlikte önemli miktarda mannan tuttu. Daha sonra Kurschner'in yöntemi selüloz çıkarmak için nitrik asit ve etanol kullanarak geliştirilmiştir15. Bu yöntemde total lignin ve pentosanların %75'inin çıkarıldığı ancak gerçek selüloz sonuçlarının Cross ve Bevan klorlama yöntemi ile tahmin edilenlerle aynı olduğu belirtilmiştir. Başka bir yöntem (Norman ve Jenkins) selüloz çıkarmak için metanol-benzen, sodyum sülfat ve sodyum hipoklorit kullanarak geliştirilmiştir16. Bu yöntem ayrıca lignin bazı fraksiyonunu da korudu (%3) ve selülozun doğru tahmin edilmesine yol açan önemli miktarda pentosan. Daha sonra, Kiesel ve Semiganowsky% 80 konsantre sülfürik asit kullanarak selülozu hidrolize etmek için farklı bir yaklaşım kullandılar ve hidrolizlenmiş azaltılmış şekerler Bertrand'ın yöntemi ile tahmin edildi17. Kiesel ve Semiganowsky'nin yöntemine dayanarak geliştirilen Waksman's ve Stevens18ve Salo 14 ,19 olmak üzere iki yöntem, önceki yöntemlere kıyasla % 4-5 daha az selüloz içeriği sağladı20.
Updegraff yöntemi, kristal selüloz içeriğinin tahmin edilmesi için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu yöntem ilk olarak Updegraff tarafından 1969 yılında selüloz ölçümü içintanımlanmıştır 21. Updegraff yöntemi Kurschner yöntemini (nitrik asit kullanımı), Kiesel ve Seminowsky yöntemlerini (selülozun sülfürik asit kullanarak glikoz monomerlerine hidrolizi) ve glikoz ve kristal selüloz içeriğinin basit kolorimetrik tahmini için Viles ve Silverman'ın antroni tahlilini entegre eder22. Bu yöntemin prensibi, daha fazla işleme ve tahmin için asetik/nitrik aside dirençli selüloz bırakan homojen bitki dokularından hemiselüloz ve lignin ortadan kaldırmak için asetik asit ve nitrik asit (Updegraff reaktifi) kullanılmasıdır15. Asetik/nitrik aside dirençli selüloz, selülozu glikoz monomerlerine kırmak için% 67 sülfürik asit ile tedavi edilir ve salınan glikoz monomerleri anthrone tahlil21,23. Prosedürü ve selüloz tahminini anthrone tahlil24ile basitleştirmek için orijinal Updegraff yönteminin çeşitli modifikasyonları kullanılmıştır. Genel olarak, bu yöntem beş aşamaya ayrılabilir. İlk aşamada, bitki malzemesi hazırlanır. İkinci aşamada, selüloz bitki hücre duvarlarının anahtar bileşeni olduğu için ham hücre duvarı toplam biyokütleden ayrılır. Daha sonra üçüncü fazda selüloz, Updegraff reaktifi ile tedavi ederek selüloz olmayan hücre duvarı bileşenlerinden ayrılır. Dördüncü evrede asetik/nitrik aside dirençli selüloz sülfürik asit tedavisi ile glikoz monomerlerine ayrılır. Selülozun sülfürik asit tedavisi, glikotik monomerlerin sülfürik asit ile reaksiyonundan 5-hidroksimetilfurfural bileşiklerin oluşumu ile sonuçlanır. Son olarak, son aşamada, anthrone önceki faz25'teüretilen furfural bileşik ile kaynatılarak yeşilimsi mavi bir kompleks oluşturur. Bu anthrone tabanlı kolorimetrik yöntem ilk olarak 1942 yılında Dreywood tarafından kullanılmıştır. Antroron, asidik koşullar altında 5-hidroksimetilfurfural gibi pentoz ve altıgen susuz ürünlerin furfural bileşiklerini tanımlayan bir boyadır. Altıgen ile reaksiyon pentozlara kıyasla yoğun bir renk ve daha iyi tepki üretir25. Bağlı glikoz miktarı 620 nm'de spektrofotometre emilimi ile ölçülür ve yeşilimsi mavi kompleksin yoğunluğu numunedeki şeker miktarı ile doğru orantılıdır. Ölçülen absorbans değerleri, numunenin glikoz konsantrasyonunu hesaplamak için bir glikoz standart eğri gerileme hattı ile karşılaştırıldı. Ölçülen glikoz içeriği, bitki biyokütlesinin selüloz içeriğini tahmin etmek için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Deneysel hazırlık
- Kurutulmuş bitki malzemeyi ince bir toz haline getirin.
