Summary
שיטת השתלת איונים מכוסה שומן זו מתאימה לאיתור איים מושתלים בחלל התוך-צפק. יש לציין כי היא אינה דורשת שימוש בחומרים מחייבים ביולוגיים או בתפירה.
Abstract
השתלת איון היא טיפול חלופי תאי לסוכרת קשה. החלל התוך-צפקי הוא בדרך כלל אתר ההשתלה להליך זה. עם זאת, להשתלת איון תוך-צפקית יש כמה מגבלות, כולל יעילות השתלה ירודה, יכולת זיהוי שתלים קשה והיעדר יכולת השתלה לניתוח לאחר ההשתלה. במאמר זה, "השתלת איון מכוסה שומן", שיטת השתלת איון תוך-צפקית המשתמשת ברקמת שומן לבנה אפידידימלית, משמשת להערכת ההשפעות הטיפוליות של איים מהונדסים ביולוגית. פשטות השיטה טמונה בזריעת איים על רקמת שומן לבן אפידידימלי ושימוש ברקמה לכיסוי האיונים. בעוד שניתן לסווג שיטה זו כטכניקת השתלת איון תוך-צפקית, היא חולקת מאפיינים עם השתלת איון רקמת שומן. עם זאת, שיטת השתלת האיים המכוסים בשומן מדגימה השפעות טיפוליות חזקות יותר מאשר השתלת איון רקמת שומן תוך-שומנית, כולל שיפור רמות הגלוקוז בדם והאינסולין בפלזמה והפוטנציאל להסרת שתלים. אנו ממליצים על אימוץ שיטה זו להערכת המנגנונים של השתלת איונים ברקמת שומן לבנה ואת ההשפעות הטיפוליות של איים מהונדסים ביולוגית.
Introduction
השתלת איים היא טיפול תחליפי תאים לחולים עם סוכרת קשה. דיווחים אחרונים הראו כי שיעורי עצמאות האינסולין בשלוש שנים לאחר ההשתלה משתפרים עד 44%1 וכי כ -80% מהמושתלים המקבלים יותר מ -600,000 שווה ערך לאיים בסך הכל משיגים עצמאות אינסולין2. יתר על כן, בדו"ח האחרון של מרשם השתלות האיים השיתופיים, התגלה כי רמות הגלוקוז בדם בצום נשמרו על 60-140 מ"ג/דצ"ל במשך תקופה של 5 שנים ביותר מ-70% מהחולים שעברו השתלת איון בלבד. המחקר גם קבע כי כ-90% מהחולים שקיבלו השתלת איון בלבד או השתלת איון לאחר השתלת כליה לא פיתחו אירועי היפוגליקמיה חמורים במשך למעלה מ-5 שנים3.
למרות שהתוצאות הקליניות של טיפול זה השתפרו, עדיין יש להתייחס לכמה מגבלות, כולל הצורך בהקמת אתר השתלה אופטימלי. הכבד הוא אתר השתלה טיפוסי להשתלת איונים קלינית מכיוון שהוא האיבר הגדול ביותר שיכול להכיל נפח גבוה של איונים. עם זאת, בחלק מהחולים הכבד אינו זמין (למשל, עקב יתר לחץ דם פורטלי, הפטיטיס ו / או שחמת4) ולכן אתרים אחרים, כולל החלל התת-קפסולרי הכלייתי5,6, שקית omental 7,8,9,10, mesentery 11, מערכת העיכול 12, שרירי השלד 13, רקמה תת עורית 13, מח עצם 14, וטחול 15 ,16,17, נחשבו כאתרי השתלה חלופיים.
למרות שהשתלת איון תוך-צפקית יכולה להתבצע בקלות בהרדמה מקומית, מה שהופך את החלל התוך-צפקי לאתר מושך להשתלת איון קלינית, עם ההשתלה, האיים מפוזרים לאורך כל החלל התוך-צפקי, מה שמקשה על זיהוי השתלת איון ואישור חריטה מוצלח. לכן, חלל intraperitoneal אינו מוכר באופן נרחב כאתר השתלה קליני אידיאלי. במקום זאת, הוא משמש לעתים קרובות כמודל בקרה למחקרים פרה-קליניים כדי לחקור את היעילות של 18 מושתלים18 ואיונים מהונדסים ביולוגית19. עם זאת, השוואה מדויקת בין איים מהונדסים ביולוגית לבין איי בקרה קשה להשיג בשל האתגרים בביצוע הערכת חריטה מדויקת.
