Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Düzensiz bağırsak epitel bariyer fonksiyonu ve immün yanıtlar, fizyolojik modellerin eksikliği nedeniyle kötü araştırılmaya devam eden enflamatuar bağırsak hastalığının ayırt edici özellikleridir. Burada, mukozal geçirgenliği ve lökosit işe alımını vivo olarak incelemek için iyi vaskülerleştirilmiş ve dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanan bir fare bağırsak döngüsü modelini tarif ediyoruz.

Abstract

Bağırsak mukozası, luminal bakterilerin ve eksojen maddelerin geçişini önlerken besinlerin ve suyun paraselüller taşınmasına izin veren dinamik bir bariyer oluşturan tek bir epitel hücre tabakası ile kaplıdır. Bu tabakanın ihlali, her ikisi de inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) da dahil olmak üzere bağırsaktaki patolojik durumların ayırt edici özellikleri olan ışık içeriğine geçirgenliğin artmasına ve bağışıklık hücrelerinin işe alınmasına neden olur.

Polimorfonuklear nötrofillerin (PMN) epitel bariyer fonksiyonunu ve transepithelial göçlerini (TEpM) düzenleyen mekanizmalar, nicel analizlere izin eden deneysel in vivo yöntemlerin eksikliği nedeniyle eksik anlaşılmaktadır. Burada, ileum veya proksimal kolonun dışlanmış bir bağırsak segmentini kullanan sağlam bir murine deneysel modelini tarif ediyoruz. Dışsallaştırılmış bağırsak döngüsü (iLoop) tamamen damarlıdır ve epitel hücre monolayerleri arasında geçirgenlik ve PMN göçünü incelemek için yaygın olarak kullanılan ex vivo oda bazlı yaklaşımlara göre fizyolojik avantajlar sunar.

Bu modelin iki uygulamasını ayrıntılı olarak gösteriyoruz: (1) intralüminal enjeksiyondan sonra serumda floresan etiketli dekstransın tespiti yoluyla bağırsak geçirgenliğinin nicel ölçümü, (2) böbrek içi kemoattratantların intralüminal girişinden sonra bağırsak lümenine göç eden PMN'nin nicel değerlendirmesi. Bu modelin fizibilitesini gösteriyoruz ve kontrollere kıyasla epitel sıkı kavşakla ilişkili protein JAM-A'dan yoksun farelerde iLoop'u kullanarak sonuçlar sağlıyoruz. JAM-A'nın enflamatuar yanıtlar sırasında PMN TEpM'nin yanı sıra epitel bariyer fonksiyonunu da düzenlediği gösterilmiştir. iLoop'u kullanan sonuçlarımız önceki çalışmaları doğrular ve homeostaz ve hastalık sırasında bağırsak geçirgenliğinin düzenlenmesinde JAM-A'nın ve in vivo PMN TEpM'nin önemini vurgular.

iLoop modeli, bağırsak homeostazı ve iltihabının tekrarlanabilir in vivo çalışmaları için son derece standartlaştırılmış bir yöntem sağlar ve IBD gibi hastalıklarda bağırsak bariyeri fonksiyonu ve mukozal inflamasyonun anlaşılmasını önemli ölçüde artıracaktır.

Introduction

Bağırsak mukozası, tek bir sütunlu bağırsak epitel hücrelerini (IECs), alttaki lamina propria bağışıklık hücrelerini ve kas mukozasını kapsar. Bağırsak epitel, besinlerin emiliminde rolünün yanı sıra, vücut içini ışıksal kommensal bakterilerden, patojenlerden ve diyet antijenlerinden koruyan fiziksel bir bariyerdir. Ek olarak, IEC'ler ve lamina propria immün hücreleri, bağlam ve uyaranlara bağlı olarak tolerans veya yanıt indükleyen immün yanıtı koordine edin. Epitel bariyerinin bozulmasının patolojik mukozal inflamasyonun başlangıcından önce gelebileceği ve hem ülseratif kolit hem de Crohn hastalığı 1 ,2 ,3,4,5,6,7'yi kapsayan enflamatuar bağırsak hastalığına (IBD) katkıda bulunabileceği bildirilmiştir. Ülseratif kolitli bireyler, kript apseleri oluşturan polimorfonuklear nötrofillerin (PMN) aşırı transepithelial göçünü (TEpM) sunar, hastalığın şiddeti ile ilişkili bir bulgu8,9. Her ne kadar tehlikeye atılmış epitel bariyer fonksiyonu ve aşırı immün yanıtlar IBD'nin ayırt edici özellikleri olsa da, bağırsak geçirgenliği ve bağırsak mukozasına bağışıklık hücresi alımının nicel değerlendirmelerini yapmak için deneysel in vivo testlerin eksikliği vardır.

Bağırsak epitel geçirgenliğini ve PMN TEpM'yi incelemek için kullanılan en yaygın yöntemler, yarı geçirgen gözenekli membran ekler10 , 11,12üzerinde kültürlenmiş IEC monolayerlerini kullanarak ex vivo oda bazlı yaklaşımlar kullanmaktadır. Epitel bariyer bütünlüğü, transepithelial elektrik direnci (TEER) ölçümleri veya Floresan izotiyosiyanat (FITC) etiketli dektranın apikal bölme13, 14,15ölçümleri ile izlenir. Benzer şekilde, PMN TEpM genellikle alt oda16'yaeklenen bir kemoattractant'a yanıt olarak çalışılmıştır. PMN üst bölmeye yerleştirilir ve bir kuluçka döneminden sonra bazal bölmeye taşınan PMN toplanır ve ölçülür. Bu yöntemler yararlı, gerçekleştirilmesi kolay ve çok tekrarlanabilir olsa da, açıkça indirgemeci yaklaşımlardır ve mutlaka in vivo koşulların doğru bir yansımasını temsil etmezler.

Farelerde, bağırsak parasellüler geçirgenliğini incelemek için yaygın bir test, FITC-dektran oral gavage ve daha sonra kan serumunda FITC-dektran görünümünün ölçülmesiile 13,17. Bu testin dezavantajı, bölgesel bağırsak katkılarından ziyade gastrointestinal sistemin genel bariyer bütünlüğünün bir değerlendirmesini temsil ediyor olmasıdır. Ek olarak, Evans mavisi yaygın olarak vasküler sızıntıyı değerlendirmek için kullanılır vivo 18 ve ayrıca fare ve sıçan19 , 20,21'dekibağırsak mukozal geçirgenliğini değerlendirmek içinkullanılmıştır. Evans mavisinin bağırsak mukozasında nicelemesi, bir gecede formamid inkübasyon kullanan dokudan ekstraksiyon gerektirir. Bu nedenle, aynı doku bağırsak epitel geçirgenliği ve nötrofil infiltrasyonunu incelemek için kullanılamaz.

