Summary
調節不整合な腸上皮バリア機能および免疫応答は、生理学的モデルの欠如のために十分に調査されていない炎症性腸疾患の特徴である。ここでは、生体内での粘膜透過性および白血球の採用を研究するために、十分に血管化され、外装された腸セグメントを採用したマウス腸管ループモデルについて述べている。
Abstract
腸粘膜は、単一の上皮細胞層が並び、光細菌や外因性物質の通過を防ぎながら、栄養素や水の超細胞輸送を可能にする動的バリアを形成する。この層の違反は、発光内容物への透過性の増加と免疫細胞の募集をもたらし、どちらも炎症性腸疾患(IBD)を含む腸内の病理学的状態の特徴である。
多形核好中球(PMN)の上皮バリア機能と経上皮移行(TEpM)を調節するメカニズムは、定量的分析を可能にするインビボ法の実験不足のために不完全に理解されている。ここでは、腸管または近位結腸の外形化された腸管セグメントを採用した堅牢なマウス実験モデルについて説明する。外装された腸ループ(iLoop)は完全に血管化され、上皮細胞単層間の透過性およびPMNの移動を研究するために一般的に使用されるex vivoチャンバーベースのアプローチよりも生理学的な利点を提供する。
我々は、このモデルの2つの用途を詳細に示す:(1)内環注入後の血清中の蛍光標識デックストランスの検出による腸透過性の定量測定、(2)化学誘引剤の侵入導入後に腸上皮を越えて腸内腔に移行したPMNの定量的評価。我々は、このモデルの実現可能性を実証し、コントロールと比較して上皮タイト接合関連タンパク質JAM-Aを欠くマウスにおけるiLoopを利用した結果を提供する。JAM-Aは、炎症反応中に上皮バリア機能とPMN TEpMを調節することが示されている。iLoopを用いた我々の結果は、これまでの研究を裏付け、恒常性および疾患の間に腸透過性およびPMN TEpM in vivoの調節におけるJAM-Aの重要性を強調する。
iLoopモデルは、腸内恒常性および炎症の研究において再現性の高い標準化された方法を提供し、IBDなどの疾患における腸バリア機能および粘膜炎症の理解を著しく高める。
Introduction
腸粘膜は、単層の柱状腸上皮細胞(IEC)、下層の層の層の下層の下層のプロプリア免疫細胞および筋性粘膜を包含する。栄養素の吸収におけるその役割に加えて、腸上皮は、発光コメンサル細菌、病原体、および食事抗原から身体内部を保護する物理的な障壁である。また、IECとラミネラプロプリア免疫細胞は、コンテキストおよび刺激に応じて耐性または応答のいずれかを誘導する免疫応答を調整します。上皮バリアの破壊は、病的粘膜炎症の発症に先行し、潰瘍性大腸炎およびクローン病1、2、3、4、5、6、7の両方を包含する炎症性腸疾患(IBD)に寄与することが報告されている。潰瘍性大腸炎を有する個体は、多形核好中球(PMN)の過剰な経上皮移行(TEpM)を形成し、陰窩膿瘍を形成し、疾患8、9の重症度に関連していた知見である。侵害された上皮バリア機能と過剰な免疫応答はIBDの特徴であるが、腸粘膜への腸透過性および免疫細胞の配置の定量的評価を行う実験的インビボアッセイが不足している。
腸上皮透過性およびPMN TEpMを研究するために用いられる最も一般的な方法は、半透過性多孔膜挿入物10、11、12に培養されたIEC単層を用いたex vivoチャンバーベースのアプローチを採用する。上皮バリア完全性は、エピテリア電気抵抗(TEER)またはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識デキストランの経上皮電気抵抗(TEER)の測定値のいずれかによって監視される。同様に、PMN TEpMは、典型的には、下のチャンバ16に添加される化学誘引剤に応答して研究される。PMNは上部チャンバに置かれ、インキュベーション期間の後、基底コンパートメントに移行したPMNが収集され、定量化される。これらの方法は便利で、実行しやすく、非常に再現性がありますが、明らかに還元的なアプローチであり、必ずしもin vivo条件の正確な反映を表すものではありません。
マウスにおいて、腸内細胞透過性を研究する一般的なアッセイは、FITC-デキストランの経口ギャバジおよびその後の血清中のFITC-デキストランの外観の測定による、13、17である。このアッセイの欠点は、地域の腸管の寄与ではなく、消化管の全体的なバリア完全性の評価を表していることである。また、エバンブルーは、生体内18における血管漏れを評価するために一般的に使用され、また、マウスおよびラット19、20、21における腸粘膜透過性を評価するために採用されている。腸粘膜におけるエバンスブルーの定量化は、一晩ホルムアミドでインキュベーションを採用する組織からの抽出を必要とする。したがって、同じ組織を使用して腸内皮透過性および好中球浸潤を研究することはできない。
ここでは、生体内での大腸粘膜透過性および白血球経上皮移動に関する再現性データを収集するために必要な動物の数を減らす簡単なプロトコルを強調する。したがって、さらなる分析のために収穫できる腸ループの完全性を損なうことなく、血清中で容易に検出できるFITC-dextransの使用をお勧めします。なお、腸連結ループは、細菌感染(サルモネラ菌、リステリア単球遺伝子および大腸菌など)を研究するために様々な種(マウス、ラット、ウサギ、子牛を含む)で使用されてきた22、23、24、25、腸透過性26;しかし、我々の知る限りでは、IBDに一般的に関与する腸内の特定の領域(イリウムや結腸など)におけるPMN TEpMのメカニズムを調査する研究は行っていません。