- Protein Çözünürlüğü Tamponu (PSB): 1 M Tris (pH 8.8), 0.5 M etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) (pH 8.0) stok çözeltilerini hazırlayın ve otoklavlayın. Steril suda 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA ve %10 sodyum dodecyl sülfat (SDS) konsantrasyonlarında bu stok çözeltilerinden taze PSB tamponu yapın.
- %70 etanol (v/v) 100 mL hazırlayın: %100 etanol 70 mL ve 30 mL steril su.
- 100 mL metanol hazırlayın: 1:1 oranında kloroform (50 mL metanol ve 50 mL kloroform).
- 82,5 mL Updegraff reaktifi hazırlayın. 7,5 mL nitrik aside 75 mL asetik asit ekleyin, böylece suyun nihai oranı: asetik asit: nitrik asit 2:8:1'dedir (v/v). % 80 asetik asit hazırlamak için, 80 mL buzul asetik asetik asetik asetik asidi 20 mL steril suda (v/v) çözün.
- 1 mg/mL glikoz çözeltisi taze bir stok hazırlayın. 10 mg glikozu 10 mL suda çözün (w/v).
- %67 sülfürik asit (v/v) 100 mL hazırlamak için 33 mL suya 67 mL konsantre sülfürik asit ekleyin. Her zaman bir cam şişe kullanın ve suya yavaşça asit ekleyin. Bu adım eksotermiktir (ısıyı serbest bırakır). Bu nedenle, bu çözeltiyi buz üzerinde hazırlayın ve kullanmadan önce buzdolabında en az 2 saat soğutun.
- Her deneysel numune grubu için taze %0,2 antron (w/v) hazırlayın. 0,2 g anthrone tartın ve alüminyum folyo ile sarılmış bir cam şişede 100 mL önceden soğutulmuş konsantre sülfürik asit içinde çözün. Kullanmadan önce buzdolabında 1-2 saat saklayın.
NOT: Deney günü buzdolabında önceden soğutulmuş konsantre sülfürik asit ve glikoz içeriğinin doğru tahmin edilmesi için yeni anthrone hazırlanması şiddetle tavsiye edilir.
2. Bitki biyokütle malzemesinin hazırlanması
- Serada yetişen 2 aylık pamuk deney hatlarından aynı büyüme koşullarına, aynı gelişim aşamasına, bitkilerin aynı konumuna ve aynı doku türüne (yaprak/kök/kök) bitki biyokütle örnekleri toplayın.
NOT: Her örnek için en az üç biyolojik çoğaltma toplayın. Kök dokusundaki tüm kiri temizlemek için suyla iyice yıkayın. - Nem içeriğini gidermek için oda sıcaklığında kağıt havlular üzerinde 2 gün boyunca hava kuru kök dokusu (Şekil 1).
NOT: Herhangi bir mantar kirlenmesini önlemek için selüloz tahmini için hava kuru istenen doku. - Kök örneklerini tek tek kapsayıcılara yerleştirin. Daha sonra bunları 49 °C'de 10 gün boyunca inkübatördeetiketleyinve kurutun ( Malzeme Masası ).