לעומת זאת, השימוש ברקמת שומן לבנה תוך-צפקית בשקית האומנטלית8, במזנטריה ובמיקומים חוץ-כבדיים אחרים דווח היטב 10,20,21,22,23 ורבים מהמחקרים שבחנו את תפקודם של איים מהונדסים ביולוגית שהושתלו באמצעות רקמת שומן לבנה הצליחו לדווח על תוצאות טיפוליות מבטיחות20,24,25, 26. מכיוון שהשימוש ברקמת שומן אפידידימלית מקל על איתור איים מושתלים, פותחה "שיטת השתלת האיים המכוסים בשומן", תוך שימוש ברקמת שומן אפידידימלית, כדי להתגבר על המגבלות של השתלת איון תוך-צפקי. במאמר זה מתוארת השתלת איון מכוסה שומן באמצעות רקמת שומן אפידידימלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליך הבא מבוצע בשלושה שלבים. הצעד הראשון כולל השראת סוכרת בעכברים המקבלים ובידוד של איים תורמים. השלב השני כרוך בהכנת איים לפני ההשתלה. בשלב השלישי מתבצעת השתלת איון על רקמת השומן האפידידימלית וכיסוי האיים באמצעות רקמת השומן. לאחר מכן, ההשפעות הטיפוליות הוערכו. הטיפול בעכברים וההליכים הניסיוניים שבוצעו במחקר זה עולים בקנה אחד עם "עקרונות הטיפול בחיות מעבדה" (מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, המכונים הלאומיים לבריאות מהדורה8, 2011), והפרוטוקול הניסויי אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פוקואוקה (מספר אישור: 186018).
1. הכנה כירורגית
- אינדוקציה של סוכרת: לגרום לסוכרת במשקל גוף של 20-25 גרם, עכברים זכרים מושתלים בני 8-12 שבועות באמצעות הזרקה תוך ורידית של 18 מ"ג/מ"ל תמיסת סטרפטוזוטוצין שהוכנה בחיץ ציטראט של 0.1M (180 מ"ג/ק"ג משקל גוף). עכברים עם רמות גלוקוז בדם העולות על 400 מ"ג/דצ"ל נחשבים לחולי סוכרת. השתמש בעכברים סוכרתיים בתוך שבוע לאחר השראת סוכרת לפני ניוון מוגזם של רקמת השומן הלבן האפידידימלי לכיסוי איונים.
- בידוד איים: בצעו בידוד איון מורין יום אחד לפני ההשתלה בהתאם לשיטה27 של Gotoh לבידוד איון.
- בקצרה, לעכל רקמת הלבלב באמצעות פתרון collagenase. לבודד איונים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות באמצעות פתרון הפרדת תאים מתאים. לאחר מכן איים תרבותיים לילה באינקובטור ב 22 °C ו 5% CO2 (תרבות ב <37 °C דווח כדי למנוע מוות איון 28,29,30,31).
הערה: טפל בתרביות האיים המטוהרים בארון בטיחות. סנן-עקר את כל הפתרונות המשמשים לבידוד ותרבית איים באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
2. הכנת איים להשתלה
- אספו את המכשירים והחומרים המתאימים כפי שמצוין באיור 1A.
- מכיוון שאנזימי עיכול כמו עמילאז וליפאז עלולים לגרום לפגיעה באיים המבודדים והמושתלים, ואובדן של איונים יכול להתרחש כתוצאה מלהילכד ברקמות סיביות מזהמות בתוך צלחת התרבית, לפני ההשתלה, השתמשו במלקחיים כדי לבחור ידנית רכיבים חוץ-איונים מהלבלב, כולל אקסינאר ורקמות סיביות (איור 1B), תחת מיקרוסקופ מנתח. לאחר הקטיף, השתמש במסננת תאים כדי לסנן תאי אצנר בודדים.
- העבירו את האיים המסוננים לצלחת תרבית חדשה המכילה כל מדיום תרבית או תמיסת חיץ מתאימים (למשל, DMEM עם גלוקוז נמוך, RPMI1640, CMRL1066 או HBSS) בתוספת סרום בקר או אלבומין כדי למנוע חיבור איון לפלסטיק וסובבו את התבשיל כך שימקם את האיים במרכז המנה (איור 1C). באמצעות מיקרופיפטה P200 והמיקרוסקופ, בחרו את האיים הבודדים לתוך צינור איסוף מתאים (איור 1D).