ここでは、イラミウムまたは近位結腸の良好な血管化および外形化された腸セグメントを採用した堅牢で信頼性の高いマイクロサージカルin vivo法であるマウス腸管ループ(iLoop)モデルについて説明する。iLoopモデルは生理学的に関連しており、麻酔下で生きているマウスの腸バリア完全性およびPMN TEpMの評価を可能にする。2つの用途を実証する:1)iLoop2におけるイントラミン投与後の4kDa FITC-dextranの血清レベルの定量化)強力な基調剤ロイコトリエンB4(LTB4)27の内環注入後のiLoopルーメン中のトランスマイグレーションPMNの定量化。さらに、ILoopモデルを利用して、JAM-a-nullマウスまたはIEC上でJAM-Aの選択的損失を有するマウス(Villin-cre;Jam-a fl/fl)は、コントロールマウスと比較して、腸透過性および好中球の転化15、28、29、30、31に対する緊密な接合関連タンパク質JAM-Aに対する主要な寄与を報告した以前の研究を裏付けることができる。
iLoopモデルは、体外アッセイを裏付ける高機能・生理学的方法です。さらに、これは、ケモカイン、サイトカイン、細菌病原体、毒素、抗体および治療薬を含むループ内腔に注入することができる様々な試薬の研究を可能にする多目的な実験モデルである。
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Protocol
すべての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインと方針に従って行われ、ミシガン大学の施設動物ケア&ユース委員会によって承認されました。
1. 術前準備
注:この方法は、8〜12週齢のC57BL/6遺伝的背景から成体マウスを使用して生成された。すべてのマウスは、通常のチャウと水へのアドリビタムアクセスを伴う厳格な特定の病原体の自由条件下で保たれた。結果は、C57BL/6、ジャム-a -ヌルマウス(Jam-a---)またはIEC上のJAM-Aの選択的損失を持つマウス(Villin-cre;)ジャム・ア・フル/fl)とリッターメイトのジャム・ア・フルは、前述の30を制御します。
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エリア準備
- クリーンな場所で手術を行います。しかし、腸ループモデルは、無菌/無菌技術を必要としない非生存手術である。獣医衛生の実践を観察し、洗浄された外科器具(すなわち、石鹸で洗い流し、水で洗い流し、その後70%エタノールを使用する)を使用してください。
- 温度管理された外科用ボード(または加熱パッド)と調整された光源をオンにして、麻酔や手術中に動物を低体温症から守ります。
- 非吸収性4-0シルク外科縫合糸の6cmセグメントを切断することによって合字を準備する。
- 楕円体の形状に続いて中央にカットされた綿のガーゼ(5cm x 5cm)を用意します。これらは、正中線の腹腔切多をカバーし、外装されたiLoopと動物の毛皮との間の直接接触を防ぐために使用されます。カットガーゼを温かいハンクスのバランスドソルト溶液(HBSS)にペトリ皿容器に浸します。
- 臓器や外装されたiLoopを扱うために使用される暖かいHBSSに浸した湿った綿棒を準備してください。
- 暖かいHBSSで満たされた10 mLのシリンジを準備し、黄色の供給管に取り付けます。この注射器は、手術中に露出した組織を保湿し、便の内容のiLoopを穏やかに洗い流すために使用されます。
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動物の準備
- 承認された動物の議定書に従って動物を麻酔する。このプロトコルでは、イオブルランと酸素の混合は麻酔気化器を介して投与される。メーカーの指示に従って、酸素の流量を1 L/minに調整してください。気化器を5%に設定し、誘導チャンバをプリチャージします。5分後、イオブルラン気化器を2%~2.5%に減らします。
- 3分間から5分間誘導室に動物を入れ、加熱手術板に動物を移し、麻酔の切断プラグを接続します。粘着テープを使用して四肢で動物を上肢の位置に拘束します。
注:麻酔の代替として、ケタミン(80mg / kg - 100 mg/kg)とキシラジン(5mg/kg - 10 mg/kg)の混合物を生理食塩水(0.9%NaCl)で希釈し、腹腔内注射によって管理することができます。麻酔は、麻酔深さを確保するために、ケタミン/キシラジン(初期用量の0.1〜0.25回)の筋肉内投与によって手術中に維持されるべきである。可能であれば、イオフルラン麻酔気化器は、より良い再現性、生存性を保証し、動物の痛みを防ぐために強くお勧めします。 - 角膜乾燥を防ぐために、両眼に眼科軟膏を塗布する。
- 心拍数(約500拍/分)とリズム、粘膜色(ピンク)、毛細血管補充時間(<2 s)、呼吸数(40〜60呼吸/分未満)、および温度(36.5°C)32を含む身体検査を行う。
- 次のステップに進む前に、ペダルの引き出し反射によって麻酔深さを評価します。つま先やつま先パッドの間の皮膚の痛みを伴う刺激(ピンチ)を採用する。マウスは足を収縮して取り外すことで反応します。このペダル反射は動物が深く麻酔されると消えます。