NOT: Alternatif olarak, bitki biyokütle malzemesinde herhangi bir kimyasal değişikliğe neden olmadan bitki dokusunu daha kısa sürede (1 veya 2 gün) kurutmak için bir dondurarak kurutucu kullanılabilir. - Kurutulmuş numuneleri küçük parçalar halinde kesin, sıvı nitrojen içinde dondurun ve bir harç ve pestle, bir dondurucu değirmeni veya bir biyokütle öğütücü kullanarak düzgün ince toz haline getirin (Şekil 1).
NOT: Dondurucu değirmeni 3 döngü boyunca 10 cps hızında kullanılmıştır. - Topraklanmış dokuyu toplayın (Şekil 2) ve hücre duvarı ekstraksiyonu ile devam edin.
NOT: Numuneler oda sıcaklığında hava geçirmez kaplarda saklanarak işlem bu noktada duraklatılabilir.
3. Bitki biyokütlesinden ham hücre duvarlarının çıkarılması
NOT: Bitki hücre duvarları selüloz, lignin, selüloz olmayan bileşenler, pektin, matris proteinleri, fenolik bileşikler ve suiçerir 26. Selüloz hücre duvarlarında mevcut olduğundan, ilk adım hücre duvarı bileşenini bitki biyokütlesinin hücre dışı duvar bileşenlerinden ayırmaktır26.
- Hücre duvarı çıkarma işlemine başlamadan önce tek tek boş 2 mL tüpleri etiketleyin ve tartın.
- Daha fazla ilerlemeden önce laboratuvar defterindeki boş tüp ağırlıklarını not edin.
- Adım 2.5'ten itibaren 20 mg toz doku tartın ve önceden tartılmış 2 mL tüplere aktarın ve etiketleyin.
- Proteinleri çözünürlükize etmek için 1 mL protein çözünürlüğü tamponu (PSB) (50 mM Tris hidroklorür (HCl) tampon pH 8.8, 0.5 mM EDTA ve% 10 sodyum dodecyl sülfat (SDS) ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 25.200 x g'da girdap ve santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peletin kaydedilsin.
NOT: Protein bileşeninin analiz edilmesi gerekiyorsa, süpernatant kaydedilebilir. - 3.4. adımı iki kez daha yineleyin.
- Tutulan peletin içine 1 mL damıtılmış su ve girdap ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 25.200 x g'da santrifüj ve üst yapıyı çıkarın.
- 3.6. adımı iki kez daha yineleyin.
- Tasarruf edilen pelet, girdap içine 1 mL% 70 etanol ekleyin ve çözünür bileşenleri ve nişastayı numunelerden çıkarmak için bir su banyosu / ısı bloğunda 1 saat boyunca 70 ° C'de ısıtın. RT'de 5 dakika boyunca 25.200 x g'da Vortex ve santrifüj.
- 3.8. adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Peletin içine 1 mL% 100 metanol ve girdap ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 25.200 x g'da santrifüj ve üst yapıyı çıkarın.
- Pelet ve girdaba 1 mL kloroform/metanol (1:1 oranında kloroform ve metanol) ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 25.200 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Metanol ve kloroform çözücü ilavesi lipit fraksiyonunu çözünür ve biyokütleden çıkarır27.
- Pelete, % 100 aseton ve girdap 1 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır. RT'de 5 dakika boyunca 25.200 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Aseton, klorofil ve serbest yağ asitleri gibi pigmentleri biyokütleden çıkarır28,29.
- Peletin gece boyunca 37 °C'de kurutun veya vakumla kurutarak daha fazla ilerleyin.
NOT: Kurutulmuş pelet, kristal selüloz tahmini için kullanılan ham hücre duvarıdır. İşlem bu noktada duraklatılabilir veya numunelerin kurutılması için vakum kurutucu kullanılarak daha fazla ilerleyebilir.