- הניחו מסננת תאים חדשה בגודל 40 מיקרומטר על גבי צינור פלסטיק בנפח 50 מ"ל (איור 1E משמאל ובמרכז) ושטפו את המסנן במדיום טרי (איור 1E מימין).
- השתמשו בפיפטה של 1000 μL כדי להוסיף את האיים למסננת כדי להפריד בין האיים לתאי אצנר בודדים (איור 1 F1 ואיור 1F2).
הערה: האיים המטוהרים במסננת התא יהיו טהורים בכ-100%. - השתמשו במלקחיים כדי להפוך את המסננת על צלחת תרבית חדשה בגודל 60 או 100 מ"מ שאינה מטופלת, המכילה מדיום תרבית או תמיסת חיץ מתאימה בתוספת סרום בקר או אלבומין (איור 1 F3 ואיור 1F4). השתמשו במדיום/חיץ טרי כדי לשטוף את האיים למנת תרבות חדשה. לאחר מכן הוסיפו מספיק מדיום/חיץ למנת התרבית כדי להגיע לנפח כולל של כ-20 מ"ל.
- ספרו את האיים תחת מיקרוסקופ וחלקו את מספר האיים באופן שווה בין צינורות צנטריפוגות פלסטיק בודדים בגודל 1.5 מ"ל בהתאם למספר בעלי החיים התורמים (איור 1G). לדוגמה, מאתיים, 100-200 מיקרומטר שווה ערך איון (IEQ) משני עכברים יתווספו לכל אחד משני צינורות.
- צנטריפוגה של האיים ב 2,100 x גרם בתוך דקה אחת בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. כ-20-30 μL של תמיסה שיורית יישארו בדרך כלל בצינור (איור 1H).
3. השתלת איון על רקמת שומן אפידידימלית וכיסוי ברקמת שומן לבנה אפידידימלית
- לפני הניתוח, אספו מכונת הרדמה לבעלי חיים קטנים, מיקרוסקופ סטריאו, מקור אור, מיקרופיפט 50-200 μL עם קצוות מיקרופיפטה של 200 μL, מקלוני צמר גפן, ערכת תפירה של 4-0 וכלי ניתוח מחוטאים (איור 2A). אוטוקלאב את מספריים קופר, מספריים אופתלמיים, מלקחיים Pean מלקחיים, פינצטה, ומחזיקי מחטים. לאחר אוטוקלב, טבלו את הציוד בתמיסת 1% פובידון-יוד (איור 2A). השתמש צמר גפן לגיוס של רקמת השומן הלבן epididymal ועל hemostasis במקרים של דימום. השתמש micropipette עם 50-200 μL טיפים להשתלת איון.
- לספק הרדמה לעכבר מושתל סוכרת באמצעות חומר הרדמה בשאיפה (2% איזופלוראן בחמצן). יש למרוח חומר סיכה אופתלמי על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן הניחו את העכבר במצב שכיבה (איור 2B משמאל) והסירו את השיער מהבטן כדי למנוע זיהום באמצעות קוצצי שיער ו/או קרם דפילציה. חיטוי הבטן ואזור המפשעה באמצעות לפחות שלושה סיבובים מתחלפים של תמיסת פובידון-יוד ואחריה 70% אתנול (איור 2B מימין). לפני הניתוח יש לאשר את עומק ההרדמה באמצעות היעדר רפלקס צביטה בבוהן. ספק תמיכה תרמית תוך ניתוחית באמצעות כרית חימום והשתמש בווילון כירורגי כדי לאבטח את אזור הניתוח הסטרילי.
- חתכו את העור באזור החציוני התחתון (איור 2C משמאל). מומלץ לבצע חתך בעור שאורכו כ-2 ס"מ. הדקו את דופן הבטן השמאלית באמצעות מלקחיים מסוג Pean (ניתן להשתמש גם במלקחיים א-טראומטיים או במלקחיים) ומשכו את הרקמה לצד שמאל של העכבר כדי לאבטח את שדה הניתוח (איור 2C מימין). לאחר לפרוטומיה, להקטין את אחוז isoflurane ל 1.0-1.5% עבור תחזוקת הרדמה.