注:麻酔中のバイタルとペダル反射のモニタリングは、麻酔を通じて少なくとも15分ごとに推奨されます。血の灌流または呼吸困難の減少を示すとして、通常と淡いまたは青としてピンク色;(b)呼吸パターンを規則的な呼吸対不規則呼吸として評価する。直腸温度プローブ、げっ歯類のオキシメーター、心拍数モニターをそれぞれ体温、心拍数、呼吸数の評価に使用できます。
2. 回腸ループの生成
- 皮膚の準備:70%エタノールを浸したアルコール綿棒またはガーゼスポンジで腹部中線の毛皮をスクラブ。低体温症を防ぐために、アルコールで毛皮の広い範囲を濡らないでください。
- はさみを使用して、中線の腹腔切多を行います。腹部の真ん中(長さ約2cm)に垂直切開を行い、腹腔を露出させる。腹腔内の臓器を傷つけないように注意してください。
- 露出した腹腔の上にプレカットウェットコットンガーゼを置きます。
- 濡れた綿棒を使用して、カエカムを動員し、外装します。湿った綿のガーゼに慎重にケオカムを置きます。
注:Caecumは、動物の性別とは無関係に大多数のマウスの腹腔の左尾口象限に局在する。 - 湿った綿棒を使用して、端末部(遠位端)がカエカムに取り付けられている回腸を動員し、穏やかに外装する(図1B)。
- 腸間膜血管と血液供給の中断なしに湿った綿ガーゼに少なくとも6cmの末端の回腸を展開する。出血がなく、組織がピンク色を維持している場合、血液供給が維持される(図1B)。
注:黄色の送り管に取り付けられた10 mLの注射器を使用して、常に組織を保ち、暖かいHBSS(2〜3分ごと)で組織を湿らせた状態に保ち、露出した組織の乾燥を避けてください(ステップ1.1.6)。 - ケカムの近くで、腸間膜の回腸を供給する主要な動脈を特定する。次に、重要な血管のない腸間腸内の2つのライゲーション部位を見つけます。
- 鈍い組織鉗子を使用して、末端の回腸(caecumに最も近い)をしっかりとつかみ、細かい先端鉗子を使用して、血管を避ける腸間腸をフェンレストする。穿穿片を横切ってシルク縫合糸を配置し、外科結び目を結んで最初の結紮(ループの遠位端)を作成します。
- ルーラーを使用して、第 1 合字から 4 cm 離れた位置を測定し、ステップ 2.8 (図 1C)で説明したように、第 2 合字 (ループの近位の端) を作成します。
- 細かいはさみで慎重に4cmの回腸ループを分離するために各ライゲーションの隣にカットし、無傷の血液供給および腸間膜を保つ。
注:iLoopの外装されたセグメントの両端を切断し、照明内容物(便体)との干渉を防ぐ必要なステップとして穏やかに洗い流し、分離されたセグメントの全長にわたってFITC-dextransまたは化学戦術刺激の分散を促進し、流量細胞量による白血球のより正確な定量化を可能にする。この手順はまた、試薬の指定された量の注入後の粘膜の均一な縮裂および動物間のより良い再現性を可能にする。 - 10 mLシリンジに取り付けられた柔軟な黄色の給紙チューブを使用して、イレラルループセグメントの内容をウォームHBSSで静かに洗い流します(ステップ1.1.6を参照)。
- シルク縫合糸を使用して、フラッシュされたIlealループの2つのカットエンドをリゲートします。
- 30G針の1mLシリンジを使用して、FITC-デックストランス(ステップ4.2)またはケモカイン(ステップ5.3)などの試薬を腸内腔にゆっくりと250μL注入します。回腸ループが膨張し、粘膜の適度な膨張を引き起こす(図1D)。
注:腸間膜動脈の反対側のループルーメンに試薬を注入します。血管を引き裂いて出血を誘発しないように注射しながら、動物から回腸を引き出さないように注意してください。 - 湿った綿棒を使用して、穏やかに回腸ループ、近位回腸およびカエカムを戻す。
- 針ホルダー、解剖学的鉗子、3.0非吸収性シルク縫合糸を逆切断針で使用して、腹壁を閉じます。
- インキュベーション期間の温度調節麻酔室に動物を置きます。
3. 近位コロンループ(pcLoop)の生成
注: pcLoop の生成に使用されたマウスの詳細については、プロトコルの冒頭で提供されている情報を参照してください。
- 手順 2.1 を実行します。- 2.4.イレラルループについては、前述のように。
- 湿った綿棒を使用して、回腸全体を外装し、湿った綿のガーゼの上に置きます。近位結腸とメソコロンに位置する血液供給を特定します。近位結腸を動員し、細かい先端鉗子を使用して、カエカムから約0.5cm遠位の中コロンの血管のない領域に最初の合字を作成する(図2B)。
- 第1合字から2cmを測定し、メソコロンの血液供給のない領域で第2の合字を作成する(図2C)。
- 細かいはさみを使用して慎重に2cm長いpcLoopを分離するために、各ライゲーションの隣にカット。
注:ステップ2.10の下のノートで述べたように、両端を切断して、発光内容を静かに洗浄するpcLoopを分離することが重要です。小さな血管が腸内腔に出血するのを防ぐために、大腸組織とメソコロンを慎重に切断する。必要に応じて、熱焼灼を使用して、切開部位の出血を制限します。 - pcLoopを温かいHBSSで静かに洗い流し、10 mLシリンジに取り付けられた柔軟な黄色の給餌管を使用して便を取り除きます(ステップ1.1.6を参照)。