Burada, kolon mukozal geçirgenlik ve lökosit transepithelial göç hakkında tekrarlanabilir veri toplamak için gereken hayvan sayısını azaltan basit bir protokolü vurguluyoruz. Bu nedenle, daha fazla analiz için hasat edilebilen bağırsak döngülerinin bütünlüğünden ödün vermeden kan serumunda kolayca tespit edilebilen FITC-dekstrans kullanılmasını öneririz. Not olarak, bağırsak ligli döngüler bakteriyel enfeksiyonu incelemek için çeşitli türlerde (fare, sıçan, tavşan, buzağı dahil) kullanılmıştır (Salmonella, Listeria monocytogenes ve Escherichia coligibi)22,23,24,25 ve bağırsak geçirgenliği26; bununla birlikte, en iyi bilgimize göre, bağırsakta yaygın olarak IBD'de yer alan ileum veya kolon gibi belirli bölgelerde PMN TEpM mekanizmalarını araştıran hiçbir çalışma yoktur.

Burada, ileum veya proksimal kolonun iyi damarlanmış ve dışlanmış bir bağırsak segmentini kullanan sağlam ve güvenilir bir mikrocerrahi in vivo yöntemi olan fare bağırsak döngüsü (iLoop) modelini açıklıyoruz. iLoop modeli fizyolojik olarak ilgilidir ve anestezi altında yaşayan fareler üzerinde bağırsak bariyeri bütünlüğünün ve PMN TEpM'nin değerlendirilmesine izin verir. İki uygulama gösteriyoruz: 1) iLoop 2'de intralüminal uygulamadan sonra 4 kDa FITC-dektran serum seviyelerinin nicelemesi) güçlü kemotottractant Lökotrien B 4 (LTB4 )27'ninintralüminal enjeksiyonundan sonra iLoop lümeninde transmigrated PMN'nin nicelemesi. Ayrıca, iLoop modelini Jam-a-null fareler veya IEC'lerde seçici JAM-A kaybı barındıran farelerle kullanmak (Villin-cre; Jam-a fl/fl) kontrol farelerine kıyasla, sıkı kavşak ilişkili protein JAM-A'nın bağırsak geçirgenliğine ve nötrofil transmijasyonuna15,28 , 29,30,31için büyük bir katkı olduğunu bildiren önceki çalışmaları doğrulayabiliyoruz.

iLoop modeli, in vitro tahlilleri doğrulamak için kullanılabilecek son derece işlevsel ve fizyolojik bir yöntemdir. Ayrıca, bu, kemokinler, sitokinler, bakteriyel patojenler, toksinler, antikorlar ve terapötikler de dahil olmak üzere döngü lümenine enjekte edilebilen çeşitli reaktiflerin incelenmesine izin veren çok yönlü bir deneysel modeldir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık Enstitülerinin yönergelerine ve politikalarına uygun olarak yapılmış ve Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

NOT: Bu yöntem, 8 -12 haftalık C57BL/6 genetik geçmişinden yetişkin fareler istihdam ederek oluşturulmuştır. Tüm fareler, normal yemek ve suya ad libitum erişimi ile katı spesifik patojensiz koşullar altında tutuldu. Sonuçlar C57BL/6, Jam-a - null fareler (Jam-a-/-) veya IEC'lerde (Villin-cre) jam-A seçici kaybı barındıran fareler kullanılarak elde edildi; Jam-afl/fl) ve çöp arkadaşı Jam-afl/fl daha önce açıklandığı gibikontroller 30.

  1. Alan hazırlama
    1. Temiz alanda ameliyat gerçekleştirin. Ancak intestinal Loop modeli aseptik/steril teknik gerektirmeyen sağkalımsız bir ameliyattır. Veteriner sanitasyon uygulamalarını gözlemleyin ve temizlenmiş cerrahi aletler kullanın (yani sabunla ovulmuş, su ile durulanmış ve ardından% 70 etanol).
    2. Anestezi ve ameliyat sırasında hayvanı hipotermiden korumak için sıcaklık kontrollü bir cerrahi tahtayı (veya ısıtma pedlerini) ve uyarlanmış ışık kaynağını açın.
    3. Emilemez 4-0 ipek cerrahi dikişlerin 6 cm'lik bölümlerini keserek bitişik harfleri hazırlayın.
    4. Elipsoid şeklinden sonra merkezde kesilen pamuklu gazlı bezleri (5 cm x 5 cm) hazırlayın. Bunlar, orta hat laparotomisini örtmek ve dış cepheli iLoop ile hayvan kürkü arasında doğrudan teması önlemek için kullanılacaktır. Kesilmiş gazlı bezleri sıcak Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi'nde (HBSS) petri kabında bekletin.
    5. Organları işlemek için kullanılacak sıcak HBSS'ye batırılmış ıslak pamuklu çubuklar hazırlayın ve iLoop'u dışlayın.
    6. Ilık HBSS ile doldurulmuş 10 mL şırıngın hazırlayın ve sarı bir besleme tüpüne takın. Bu şırıngan, ameliyat sırasında maruz kalan dokuları nemlendirmek ve dışkı içeriğinin iLoop'unu hafifçe yıkamak için kullanılacaktır.
  2. Hayvan hazırlığı
    1. Onaylanan hayvan protokolüne uygun olarak hayvanı uyuşturun. Bu protokolde bir anestezi buharlaştırıcı ile izofluran ve oksijen karışımı uygulanır. Üreticinin talimatlarına göre, oksijen akış hızını 1 L / dak'a ayarlayın. Buharlaştırıcıyı % 5'e ayarlayın ve indüksiyon odasını ön şarj edin. 5 dakika sonra, izofluran buharlaştırıcıyı% 2 - 2.5' e düşürün.
    2. Hayvanı indüksiyon odasına 3 dakika - 5 dakika yerleştirin, ardından hayvanı ısıtılmış bir ameliyat tahtasına aktarın ve bir anestezi burunkone fişi bağlayın. Yapışkan bant kullanarak hayvanı dört uzuv tarafından supine pozisyonunda zapt edin.
      NOT: Anestezi alternatifi olarak, salin çözeltisinde seyreltilmiş ketamin (80 mg/kg - 100 mg/kg) ve ksilazin (5 mg/kg - 10 mg/kg) karışımı (%0,9 NaCl) intraperitoneal enjeksiyon ile yönetilebilir. Anestezik derinliği sağlamak için ketamin/ksilazinin intramüsküler olarak (başlangıç dozlarının 0.1 - 0.25 katı) ameliyat boyunca sürdürülmelidir. Varsa, daha iyi tekrarlanabilirlik, hayatta kalma ve hayvan ağrısını önlemek için bir izofluran anestezi buharlaştırıcı şiddetle tavsiye edilir.
    3. Korneanın kopmasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
    4. Kalp atış hızı (yaklaşık 500 atım/dk) ve ritim, mukoza zar rengi (pembe), kılcal damar dolum süresi (< 2 s), solunum hızı (40 - 60 nefes/daktan düşük değil) ve sıcaklık (36,5 °C)32içeren fiziksel bir muayene gerçekleştirin.
    5. Sonraki adımlara geçmeden önce, pedal çekme refleksi ile anestezik derinliği değerlendirin. Cildin parmaklar ve/veya parmak pedleri arasında ağrılı bir uyaranı (tutam) kullanın. Fare bacağını büzerek ve çıkararak yanıt verecektir. Hayvan derinden uyuşturuldığında bu pedal refleksi kaybolur.
      NOT: Hayati değerlerin ve pedal refleksinin en az her 15 dakikada bir anestezi boyunca izlenmesi önerilir. Anestezi derinliğinin değerlendirilmesi için Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergeleri aşağıdakilerin izlenmesini önerir: (a) kuyruk, ayak ve mukoza zarının rengi (dil gibi). Kan perfüzyonunun veya solunum sıkıntısının azaldığının göstergesi olarak normal ve soluk veya mavi renk pembesi; (b) solunum düzeninin düzenli ve düzensiz nefesler olarak değerlendirilmesi. Sırasıyla vücut ısısı, kalp ve solunum hızlarının değerlendirilmesi için rektal sıcaklık probu, kemirgen oksimetresi ve kalp atış hızı monitörleri kullanılabilir.