- השתמש בצמר גפן כדי לגייס את המעי הדק והגס לצד ימין של העכבר (כלומר, צד שמאל של המפעיל). רקמת השומן הלבנה האפידידימלית השמאלית בחלל הבטן ממוקמת באזור המפשעה השמאלי. גייסו את רקמת השומן הלבן האפידידימלי ואת האשך השמאלי אל מחוץ לבטן (איור 2D משמאל) ומתחו את הרקמה (2D מימין).
- השתמשו במיקרו-פיפטה P200 המצוידת בקצה פיפטה של 200 μL כדי לאסוף את כל נפח האיים מצינור אחד של 1.5 מ"ל עם פיפטינג עדין (איור 2E משמאל), ודאגו שלא יישארו איונים בצינור לאחר האיסוף. אפשרו לאיים שנאספו להתיישב בקצה הפיפטה באמצעות כוח הכבידה (איור 2E מימין).
- מניחים קלות את קצה המיקרופיפטה על רקמת השומן המנופחת. תוך הקפדה על מניעת שטיפה מוגזמת של המדיום/חיץ בקצה, זרעו בזהירות את האיים על הרקמה (איור 2F משמאל). לאחר הזריעה, אשרו מיקום נכון של האיים תחת מיקרוסקופ מנתח (איור 2F מימין).
- כסו את האיים ברקמת השומן הלבן האפידידימלי (איור 2G). אין צורך בשימוש בתפרים או בחומרים מחייבים ביולוגית.
- מקמו את האשך השמאלי מתחת לרקמת השומן הלבן האפידידימלי והחזירו את הרקמות לחלל התוך-צפק (איור 2H). סגרו את העור בשתי שכבות (פריטונאום, ואז שרירים ועור) באמצעות תפר 4-0 (ניתן להשתמש בתפרים כגון ניילון או תפרים נספגים) (איור 2I). להזריק חומצה אצטילסליצילית (300 מ"ג/ק"ג; SQ) ליד הפצע לשיכוך כאבים לאחר הניתוח. לאחר מכן הנח את העכבר מתחת למנורת חום ונטר עד להתאוששות מלאה.
4. ניטור לאחר השתלת איון (סיכום)
- הערך את ההשפעות הטיפוליות של השתלת איון על ידי ניטור רמת הגלוקוז בדם, בדיקת סבילות לגלוקוז והערכה היסטולוגית ביום שלאחר הניתוח (POD) 28.
- עקוב אחר רמת הגלוקוז בדם, כולל מדידות הגלוקוז בדם בבדיקת סבילות לגלוקוז, באמצעות מד סוכר קטן.
- לאסוף את דגימות הדם (קצת microliters) מווריד הזנב. לגבי הערכה היסטולוגית, אינסולין מורין (לאיתור איונים מושתלים) וגורם פון וילברנד (לגילוי כלי שיט, המהווה עדות לחריטת איים) התגלו באיים מושתלים ברקמת השומן האפידידימלית המשוחזרת על ידי אימונוהיסטוכימיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להשוות את יעילות ההשתלה של השתלת איון מכוסה שומן לזו שלאחר השתלת איון תוך-צפקי, אותו מספר של איים הושתל על הצפק בחלל הפרקולי השמאלי של בעלי חיים סוכרתיים מושתלי בקרה. רמות הגלוקוז בדם של עכברים עם השתלת איון מכוסה שומן נצפו לרדת בהדרגה ובאופן משמעותי בהשוואה לעכברים מושתלים באיון תוך-צפקי (p = 0.0023; איור 3A). חודש לאחר ההשתלה, רמת הגלוקוז בדם בעכברים עם השתלת איון מכוסה שומן נשמרה ברמות נמוכות יותר מזו שנצפתה בעכברים מושתלים באיים תוך-צפקיים, כפי שהוערך על ידי בדיקת סבילות לגלוקוז תוך-צפקית (p = 0.0046; איור 3B). יתר על כן, כפי שעשינו בעבר, דיווחנו כי רמות האינסולין בפלזמה השתפרו גם לאחר השתלת איון מכוסה שומן. כמו כן אושרה העלאה מחודשת של רמות הגלוקוז בדם. נתונים אלה מראים כי השתלת איון מכוסה שומן תוך-צפקית באמצעות 200 IEQs יכולה לשפר באופן משמעותי את מצבי הסוכרת של עכברים מושתלים.