- シルク縫合糸を使用して、フラッシュされたpcLoopの2つのカットエンドをリゲートします。
- 30G針の1mLシリンジを使用して、FITC-デックストランス(ステップ4.2)またはケモカイン(ステップ5.3)などの試薬を腸内腔にゆっくりと200 μL注入します。pcLoopは、粘膜の適度な膨張を引き起こす膨張する(図2D)。
注:腸間膜動脈の反対側にあるpcLoopルーメンに試薬を注入してください。動物間の一貫性を確保し、粘膜の等しい崩壊を確実にするために2cm長いpcLoopを作成します。 - 湿った綿棒を利用して、結紮されたpcLoop、ileum、およびcaecumを腹腔に静かに戻します。
- 針ホルダー、解剖学的鉗子、3.0非吸収性シルク縫合糸を逆切断針で使用して、腹壁を閉じます。
- インキュベーション期間の温度調節麻酔室に動物を置きます。
4. 腸透過性の定量的評価:4kDa FITC-dextranアッセイ
- イレラルループまたはpcLoopを実行します(上記の通りです)。
- 30 G針を用いた1 mLシリンジを使用して、腸管腔に250 μL(イリウム - ステップ2.13)または200 μL(コロン - ステップ3.7)の4 kDa FITCデキストラン溶液(HBSSで1mg / mL)を注入します。未使用のFITC-デキストラン溶液を光から保護し、血清採取後に標準曲線を調製します。
- ileal ループの場合、pcLoop ステップ 3.8 ~ 3.10 の手順 2.14 ~ 2.16 に従います。簡単に言えば、臓器とiLoopを腹腔に戻し、腹壁を閉じる。
- 加熱麻酔室に動物を120分間置きます。
- インキュベーション期間が腹壁を開いた後、心臓へのアクセスを得て、血液を収集するために25G針で1mL注射器を使用して心臓穿刺を行う。血液を1.3mLの血清凝固活性化管に移し、穏やかに混ぜ、氷の上で光から保護します。マウス1個につき少なくとも500μLの血液を採取する。
注:動物は、切断や頸椎脱臼などの物理的方法を使用して麻酔下にあるときに安楽死させられ、承認された動物プロトコルに従って安楽死させます。 - 遠心分離機血清凝固活性化管は、メーカーの推奨に従って室温で10,000 x g で5分間の冷却凝固管。血清(上清)を収集し、1.7 mL遠心分離チューブに移します。氷の上にチューブを保ち、光から保護します。
- 血清中蛍光の定量
- コントロールマウスの血清中にFITC-デキストラン4 kDaの標準曲線を調製します(生理液またはHBSSは有効な代替手段です)。開始濃度が 1 mg/mL FITC デキストランで 2 倍の連続希釈を作成します。測定されるFITC-dextran 4 kDaの濃度は0.25 mg/mLおよび2 μg/mLの間の範囲である。
- サンプルと標準の等容積を黒い96ウェルプレート(平底)に移し、蛍光プレートリーダー(励起490 nm、放出520nm)でFITCを測定し、製造業者の指示および公表されたプロトコル33に従う。実験制御群に正規化したフォールド変化として、標準曲線または存在透過率値に基づいてFITC濃度を計算する。
5. ケモカインによる内腔刺激後の腸管腔への移行PMNの定量的評価
注:PMNはベースラインレベルで腸粘膜に存在する非常に少数です。炎症を起こすサイトカインを有する動物の前処理は、血流から腸粘膜へのPMNの採用を促進する炎症性環境をもたらす。
- 30G針を用いた1mLシリンジを用いて、200μLのリン酸緩衝塩水(PBS)において、100ngの腫瘍壊死因子-α(TNFα)および100ngのインターフェロンγ(INFγ)の無菌溶液の腹腔内注射(即ち)を行う。
- 4〜24時間の前処理を炎症性サイトカインで行った後、イレラルループまたはpcLoop(上記のとおり)を行う。
- 30 G針の1 mLシリンジを使用して、HBSSで250 μL(イリウム - ステップ2.13)または200 μL(コロン - ステップ3.7)の化学誘引性溶液の腸管腔に注入します。
注意:ロイコトリエンB4(LTB4)はPMNのための強力な化学誘引剤としてこのプロトコルで使用されています。N-フォルミルメチオニル-ロイシルフェニルアラニン(fMLF)またはケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド1(CXCL1/KC)などの他の化学誘引物質も、大腸腔30へのPMNの有意な動員を誘導するために使用することができる。 - イレラルループの場合、手順2.14~2.16を実行します。pcLoop の場合は、手順 3.8 ~ 3.10 に従います。簡単に言えば、臓器とiLoopを腹腔に戻し、腹壁を閉じる。
- 加熱麻酔室に動物を60分間置きます。
- 腸ループの内容のコレクション
- 溶液を準備し、氷の上に保存する:回腸およびpcLoopのために、カルシウムおよびマグネシウムなしで無菌PBSで2mMエチレンジアミンテアセ酢酸(EDTA)、5 mMジチオスライト(DTT)および2%FBSを含む洗浄バッファーを準備する。
- インキュベーション期間後および麻酔の維持下で、腹壁を開き、iLoop(イレラルループまたはpcLoop)を引き出す。麻酔下にある場合は、切断や頸椎脱臼などの物理的方法を使用し、承認された動物プロトコルに従って動物を安楽死させます。