2. İleal döngünün üretimi

  1. Cilt hazırlığı: Karın orta çizgisinin kürklerini% 70 Etanol ile ıslatılmış alkol sürüntüleri veya gazlı bez süngeri ile ovalayın. Hipotermiyi önlemek için geniş bir kürk alanını alkolle ıslatmayın.
  2. Makas kullanarak, orta hat laparotomi gerçekleştirin. Karnın ortasında (yaklaşık 2 cm uzunluğunda) dikey bir kesi yapın ve peritonun ortaya çıkması. Karın içi organları yaralamamaya dikkat edin.
  3. Önceden kesilmiş ıslak pamuklu gazlı bezi açıkta kalan karın içi boşluğun üzerine yerleştirin.
  4. Caecum'un mobilize ve dış görünümü için ıslak pamuklu çubuklar kullanın. Caecum'u ıslak pamuklu gazlı bez üzerine dikkatlice yerleştirin.
    NOT: Caecum, hayvanın cinsiyeti bağımsız olarak farelerin çoğunda karın boşluğunun sol kaudal kadranında lokalizedir.
  5. Terminal bölümünün (distal uç) kaekuma tutturulduğu ileumu harekete geçirmek ve hafifçe dışlamak için ıslak pamuklu çubuklar kullanın (Şekil 1B).
  6. Mezenterik damarları ve kan akışını bozmadan ıslak pamuklu gazlı bez üzerine en az 6 cm terminal ileum dağıtın. Kanama yoksa ve doku pembe rengini korursa kan akışı korunur (Şekil 1B).
    NOT: Sarı bir besleme tüpüne bağlı 10 mL şırıngır kullanarak (her 2 - 3 dakikada bir) sıcak HBSS (her 2 - 3 dakikada bir) ile dokuları her zaman nemli tutarak maruz kalan dokuların kurumasını önlayın (adım 1.1.6).
  7. Kaekuma yakın, mezentery'deki ileumu sağlayan ana arteri tanımlayın. Daha sonra mezentery'de kritik kan damarlarından arındırılmış iki ligasyon bölgesi bulun.
  8. Künt doku tokaları kullanarak, terminal ileumu (kaekuma en yakın) sıkıca tutun ve ince uçlu önps kullanarak, kan damarlarından kaçınarak mezenteri fenestrate edin. Perforasyon boyunca ipek dikiş yerleştirin ve ilk ligasyonu (döngünün distal sonu) oluşturmak için cerrahi bir düğüm bağlayın.
  9. İlk ligatürden 4 cm uzakta ölçmek ve 2.8 (Şekil 1C)adımda belirtildiği gibi ikinci ligatürü (döngünün proksimal ucu) oluşturmak için cetveli kullanın.
  10. 4 cm ileal döngüyü izole etmek için her ligasyonun yanında dikkatlice kesilmiş ince makasla, sağlam kan kaynağı ve mezenterik membran tutun.
    NOT: iLoop'un dışlanmış segmentinin her iki ucunu kesin, ardından ışık içeriğine (dışkı maddesi) müdahaleyi önleyen gerekli bir adım olarak hafifçe yıkayın, böylece FITC-dekstrans veya kemometik uyaranların izole segmentin tüm uzunluğu boyunca dağılımını kolaylaştırır ve lökositlerin akış sitometrisi ile daha doğru ölçülmesini sağlar. Bu prosedür ayrıca, belirtilen hacimlerde reaktifin enjekte edildikten sonra mukozanın düzgün bir şekilde dağılmasına ve hayvanlar arasında daha iyi tekrarlanabilirlik sağlar.
  11. 10 mL şırınna bağlı esnek bir sarı besleme tüpü kullanarak ileal döngü segmentinin içeriğini ılık HBSS ile hafifçe yıkayın (bkz. adım 1.1.6).
  12. Yıkanmış ileal döngünün iki kesik ucunu ipek dikiş kullanarak ligat.
  13. Fitc-dextrans (adım 4.2) veya kemokin (adım 5.3) gibi 250 μL reaktifi yavaşça bağırsak lümenine enjekte etmek için 30 G iğneli 1 mL şırınga kullanın. İleal döngü mukozanın orta derecede dağılmasına neden olacak şekilde şişirilecektir (Şekil 1D).
    NOT: Reaktifi mezenterik arterin karşı tarafındaki döngü lümenine enjekte edin. Kan damarlarının yırtılmasını önlemek ve kanamaya neden olmak için enjekte ederken hayvandan ileal döngüyü çıkarmamaya dikkat edin.
  14. Islak pamuklu çubuklar kullanarak, ileal döngüyü, proksimal ileumu ve caecum'u hafifçe geri koyun.
  15. Karın duvarını kapatmak için bir iğne tutucu, anatomik tokmaklar ve ters kesme iğnesi ile 3.0 emilemez ipek dikiş kullanın.
  16. Hayvanı kuluçka süresi boyunca sıcaklık düzenlemeli bir anestezi odasına yerleştirin.

3. Proksimal iki nokta üst üste döngüsünün üretimi (pcLoop)

NOT: pcLoop'un üretimi için kullanılan fareler hakkında ayrıntılı bilgi için protokol bölümünün başında verilen bilgilere bakın.