בדיקה היסטולוגית בוצעה גם כדי להעריך את השתלת האיון ברקמת השומן הלבן האפידידימלי. בחיות מושתלות של איונים המכוסים שומן, צביעת המטוקסילין-אוזין חושפת את נוכחותם של איונים בתוך רקמת השומן הלבנה האפידידימלית (איור 3C, תמונה עליונה). בנוסף, צביעת נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים של איים חיוביים לאינסולין הקלה על זיהוי מיקרו-כלי דם חיוביים לגורם פון וילברנד בתוך רקמת השומן הלבן האפידידימלי של כל העכברים המקבלים (n = 6; איור 3C). לעומת זאת, בעכברים שהושתלו באיון תוך-צפקי, לא נצפו איים חקוקים ברקמת השומן הלבנה האפידידימלית או בדופן הבטן (הנתונים לא מוצגים).
איור 1-ABC. הכנת איים להשתלה על רקמת שומן אפידידימלית וכיסוי ברקמת שומן לבנה אפידידימלית. (A) הכנת מכשירים: א. סיוע בפיפטה, ב. 10 מ"ל טיפים לפיפטה, ג. 50 מ"ל צינורות פלסטיק, ד. 15 מ"ל צינורות פלסטיק, ה. 50-200 μL (משמאל) ו 200-1000 μL (מימין) מיקרופיפטים, f. 1.5 mL צינורות צנטריפוגה פלסטיק, g. 200 ו 1000 μL טיפים micropipette, h. בינוני או חיץ המכיל אלבומין או סרום בקר עוברי (כלומר, DMEM עם גלוקוז נמוך המכיל 10% סרום בקר עוברי ו 100 U/mL פניצילין + 100 U/mL סטרפטומיצין תמיסה), ו-i. מסננת תאים בקוטר 40 מיקרומטר. (B) איים מבודדים עם אצ'ינאר (משמאל: מסומן בחץ) ורקמות סיביות (מימין). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (C) איים שנאספו בצינור הפלסטיק. שמאלה, איים מפוזרים בצלחת תרבות. במרכז, איים נאספים במרכז צלחת התרבות על ידי מערבולת. נכון, איים שנאספו במרכז המנה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 1-DEF. הכנת איים להשתלה על רקמת שומן אפידידימלית וכיסוי ברקמת שומן לבנה אפידידימלית. (D) איים שנאספו (משמאל) מועברים לצינורות פלסטיק של 15 מ"ל (מימין). (E) מסננת התאים בקוטר 40 מיקרומטר מונחת על גבי צינור הפלסטיק שגודלו 50 מ"ל (משמאל וממרכז). מדיום/חיץ מוכן שנוסף לצינור פלסטיק אחר של 50 מ"ל לשטיפת איים על מסננת התאים לצלחת תרבית חדשה (מימין). (ו) 1. איים שנאספו באמצעות מיקרופיפט של 200-1000 μL. 2. איים שנשפכו לתוך מסננת התא. 3 ו-4. מדיום/חיץ המשמש לשטיפת איונים על מסננת לתוך צלחת תרבות חדשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 1-GH. הכנת איים להשתלה על רקמת שומן אפידידימלית וכיסוי ברקמת שומן לבנה אפידידימלית. (G) איים המחולקים לצינור צנטריפוגה פלסטי 1.5 מ"ל לפי מספר העכברים המקבלים. כאן, מאתיים 100-200 מיקרומטר שווה ערך (IEQ) חולקו שווה בשווה לכל צינור. (H) איים מחולקים שווה בשווה בצינורות של 1.5 מ"ל לפני הצנטריפוגה (משמאל). איים צנטריפוגה לאיסוף בתחתית הצינור (במרכז). 20-30 μL של supernatant להישאר בצינור לאחר השלכת תמיסה עודפת (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2-ABC. הליך השתלת איון על רקמת שומן אפידידימלית וכיסוי באמצעות רקמת שומן לבן אפידידימלי. (A) הכנת מכשירים: א. מכונת הרדמה לבעלי חיים קטנים, ב. מיקרוסקופ סטריאו, ג. מקור אור, ד. מכשירי ניתוח מחוטאים, ה. איים מחולקים בצינורות פלסטיק 1.5 מ"ל, f. 50-200 μL micropipettes, g. 200 μL טיפים micropipette, ו h. 4-0 תפרים. (B) עכבר מושתל סוכרת במצב שכיבה בהרדמה כללית של 2% איזופלורן (משמאל). הבטן ואזור המפשעה מחוטאים באמצעות 70% אתנול ומכוסים על ידי מגבון מעבדה מנייר (מימין). (C) העור נוטה במיקום חציוני נמוך יותר (משמאל). דופן הבטן השמאלית מהודקת על ידי מלקחיים Pean ונמשכת לצד שמאל של העכבר כדי לאבטח שדה ניתוח (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2-DEF. הליך השתלת איון על רקמת שומן אפידידימלית וכיסוי באמצעות רקמת שומן לבן אפידידימלי. (D) רקמת השומן הלבן האפידידימלי השמאלי והאשך השמאלי מגויסים מחוץ לבטן (משמאל) ומנוקדים (מימין). סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (E) איים בצינורות פלסטיק של 1.5 מ"ל נאספים לחלוטין באמצעות מיקרופיפטה עם קצה פיפטה של 200 μL (משמאל). איים שנאספו (מסומנים על ידי חץ) מותר לשקוע לחלוטין על ידי כוח הכבידה לקצה פיפטה (מימין). (F) קצה מיקרופיפטה מונח קלות על רקמת השומן המנופחת (משמאל). זריעת איון (עיגול מנוקד) על הרקמה מאושרת על ידי ניתוח מיקרוסקופ (מימין). סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2-GHI. הליך השתלת איון על רקמת שומן אפידידימלית וכיסוי באמצעות רקמת שומן לבן אפידידימלי. (G) האיים מכוסים ברקמת שומן לבנה אפידידימלית. (H) אשך שמאלי ורקמת שומן לבן אפידידימלי חזרו לחלל תוך-צפקי. (I) תמונה לאחר סגירת בטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3. ההשפעה הטיפולית של השתלת איון מכוסה שומן. (A) רמת הגלוקוז בדם. קו כחול: השתלת איון מכוסה שומן (n = 6); קו כתום: השתלת איון תוך צפקי (n = 6) ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מדידות חוזרות ונשנות ניתוח שונות והבדל משמעותי הוגדר כ- p < 0.05. (B) רמת הגלוקוז בדם מבדיקת סבילות לגלוקוז חודש לאחר ההשתלה. קו כחול: השתלת איון מכוסה שומן (n = 6); קו כתום: השתלת איון תוך צפקי (n = 6). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מדידות חוזרות ונשנות ניתוח שונות והבדל משמעותי הוגדר כ- p < 0.05. (C) תמונה היסטולוגית של איים חקוקים חודש לאחר ההשתלה. תמונה עליונה: מכתים המטוקסילין-אוזין; תמונה תחתונה: אימונוהיסטוסטינינג עבור אינסולין מורין (ירוק) וגורם פון וילברנד (vWF: אדום, מסומן על ידי חץ לבן). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת השתלת האיים המכוסים בשומן משלבת טכניקות משתי טכניקות השתלה שונות: השתלת איון תוך-צפקי והשתלת איון רקמת שומן. מכיוון שקרום פני השטח של רקמת השומן הלבן האפידידימלי נחשב לרקמת השומן הלבנה המכוסה על ידי הצפק ומחוברת לאפידידימיס, ניתן לסווג אנטומית את שיטת השתלת האיים המכוסים בשומן כסוג של השתלת איון תוך-צפקי. עם זאת, הטכניקה שבה האיים מועברים לבעל החיים המקבל דומה יותר לזו המשמשת בהשתלת איון תוך שומן. הנתונים שלנו מראים כי ההשפעה הטיפולית של שיטת השתלת האיים המכוסים בשומן עדיפה על זו של השתלת איון תוך-צפקי. המחקר הקודם שלנו הראה גם כי יעילות ההשתלה של שיטה זו כמעט שווה לזו של השתלת איון תת-קפסולרי כליתי, שיטה של השתלת איון עם יעילות השתלה עליונה23. משערים כי התועלת של שיטה זו עשויה לנבוע ממולקולות ההידבקות הנמצאות בתוך רקמות שומן לבן ואדיפוציטוקינים, ואשר נחשבות כתורמות להשתלת איון10,23.
גודל רקמת השומן הלבן האפידידימלי מאפשר להכיל נפח גדול של איונים. לעומת זאת, האומנטום הגדול יותר של המכרסם קטן מכדי להכיל ולגשת בקלות לאיונים רבים. המגבלה הפיזית היחידה של רקמת השומן הלבן האפידידימלי כאתר השתלת איון ניסיוני פוטנציאלי היא שהיא אינה מספקת זרימת פורטל של אינסולין10.