- 冷たいPBSでループをすすぎ、残留血液汚染物質を除去し、組織拭き取りで過剰なPBSを吸収する。ループの内容物を1.7 mL遠心管(イレラルループでは約250 μL、pcLoopでは200 μL)に慎重に回収します。500 μL のコールドウォッシュバッファでループを洗い流し、収集直後にチューブを氷の上に置きます。
注:DTTは粘液を溶解するのに役立ちます。iLoopの発光含有量が非常に粘性である場合(マウスの遺伝的背景に依存して)、DTTを含む洗浄バッファーで1:2または1:3を希釈します。 - セルストレーナーキャップ付きの5 mLラウンドボトムチューブを使用して、35 μmナイロンメッシュフィルターを通して、発光含有量溶液を渡します。このステップは、組織断片および細胞凝集体を除去するのに役立ちます。1 mLの洗浄バッファーで細胞ストレーナーを洗い流します。
- 遠心管400xgで5°Cで5分間。 上清を捨て、500 μL - 1 mL洗浄バッファーでペレットをすすいで、400 x gで遠心分離機を5分間、4°Cで廃棄します。
- カルシウムおよびマグネシウムを含まない滅菌PBSで2%FBSを含む200 μLのフローサイトメトリーバッファー(FCB)でiLoop発光細胞ペレットを再懸濁する。細胞は、チューブに保持したり、フローサイトメトリー染色および分析のために96ウェルラウンドボトムプレートに移すことができます。
- フローサイトメトリー染色と分析
- 補償コントロール:白血球
- 滅菌0.5 M EDTA(pH 8.0)であらかじめ充填された25G針で1mLの注射器を準備します。予想血液量あたり10%EDTA(1mL血液のEDTAの100 μL)。
- 心臓穿刺によって麻酔下で血液を収集する。血液を1.7mLチューブに移し、400xgで遠心分離機を10分間、4°Cに移します。
注:マウスが麻酔下にある間、承認された動物のプロトコル(子宮頸部脱臼など)に従って死亡を確認するために物理的な方法を使用します。 - 上清を吸引する。赤血球のリシスのためのアンモニウム-塩化カリウム(ACK)リシスバッファーの1 mLでペレットを再懸濁します。氷の上で3分間-5分間インキュベート。遠心分離機 400 x g 5分間、4 °C ペレットが赤い場合は、ペレットが白くなるまでこのACKのリシスバッファーステップを繰り返します。
- ペレットを1 mL FCBに再懸濁し、プレート0.5 x 106~ 1 x 106 の細胞をウェルあたりに再懸濁します。96ウェルの丸底プレートの5つの井戸を準備します。プレートを氷の上に置きます。
注: ループの明るさの内容を含む同じ 96 ウェル プレートを使用してください(ステップ 5.6.6 を参照)。
- フローサイトメトリー染色
- 96ウェルプレートを400xg、4°Cで5分間遠心します。 上清を捨てて、50 μLの精製ラットアンチマウスCD16/CD32をFcブロック(FCBの100 μLあたり1μg)としてペレットを再懸濁します。5分間-氷の上で10分のインキュベート。
- iLoop発光含有量の免疫染色:フルオロクロム共役抗体(FCBにおける1:50希釈)を含む混合物を調製する:抗CD45-PerCP、抗CD11b-PEおよび抗Ly-6G-アレクサフルオール647。100 μL の最終ボリュームに対して、ウェルごとに 50 μL の組み合わせを追加します。
- 補償のための白血球の免疫染色(FCBにおける1:50希釈):FCBの50 μLを単独で使用(未染色サンプル、ウェル1)、各個々のフルオロクロム共役抗体の50 μL(ウェル2-4、全てのフルオロクロム共役抗体の組み合わせの50 μL)100 μLの最終容積。
- プレートを光から保護された氷の上で30分間インキュベートします。
- 400 x g、4°Cでプレートを5分間遠心します。 上清を捨て、200μLのFCBで洗います。この洗浄手順を2回繰り返します。
- 血液サンプルにFCB 150 μL/ウェルを加えます。
- iLoopの発光コンテンツサンプルに100 μL/well FCBを加えます。その後、蛍光計数ビーズの50 μL/ウェル。
- フローサイトメトリー解析
- CD45ポジティブイベントのためのゲートとLy-6G-/Gr-1とCD11b30の表現のための。
- 停止条件としてサンプルボリュームの100 μLを使用します。
- 蛍光計数ビーズのメーカーから提供された情報に従って、iLoopルーメンに移行したPMNの絶対数を計算します。
注: データは、(1) ルーメンの PMN の総数30,34,35,(2) 組織のグラムあたりの PMN 数と (3) 円柱の体積に関する式を使用してミリメートルあたりの PMN の数: V= π(pi) r 2 h (体積の場合は V、半径、高さ h) として表示されます。
- 補償コントロール:白血球
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Representative Results