  1. 2.1 adımlarını gerçekleştirin. - 2.4. ileal döngü için yukarıda açıklandığı gibi.
  2. Islak pamuklu çubuklar kullanarak, tüm ileumu dışlaştırın ve ıslak bir pamuklu gazlı bezin üzerine yerleştirin. Proksimal kolonu ve mezokolonda bulunan kan akışını tanımlayın. Proksimal kolonu harekete geçirin ve ince uçlu asalar kullanarak, asetondaki damarlardan arındırılmış bir alanda ilk ligatürü kaeksten yaklaşık 0,5 cm distal olarak oluşturun (Şekil 2B).
  3. İlk ligatürden 2 cm ölçün ve mezokolondaki kan kaynağı olmayan bir alanda ikinci bir ligatür oluşturun (Şekil 2C).
  4. 2 cm uzunluğunda bir pcLoop'ı izole etmek için her ligasyonun yanında dikkatlice kesilmiş ince makas kullanın.
    NOT: Adım 2.10 altındaki notta belirtildiği gibi, ışık içeriğinden hafifçe temizlenen bir pcLoop'ı izole etmek için her iki ucu kesmek önemlidir. Küçük damarların bağırsak lümenine kanamasını önlemek için kolonik dokuyu ve mezokolonları dikkatlice kesin. Gerekirse, kesi yerindeki kanamayı sınırlamak için termal koter kullanın.
  5. 10 mL şırıngana bağlı esnek bir sarı besleme tüpü kullanarak dışkıyı çıkarmak için pcLoop'u ılık HBSS ile hafifçe yıkayın (bkz. adım 1.1.6).
  6. Temizlenmiş pcLoop'un iki kesim ucunu ipek dikiş kullanarak lige edin.
  7. Fitc-dextrans (adım 4.2) veya kemokin (adım 5.3) gibi 200 μL reaktifi yavaşça bağırsak lümenine enjekte etmek için 30G iğneli 1 mL şırınga kullanın. pcLoop mukozanın orta derecede dağılmasına neden olacak şekilde şişirilecektir (Şekil 2D).
    NOT: Reaktifi mezenterik arterin karşı tarafındaki pcLoop lümenine enjekte edin. Mukozanın eşit şekilde dağılmasını sağlamak için hayvanlar arasında tutarlılık sağlayın ve 2 cm uzunluğunda bir pcLoop oluşturun.
  8. Ligated pcLoop, ileum ve caecum'u karın boşluğuna hafifçe geri yerleştirmek için ıslak pamuklu çubuklar kullanın.
  9. Karın duvarını kapatmak için bir iğne tutucu, anatomik tokmaklar ve ters kesme iğnesi ile 3.0 emilemez ipek dikiş kullanın.
  10. Hayvanı kuluçka süresi boyunca sıcaklık düzenlemeli bir anestezi odasına yerleştirin.

4. Bağırsak geçirgenliğinin nicel değerlendirmesi: 4 kDa FITC-dektran tahlil

  1. İleal döngü veya pcLoop gerçekleştirin (yukarıda açıklandığı gibi).
  2. 30 G iğneli 1 mL şırınga kullanarak, bağırsak lümenine 250 μL (ileum - adım 2.13) veya 4 kDa FITC-dektran çözeltisinin 200 μL'si (kolon - adım 3.7) (HBSS'de 1 mg / mL) enjekte edin. Serum toplamadan sonra standart eğriyi hazırlamak için kullanılmayan FITC-dektran çözeltisini ışıktan koruyun.
  3. İleal döngü için, pcLoop adımları 3.8 ile 3.10 arasında 2.14 ile 2.16 adımlarını izleyin. Kısaca, organları ve iLoop'u karın boşluğuna geri koyun, karın duvarını kapatın.
  4. Hayvanı 120 dakika boyunca ısıtılmış bir anestezi odasına yerleştirin.
  5. Kuluçka süresinden sonra karın duvarını açın, kalbe erişin ve kanı toplamak için 25G iğneli 1 mL şırınga kullanarak kalp delinmesi yapın. Kanı 1,3 mL serum pıhtı aktivatör tüpüne aktarın, hafifçe karıştırın ve ışıktan korunan buzda tutun. Fare başına en az 500 μL kan toplayın.
    NOT: Hayvanlar anestezi altındayken, kafa kesme veya servikal çıkık gibi fiziksel bir yöntem kullanılarak ve onaylanmış hayvan protokolüne uygun olarak ötenaziye tabi edilir.
  6. Santrifüj serum pıhtı aktivatör tüpü, üreticinin önerilerine göre oda sıcaklığında 10.000 x g'da 5 dakika boyunca. Serumu (süpernatant) toplayın ve 1,7 mL santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü buzda tutun ve ışıktan koruyun.
  7. Kan serumunda floresan nicelemesi
    1. Kontrol farelerinin serumunda standart bir FITC-dektran 4 kDa eğrisi hazırlayın (salin veya HBSS geçerli bir alternatiftir). 1 mg/mL FITC-dektran başlangıç konsantrasyonu ile iki katlı bir seri seyreltme oluşturun. FITC-dektran 4 kDa konsantrasyonları 0,25 mg/mL ile 2 μg/mL arasında ölçülür.
    2. Üreticinin talimatlarına ve yayınlanan protokollere göre, numune ve standartların eşit hacmini siyah bir 96 kuyu plakasına (düz taban) aktarın ve floresan plaka okuyucusunda FITC'yi ölçün(Excitation 490 nm, Emisyon 520 nm). FITC konsantrasyonu standart eğriye göre hesaplayın veya deneysel kontrol grubuna normalleştirilmiş kat değişimi olarak geçirgenlik değerlerini sun.

5. Kemokinlerle intralüminal stimülasyondan sonra bağırsak lümenine göç eden PMN'nin nicel değerlendirmesi

NOT: Bağırsak mukozasında taban çizgisi seviyesinde çok az PMN bulunmaktadır. Pro-enflamatuar sitokinli hayvanların ön işlem, kan dolaşımından bağırsak mukozasına PMN alımını kolaylaştıran enflamatuar bir ortamla sonuçlanır.