השיטה ייחודית משום שהאיים מכוסים ברקמות שומן, במקום להיות מוחדרים ישירות לרקמה. איונים מושתלים ברקמת תוך שומן עלולים לסבול מהשפעת ליפוטוקסיות, שכן תפקוד האינסולין הלקוי בבעלי חיים סוכרתיים עלול להוביל לעודף חומצות שומן חופשיות32. שיטה זו גם אינה דורשת סוכני ביו-בונדינג או תפירה כדי למנוע אובדן איון מושתל. כפי שנצפה באיור 3C, איים נשארים חקוקים בהצלחה בתוך רקמת השומן עד חודש לאחר ההשתלה ושמירה על רמת הגלוקוז בדם אושרה לאחר כריתת השתלה23. תופעה זו עשויה לנבוע מהיכולת של רקמת השומן ללכוד את האיונים, אשר הופכים קשים לקילוף.
היתרונות של שיטה זו הם שהיא קלה מבחינה טכנית לביצוע, מאפשרת הערכה מטבולית והיסטולוגית של ההשפעות הטיפוליות של האיונים, ומקלה על הערכת ביטוי הגן ו/או החלבון של האיים לאחר כריתת שד. בהשוואה למחקרים קודמים, היעילות של שיטה זו אינה נחותה מזו של השתלת איון לרקמת שומן לבנה אפידידימלית 10,33,34,35,36. חשוב לציין כי זריעה מדויקת של האיים על רקמת השומן הלבן האפידידימלי ללא אובדן איים הכרחית לחריטה מוצלחת. כדי להבטיח הצלחה, יש לשאוף בעדינות את כל נפח האיים לתוך קצה המיקרופיפטה מצינור הפלסטיק של 1.5 מ"ל, שכן פיפטינג מחוספס ומהיר עלול לגרום להידבקות איון לדפנות צינור הפלסטיק, מה שמקשה על החלוקה. הידבקות איים היא סיבה מרכזית לזריעה לא מספקת של איים. לאחר מתן אפשרות לאיונים להתיישב בקצה קצה המיקרופיפטה, יש להשתיל את האיים על רקמת השומן האפידידימלית מבלי לשטוף. חשוב למזער את הדיכאון של כפתור הבוכנה בעת שאיפה וחלוקה של האיים כדי למנוע שטיפה בינונית/חוצצת מוגזמת של רקמת השומן. לכן, חיוני להמתין עד שהאיים יצטברו לחלוטין בקצה קצה המיקרופיפטה לפני שתדכאו את כפתור הבוכנה של המיקרופיפטה להשתלה. מספיק להניח את הקצה קלות על רקמת השומן ולאשר את זריעת האיונים על הרקמה על ידי מיקרוסקופיית אור.
לסיכום, שיטה זו היא פשוטה מאוד, למרות הדרישה למספר צעדים קריטיים להצלחתה. אנו מקווים לאימוץ נרחב של שיטה זו כדי לסייע עוד יותר בהקלה על השתלת איונים על רקמת שומן לבנה ולהערכה נוספת של ההשפעות הטיפוליות של איים מהונדסים ביולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו ניגוד עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענק סיוע למחקר מדעי (C) (19K09839, NS) ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
- Barton, F. B., et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
- Balamurugan, A. N., et al. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010. American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).
- Collaborative Islet Transplant Registry. Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).
- Rajab, A., et al. Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection. Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).
- Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen. Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).
- Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation. Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).
- Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch. Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).
- Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch. American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).
- Kasoju, N., et al. Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules. Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation. Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).
- Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation. Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).
- Fujita, M., et al. Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs. Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).
- Sakata, N., et al. Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).
- Cantarelli, E., et al. Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver. Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).
- White, S. A., et al. The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation. Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).
- Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice. PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).
- Sakata, N., et al. Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival. Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).
- Nagaya, M., et al. Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).
- Weaver, J. D., et al. Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites. Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).
- Chen, X., et al. The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass. Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).
- Sakata, N., et al. Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue. Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).
- Navarro-Requena, C., et al. PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation. Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).
- Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes. Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).
- Manzoli, V., et al. Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol. American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions. Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).
- Noguchi, H., et al. Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation. Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).
- Itoh, T., et al. Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model. Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).
- Komatsu, H., et al. Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets. Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).
- Unger, R. H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome. Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).
- Mao, D., et al. A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival. Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).
- Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).
- Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice. Biomaterials. 138, 80-90 (2017).
- Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice. Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).