イレラル ループモデルと pcLoop モデルの概略図を図1と図 2にそれぞれ示します。解剖学的写真は、腸管セグメントの外装を含む手順の重要なステップを示す(図1Bおよび図2B)、血液供給の妨害を最小限に抑える結紮の適切な位置の同定(図1Cおよび図2C)、洗浄後に試薬溶液で満たすことができるiLoopの切り口の結紮(図1Dおよび図2D))。重要なことに、iLoopモデルは、重要な血液供給を維持し、FITC-デックストランスまたは強力なPMN化学誘引剤LTB4などの応用試薬の生理学的吸収を可能にする。アッセイの最後に、iLoopを膨張させ(図1Dおよび図2Dに示す)、通常の粘膜灌流を明赤色の腸間膜血管で表示する必要があります。アッセイに応じて、血液を採取して血清中またはiLoop発光内容物中のFITC-dextranを測定し、動物を安楽死させる前にPMN TEpMの定量化のために処理する。
腸透過性評価のためのiLoopモデルの精度を検証するために、FITC-dextran pcLoopアッセイを実施し、生体内における腸バリア機能の調節におけるTJ関連タンパク質JAM-Aの役割を評価した。なお、JAM-A欠乏症は、vitro28および生体内での経口ギャージの後に上皮性腸透過性の増加を招くという報告がある。本明細書において、pcLoopモデルを用いて、4kDaFITC-デキストラン血清レベルの2.5倍の増加を制御(Jam-a++)と比較してジャム-ヌルマウス(Jam-a--)で定量した(図3A)30。さらに同様の結果が、IPC上でJAM-Aの選択的損失を有するマウス(Villin-cre;)ジャム・ア・フ・フ)とリッターメートコントロール(ジャム・ア・フ・フ)(図3B)30.したがって、pcLoopモデルは、JAM-Aの腸バリア機能への肯定的な寄与を報告した以前の研究を裏付けることができた。
次に、腸粘膜へのPMNの採用と、その後のTEpM in vivoのPCLoopモデルを用いた。図4Aに示すように、pcLoopの発光含有量におけるPMNの数をフローサイトメトリー解析により定量した。PMNは、細胞表面メーカーCD45、CD11bおよびLy6G36の各セルに陽性細胞として定義した。循環白血球は、ゲージ戦略のための肯定的なコントロールとして使用された。予想通り、pcLoopと同様の近位結腸のセグメントに存在するPMNの数は、生理学的条件下で低かった(図4B)。手術前に炎症性サイトカインTNFαおよびIFNγを用いた前処理は、pcLoopルーメンに募集されたPMNの増加数をもたらした。PMN化学誘引性LTB4の投与は、LTB4依存PMN採用を支持するPMN数の劇的な増加につながった(図4B)。大腸粘膜におけるPMNの免疫染色は、LTB4を伴わないサイトカイン処理と比較した場合のサイトカインおよびLTB4による刺激後のPMNの上昇の採用を裏付ける(図4C)30。PCLoopモデルは、VILLin-creを用いてJAM-AのPMN TEpMへの貢献を研究するために採用されました。ジャム・ア・フル/flマウス。上皮JAM-Aの喪失は、リッターメートコントロールと比較して大腸内腔内の転生PMNの数を減少させた(図4D)30.これらの知見は、JAM-Aが腸上皮を横断するPMN移行を促進する役割を強く支持し、炎症の様々なモデルにおける血管内皮間のPMN移行におけるJAM-Aの関与を報告した研究に補完的な洞察を提供する31、37、38。
図1: 回腸ループモデル (A) イレアル ループ モデルの概略図。中央値の腹腔内術は麻酔下のマウスで行われ、温度調節された外科用基板に置かれる。(B) カエカム(*)、腸内および腸間性の外装。ライゲーションに適した2つの部位が同定される(1,2)。(C)4 cmの長さのセグメントを分離する:第1合字(1)は、イレオ・ケーカル接合部の近くに配置され、第2合字(2)は第1合字から4cm離れたところに配置される。(D)2つの小さな切開部が腸間膜(1,2)で作られ、長さ4cmのイレラルループを作り出す。カットエンドの発光含有量およびライゲーションを除去した後、蛍光マーカーおよび化学誘引剤などの試薬を内腔に注入することができる。回腸ループは、十分に血管化されている(黒い矢印)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 近位コロンループモデル( A)pcLoopモデルの概略図中央値の腹腔内術は、温度制御された手術盤に置かれた麻酔下のマウスに対して行われる。(B) カエカムの外装 (*), 近位コロン, メソコロンと回腸.ライゲーションに適した2つの部位が同定される(1,2)。(C)第1合字(1)は、カイカムの近くに配置され、第2合字(2)は第1合字から2cmより遠位に置かれる。(D)pcLoopは外装され、発光含有量を洗浄し、蛍光マーカーや化学誘引物質などの試薬で膨らませる。pcLoopは、近位結腸の十分に血管化された2cmセグメントである(黒い矢印は血液供給を示す)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:JAM-Aは生体内の腸透過性を調節する。(A)JAM-A欠乏症(Jam-a---)は、4kDa FITC-dextranに大腸透過性を増加させた。ジャム-a-/-(13 倍の動物;黒い点)は、ジャム-a+/+ コントロール(12倍の動物;白い点)と比較した。4 kDa FITC デキストラン (1 mg/mL) HBSS で pcLoop ルーメンに注入されました。蛍光は、120分インキュベーション期間後に血清中で測定した。データは SEM ±手段として表現されます。n = 3独立した実験。****P < 0.0001;マンホイットニーUテスト。(B)ヴィリン・クレにおける4kDa FITC-dextranへの大腸透過性の増加;コントロール(ジャム・ア・フル/fl、12倍の動物、白い点)と比較してジャム・ア・フル(18倍の動物、黒い点)。データは SEM ±手段です。n = 4独立した実験。****P < 0.0001;マンホイットニーUテスト。この図は、フレミングS、ルイシントACら30から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:JAM-Aは、PCLoopのルーメンへのPMNのLTB4依存的な採用を促進する。(A) 蛍光計数ビーズによるフローサイトメトリーによる発光量PMN(CD45+、CD11b+、Ly-6G/Gr1+細胞)を定量化する測定戦略。血液サンプルからの白血球は、血液の戦略のための肯定的な対照として使用された。(B) サイトカイン後のpcLoopルーメンに採用されたPMNの数 (TNFα+IFNγ, 各100ng各) 処置 (10x 動物; 白点) またはサイトカインと 1 nM LTB4 (10x 動物; 黒点) の組み合わせ後。黒い正方形は、炎症性サイトカインおよびLTB4(9x動物)による手術または治療を受けていないpcLoopと同じ長さの無傷の大腸セグメントで評価されたベースラインにおけるPMNの数を表す。データはSEM±(n =3の独立した実験)、ダンの多重比較テストを用いるクルスカル・ウォリス検定の平均値である。*P < 0.05, ****P < 0.0001.(C)サイトカイン単独で処置した後のpcLoop上皮中のPMN(抗Ly6G/Gr1抗体)の免疫ヒストリカル染色(左パネル、TNFα+IFNγ)またはサイトカインとLTB4(右パネル)の組み合わせ。PCLoopで募集されるPMNの数は、LTB4(黒矢印)の存在下で増加します。スケールバー:100μm(D)ヴィリンクレのpcLoopルーメンに募集されたPMNの数。ジャム・ア・フル/flマウス(11x動物;黒点)は、1nM LTB 4に応答してジャム・ア・fl/flマウス(10x動物;白点)と比較した。データは SEM ±手段です。n = 3独立した実験。*P < 0.05;2尾の学生のtテスト。この図は、フレミングS、ルイシントACら30から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
IBDなどの病理的条件下での腸バリア機能の調節障害や免疫細胞の形成を担う機構は不完全に理解されている。ここでは、腸管または近位結腸の血管化された外形性腸セグメントを採用し、腸の透過性、好中球移動研究、ならびに他の用途の評価を可能にする、堅牢なin vivoマウスモデルについて詳述する。
iLoopは生きている動物に対して行われる非回復手術である。麻酔は実験の過程で継続的に監視する必要があり、沈下深度の評価は必須です。最も重要なステップは、(1)iLoopの単離、(2)切り端の結紮、(3)試薬溶液のイントラミラル注入によるiLoopのインフレーションを含む。これらの各ステップでは、出血が起こり、iLoopの血液供給が損なわれ、結果の精度に影響を与える。注意すべきは、PMN TEpMアッセイ中のイントラミン性出血のまれな例では、ここで提示されるフローサイトメトリー測定戦略は、血流から直接発生するPMN(非移行PMN)から移行したPMNを区別するのに役立ちます。iLoopルーメンに集められたトランスマイグレートPMNは、循環PMNと比較して高レベルの表面マーカーCD11b10を発現する(図4D)。
iLoopは、腸内腔への腸透過性および血液PMNの移行の定量的分析を可能にすることを考えると、吸収粘膜領域および血液供給の大きさを標準化することが重要である。動物間の一貫性を確保するためには、腸管セグメントの正しい長さが外装することが不可欠です。iLoopは、回腸ループ用の4cm、pcLoop用の2cmで、同等の血液供給によって浸透する必要があります。これらのパラメータの不整合はまた、試薬の内環注入後にiLoopの不均一なディステンションをもたらし、実験群間および実験群間の変動性を増強する。さらに、iLoopの過剰な崩壊を避けるために、250 μL以下の試薬溶液を、それぞれ回腸ループ用のルーメンに注入し、pcLoopに対して200 μLを注入することを推奨します。
手順の性質に固有のいくつかの制限があります。iLoopは生きている動物に対して行われる非回復手術である。これは技術的に困難な微小外科的方法です。しかし、人は練習を通して外科技能を身に付けることができる。手術の平均期間は短くする必要があります(最大15分)。腸の透過性を測定するための理想的なインキュベーション時間として120分、PMN TEpMの場合は60分を推奨します。インキュベーション時間は短縮できますが、延長されたタイムポイントは麻酔下で動物の全体的な炎症状態に影響を与える可能性があります。また、外科的処置の開始からサンプル採取/分析までのプロトコルは一時停止することができない。
このiLoopモデルは、既存の方法に関して重要な利点を提示する:(1)iLoopは完全に血管化され、より生理学的に関連しており、(2)全体的な胃腸管の完全性を評価し、胃腸運動性13に依存する経口gavage法とは対照的に、iLoopは腸内の特定の局所領域(末端回腸または近位結腸)の特性を研究することを可能にする (3)iLoopは、PMN TEpMを腸内腔内に定量的に研究し、また、ラミナプロプリアおよび上皮派を含む腸粘膜の他の部分を定量的に研究することを可能にする初のインビボモデルである。高対低分子量のFITC標識デックストランス(4~150kDa)を採用して、腸の炎症を含むノックアウト/ノックインマウスまたは様々な実験モデルにおける上皮バリア欠陥のサイズ選択性および/または重症度の両方を評価することが可能である。さらにFITC標識デックストランスは、肝臓39などの他の器官で定量化することも、または腸肝および腸脳軸40,41,42における腸透過性の役割に関する洞察を提供する血液脳関門の研究のための新規アプローチとして定量することができる。さらに、この方法は、2つのループを並行して(同じ動物の中で回腸ループとpcLoop)実行し、腸内の異なる領域のバリア特性の分析のために2つの異なる蛍光標識プローブを植え付ける可能性を提供する。同様の線に沿って、並行して2つのループの生成を使用して、同じ試薬に応答して免疫細胞の採用における差異または類似性について、結腸との間でのイリウムを特異的に評価することができる。
ここでは、JAM-a-nullマウスまたはIEC上のJAM-Aの選択的損失を有するマウスを含むpcLoopを使用して(Villin-cre;Jam-a fl/fl)は、腸透過性およびPMN TEpMにおけるTJ関連タンパク質JAM-Aの肯定的な役割を報告した以前の研究からの知見を裏付ける。iLoopの用途は、抗体、微生物病原体および治療薬30、34、35を含む様々な試薬に拡大することができる。LTB 4(336.5 Da)を使用してPMN TEpMをモデル化した場合、強力で生理学的PMNの化学誘引物質であり、生理学的範囲で低濃度(1nM)でTEpMを誘導する能力を有しています。 しかし、当社のループモデルは、他の関連する化学誘引物質に適応可能です。我々は、細菌ペプチドN-ホルミル-メチオニル-ロイシルフェニルアラニン(fMLF)を使用して、大腸腔内へのPMNの有意な採用を誘導することを報告した。fMLF(437.5 Da)は、効果を発揮するためにはるかに高い濃度を必要とするマウスの低い親和性化学誘引剤である(1μM)。このモデルはCXCL1/KC、我々が正常に使用しているもう一つの強力な生理学的化学誘引剤の使用のために適応可能であるが、CXCL1/KCは高価であり、比較的大きい分子(11 kDa)は上皮障壁を越える効率が低い。また、化学誘引剤LTB4の前投与でループ内腔に注入された白血球特異的インテグリンCD11b/CD18(αMβ2)に対する中和抗体は、インビトロ研究10、30、35からPMN TEpMの腐食結果を減少させたことを実証した。さらに、PCLoopは最近、PMN TEpM43の速度を制御するPMN対上皮グリカンの効果を研究するために採用された。試薬は、化学誘引剤LTB4の前投与pcLoopルーメンに注入された。したがって、広い範囲のアプリケーションを使用すると、iLoopはインビトロアッセイを介して得られた所見を補完し、確認することができます。合字型腸ループは、他の人が細菌感染(サルモネラ菌、L.モノサイトゲネス、大腸菌など)を研究するためにも使用されてきたので、このiLoopモデルの適応性の容易さは、これらの研究にも使用できると考えています。
炎症促進免疫メディエーターによる治療後、iLoopは腸内炎症の急性モデルとして使用することができる。さらに、iLoopは、腸透過性の増加と、内皮病原体への曝露後の免疫細胞のリクルートまたは慢性炎症性実験モデルとの関連を解明する研究を可能にし得る。なお、最近、高用量の炎症性サイトカインTNFαおよびIFNγ(それぞれ1mg)の腸内細胞透過性に応答して、低用量サイトカイン(各100ng)と比較してLTB4に応答してPCLoop内腔へのPMN採用が強化されたことをpcLoopモデルを採用して観察した。興味深いことに、ここでJam-a欠乏症に二次的な上皮透過性の増加は、PMN TEpMの強化につながらなかったが、それを減少させたことを示す。これらの結果は、腸内細胞透過性がPMN TEpMの速度に影響を及ぼすことを示唆しているが、相関関係は直接的ではなく、上皮バリア機能および白血球移動の両方において重要な役割を果たす接着分子(JAM−Aに類似)の発現などの要因に依存する。腸上皮による免疫細胞応答の微調整や、炎症性腸疾患などの病的粘膜炎症への寄与を調べるには、今後の研究が必要である。
結論として、iLoopモデルは、腸の炎症およびIBDの調節の基礎となるメカニズムの理解に大きく役立つ腸透過性およびPMN TEpM in vivoの評価のための既存のアプローチに大きな改善をもたらす。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ヴュルツブルク大学のスヴェン・フレミング博士が、近位大腸ループモデルの確立に貢献した、マウスコロニーの管理にショーン・ワトソン、iLoopモデルの写真の入手を支援してくれたチトラ・K・ムラリードハランに感謝する。この研究は、ドイツ研究財団/DFG(BO 5776/2-1)からKB、R01DK079392、R01DK072564、R01DK061379からC.A.P.に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
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