4. Selülozik olmayan bileşenleri çıkarmak için Updegraff reaktifi (asetik ve nitrik asit) ile tedavi
NOT: Protokol asitlerin ve diğer kimyasalların kullanımını içerir. İşlem boyunca kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin.
- 5 mg kurutulmuş ham hücreli duvar peletini taze 2 mL vidalı kapaklı bir tüpe ölçün. Tam ağırlığa dikkat edin (Şekil 3)30.
- Bu noktada pozitif bir denetim ekleyin. % 80 selüloz içeriği sağlayan pozitif bir kontrol olarak 2 mg filtre kağıdı (Malzeme Tablosu) kullanın.
- Tartılmış 5 mg hücre duvarı ekstresine ve pozitif kontrole 1,5 mL Updegraff reaktifi ekleyin. Girdapla karıştırın.
NOT: Pozitif kontrol, bu adımdan itibaren deneysel örneklerle aynı şekilde işlenmelidir. Bu adım duman kaputunda uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) ile yapılmalıdır.
DİkKAT: Bu adım, numunenin sıçramasını ve tüplerin patlamasını önlemek için vidalı kapak tüplerinde yapılmalıdır. Pozitif kontrol için her numunenin üç biyolojik çoğaltılması ve üç çoğaltılması dahil edilmelidir. - Süspansiyonu kaynar su banyosunda 30 dakika 100 °C'de ısıtın ve bir bankta 10 dakika soğutun. RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g'da santrifüj.
NOT: Üretilen atıklar organik çözücüler, sülfürik asit ve Updegraff reaktifi (asetik asit ve nitrik asit) için ayrı ayrı toplanmalıdır. Asetik asit ve nitrik asit içeren atıklar, havalandırılmış kapaklarla serin sıcaklıklarda tutulmalı ve herhangi bir patlamayı önlemek için asla diğer organik çözücüler ve diğer asitlerle karıştırılmamalıdır. - Peletin içine 1 mL su ekleyin. RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g'da santrifüj.
- RT'de 5 dakika boyunca 25.200 x g'da santrifüj.
- Santrifüjlemeden sonra, tüm süpernatantı çıkarın ve peleti 1 mL asetonda askıya alın. Tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın ve RT'de 5 dakika boyunca 25.200 x g'da döndürün.
- Üstnatant atın ve pelet kaydedin. Peletin gece boyunca 37 °C'de kurutun(Şekil 3).
NOT: İşlem bu noktada duraklatılabilir veya kurutma için vakum kurutucu kullanarak daha fazla devam edebilir ve bir sonraki adıma geçilebilir.
5. Glikoz monomer üniteleri üretmek için selülozun asitle hidroliz
- Kurutulmuş pelete 1 mL% 67 sülfürik asit ekleyin. Peleti asitle tamamen karıştırmak için girdap.
- Selüloz peletini% 67 sülfürik asitte çözmek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca tüpleri çalkalayın.
NOT: Alternatif olarak, selüloz peletinin% 67 sülfürik asitte çözünmesi, çalkalayıcıda 30 dakika inkübasyondan sonra her numunenin 10 dakika boyunca sonication ile iyileştirilebilir. Sonication sonra, örnekler RT çalkalayıcıda yeniden inkübe edilebilir. Bununla birlikte, 5 mg ham hücre duvarı özü ile başladığımızda selüloz peletinin sonikasyon olmadan tam çözünürlük gözlemledik (Şekil 3). Bu prosedür çeşitli bitki biyokütle örnekleri için iyi çalıştı3.
6. Glikoz içeriğinin antron tahlil ve selüloz içeriğinin tahmini ile ölçülmesi
- Bu aşamada, selüloz serbest glikoz monomerleri şeklindedir. Spektrofotometri ile numunede bulunan glikoz miktarını ölçerek selüloz miktarını belirleyin.
