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Neuroscience

ड्रोसोफिला में एक रैपिड फूड-प्रिफरेंस परख

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62051
Automatic Translation
1, 1,2
1Monell Chemical Senses Center, 2Department of Physiology, The Diabetes Research Center, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

हम मक्खियों के लिए दो-पसंद फीडिंग परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह फीडिंग परख तेज और चलाने में आसान है और न केवल छोटे पैमाने पर प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए उपयुक्त है, बल्कि मक्खियों में उच्च-थ्रूपुट व्यवहार स्क्रीन के लिए भी उपयुक्त है।

Abstract

हानिकारक एजेंटों की खपत से बचने के दौरान पोषण मूल्य के साथ भोजन का चयन करने के लिए, जानवरों को अपने खाद्य वातावरण का मूल्यांकन करने के लिए एक परिष्कृत और मजबूत स्वाद प्रणाली की आवश्यकता होती है। फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर,एक आनुवंशिक रूप से ट्रैक्टेबल मॉडल जीव है जिसका व्यापक रूप से आणविक, सेलुलर और तंत्रिका आधार को समझने के लिए उपयोग किया जाता है। फ्लाई फूड प्रिफरेंस का विश्लेषण करने के लिए, एक मजबूत भोजन विधि की आवश्यकता है। यहां वर्णित एक दो विकल्प खिला परख है, जो कठोर, लागत की बचत, और तेजी से है । परख पेट्री-डिश आधारित है और इसमें डिश के दो हिस्सों में नीले या लाल रंग के साथ पूरक दो अलग-अलग खाद्य पदार्थों के अलावा शामिल है। फिर, ~ 70 prestarved, 2-4 दिन पुरानी मक्खियों पकवान में रखा जाता है और के बारे में ९० मिनट के लिए अंधेरे में नीले और लाल खाद्य पदार्थों के बीच चयन करने की अनुमति दी । प्रत्येक मक्खी के पेट की परीक्षा वरीयता सूचकांक की गणना के बाद होती है। मल्टीवेल प्लेटों के विपरीत, प्रत्येक पेट्री डिश को भरने और समय और प्रयास को बचाने के लिए केवल ~ 20 एस लेता है। इस खिला परख को जल्दी से यह निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है कि मक्खियों की तरह उड़ता है या किसी विशेष भोजन को नापसंद करता है।

Introduction

मक्खियों और स्तनधारियों के बीच स्वाद अंगों की शारीरिक संरचना में नाटकीय अंतर के बावजूद, कई टैस्टेंट पदार्थों के लिए मक्खियों की व्यवहार प्रतिक्रियाएं स्तनधारियों के समान हैं। उदाहरण केलिए, मक्खियां चीनी1,2,3,4,5,6,7,8,अमीनो एसिड9,10,और कम नमक11पसंद करती हैं, जो पोषक तत्वों का संकेत देती हैं, लेकिन कड़वे खाद्य पदार्थों को अस्वीकार करते हैं12,13,14,15 जो अप्रिय या जहरीले हैं। पिछले दो दशकों में, मक्खियों ने स्वाद सनसनी और भोजन की खपत से संबंधित कई मूलभूत प्रश्नों की समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान मॉडल जीव साबित किया है, जिसमें टैस्टेंट डिटेक्शन, स्वाद ट्रांसडक्शन, स्वाद प्लास्टिसिटी और फीडिंग रेगुलेशन16,17,18,19,20शामिल हैं। उल्लेखनीय रूप से, कई अध्ययनों से पता चला है कि स्वाद लेनदेन और तंत्रिका सर्किट तंत्र अंतर्निहित स्वाद धारणा फल मक्खियों और स्तनधारियों के बीच अनुरूप हैं। इसलिए, फल मक्खी एक आदर्श प्रयोगात्मक जीव के रूप में कार्य करती है, जिससे शोधकर्ताओं को पशु साम्राज्य में खाद्य पहचान और खपत को नियंत्रित करने वाली विकासवादी संरक्षित अवधारणाओं और सिद्धांतों को उजागर करने में सक्षम बनाया जाता है।