  1. 30 G iğneli 1 mL şırınga kullanarak, 200 μL Fosfat Tamponlu Salin 'de (PBS) 100 ng Tümör Nekroz Faktör α (TNFα) ve 100 ng Interferon-γ (INFφ) steril çözeltisinin intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu yapın.
  2. Pro-enflamatuar sitokinlerle 4 - 24 saat ön işlemden sonra, ileal bir döngü veya pcLoop gerçekleştirin (yukarıda açıklandığı gibi).
  3. 30 G iğneli 1 mL şırınga kullanarak, HBSS'de 250 μL (ileum - adım 2.13) veya 200 μL (kolon - adım 3.7) kemotatraktant çözeltisi Lökotrien B4 (LTB4) 1 nM bağırsak lümenine enjekte edin.
    NOT: Lökotriene B4 (LTB4)bu protokolde PMN için güçlü bir kemoattraktant olarak kullanılır. N-Formylmethionyl-leucyl-fenilalanin (fMLF) veya kemokin (C-X-C motifi) ligand 1 (CXCL1/KC) gibi diğer kemotattraktantlar da PMN'nin kolonik lümene önemli ölçüde alınmasını teşvik etmek için kullanılabilir30.
  4. İleal döngü için 2.14 ile 2.16 arası adımları izleyin. pcLoop için 3.8 ile 3.10 arası adımları izleyin. Kısaca, organları ve iLoop'u karın boşluğuna geri koyun, karın duvarını kapatın.
  5. Hayvanı 60 dakika boyunca ısıtılmış bir anestezi odasına yerleştirin.
  6. Bağırsak döngüsü içeriğinin toplanması
    1. Çözeltiler hazırlayın ve buzda saklayın: İleal döngü ve pcLoop için, kalsiyum ve magnezyum olmadan steril PBS'de 2 mM Etileniaminetetraasetik asit (EDTA), 5 mM Dithiothreitol (DTT) ve% 2 FBS içeren bir yıkama tamponu hazırlayın.
    2. Kuluçka süresinden sonra ve anestezi bakımı altında, karın duvarını açın ve iLoop'u (ileal döngü veya pcLoop) çekin. Başı kesme veya servikal çıkık gibi fiziksel bir yöntem kullanarak ve onaylanmış hayvan protokolüne uygun olarak anestezi altındayken hayvanları ötenazi edin.
    3. Kalan kan kirleticilerini gidermek ve doku mendilleriyle PBS'nin fazlalığını emmek için soğuk PBS ile döngüyü durulayın. Döngü içeriğini dikkatlice 1,7 mL santrifüj tüpünde (ileal döngü için yaklaşık 250 μL ve pcLoop için 200 μL) toplayın. Döngüyü 500 μL soğuk yıkama tamponu ile yıkayın ve toplamadan hemen sonra tüpü buza yerleştirin.
      NOT: DTT mukusu eritmeye yardımcı olur. İLoop ışıklı içeriği çok viskozsa (fare genetik arka planına bağlı olarak), DTT içeren yıkama arabelleği ile 1:2 veya 1:3 seyreltin.
    4. Luminal içerik çözeltisini hücre süzgeç kapağına sahip 5 mL yuvarlak tabanlı bir tüp kullanarak 35 μm naylon ağ filtresinden geçirin. Bu adım doku parçalarını ve hücre agregalarını gidermeye yardımcı olur. Hücre süzgecini 1 mL yıkama tamponu ile durulayın.
    5. 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj tüpü. Süpernatantı atın, peleteri 500 μL - 1 mL yıkama tamponu ile durulayın, ardından 5 dakika, 4 °C için 400 x g'da santrifüjlayın.
    6. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen steril PBS'de %2 FBS içeren 200 μL akış sitometri tamponunda (FCB) iLoop luminal hücre peletini yeniden kullanın. Hücreler bir tüpte tutulabilir veya akış sitometrisi boyama ve analizi için 96 kuyu yuvarlak bir alt plakaya aktarılabilir.
  7. Akış Sitometrisi boyama ve analizi
    1. Kompanzasyon kontrolleri: beyaz kan hücreleri
      1. Steril 0,5 M EDTA (pH 8,0) ile önceden doldurulmuş 25 G iğneli 1 mL şırınga hazırlayın. Beklenen kan hacmi başına % 10 EDTA (1 mL kan için 100 μL EDTA).
      2. Kalp delinmesi ile anestezi altında kan toplayın. Kanı 1,7 mL'lik bir tüpe aktarın, ardından 10 dakika, 4 °C için 400 x g'da santrifüj.
        NOT: Fare anestezi altındayken, onaylanmış hayvan protokolüne (servikal çıkık gibi) uygun olarak ölümü doğrulamak için fiziksel bir yöntem kullanın.
      3. Üst sıraları aspire edin. Peletin kırmızı kan hücrelerinin lizisi için 1 mL Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) lizis tamponunda yeniden dürtülür. Buz üzerinde 3 dakika - 5 dakika kuluçkaya yatır. 5 dakika, 4 °C için santrifüj 400 x g. Pelet hala kırmızıysa, pelet beyaza dönene kadar bu ACK liziz tampon adımını tekrarlayın.
      4. Peletin 1 mL FCB ve plaka 0,5 x 106- 1 x 106 hücre başına kuyu başına yeniden kullanın. 96 kuyulu yuvarlak tabanlı bir plakanın beş kuyusunun hazırlayın. Tabağı buza koyun.
        NOT: Döngü ışık içeriğini içeren aynı 96 kuyu plakasını kullanın (bkz. adım 5.6.6).
    2. Akış sitometrisi boyama
      1. 96 kuyu plakasını 400 x g, 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantı atın ve peletleri 50 μL Saflaştırılmış Sıçan Anti-Mouse CD16/CD32 ile Fc-Block (100 μL FCB başına 1 μg) olarak yeniden kullanın. Buz üzerinde 5 dakika - 10 dakika kuluçkaya yatır.
      2. iLoop armatür içeriğinin immünostaining: Tüm florokrom konjuge antikorları içeren bir karışım hazırlayın (FCB'de 1:50 seyreltme): anti-CD45-PerCP, anti-CD11b-PE ve anti-Ly-6G-Alexa Fluor 647. 100 μL'lik son hacim için kuyu başına 50 μL kombinasyon ekleyin.
      3. Beyaz kan hücrelerinin kompanzasyonlar için immünostainingi (FCB'de 1:50 seyreltme): Sadece 50 μL FCB kullanın (lekesiz örnek, kuyu 1), her bir florokrom konjuge antikorun 50 μL'si (kuyular 2 - 4), 50 μL tüm florokrom konjuge antikorların kombinasyonu (iyi 5). Son hacim 100 μL.
      4. Plakayı ışıktan korunan buzda 30 dakika kuluçkaya yatırın.
      5. Plakayı 400 x g, 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. Süpernatant atın ve 200 μL FCB ile yıkayın. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
      6. Kan örneklerine FCB 150 μL/well ekleyin.
      7. iLoop ışıklı içerik örneğine 100 μL/kuyu FCB ekleyin. Daha sonra 50 μL / kuyu floresan sayım boncukları.
    3. Akış sitometrisi analizi
      1. CD45 olumlu olaylar ve Ly-6G-/Gr-1 ve CD11b30ifadesi için kapı.
      2. Durdurma koşulu olarak numune hacminin 100 μL'lik kısmını kullanın.
      3. Floresan sayım boncuklarının üreticisi tarafından sağlanan bilgileri izleyerek iLoop lümenine taşınan mutlak PMN sayısını hesaplayın.
        NOT:Veriler,bir silindirin hacmi için formül kullanılarak (1)lümen 30,34,35,(2) doku başına PMN sayısı ve (3) mmbaşına PMN sayısı olarak sunulabilir: V= π(pi) r 2 h (hacim için V, yarıçap için r ve yükseklik için h).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İleal döngünün ve pcLoop modellerinin şematik bir gösterimi sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2'detasvir edilir. Anatomik resimler, bağırsak segmentinin dışsallaştırılması ( Şekil 1B ve Şekil 2B),kan akışının en az bozulmasına izin veren ligasyonlar için uygun bir yerin tanımlanması (Şekil 1C ve Şekil 2C) ve temizleme ve ardından iLoop'un reaktif çözeltisi ile doldurulabilen kesilmiş uçlarının ligasyonu dahil olmak üzere prosedürün kritik adımlarını görüntüler (Şekil 1D ve Şekil 2D). Daha da önemlisi, iLoop modeli hayati kan akışını korur ve FITC-dekstrans veya güçlü PMN kemoattratant LTB4gibi uygulanan reaktiflerin fizyolojik emilimine izin verir. Tahlil sonunda, iLoop şişirilmeli (Şekil 1D ve Şekil 2D'degörüldüğü gibi) ve parlak-kırmızı mezenterik damarlarla normal mukozal perfüzyon gösterilmelidir. Teste bağlı olarak, serumdaki FITC-dektranı ölçmek için kan toplanır veya iLoop luminal içeriği, hayvanın ötenazisinden önce PMN TEpM'nin nicelleştirilmesi için işlenir.