- 5. adımdan numunenin 10 μL'sini alın ve her numunenin 500 μL'ye seyreltilmesini sağlamak için 490 μL steril damıtılmış suya ekleyin.
- Her tüpe 1 mL taze hazırlanmış %0,2 anthrone reaktif ekleyin ve vorteks yaparak hemen karıştırın.
- Numuneleri 100 °C'de 10 dakika kaynatın ve tüpleri 5 dakika buz üzerinde soğutun. Her numunenin 200 μL'lik kısmını 96 kuyu plakasının üç kuyusuna aktarın. Absorbansı 620 nm olarak ölçmek için 96 kuyu plakasını bir spektrofotometreye yükleyin.
NOT: Yüksek sıcaklıkta kaynatmak için, zararlı kimyasalların sıçramasını önlemek ve numune kaybını önlemek için vidalı borular kullanın.
7. Glikoz standart eğrisinin hazırlanması
- Glikoz standardını hazırlamak için, 10 mL steril damıtılmış suda 10 mg glikoz eriterek 1 mg / mL glikoz taze bir stok yapın. 1 mg/mL'lik bu stok çözeltisini 20 μL artışlarla ekleyin (0, 20, 40, 60, 80.100.120.140, 160, 180 μL) steril damıtılmış suya (toplam hacim 1 mL) 0 μg ila 180 μg/mL konsantrasyon arasında değişen glikoz standartları hazırlamak için (Şekil 3). Steril su ekledikten sonra her glikoz standardında girdap.
- Bu 10 farklı konsantrasyondan, her glikoz konsantrasyonunun 500 μL'lik aliquot'unun taze 2 mL vidalı kapaklı bir tüpe dönüşmesi.
- Her tüpe 1 mL taze hazırlanmış %0,2 anthrone ekleyin ve vorteks ile hemen karıştırın. Buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve 10 dakika boyunca 100 ° C'de kaynatın ve ardından 5 dakika23boyunca buz üzerinde inkübasyon.
- Her standardın 200 μL'sini üç teknik çoğaltma için 96 kuyu mikro titre plakasında üç kuyuya aktarın ve emiciliği 620 nm olarak ölçün (Şekil 3).
- 620 nm'de normalleştirilmiş absorbans değerlerine karşı farklı glikoz konsantrasyonları (0 ila 180 μg/mL) çizerek standart bir glikoz eğrisi geliştirin(Şekil 7). Hazırlanan örneklerdeki selüloz içeriğini hesaplamak için absorbans değerlerinden oluşturulan Y= mx+c regresyon satırını kullanın.
NOT: Glikoz standartları her deney seti için taze olarak hazırlanmalıdır. OD değerleri çok yüksek / düşükse glikoz konsantrasyonu artırılmalıdır, böylece bu değerler standart eğri absorbans değerleri aralığına girer. Regresyon çizgisi, her numune grubu için kullanılan glikoz standartlarına göre farklı m ve c değerleri oluşturur. Anthrone23'üneklenmesinden hemen sonra tüpleri karıştırın. Anthrone, seyreltilmiş numuneler ve hazırlanan standartlar, bu reaksiyonun eksotermik doğası nedeniyle anthrone tahlili yapılana kadar her zaman soğuk tutulurdu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma için yeşil evde yetişen pamuk bitkileri seçilmiştir. Selüloz içeriğinin karşılaştırmalı analizi için iki farklı deneysel pamuk çizgisi seçildi. Her deneysel çizgi için kök doku üç biyolojik kopyadan toplanmıştı. Toplam 500 mg doku homojenize edildi ve 20 mg'ı ham hücre duvarı ekstraksiyonu için kullanıldı. Daha sonra, selülozdan hemiselüloz ve lignin çıkarmak için Updegraff reaktif tedavisi için 5 mg ham hücre duvarı özü kullanılmıştır. Saflaştırılmış selüloz, selülozu glikoz birimlerine bölmek için sülfürik asit tedavisi ile hidroloz edildi. 620 nm'deki absorbans okumalarının sonuçları (Ek Tablo 1) glikoz konsantrasyonunu ölçmek ve selüloz içeriğini antrone test ile tahmin etmek için kullanıldı. Üç teknik kopyanın ortalama absorbans değerleri, 0 μg glikoz konsantrasyonunun boş absorbans değeri çıkarılarak normalleştirildi. Glikoz standart eğrisi dağınık bir çubuk grafik kullanılarak oluşturulmuştır (Şekil 4).