मक्खियों में स्वाद सनसनी की जांच करने के लिए, भोजन वरीयता को निष्पक्ष रूप से मापने के लिए एक तेज और कठोर परख स्थापित करना महत्वपूर्ण है। पिछले कुछ वर्षों में, विभिन्न भोजन विधियों, जैसे डाई-आधारित परख11,12,13,21,22,23,फ्लाई सूंड विस्तार प्रतिक्रिया परख24,केसिलेरी फीडर (कैफे) परख25, 25,26,फ्लाई लिक्विड-फूड इंटरैक्शन काउंटर (एफएलआइसी) परख27,और अन्य संयोजन तरीकों को मात्रात्मक रूप से खाद्य वरीयता और/या फल मक्खियों के लिए भोजन का सेवन28, 29,30, 31को मापने के लिए विकसित किया गया है । लोकप्रिय भोजन प्रतिमानों में से एक डाई-आधारित दो-पसंद फीडिंग परख है जो या तो एक मल्टीवेल माइक्रोटेटर प्लेट12, 21,32 या, जैसा कि यहां वर्णित है, एक छोटा पेट्री डिश11,22 फीडिंग चैंबर के रूप में उपयोग करता है। यह परख मक्खी के पेट की पारदर्शिता के आधार पर बनाया गया है। इस परख के दौरान, मक्खियों को खिलाने वाले कक्ष में रखा जाता है और लाल डाई या नीले रंग के साथ मिश्रित दो खाद्य विकल्पों के साथ प्रस्तुत किया जाता है। एक बार परख पूरी हो जाने के बाद, फ्लाई पेट लाल या नीले दिखाई देते हैं, जिसके आधार पर उन्होंने भोजन का सेवन किया है।

पेट्री-डिश और मल्टीवेल-प्लेट डाई-आधारित फीडिंग परख दोनों अत्यधिक मजबूत हैं और लगभग एक ही परिणाम उत्पीठित होते हैं। इन दो परखों का उपयोग करते हुए, भोजन के स्वाद और भोजन की बनावट 11 ,12,22, 32 ,32,33को संवेदन करने के लिए उत्तरदायी अत्यधिक विविध रिसेप्टर्स और कोशिकाओं को समझने की दिशा में कई महत्वपूर्ण खोजें और सफलताएं की गई हैं । डाई आधारित परख में, एक प्रयोगात्मक कदम काफी समय और प्रयास की आवश्यकता होती है तैयार कर रहा है और खिला चैंबर में भोजन लोड हो रहा है । भोजन की तैयारी और लोडिंग समय को कम करने के लिए, इस परख को मल्टीवेल माइक्रोटिटर प्लेट को एक छोटे पेट्री डिश के साथ बदलकर संशोधित किया गया था, जिसे दो बराबर डिब्बों में विभाजित किया गया है। पेट्री-डिश बेस्ड परख में ब्लू या रेड डाई के साथ सप्लीमेंट करने वाले दो अलग-अलग फूड्स को डिश के दो हिस्सों में मिलाया जाता है । फिर, ~ 70 prestarved, 2-4 दिन पुरानी मक्खियों पकवान में रखा जाता है और के बारे में ९० मिनट के लिए अंधेरे में नीले और लाल खाद्य पदार्थों के बीच चयन करने की अनुमति दी । प्रत्येक फ्लाई के पेट की फिर जांच की जाती है, और वरीयता सूचकांक (पीआई) की गणना की जाती है।

इस पेट्री डिश आधारित दो विकल्प खिला परख सस्ती, सरल है, और तेजी से । एक मल्टीवेल प्लेट को भरने के लिए लगभग 110 एस की आवश्यकता होती है, जबकि प्रत्येक पेट्री डिश केवल ~ 20 एस लेती है। इसके अलावा, मल्टीवेल प्लेट को बड़ी संख्या में छोटे कुओं (जैसे, 60 या प्रति प्लेट वाले कुओं) में भोजन की छोटी मात्रा को पाइपिंग करने की आवश्यकता होती है, जो काफी सटीक और ध्यान की मांग करता है। इसके विपरीत, पेट्री-डिश आधारित परख के लिए प्रति प्लेट केवल दो क्रियाओं की आवश्यकता होती है। के रूप में खिला परख प्रतिकृति की एक बड़ी संख्या में शामिल कर सकते हैं, पेट्री पकवान आधारित परख समय और प्रयास की एक गैर-त्रयी राशि बचाता है । यह परख मल्टीवेल-आधारित परख से उन लोगों के बराबर परिणाम देता है और स्वाद सनसनी में कई बुनियादी सवालों को संबोधित करने में सफल साबित हुआ है, जिसमें नमक स्वाद कोडिंग11,खाद्य अनुभव द्वारा संशोधित प्लास्टिक का स्वाद22,और खाद्य बनावट सनसनी का आणविक आधार33शामिल है। संक्षेप में, यह पेट्री-डिश-आधारित दो-पसंद परख एक शक्तिशाली उपकरण है जो यह जांचने के लिए है कि मक्खियों को उचित भोजन व्यवहार प्राप्त करने के लिए बाहरी और आंतरिक पोषक तत्वों के परिवेश को कैसे देखते हैं।