Bağırsak geçirgenliğinin değerlendirilmesi için iLoop modelinin doğruluğunu doğrulamak için, in vivo bağırsak bariyer fonksiyonunun düzenlenmesinde TJ ile ilişkili protein JAM-A'nın rolünü değerlendirmek için bir FITC-dextran pcLoop tahlili yapıldı. Not olarak, JAM-A eksikliğinin vitro28'de ve oral gavage in vivo 29'dan sonra epitel bağırsak geçirgenliğinin artmasına yol açtığınıbildirmiştir. Burada, pcLoop modeli kullanılarak, Jam- a-null farelerde (Jam-a-/-) kontrollere kıyasla 4 kDaFITC-dextran serum seviyelerinde2,5kat artış ölçüldü (Jam-a+/+) ( Şekil 3A )30. Ayrıca, IEC'lerde (Villin-cre) JAM-A seçici kaybını barındıran farelerle benzer sonuçlar eldeedilmiştir; Jam-a fl/fl) çöp atma kontrollerine kıyasla (Jam-a fl/fl) (Şekil 3B)30. Bu nedenle, pcLoop modeli, JAM-A için bağırsak bariyeri işlevine olumlu bir katkı bildiren önceki çalışmaları doğrulayabildi.

Daha sonra pcLoop modeli, pmn işe alımını bağırsak mukozasına ve sonraki TEpM in vivo'ya incelemek için kullanıldı. Şekil 4A'dagösterildiği gibi, pcLoop'un ışık içeriğindeki PMN sayısı akış sitometri analizi ile ölçüldü. PMN, hücre yüzeyi üreticilerinin her biri için pozitif hücreler CD45, CD11b ve Ly6G36olarak tanımlanmıştır. Dolaşımdaki beyaz kan hücreleri gating stratejisi için pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Beklendiği gibi, pcLoop'a benzer bir proksimal kolon segmentinde bulunan PMN sayısı fizyolojik koşullar altında düşüktü (Şekil 4B). Ameliyattan önce pro-enflamatuar sitokinler TNFα ve IFNφ ile ön tedavi, pcLoop lümeninde işe alınan PMN sayısının arttırıldığı sonucuna vardı. PMN kemoattractant LTB4'ün yönetimi, LTB4bağımlı PMN işe alımını destekleyen PMN sayılarında çarpıcı bir artışa yol açtı (Şekil 4B). Kolon mukozasında PMN'nin immünohistokimyasal lekelenmesi, LTB 4 (Şekil 4C)30olmadan sitokin tedavisi ile karşılaştırıldığında sitokinler ve LTB4 ile uyarılmasını takiben PMN'nin yüksek işe alımını doğrular. pcLoop modeli, JAM-A'nın PMN TEpM'ye katkısını Villin-cre kullanarak incelemek için kullanıldı; Jam-a fl/fl fareler. Epitel JAM-A kaybı, kolon lümeninde çöp arkadaşı kontrollerine kıyasla transmigran PMN sayısının azalmasına yol açtı (Şekil 4D)30. Bu bulgular, bağırsak epitelinde PMN göçünü kolaylaştırmada JAM-A için bir rolü kuvvetle desteklemekte ve çeşitli inflamasyon modellerinde JAM-A'nın vasküler endotel boyunca PMN göçüne dahil olduğunu bildiren çalışmalara tamamlayıcı içgörüler sağlamaktadır31,37,38.

Figure 1
Şekil 1: İleal döngü modeli. (A) İleal döngü modeline şematik genel bakış. Median laparotomi anestezi altında farelere yapılır ve sıcaklık kontrollü bir ameliyat tahtasına yerleştirilir. (B) Caecum (*), ileum ve mesentery'nin dış cephesi. Ligasyon için yeterli iki bölge tanımlanmıştır (1,2). (C) 4 cm uzunluğunda bir segmenti izole edin: birinci ligatür (1) ileo-caecal kavşağına yakın yerleştirilir ve ikinci bir ligatür (2) ilk ligatürden 4 cm uzağa yerleştirilir. (D) Mezentery içinde iki küçük kesi yapılır (1, 2) 4 cm uzunluğunda ileal döngü oluşturmak için. Işıltı içeriğinin giderilmesinden ve kesme uçlarının ligasyonundan sonra, floresan belirteçler ve kemoattraktantlar gibi reaktifler lümene enjekte edilebilir. İleal döngü iyi vaskülerize edilir (siyah ok uçları). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Proksimal iki nokta üst üste döngü modeli. (A) pcLoop modeline şematik genel bakış. Median laparotomi, sıcaklık kontrollü bir ameliyat tahtasına yerleştirilen anestezi altında farelere yapılır. (B) Caecum (*), proksimal kolon, mezokolon ve ileumun dışlanması. Ligasyon için yeterli iki bölge tanımlanmıştır (1,2). (C) Birinci ligatür (1) kaekuma yakın, ikinci ligatür (2) ise birinci ligatürden 2 cm daha distal yerleştirilir. (D) pcLoop dışlanır, aydınlık içerikten temizlenir ve floresan belirteçler ve kemoattraktantlar gibi reaktiflerle şişirilir. pcLoop iyi damarlanmış 2 cm proksimal kolon segmentidir (siyah ok uçları kan akışını gösterir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: JAM-A, in vivo bağırsak geçirgenliğini düzenler. (A) JAM-A eksikliği (Jam-a-/-) 4 kDa FITC-dektrana kadar kolon geçirgenliğinin artmasına neden oldu. Jam-a-/- (13x hayvanlar; siyah noktalar) Jam-a+/+ kontrolleri (12x hayvanlar; beyaz noktalar) ile karşılaştırıldı. HBSS'de 4 kDa FITC-dektran (1 mg/mL) pcLoop lümenine enjekte edildi. Floresan 120 dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra kan serumunda ölçüldü. Veriler SEM ± araç olarak ifade edilir; n = 3 bağımsız deney. ****P < 0.0001; Mann-Whitney U testi. (B) Villin-cre'de kolonik geçirgenliği 4 kDa FITC-dektrana yükseltilir; Jam-afl/fl (18x hayvanlar, siyah noktalar) kontrollere kıyasla(Jam-afl/fl, 12x hayvanlar, beyaz noktalar). Veriler SEM± anlamına gelir; n = 4 bağımsız deney. ****P < 0.0001; Mann-Whitney U testi. Bu rakam Flemming S, Luissint AC ve ark.30'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: JAM-A, LTB4-bağımlıPMN alımını pcLoop'un lümenine teşvik eder. (A) Floresan sayım boncukları ile akış sitometrisi ile ışık içeriğindeki PMN'yi (CD45+ , CD11b+ve Ly-6G / Gr1+ hücreler) ölçmek için gating stratejisi. Kan örneklerinden alınan lökositler, gating stratejisi için pozitif kontrol olarak kullanıldı. (B) Sitokin (TNFα + IFNφ, her biri 100ng) tedavisinden (10x hayvanlar; beyaz noktalar) veya sitokin ve 1 nM LTB4 (10x hayvanlar; siyah noktalar) kombinasyonundan sonra pcLoop lümenine alınan PMN sayısı. Siyah kareler, proinflamatuar sitokinler ve LTB4 (9x hayvanlar) ile herhangi bir ameliyata veya tedaviye tabi tutulmayan pcLoop ile aynı uzunlukta bozulmamış bir kolonik segmentte değerlendirildiği gibi taban çizgisindeki PMN sayısını temsil eder. Veriler, Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi ile SEM(n = 3 bağımsız deney), Kruskal-Wallis testi ± ortalamadır. *P < 0.05, ****P < 0.0001. (C) Sadece sitokinler (sol panel, TNFα +IFNφ) veya sitokinler ve LTB 4 (sağ panel) kombinasyonu ile tedaviden sonra pcLoop epitelinde PMN'nin (anti-Ly6G/Gr1 antikoru) immünohistokimyasal boyanması. LTB4 (siyah ok uçları) varlığında pcLoop'ta işe alınan PMN sayısı artırılmıştır. Ölçek çubuğu: 100 μm. (D) pcLoop lümeninde işe alınan PMN sayısı Villin-cre; Jam-afl/fl fareleri (11x hayvanlar; siyah noktalar) Jam-afl/fl farelerine (10x hayvanlar; beyaz noktalar) karşılık 1 nM LTB4. Veriler SEM± anlamına gelir; n = 3 bağımsız deney. *P < 0,05; 2 kuyruklu öğrenci sınavı. Bu rakam Flemming S, Luissint AC ve ark.30'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IBD gibi patolojik koşullar altında bağırsak bariyeri fonksiyonunun düzensizliği ve immün hücre alımından sorumlu mekanizmalar eksik anlaşılmaktadır. Burada, ileum veya proksimal kolonun iyi damarlı dışlanmış bir bağırsak segmentini kullanan ve bağırsak geçirgenliğinin, nötrofil göç çalışmalarının ve diğer uygulamaların değerlendirilmesine izin veren sağlam bir in vivo murine modelini detaylandırırız.