Bu standart eğriden elde edilen regresyon çizgisi, normalleştirilmiş absorbans okumaları kullanılarak çıkarılan test örneklerinde bilinmeyen bir glikoz konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılır. x hesaplamak için (μg/μL'de bilinmeyen glikoz konsantrasyonu), formül (x = normalleştirilmiş emiş-c/m) kullanılmıştır. μg/μL'deki glikoz konsantrasyonunu ölçmek için standart glikoz eğrisinin (R2 = 0.99) regresyon hattından elde edilen c ve m değerleri kullanıldı. Daha sonra bu değer, son hacim 500 μL olduğu için 2 seyreltme faktörüne bölünür ve μg / μL'deki glikoz konsantrasyonunu ölçmek için 10 μL örnek hacmine bölünür. Hesaplanan değer 5 mg hücre duvarı özü için olduğundan, mg başına glikoz konsantrasyonu elde etmek için her deneysel örnek için kullanılan ilgili ham hücre duvar ağırlığı ile 5'e bölünür. Hidroliz sürecinde kazanılan suyu telafi etmek için değer 1,1'e bölünür (glikozun moleküler ağırlığı 180 ve bir su molekülünün moleküler ağırlığı 18'dir ve bu nedenle glikoz monomerlerinin salınma sürecinde üretilen su nem faktörü bölünerek çıkarılmıştır, 1.1). Kristal selüloz içeriğini yüzde olarak hesaplamak için elde edilen değer 100 ile çarpılacaktır (Tamamlayıcı Tablo 1).
Selüloz içeriğinin sonuçları, biyolojik kopyalar arasında tutarlı olduklarını gösterir ve Updegraff yönteminin teknik doğruluğunu gösterir. Ayrıca, farklılıklar 2D grafikler kullanılarak çizildi. Bu sonuçlar, karşılaştırılan deneysel örnek sayı 1 ve 2'deki selüloz içerik farklılıklarını göstermiştir (Şekil 4). Örnek 1% 43.4 gösterirken, örnek 2% 28.12 gösterir, bu da bu yöntemin deneysel örnekler arasındaki farklılıkları ayırt edebileceğini düşündürmektedir. Önemli farklılıklarını test etmek için %95 önem düzeyinde bir Öğrenci t-testi uygulanmıştır.
Şekil 1: Köklerde selüloz içeriği tahmini için pamuk bitki biyokütlesinin hazırlanması. (A) Serada yetişen bitkiler topraktan hafifçe çekilerek su ile iyice yıkanmıştır. Bitki kök dokusu ayrıldı, kağıt havlularda tutuldu ve 2 gün boyunca kurumasına izin verildi. (B) Daha sonra kök doku tek tek etiketli kaplara aktarılır ve 49 °C'de -10 gün boyunca inkübatörde kurumasına izin verilir. (C) Kurutulmuş doku küçük parçalara ayrıldı, sıvı nitrojen içinde donduruldu, öğütme şişelerine yüklendi ve dondurucu değirmen kullanılarak ince toz haline getirildi. (D) 50 mL tüpte ince topraklanmış doku tozu toplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Updegraff yönteminde yer alan ana adımların akış şeması. (A) Protokoldeki önemli adımların resimsel gösterimi. (B) Panelde gösterilen kritik adımları açıklar (A). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Standart eğri için farklı glikoz konsantrasyonlarının hazırlanması. (A) 10 mg glikozu 10 mL steril damıtılmış suda eriterek stok çözeltisini hazırlayın, böylece stokun son konsantrasyonu 1 mg / mL olur. 0 μg ila 180 μg/ mL arasında farklı glikoz konsantrasyonları hazırlamak için steril damıtılmış su ile 1 mL'lik son hacme 20 μL artışlarla 1 mg / mL glikoz stok çözeltisi ekleyin. (B) Farklı glikoz konsantrasyonları yapmak için eklenecek 1 mg/mL glikoz ve steril damıtılmış su miktarını gösteren tablo. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 620 nm'de farklı glikoz konsantrasyonlarının absorbans değerleri kullanılarak oluşturulan glikoz standart eğrisi. (A) 0 ila 180 μg/ mL arasında değişen farklı glikoz konsantrasyonlarını gösteren tablo, ilgili normalleştirilmiş absorbans değerleri 620 nm'de. (B) Absorbans değerlerinden bir dağılım grafiği kullanılarak oluşturulan glikoz standart eğrisi (A). (C) Deneysel örnekler 1 ve 2'de kristal selüloz içeriği farklılıklarını gösteren çubuk grafik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Deneysel örneklerde selüloz içeriğinin tahmini. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pamuk lifleri pamuklu elyaftan üretilen doğal liflerdir. Pamuk lifi, tekstil endüstrisindeki kapsamlı uygulamaları ile yüksek kristal selüloz içeriğine sahip ~% 95 selüloz içeriği2 olan tek bir hücredir31. Pamuk lifi ~ % 95 selüloz içerdiğinden, kristal selüloz içeriğinin tahmininin gösterimi için pamuk kök dokuları kullandık. Pamuk kök dokuları kristal selüloz içeriği bakımından orta derecede zengindir ve yaygın olarak bulunan bir bitki biyokütleyi temsil eder. Kristal selüloz içeriği için gerekli toplam hücre duvarı miktarı sadece 5 mg'dır ve bu nedenle bu yöntem farklı gelişim evrelerinde/doku spesifik selüloz içeriği tahmininde kristal selüloz içeriğini tahmin etmek için kullanılabilir. Sülfürik asit yüzdesi (%67) ayrıca selülozun glikoz monomerlerine kırılmasında ve selülozun sonikasyona gerek kalmadan tamamen23'te çözülmesinde kritik bir rol oynar. Kristal selüloz peleti, tahmin sürecinde farklı adımlarda tüpün dibinde katı olmadığı için Updegraff tedavisinden sonra numune kaybı yaygındır. Updegraff tedavisinden sonra suyun ve aseton yıkamalarının her adımında küçük hacimlerde süpernatant çıkarılarak bu en aza indirilebilir. Ayrıca, numunenin ve standartların anthrone ile anında girdaplatulmasının renk gelişiminde ve standartların doğruluğunun artmasında önemli roller üstlenir ve %99,5 belirleme katsayısına (R2)yol açar (Şekil 3). Glikoz standart eğrisi, kristal selüloz içeriğini tahmin etmek için kullanılan glikoz konsantrasyonu belirlemede anahtardır. Bu nedenle, glikoz konsantrasyonları gerekli konsantrasyon aralığına göre ayarlanabilir. Deneysel değerlere uyacak değer aralığına bağlı olarak, standart eğri 0 ila 100 μg / mL veya 0 ila 200 μg / mL arasında 1000 μg / mL glikoz konsantrasyonlarına kadar değişebilir; bu, c ve m regresyon değerlerini daha da değiştirerek kristal selüloz tahmininin doğruluğunu artırır. Hem numuneler hem de standart için her zaman taze% 0.2 anthrone yapmak önemlidir. İstatistiksel bir ölçüm olan R-kare, regresyon hattındaki tüm veri noktalarının değişkenliğini temsil eder. Anthrone ekledikten sonra hem standartları hem de numuneleri aynı süre kaynatmak önemlidir. Bilinen bir selüloz içeriğine sahip pozitif bir kontrol eklemek her zaman önemlidir. Etkili veri tekrarlanabilirliği için, çözelti hazırlama (standartlar, standart eğri ve Updegraff reaktifi) dahil olmak üzere tüm prosedür doğru bir şekilde takip edilmelidir.
Son zamanlarda selüloz, selülozik aerosoller, bilgisayar parçaları ve selülozik etanol32,33gibi tekstil dışı uygulamalar için araştırılmıştır; bu nedenle, bu yöntem gelecekte geniş uygulamalara sahip olacaktır. Bilimsel ilerleme, kavramları anlamada, alternatif hipotezler önermede ve mevcut bilgiyi sağlamada/çürütmede artımlı ilerleme ile yapılır. Benzer ilerleme, bitki biyokütlesinde selüloz içeriğinin tahmin edilmesi için güvenilir bir yöntemin geliştirilmesinde de görülebilir. Hücre duvarı karmaşık bir matristir ve Updegraff yöntemi, saf selülozdan selüloz olmayan fraksiyonları sıralı bir şekilde ortadan kaldırarak bitki biyokütleslerindeki selüloz içeriğinin doğru tahmin edilmesine yol açmaktadır. Ayrıca, glikoz konsantrasyonunu ölçerek selüloz içeriğinin tahmin edilmesi için geliştirilen basit kolorimetrik yöntem, bu yöntemi son derece uyarlanabilir ve yaygın olarak kullanılmıştır. Mevcut çalışmada, selüloz verileri tek bir çizgiden toplanan örneklerin farklı biyolojik kopyaları arasında tutarlıydı. Bu nedenle, bu yöntemle üretilen verilerin tutarlı, güvenilir, tekrarlanabilir ve selüloz içeriğini basit kolorimetrik testle ölçmenin kolay olduğunu göstermektedir.
Updegraff yöntemi selüloz tahmini için en yaygın kullanılan yöntemdir. Gıda, ahşap, kağıt, lifler, biyoyakıtlar, giysiler, kozmetik ve farmasötikler gibi selülozun endüstriyel uygulamasının son zamanlarda genişletilmesiyle, bitki biyokütlesinin selüloz içeriğinin doğru tahmini çeşitli uygulamalar için çok önemlidir. Bu selüloz tahmini için en yaygın kullanılan yöntem olsa da, tekrarlanabilir veriler elde etmek için birkaç önlem almak önemlidir. Biyokütle örnekleri, selüloz içeriğinin kesin ve tekrarlanabilir tahminini elde etmek için aynı boyuta öğütülmelidir. Glikoz standart eğrisi oluşturulurken dikkatli olunmalıdır. Glikoz standart eğrisi hazırlama için kullanılan glikoz standartları, numune emicilik okumalarına göre artırılmalı veya azaltılmalıdır, böylece bilinmeyen konsantrasyonlar standart eğriyi hazırlamak için kullanılan glikoz konsantrasyonları aralığına girer. Değilse, m ve c değerleri değişebilir, bu da kristal selüloz içeriğinin yanlış tahmin edilmesine neden olabilir. Her numune grubu için % 0,2'lik bir antrone'un taze hazırlanması, Updegraff yönteminin bir başka kritik adımıdır. Selüloz içeriğinin doğru tahmin edilmesi için taze hazırlanmış % 0,2 antrone kullanılması esastır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bitki ve Toprak Bilimi Bölümü ve Pamuk A.Ş.'ye bu çalışmaya verdikleri kısmi destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
- Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
- Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
- Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
- Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
- Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
- Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
- Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
- Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
- Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
- Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
- Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
- Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
- Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
- Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
- Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
- Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
- Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
- Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
- Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
- Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
- Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
- Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
- Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
- Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
- Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
- Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
- Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).