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Protocol

1. परख कक्षों कोडांतरण

नोट: हालांकि यह प्रोटोकॉल 35 मिमी पेट्री डिश(चित्रा 1 ए)के उपयोग का वर्णन करता है, वांछित प्रभाव किसी भी निर्विवाद, चिकनी-तली पोत का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है जिसे विभाजित और कवर किया जा सकता है।

  1. सबसे पहले, दो निर्विवाद डिब्बों के साथ मिडलाइन के नीचे प्लास्टिक की लंबाई (चौड़ाई में 5 मिमी और ऊंचाई में 3 मिमी) को ठीक करके एक लिडेड 35 मिमी पेट्री डिश को विभाजित करें। पुष्टि करें कि सील रिसाव से बचने के लिए पूरी हो गई है जो दो खाद्य सब्सट्रेट्स को मिलाने का कारण बन सकती है।
    नोट: विधानसभा के बाद, जब तक सील रखती है इस उपकरण का पुन: उपयोग करें।

2. भुखमरी की शीशियों की तैयारी

  1. पर्याप्त संख्या में खाली प्लास्टिक फ्लाई शीशियां तैयार करें; फिर, शिथिल नीचे टिश्यू पेपर का एक टुकड़ा कॉम्पैक्ट करें। ऊतक कागज पर्याप्त है कि यह अंतरिक्ष भरता है सेक, लेकिन इतना नहीं है कि यह एक घने द्रव्यमान रूपों ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि ऊतक में कोई गहरी दरारें या सिलवटें नहीं हैं, क्योंकि इससे मक्खियां फंस सकती हैं।
  2. शीशी में ~3 एमएल शुद्ध पानी डालें ताकि टिश्यू पूरी तरह से संतृप्त हो जाए, लेकिन खड़े पानी न पड़े। सुनिश्चित करें कि शीशी की दीवार पर अतिरिक्त पानी की बड़ी बूंदें न हों। वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक खाली शीशी में 1% एग्राम के 5 एमएल जोड़कर 1% डब्ल्यू/वी एगर समाधान (सुक्रोज के बिना) तैयार करके भिगोए गए पेपर के लिए स्थानापन्न एगर उठे और एगर को कमरे के तापमान पर जमना करने की अनुमति दी।

3. प्रयोग से पहले मक्खियों की गीली भुखमरी

  1. प्रयोग के समय से पहले भुखमरी 24 घंटे शुरू करें। सीओ2 संज्ञाहरण के तहत, ~70, 2-4 दिन पुराने के समूहों को तैयार भुखमरी की शीशियों में उड़ता है, प्रत्येक शीशी को जीनोटाइप और भुखमरी के समय के साथ लेबल करता है।