iLoop, canlı hayvanlara yapılan iyileşmeyen bir ameliyattır. Anestezi deney boyunca sürekli izlenmelidir ve sedasyon derinliğinin değerlendirilmesi zorunludur. En kritik adımlar şunlardır: (1) iLoop'un izolasyonu, (2) kesme uçlarının ligasyonu ve (3) reaktif çözeltisinin intralüminal enjeksiyonu ile iLoop'un enflasyonu. Bu adımların her birinde kanama meydana gelebilir, iLoop'un kan akışını tehlikeye atabilir ve sonuçların doğruluğunu etkiler. Not olarak, PMN TEpM tahlili sırasında intralüminal kanamanın nadir örneklerinde, burada sunulan akış sitometrisi gating stratejisi, transmigran PMN'yi doğrudan kan dolaşımından kaynaklanan PMN'den (göç edilmemiş PMN) ayırt etmeye yardımcı olacaktır. iLoop lümeninde toplanan transmigrated PMN, dolaşımdaki PMN'ye kıyasla yüksek düzeyde yüzey işaretleyiciCD11b 10 ifade eder (Şekil 4D).

İLoop'un bağırsak geçirgenliğinin nicel analizlerine ve kan PMN'nin bağırsak lümenine geçişine izin verdiği göz önüne alındığında, emici mukozal alanın boyutunu ve kan akışını standartlaştırmak önemlidir. Hayvanlar arasında tutarlılık sağlamak için, doğru bir bağırsak segmenti uzunluğunun dışsallaştırılması esastır. iLoop ileal döngü için 4 cm ve pcLoop için 2 cm olmalı ve karşılaştırılabilir kan kaynağı ile perfüzyona tabi olmalıdır. Bu parametrelerdeki tutarsızlık, reaktiflerin intralüminal enjeksiyonundan sonra iLoop'un eşitsiz bir şekilde dağılmasına ve deneysel gruplar arasında ve eklem değişkenliğine neden olacaktır. Ayrıca, iLoop'un aşırı şişkinliğini önlemek için, ileal döngü için lümene sırasıyla 250 μL'den fazla reaktif çözeltisi ve pcLoop için 200 μL'den fazla enjekte edilmesi öneririz.

Prosedürün doğasına uygun bazı sınırlamalar vardır. iLoop, canlı hayvanlara yapılan iyileşmeyen bir ameliyattır. Bu teknik olarak zorlu bir mikrocerrahi yöntemdir; ancak personel pratik yaparak cerrahi beceriler kazanabilir. Ameliyatın ortalama süresi kısa olmalıdır (maksimum 15 dk). Bağırsak geçirgenliğini ölçmek için ideal bir kuluçka süresi olarak 120 dk ve PMN TEpM için 60 dk öneririz. Kuluçka süreleri azaltılabilir, ancak uzatılmış zaman noktaları anestezi altındaki hayvanın genel enflamatuar durumunu etkileyebilir. Ayrıca cerrahi işlemin başlangıcından numune toplama/analize kadar olan protokole ara verilemez.

Bu iLoop modeli mevcut yöntemlerle ilgili önemli avantajlar sunar: (1) iLoop tamamen damarlıdır ve fizyolojik olarak daha alakalıdır, (2) genel gastrointestinal sistem bütünlüğünü değerlendiren ve gastrointestinal hareketlilik13'e bağlı olan oral gavage yönteminin aksine, iLoop bağırsakta yaygın olarak IBD'de yer alan belirli lokalize bölgelerin (terminal ileum veya proksimal kolon) özelliklerini incelemeye izin verir, (3) iLoop, PMN TEpM'nin bağırsak lümeninin yanı sıra lamina propria ve epitel fraksiyonları da dahil olmak üzere bağırsak mukozasının diğer kısımlarına nicel çalışmasına izin veren ilk in vivo modeldir30,35. Nakavt/knock-in farelerde veya bağırsak iltihabı dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli deneysel modellerde epitel bariyer kusurlarının hem boyut seçiciliğini hem de şiddetini değerlendirmek için yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı FITC etiketli dekstrans (4 ila 150 kDa) kullanarak mümkündür. Buna ek olarak FITC etiketli dekstrans karaciğer39 gibi diğer organlarda veya bağırsak-karaciğer ve bağırsak-beyin eksenlerinde bağırsak geçirgenliğinin rolü hakkında fikir veren kan beyin bariyeri çalışmaları için yeni bir yaklaşım olarak ölçülebilir40,41,42. Ayrıca, bu yöntem paralel olarak iki döngü gerçekleştirme imkanı sunar (aynı hayvanda ileal döngü ve pcLoop) ve bağırsaktaki farklı alanlarda bariyer özelliklerinin analizleri için iki farklı floresan etiketli prob aşılar. Benzer hatlar boyunca, paralel olarak iki döngünün üretilmesi, aynı reaktife yanıt olarak bağışıklık hücrelerinin alımındaki farklılıklar veya benzerlikler için ileum ve kolona karşı özellikle değerlendirmek için kullanılabilir.