4. रिएजेंट सेटअप

  1. रंगों की तैयारी
    नोट: किसी भी प्रयोग करने से पहले, उपयोग करने के लिए लाल और नीले रंगों की सही सांद्रता निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक नियंत्रण परख करना महत्वपूर्ण है।
    1. नियंत्रण परख के लिए, प्रत्येक डाई के लिए कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला तैयार करें, और एक अलग डाई रंग के साथ एक ही भोजन के साथ भोजन परख करें। परिणामों का उपयोग दो डाई सांद्रता (एक लाल, एक नीला) की पहचान करने के लिए करें जो ~0 की पीआई उत्पील्ड करते हैं जब कोई प्रायोगिक यौगिक नहीं जोड़ा जाता है (धारा 7 देखें)।
      नोट: उदाहरण के लिए, अंतिम नीले रंग की एकाग्रता 50 माइक्रोन पर तय की गई थी और लाल डाई सांद्रता की एक श्रृंखला के खिलाफ परीक्षण किया गया था। लाल डाई खुराक वक्र के आधार पर, इष्टतम लाल डाई एकाग्रता 210 माइक्रोन थी, जिसने न्यूनतम डाई पूर्वाग्रह(चित्रा 1B)दिया। एक उच्च लाल डाई एकाग्रता ड्राइव लाल भोजन पसंद करने के लिए मक्खियों, जबकि एक कम एकाग्रता ड्राइव नीले भोजन पसंद करने के लिए मक्खियों । ध्यान से 1 माइक्रोन की वेतन वृद्धि में नीले या लाल रंग सांद्रता को परिष्कृत, इस परिमाण और अधिक के मतभेदों के रूप में प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं ।
  2. 1% एगरे की तैयारी
    1. माइक्रोवेव-सुरक्षित पोत में 0.5 ग्राम एग्राज और 50 मिलियन शुद्ध पानी (या उसके कुछ कई) को मिलाएं। माइक्रोवेव जब तक भंग समाधान, यह जरूरत के रूप में सरगर्मी ।
  3. अन्य खाद्य घटकों की तैयारी
    1. प्रत्येक खाद्य घटक को भंग करें, जिसमें सुक्रोज और किसी भी प्रयोगात्मक यौगिक शामिल हैं, पानी में अंतिम परीक्षण एकाग्रता के 100 गुना या उच्च एकाग्रता पर।
      नोट: 1% एगर में जोड़े गए प्रत्येक खाद्य घटक की कुल मात्रा 1 एमएल प्रति 10 एमएल पिघला हुआ एगर से अधिक नहीं होनी चाहिए। अन्यथा, एगर उठी बहुत कमजोर हो सकती है और उचित रूप से जमना नहीं होगा।
  4. खाद्य मीडिया की तैयारी
    1. कॉनिकल पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रलाइज ट्यूब (15 या 50 एमएल) में एगर, डाई और वांछित प्रायोगिक यौगिक मिलाएं; कंट्रोल फूड में एक्सपेरिमेंटल टैस्टेंट की जगह पानी का इस्तेमाल करें। ऐसा करें जबकि एगर अभी भी पूरी तरह से तरल है और भंवर मिक्सर का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं। ट्यूबों को 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें, जबकि उपयोग में नहीं होने से उत्पीर को व्यंजनों में वितरित करने से पहले सख्त होने से रोका जा सके।
  5. प्रयोग के लिए व्यंजन तैयार करना
    नोट: सुनिश्चित करें कि शुरू करने से पहले सभी व्यंजन पूरी तरह से सूखे हैं।
    1. परख पकवान के एक तरफ लाल प्रयोगात्मक खाद्य माध्यम के पिपेट 1 एमसीए(चित्रा 1A); व्यंजनों की वांछित संख्या के लिए दोहराएं। अगेन को फर्म (3-5 मिनट) तक ठंडा होने दें, और फिर व्यंजनों के दूसरी तरफ नीले नियंत्रण भोजन के 1 मिलियन एमएल(चित्रा 1A)। इस प्रक्रिया को नियंत्रण लाल/प्रायोगिक नीली जोड़ी के साथ दोहराएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्रयोग शुरू करने से पहले सभी व्यंजन पूरी तरह से सेट किए गए हैं। 30 मिनट के भीतर व्यंजन का प्रयोग करें।

5. दो तरह से खिला परख की शुरुआत

  1. अस्थायी रूप से बर्फ पर प्रयोगात्मक फ्लाई लाइनों को लकवा देते हैं जब तक कि उड़ान और चढ़ाई जैसी कोई स्पष्ट मोटर गतिविधियां नहीं देखी जाती हैं। एक बार जब मक्खियों को स्थिर कर दिया जाता है, तो धीरे-धीरे शीशी को उलट दें, और सभी मक्खियों को परख कक्ष में स्थानांतरित करने के लिए टैप करें।
    नोट: कोल्ड शॉक ~ 3-5 मिनट लेता है। ठंड के लंबे समय तक संपर्क में रहने से फ्लाई के शरीर विज्ञान और स्वास्थ्य पर असर पड़ सकता है और इसलिए इससे बचा जाना चाहिए।
  2. जल्दी से कवर को चैंबर पर रखें और उसे अलग रख दें। एक बार जब सभी मक्खियों को स्थानांतरित कर दिया गया है, तो सभी कक्षों को एक अंधेरे, संलग्न स्थान पर ले जाएं। परख को 90 मिनट तक चलने दें।
    नोट: एक अंधेरे वातावरण खिला व्यवहार पर मक्खी के दृश्य मार्ग के प्रभाव को कम करता है और पकवान के बाहर से किसी भी पर्यावरण संकेतों को हटा ।

6. दो तरह से खिला परख समाप्त

  1. 90 मिनट बीत जाने के बाद, मक्खियों की बलि देने के लिए कक्षों को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें। ~ 1 एच के बाद, मक्खियों की गिनती करें।
    नोट: फ्रीजर में पकवान रखने से पहले प्रत्येक पेट्री पकवान उलटा सुनिश्चित करने के लिए कि कोई मक्खियों भोजन पर जमे हुए हो जाएगा ।

7. भोजन वरीयता निर्धारित करने के लिए एक वरीयता सूचकांक (पीआई) असाइन करना

  1. एक मानक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, प्रत्येक व्यक्तिगत पकवान में मक्खियों के पेट के रंग की जांच करें। मक्खियों को उनके पेट के रंग(चित्रा 2 ए)के अनुसार लाल, नीला या बैंगनी रंग के रूप में गिनें। यदि इसका पेट 50% से अधिक रंगीन है, तो फ्लाई गिनें, जो मजबूत भोजन(चित्रा 2B) का संकेत देता है। मक्खी को बाहर करें यदि इसके पेट में केवल एक छोटा सा भोजन स्थान होता है, जो खराब खाने(चित्रा 2C) कासंकेत देता है।
  2. नीले, लाल, या दोनों नीले और लाल खाद्य पदार्थ खाने मक्खियों की संख्या के बाद गिना गया है, प्रत्येक पेट्री डिश एक वरीयता सूचकांक (PI) आवंटित करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें:

PI = (मक्खियों की संख्या प्रयोगात्मक भोजन खाने) - (मक्खियों के नियंत्रण भोजन खाने की संख्या) / (मक्खियों की संख्या नियंत्रण भोजन खाने) + (मक्खियों की संख्या नियंत्रण भोजन खाने) + (मक्खियों की संख्या दोनों खाने)

PI > 0 प्रायोगिक यौगिक के लिए वरीयता इंगित करता है, पीआई < 0 प्रायोगिक यौगिक के लिए एक घृणा इंगित करता है, और PI = 0 खिला व्यवहार पर यौगिक का कोई प्रभाव इंगित करता है ।

8. परख कक्षों की सफाई

  1. खाद्य सब्सट्रेट को खुरचकर और उन्हें बिना सोचे-सुथरे साबुन और पानी से धोकर पेट्री व्यंजनों को तुरंत साफ करें। पेट्री डिश को रात भर आसुत पानी में भिगो दें। जांच करें कि प्रत्येक डिश में विभाजन सील अभी भी निर्विवाद है, फिर पकवान हवा सूखी चलो ।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के बाद कि कोई अवशिष्ट agarose या डाई धुंधला है, पेट्री व्यंजन फिर से उपयोग करने के लिए तैयार हैं ।

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Representative Results

इस परख में, एक 35 मिमी पकवान को दो समान भोजन डिब्बों में विभाजित किया गया था, जिसमें प्रत्येक आधे पकवान में नीले या लाल रंग(चित्रा 1A)के साथ मिलकर एगर उठे हुए भोजन थे। डाई पूर्वाग्रह को बाहर करने के लिए, नीले और लाल रंग सांद्रता को ध्यान से एक अनुमानित "0" पीआई उपज के लिए परिष्कृत किया गया था जब केवल इन दो रंगों को जोड़ा गया था(चित्रा 1B)। एक बार पेट्री डिश परीक्षण भोजन के साथ भरी हुई थी, ~७० गीला भूखे, 2-4 दिन पुराने वयस्क मक्खियों पकवान के लिए स्थानांतरित कर दिया गया, उंहें अंधेरे में दो खाद्य विकल्पों के बीच चयन करने की अनुमति । 90 मिनट के बाद, मक्खियों के पेट के रंग की विच्छेदन माइक्रोस्कोप से जांच की गई। आमतौर पर, फ्लाई पेट नीला या लाल दिखाई देता है यदि जानवर मुख्य रूप से क्रमशः नीले या लाल भोजन(चित्रा 2 ए)का उपभोग करता है। यदि मक्खी नीले और लाल दोनों का उपभोग करती है, तो उसका पेट बैंगनी होजाता है (चित्रा 2A)।

अपर्याप्त भोजन सेवन(चित्रा 2C)के साथ मक्खियों को लंघन करते हुए, भोजन की काफी मात्रा में मक्खियों को रन(चित्रा 2B)बनाए गए थे। इस पेट्री-डिश आधारित परख की तुलना मल्टीवेल-प्लेट बेस्ड परख से की गई । परिणाम बताते हैं कि ये दो खिलाने के तरीके अनिवार्य रूप से जंगली प्रकार की मक्खियों(चित्रा 3 ए-सी)में मीठे, कड़वे या नमकीन भोजन के लिए खिला प्रतिक्रियाओं को परखने में एक ही परिणाम देते हैं। विशेष रूप से, 60 कुओं(चित्रा 3 डी)वाली मल्टीवेल प्लेट की तुलना में पेट्री डिश में भोजन तैयार करना और वितरित करना बहुत तेज़ है। कुल मिलाकर, पेट्री-डिश-आधारित परख एक मजबूत और तेजी से खिलाने की विधि है जिसका उपयोग मक्खियों के लिए भोजन वरीयता को जल्दी से निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:दो पसंद परख डिवाइस और डाई खुराक वक्र। (A)पेट्री डिश के दो हिस्सों का उपयोग दो अलग-अलग खाद्य विकल्पों को प्रस्तुत करने के लिए किया जाता है। पकवान के एक आधे नीले रंगे भोजन होता है, और दूसरे आधे लाल रंगे भोजन में शामिल हैं । प्रीस्टारव्ड मक्खियों को पकवान में रखा जाता है ताकि वे जो भी भोजन पसंद करते हैं, उसे उपभोग करने की अनुमति दें। (ख)जंगली प्रकार की मक्खियों के लिए खाद्य वरीयता 1% एगर उठी प्लस 2 एमएम सुक्रोज के बीच चुनने से या तो 50 μM ब्लू डाई या लाल डाई की अलग-अलग सांद्रता होती है। इष्टतम लाल डाई एकाग्रता 210 माइक्रोन है। डेटा मतलब का प्रतिनिधित्व ± मानक त्रुटि है। प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए, एन = 6 परीक्षण। प्रत्येक परीक्षण में लगभग 70 मक्खियों का परीक्षण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:नीला, लाल, या दोनों नीले और लाल खाद्य पदार्थ खाने के बाद पेट का रंग उड़ना। (ए)नीले भोजन (ऊपर दाएं), लाल भोजन (ऊपर बाएं), या दोनों को निगलने के बाद मक्खियों की प्रतिनिधि छवियां, जिससे पेट बैंगनी (नीचे) दिखाई देता है। (ख)नीले भोजन की पर्याप्त खपत दिखाने वाली फ्लाई। (ग)एक छोटी मात्रा में नीले भोजन को निगलने के बाद एक मक्खी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:जंगली प्रकार की मक्खियों में विभिन्न टैस्टेंट के लिए प्रतिक्रियाओं को खिलाना, और पेट्री-डिश-आधारित फीडिंग डिवाइस बनाम 60-अच्छी प्लेट के लिए भोजन-लोडिंग समय। (ए)जंगली प्रकार की मक्खियों के लिए भोजन वरीयता 2 m सुक्रोज और 10 mM सुक्रोज के बीच चयन। n = 12 परीक्षण, अकीदत प्राप्त छात्र के टी-टेस्ट। (ख)10 एमएम कैफीन के साथ या बिना 2 एमएम सुक्रोज युक्त भोजन के लिए जंगली प्रकार की मक्खियों में भोजन वरीयता। n = 10 परीक्षण, अकीदत प्राप्त छात्र के टी-टेस्ट। (ग)20 एमएम एनएसीएल के साथ या बिना 2 एमएम सुक्रोज युक्त भोजन के लिए जंगली प्रकार की मक्खियों में भोजन वरीयता। n = 10 परीक्षण, अकीदत प्राप्त छात्र के टी-टेस्ट। (घ)भोजन को 60-अच्छी थाली और पेट्री डिश में भरने में समय बिताया। n = 12 प्लेटें या व्यंजन, *पी < 0.0001, अकर्ण छात्र के टी-टेस्ट। डेटा का प्रतिनिधित्व करता है ± SEM. संक्षिप्त: n.s. = सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं; SEM = मतलब के मानक त्रुटि; एनएसीएल = सोडियम क्लोराइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस विधि में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं जहां समस्याएं हो सकती हैं। सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि मक्खियों स्थिर डेटा प्रदान करने के लिए पर्याप्त मात्रा में भोजन निगलना। यदि मक्खियां खराब खाती हैं, तो सुनिश्चित करें कि मक्खियों को कम से कम 24 घंटे के लिए गीला-भूखा रखा गया है, और प्रयोगात्मक मीडिया में कम से कम एक न्यूनतम सुक्रोज एकाग्रता (2 mM) शामिल है। भोजन की खपत को और अधिक प्रोत्साहित करने के लिए, मक्खियों की शारीरिक स्थिति के आधार पर 24 घंटे से परे गीले भुखमरी की अवधि को लम्बा करें। यदि बहुत अधिक मक्खियां लंबे समय तक भुखमरी से बचने में विफल रहती हैं, तो यह सुनिश्चित करें कि शीशियों में गीला-भुखमरी प्रदर्शन करते समय ऊतक पेपर में पर्याप्त पानी जोड़ा जाता है। अत्यधिक पानी से बचें जो मक्खियों को डुबो सकता है। दूसरा, मक्खियों या तो नीले या लाल रंग की ओर खिला पूर्वाग्रह दिखाने के लिए अगर उनकी सांद्रता ध्यान से संतुलित नहीं कर रहे हैं । डाई एकाग्रता में छोटे बदलावों का गहरा भोजन प्रभाव हो सकता है(चित्रा 1B)। इस प्रकार, डाई पूर्वाग्रह को रोकने के लिए, डाई एकाग्रता सटीक होना चाहिए। यदि मक्खियां डाई से प्रभावित होती हैं, तो ध्यान से 1 माइक्रोन की वेतन वृद्धि पर डाई एकाग्रता को परिष्कृत करें, और फिर लाल/नीले रंग की एकाग्रता जोड़ी की पहचान करने के लिए विभिन्न डाई संयोजनों का परीक्षण करें जो पीआई = 0 की पैदावार करता है जब सुक्रोज (जैसे, 2 mM) की कम एकाग्रता को छोड़कर कोई प्रायोगिक यौगिक नहीं जोड़ा जाता है। नई फ्लाई लाइनों का परीक्षण करते समय या नए डाई स्टॉक बनाने के बाद इष्टतम लाल या नीले रंग के डाई कॉन्सर्ट को पुन: समायोजित किया जाना चाहिए। तीसरा, सुनिश्चित करें कि परख 90 मिनट तक विवश है। पिछले अध्ययन22के अनुसार, लंबे समय तक खिलाने से अनुकूलन या असंवेदनशीलता का स्वाद हो सकता है।

अन्य खिला तकनीकों के साथ तुलना में, जैसे FLIC27 या कैफे25 परख, इस पेट्री-डिश आधारित दो पसंद परख में निम्नलिखित विशेषताएं और फायदे हैं: (1) सादगी: इस डिवाइस में प्लास्टिक डिवाइडर के साथ केवल एक छोटा पेट्री डिश शामिल है। क्योंकि व्यंजन और प्लास्टिक डिवाइडर सस्ती और इकट्ठा करने के लिए आसान कर रहे हैं, एक पूरे प्रयोग केवल ंयूनतम निवेश की आवश्यकता है । (2) औचित्य: पेट्री-डिश-आधारित डिवाइस फीडिंग परख(चित्रा 3 डी)को काफी गति देता है। नियमित विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रंग-स्कोरिंग प्रक्रिया भी तेज और सीधी है। इस विधि के साथ, एक विशेष खाद्य घटक की ओर मक्खियों के स्वाद वरीयता का जल्दी से परीक्षण किया जा सकता है। इस प्रकार, यह छोटे पैमाने पर अनुसंधान और बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन दोनों के लिए उपयुक्त है। (3) स्थिरता: प्रत्येक डिवाइस में केवल कुछ मक्खियों का विश्लेषण करने वाले अन्य खिला विधियों के विपरीत, यह विधि एक समय में बड़ी संख्या में वयस्क मक्खियों के लिए फीडिंग प्रतिक्रियाओं की मात्रा की अनुमति देती है, जो व्यक्तिगत मक्खियों के बीच विभिन्नताओं को खिलाने के प्रभावों को काफी कम करती है। यह डाई-आधारित दो-पसंद भोजन परख कठोर और प्रजनन योग्य साबित हुई है और इसका उपयोग महत्वपूर्ण फ्लाई म्यूटेंट को अलग करने के लिए किया गया है, जिसमें खाद्य स्वाद और बनावट11,22,33को समझने में दोष हैं।

जैसा कि इन परिणामों द्वारा प्रदर्शित किया गया है, पेट्री-डिश-आधारित परख अनिवार्य रूप से मीठे, कड़वे और नमकीन स्वाद प्रतिक्रियाओं के लिए मल्टीवेल-आधारित फीडिंग परख के समान परिणाम पैदा करती है, हालांकि पेट्री-डिश-आधारित परख में छोटे बदलाव(चित्रा 3ए-सी)होते हैं। डाई आधारित फीडिंग परख का एक बार लेने वाला कदम भोजन कक्ष में भोजन का निर्वहन है। मल्टीवेल प्लेट, जिसमें 60 या अधिक कुएं होते हैं, प्रति प्लेट 60 या उससे अधिक कुओं में पिघले हुए एगर उठे भोजन को ठीक से लोड करने की आवश्यकता के कारण स्थापित करने के लिए श्रमसाध्य हो सकते हैं। मल्टीवेल प्लेट की तुलना में पेट्री डिश में खाना तैयार करना और लोड करना काफी तेज होता है, क्योंकि पेट्री डिश में केवल दो अलग-अलग डिब्बे(चित्रा 3डी)होते हैं। इस प्रकार, यह पेट्री-डिश-आधारित विधि न केवल डाई-आधारित परख की मजबूती को बनाए रखती है, बल्कि परख की तैयारी में बिताए गए समय और प्रयास को भी काफी कम कर देती है, जिससे फीडिंग परख की क्षमता और गति काफी बढ़ गई है। नतीजतन, यह आसानी से इस तरह के एक आनुवंशिक स्क्रीन परियोजना के रूप में मक्खी लाइनों की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

जबकि डाई-आधारित परख उनकी सादगी और गति के कारण अध्ययन का एक उच्च-थ्रूपुट एवेन्यू प्रदान करते हैं, वे अवधि या मात्रा जैसे भोजन के अधिक विस्तृत मात्रात्मक पहलुओं के बारे में जानकारी नहीं पकड़ सकते हैं। इस समस्या को दूर करने के लिए, डिश के ऊपर एक हाई-स्पीड कैमरा स्थापित किया जा सकता है, जो प्रत्येक कक्ष में फीडिंग अवधि और आवृत्ति जैसे भोजन प्रक्रिया की अधिक विस्तृत जानकारी प्रकट करता है। इसके अलावा, डाई-आधारित प्रयोगों से एकत्र किए गए डेटा को पूरक करने के लिए कई अन्य फीडिंग प्रतिमानों का उपयोग किया जा सकता है। एफएलआइसी27 और फ्लाई सूंड और गतिविधि डिटेक्टर (फ्लाईपैड)34जैसे स्वचालित फीडिंग डिवाइस, खिलाने की लौकिक गतिशीलता को रिकॉर्ड कर सकते हैं। कैफे परख25 या मैनुअल खिला परख३५ खपत भोजन की मात्रा को मापने कर सकते हैं । फिर भी, इन दृष्टिकोणों की अपनी चेतावनी है। उदाहरण के लिए, पेट्री डिश या मल्टीवेल प्लेट की तुलना में, लैब में स्थापित करने के लिए स्वचालित भोजन उपकरण बहुत महंगे हैं। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक डिवाइस एक समय में केवल कुछ मक्खियों को बताता है, जिससे यह व्यक्तिगत जानवरों में परिवर्तनशीलता के लिए अधिक असुरक्षित हो जाता है। के रूप में कैफे परख मक्खियों को खिला कक्ष के अंदर लटक केशिका ट्यूब के अंत तक अपने शरीर पैंतरेबाज़ी करने की क्षमता पर निर्भर करता है, परिणाम मोटर हानि स्वाद सनसनी से असंबंधित द्वारा चकित किया जा सकता है ।

यद्यपि अन्य दृष्टिकोण अपने आप में शक्तिशाली हैं, डाई-आधारित परख मक्खियों में भोजन वरीयता को तेजी से खोजने और विश्लेषण करने के लिए एक अधिक कुशल उपकरण हो सकते हैं। इसके अलावा, दो-विकल्प सेटअप को फ्लाई के खिलाने के व्यवहार में चुनिंदा और तीव्रता से हेरफेर करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स36 जैसी अत्याधुनिक तकनीकों के साथ एकीकृत किया जा सकता है। यह प्रकाश सक्रियण के लिए पकवान के एक आधे और एक प्रकाश निष्क्रिय नियंत्रण के रूप में दूसरे आधे का उपयोग किया जा सकता है । विशिष्ट न्यूरॉन्स की सीधी सक्रियता या निष्क्रियता यह निर्धारित करने में मदद करती है कि भोजन व्यवहार को विनियमित करने में उनकी भूमिका है या नहीं। संक्षेप में, इन परिणामों से पता चलता है कि पेट्री डिश आधारित दो विकल्प खिला परख एक तेजी से और मजबूत खिला विधि है कि शोधकर्ताओं को विभिन्न शारीरिक और चयापचय राज्यों के तहत खिला व्यवहार का विश्लेषण करने में मदद कर सकते है ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव या प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक डॉ टिंगवेई एमआई को दो पसंद के फीडिंग परख को अनुकूलित करने में मदद करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । वे पांडुलिपि पर अपनी टिप्पणियों के लिए सैमुअल चान और वायाट कूलमीस को भी धन्यवाद देना चाहेंगे । इस परियोजना को स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों R03 DC014787 (Y.V.Z.) और R01 DC018592 (Y.V.Z.) और एम्ब्रोस Monell फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Petri dish Fisher Scientific 08-772E
Agarose Thomas Scientific C756P56
Clear adhesive Fisher Scientific NC9884114
Conical centrifuge tubes Fisher Scientific 05-527-90
Dissection microscope Amscope SM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant Blue Wako Chemical 3844-45-9
Fly CO2 anesthesia setup Genesee Scientfic 59-114/54-104M
Fly incubator with programmable day/night cycle Powers Scientific Inc. IS33SD
Fly lines
Glass dish (microwave-safe)
Kimwipes Fisher Scientific 06-666A
Media storage bottle Fisher Scientific 50-192-9998
Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm
Plastic fly vials Genesee Scientific 32-116
Sucrose Millipore Sigma S9378
Sulforhodamine B Millipore Sigma S9012
Tastant compound of interest
Vortex mixer Benchmark Scientific BV1000
Water bath Fisher Scientific FSGPD05

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 168
<em>ड्रोसोफिला</em> में एक रैपिड फूड-प्रिफरेंस परख
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Mack, J. O., Zhang, Y. V. A Rapid… More

Mack, J. O., Zhang, Y. V. A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (168), e62051, doi:10.3791/62051 (2021).

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