Burada, pcLoop'u Jam-a-null farelerle veya IEC'lerde jam-A seçici kaybını barındıran farelerle kullanarak (Villin-cre; Jam-a fl/fl), bağırsak geçirgenliği ve PMN TEpM'de TJ ile ilişkili jam-A proteini için olumlu bir rol bildiren önceki çalışmalardan elde edilen bulguları doğruluyoruz. iLoop uygulamaları antikorlar, mikrobiyal patojenler ve terapötik ilaçlar30 , 34,35dahil olmak üzere çeşitli reaktiflere genişletilebilir. Not olarak, iyi kabul görmüş güçlü ve fizyolojik bir PMN kemoattratantı olduğu ve fizyolojik aralıkta düşük konsantrasyonlarda (1 nM) TEpM'yi indükleme yeteneği göz önüne alındığında PMN TEpM'yi modellemek için LTB4 'ü (336.5 Da) kullandık. Bununla birlikte, döngü modelimiz diğer ilgili kemoattractantlara uyarlanabilir. Biz bakteriyel peptid N-formyl-metionil-lükil-fenilalanin (fMLF) kolonik lümen içine PMN önemli işe alımı teşvik etmek için kullanımınıbildirdik 30. fMLF (437.5 Da), farelerde etkili olması için çok daha yüksek konsantrasyonlar gerektiren daha düşük bir benzeşim kemoattratantıdır (1μM). Bu model, başarıyla kullandığımız başka bir güçlü fizyolojik kemoattraktant olan CXCL1 / KC'nin kullanımı için uyarlanabilir, ancak CXCL1 / KC pahalıdır ve epitel bariyerini geçmede daha az verimli olan nispeten büyük bir moleküldür (11 kDa). Ayrıca, kemoattraktant LTB4'ün uygulamadan önce döngü lümenine enjekte edilen lökosit spesifik integrin CD11b/CD18'e (αMβ2) karşı nötralize edici antikorların, in vitro çalışmalardan10 , 30,35'inazaltılmış PMN TEpM doğrulayıcı sonuçları ile sonuçlandığını gösterdik. Ayrıca, pcLoop son zamanlarda PMN TEpM43oranını kontrol etmede PMN ve epitel glikanların etkisini incelemek için kullanıldı. Reaktifler pcLoop lümen kemoattractant LTB4'ünönceden yönetimine enjekte edildi. Bu nedenle, geniş uygulama yelpazesi ile iLoop, in vitro tahliller yoluyla elde edilen bulguları tamamlayabilir ve doğrulayabilir. Ligated bağırsak döngüleri de bakteriyel enfeksiyonu incelemek için başkaları tarafından kullanılmıştır (Salmonella, L. monocytogenes ve E. coligibi), bu nedenle bu iLoop modelinin uyarlanabilirliğindeki kolaylığın bu çalışmalar için de kullanılabileceğine inanıyoruz.

Pro-enflamatuar immün mediatörler ile tedaviden sonra, iLoop akut bir bağırsak iltihabı modeli olarak kullanılabilir. Ayrıca, iLoop intralüminal patojenlere maruz kaldıktan sonra veya kronik inflamatuar deneysel modellerde artan bağırsak geçirgenliği ve bağışıklık hücresi işe alımı arasındaki bağlantıyı aydınlatan çalışmalara olanak sağlayabilir. Not olarak, son zamanlarda proinfammatory sitokinler TNFα ve IFNφ (her biri 1 mg) bağırsak parasellüler geçirgenlik yüksek doz yanıt olarak pcLoop modeli kullanarak gözlemledik 4 kDa FITC-dextran, düşük doz sitokinlere (her birinin 100 ng'si)30'akıyasla LTB4'e yanıt olarak pcLoop lümenine gelişmiş PMN alımı ile sonuçlandı. İlginçtir ki, burada Jam-a eksikliğine sekonder epitel geçirgenliğinin artmasının pmn TEpM'nin artmasına yol açmadığını ancak azalttığını gösteriyoruz. Hep birlikte bu sonuçlar, bağırsak parasellüler geçirgenliğinin PMN TEpM oranını etkilediğini, ancak korelasyonun doğrudan olmadığını ve hem epitel bariyer fonksiyonunda hem de lökosit göçünde önemli bir rol oynayan yapışma moleküllerinin (JAM-A'ya benzer) ekspresyonu gibi faktörlere bağlı olduğunu göstermektedir16. Bağışıklık hücresi yanıtlarının bağırsak epitel tarafından ince ayarını ve enflamatuar bağırsak hastalığı gibi patolojik mukozal inflamasyona katkıları araştırmak için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır.

Sonuç olarak, iLoop modeli, bağırsak geçirgenliğinin ve PMN TEpM in vivo'nun değerlendirilmesi için mevcut yaklaşımlarda, bağırsak iltihabı ve IBD'nin düzenlenmesinin altında kalan mekanizmaların anlaşılmasına önemli ölçüde yardımcı olacak önemli bir gelişme sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, proksimal kolon döngüsü modelinin kurulmasına katkılarından dolayı Wuerzburg Üniversitesi'nden Dr. Sven Flemming'e, fare kolonilerinin yönetimi için Sean Watson'a ve iLoop modelinin resimlerinin alınmasına yardımcı olduğu için Chithra K. Muraleedharan'a teşekkür ediyor. Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı/DFG (BO 5776/2-1) tarafından KB, R01DK079392, R01DK072564 ve R01DK061379 ila C.A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs BD 326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" BD 305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" BD 305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle BD 309659
15ml Centrifuge Tube Corning 14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate FisherScientific 07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm MilliporeSigma CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile FisherScientific 25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" Medex 3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) E-Z Systems EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml  VWR 21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape FisherScientific 15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)  FST 12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe) FisherScientific 06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes  Thomas Scientific  c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) Sarstedt  41.1501.105
Moria Fine Scissors FST 14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) Falcon 352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant Dechra 12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps) FST 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD FisherScientific NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps) FST 1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting  HenrySchein SS694
Student Fine Forceps, Angled FST 91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma  Z248029
96 Well Cell Culture Plate Corning 3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm Instech FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA Lonza 51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer BioWhittaker 10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution Corning 21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) BioLegend 127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) ThermoFisher 12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen C36950
Dithiotreitol FisherScientific BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated R&D Systems 511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 Sigma 60842-46-8
Isoflurane Halocarbon 12164-002-25
Leukotriene B4 Millipore Sigma 71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) BD Pharmingen 557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) BD Bioscience 553142
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
  3. Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
  4. Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
  6. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  7. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  8. Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
  9. Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
  10. Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
  11. Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
  12. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
  13. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
  14. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  15. Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
  16. Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
  17. Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
  18. Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
  19. Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
  20. Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
  21. Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
  22. Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
  23. Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
  24. Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
  25. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
  26. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
  27. Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
  28. Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
  29. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  30. Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
  31. Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
  32. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
  33. JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , JoVE, Cambridge, MA. e5024 (2020).
  34. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  35. Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
  36. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  37. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  38. Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
  39. Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
  40. Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
  41. Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
  42. Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
  43. Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 168 bağırsak bariyer fonksiyonu mukozal immünoloji bağırsak epitel geçirgenlik tahlili lökosit transepithelial göç tahlili ileal döngü proksimal kolon döngüsü floresan izotiyosiyanat (FITC)-dektran kemokin proinflamatuar sitokin
Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boerner, K., Luissint, A. C.,… More

Boerner, K., Luissint, A. C., Parkos, C. A. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (168), e62093, doi:10.3791/62093 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter