Summary
Este método de transplante de ilhotas cobertas de gordura é adequado para a detecção de ilhotas enxertadas na cavidade intraperitoneal. Notavelmente, não requer o uso de agentes bioligantes ou sutura.
Abstract
O transplante de ilhotas é uma terapia de reposição celular para diabetes mellitus grave. A cavidade intraperitoneal é tipicamente o local de transplante para este procedimento. No entanto, o transplante de ilhotas intraperitoneais tem algumas limitações, incluindo baixa eficácia do transplante, difícil capacidade de detecção do enxerto e falta de capacidade de enxertectomia para análise pós-transplante. Neste artigo, o "transplante de ilhotas cobertas de gordura", um método de transplante de ilhotas intraperitoneais que utiliza tecido adiposo branco epididimal, é usado para avaliar os efeitos terapêuticos de ilhotas de bioengenharia. A simplicidade do método reside na semeadura de ilhotas no tecido adiposo branco epididimal e no uso do tecido para cobrir as ilhotas. Embora este método possa ser categorizado como uma técnica de transplante de ilhotas intraperitoneais, ele compartilha características com o transplante de ilhotas de tecido adiposo. O método de transplante de ilhotas cobertas de gordura demonstra efeitos terapêuticos mais robustos do que o transplante de ilhotas de tecido adiposo, no entanto, incluindo a melhoria dos níveis de glicose no sangue e insulina plasmática e o potencial para a remoção do enxerto. Recomenda-se a adoção deste método para avaliar os mecanismos de enxerto de ilhotas em tecido adiposo branco e os efeitos terapêuticos de ilhotas de bioengenharia.
Introduction
O transplante de ilhotas é uma terapia de reposição celular para pacientes com diabetes mellitus grave. Relatórios recentes têm mostrado que as taxas de independência de insulina em três anos após o transplante melhoram até 44%1 e que aproximadamente 80% dos receptores que recebem mais de 600.000 equivalentes totais de ilhotas atingem a independência da insulina2. Além disso, no mais recente relatório do Registro Colaborativo de Transplante de Ilhotas, foi revelado que os níveis de glicose no sangue em jejum foram mantidos em 60-140 mg / dL por um período de 5 anos em mais de 70% dos pacientes que foram submetidos apenas ao transplante de ilhotas. O estudo também determinou que cerca de 90% dos pacientes que receberam transplante de ilhotas isoladamente ou transplante de ilhotas após o transplante renal não desenvolveram nenhum evento hipoglicêmico grave por mais de 5 anos3.
Embora os desfechos clínicos desse tratamento tenham melhorado, algumas limitações ainda devem ser abordadas, incluindo a necessidade de estabelecer um local ideal para o transplante. O fígado é um local de transplante típico para o transplante clínico de ilhotas porque é o maior órgão que pode acomodar um alto volume de ilhotas. No entanto, em alguns pacientes, o fígado não está disponível (por exemplo, devido à hipertensão portal, hepatite e/ou cirrose4) e, portanto, a outros locais, incluindo o espaço subcapsular renal5,6, bolsa omental 7,8,9,10, mesentério 11, trato gastrointestinal 12, músculo esquelético 13, tecido subcutâneo13, medula óssea 14 e baço 15 ,16,17, têm sido considerados como locais alternativos de transplante.
Embora o transplante intraperitoneal de ilhotas possa ser realizado facilmente sob anestesia local, tornando a cavidade intraperitoneal um local atraente para o transplante clínico de ilhotas, após o transplante, as ilhotas são dispersas por toda a cavidade intraperitoneal, dificultando a detecção do enxerto de ilhotas e a confirmação bem-sucedida do enxerto. Portanto, a cavidade intraperitoneal não é amplamente reconhecida como um local ideal de transplante clínico. Em vez disso, é frequentemente utilizado como um modelo de controle para estudos pré-clínicos para investigar a eficácia de ilhotas encapsuladastransplantadas 18 e de ilhotas de bioengenharia19. No entanto, uma comparação exata entre a bioengenharia e as ilhotas de controle é difícil de alcançar devido aos desafios na realização de uma avaliação precisa do enxerto.
Em contraste, o uso de tecido adiposo branco intraperitoneal na bolsa omental8, mesentério e outras localizações extra-hepáticas tem sido bem relatado 10,20,21,22,23 e muitos dos estudos que investigaram a função de ilhotas de bioengenharia transplantadas com tecido adiposo branco foram capazes de relatar resultados terapêuticos promissores 20,24,25, 26. Como o uso de tecido adiposo epididimal facilita a detecção de ilhotas transplantadas, o "método de transplante de ilhotas cobertas de gordura", utilizando tecido adiposo epididimal, foi desenvolvido para superar as limitações do transplante de ilhotas intraperitoneais. Neste trabalho, o transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo epididimal é descrito.
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Protocol
O procedimento a seguir é executado em três etapas. O primeiro passo inclui a indução de diabetes nos camundongos receptores e o isolamento das ilhotas doadoras. A segunda etapa envolve a preparação de ilhotas antes do transplante. Na terceira etapa, é realizado o transplante de ilhotas no tecido adiposo epididimal e a cobertura das ilhotas utilizando o tecido adiposo. Em seguida, os efeitos terapêuticos foram avaliados. O manuseio dos camundongos e os procedimentos experimentais realizados neste estudo estão em conformidade com os ''Princípios de Cuidados com Animais de Laboratório'' (Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, National Institutes of Health publicação8ª edição, 2011), e o protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Fukuoka (número de aprovação: 186018).
1. Preparação cirúrgica
- Indução de diabetes: Induzir diabetes em camundongos machos receptores de 8-12 mg de peso corporal de 20-25 g de idade através de injeção intravenosa de solução de estreptozotocina de 18 mg/mL preparada em tampão de citrato 0,1M (180 mg/kg de peso corporal). Ratos com níveis de glicose no sangue superiores a 400 mg / dL são considerados diabéticos. Use ratos diabéticos dentro de 1 semana após a indução do diabetes antes da atrofia excessiva do tecido adiposo branco epididimal para cobrir ilhotas.
- Isolamento de ilhotas: Realizar isolamento de ilhotas murinas um dia antes do transplante seguindo o método de Gotoh27 para isolamento de ilhotas.
- Em resumo, digerir o tecido pancreático usando solução de colagenase. Isolar ilhotas por centrifugação por gradiente de densidade utilizando uma solução de separação celular apropriada. Em seguida, cultivar ilhotas durante a noite em uma incubadora a 22 °C e 5% de CO2 (cultura a <37 °C foi relatada para prevenir a morte de ilhotas 28,29,30,31).
NOTA: Manuseie as culturas de ilhotas purificadas em um armário de segurança. Filtrar-esterilizar todas as soluções utilizadas para isolamento e cultura de ilhotas usando um filtro de 0,22 μm.
2. Preparação de ilhotas para transplante
- Reúna os instrumentos e materiais apropriados, conforme indicado na Figura 1A.
- Como enzimas digestivas como amilase e lipase podem resultar em lesões nas ilhotas isoladas e transplantadas e uma perda de ilhotas pode ocorrer por estarem presas em tecidos fibrosos contaminantes dentro da placa de cultura, antes do transplante, use fórceps para escolher a dedo quaisquer componentes extra-ilhotas do pâncreas, incluindo tecidos acinares e fibrosos (Figura 1B), sob um microscópio de dissecação. Após a colheita, use um filtro de células para filtrar células acinares únicas.
- Transfira as ilhotas filtradas para uma nova placa de cultura contendo qualquer meio de cultura apropriado ou solução tampão (por exemplo, DMEM com baixa glicose, RPMI1640, CMRL1066 ou HBSS) suplementada com soro bovino ou albumina para evitar a fixação das ilhotas ao plástico e girar o prato para posicionar as ilhotas no centro do prato (Figura 1C). Usando uma micropipeta P200 e o microscópio, escolha as ilhotas individuais em um tubo de coleta apropriado (Figura 1D).
- Coloque um novo filtro celular de 40 μm em cima de um tubo de plástico de 50 mL (Figura 1E esquerda e centro) e lave o filtro com meio fresco (Figura 1E à direita).
- Use uma pipeta de 1000 μL para adicionar as ilhotas ao filtro para separar as ilhotas e as células acinares únicas (Figura 1 F1 e Figura 1F2).
NOTA: As ilhotas purificadas no filtro celular serão aproximadamente 100% puras. - Use fórceps para inverter o filtro em uma nova placa de cultura não tratada de 60 ou 100 mm contendo meio de cultura ou uma solução tampão apropriada suplementada com soro bovino ou albumina (Figura 1 F3 e Figura 1F4). Use meio fresco / tampão para lavar as ilhotas em um novo prato de cultura. Em seguida, adicione meio / tampão suficiente ao prato de cultura para atingir um volume total de aproximadamente 20 mL.
- Contar as ilhotas ao microscópio e dividir o número de ilhotas igualmente entre tubos de centrífuga plástica individuais de 1,5 mL de acordo com o número de animais doadores (Figura 1G). Por exemplo, duzentos equivalentes de ilhotas de 100-200 μm (IEQ) de dois ratos seriam adicionados a cada um dos dois tubos.
- Centrifugar as ilhotas a 2.100 x g no prazo de 1 minuto à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante. Cerca de 20-30 μL de solução residual normalmente permanecerão no tubo (Figura 1H).
3. Transplante de ilhotas para tecido adiposo epididimal e cobertura com tecido adiposo branco epididimal
- Antes da cirurgia, coletar uma máquina de anestesia para animais de pequeno porte, microscópio estéreo, fonte de luz, micropipeta de 50-200 μL com pontas de micropipeta de 200 μL, cotonetes, conjunto de sutura 4-0 e instrumentos cirúrgicos desinfetados (Figura 2A). Autoclave a tesoura de tanoeiro, tesoura oftálmica, pinça de ervilha, pinça e suportes de agulhas. Após a autoclavagem, imergir o equipamento em solução de iodopovidona a 1% (Figura 2A). Use cotonetes para mobilização do tecido adiposo branco epididimal e para hemostasia em casos de sangramento. Use uma micropipeta com pontas de 50-200 μL para transplante de ilhotas.
- Administrar anestesia ao rato receptor diabético utilizando um agente anestésico inalado (isoflurano a 2% em oxigénio). Aplique lubrificante oftálmico em ambos os olhos para evitar a secagem. Em seguida, coloque o rato na posição supina (Figura 2B à esquerda) e remova o cabelo do abdômen para evitar a infecção usando cortadores de cabelo e / ou creme depilatório. Desinfetar o abdome e a região inguinal utilizando pelo menos três rodadas alternadas de solução de iodopovidona seguida de etanol a 70% (Figura 2B à direita). Antes da cirurgia, confirme a profundidade da anestesia através da ausência de um reflexo de pinça do dedo do pé. Forneça suporte térmico intraoperatório usando uma almofada de aquecimento e use uma cortina cirúrgica para proteger a área cirúrgica estéril.
- Incidir a pele na área mediana inferior (Figura 2C à esquerda). Recomenda-se uma incisão na pele com aproximadamente 2 cm de comprimento. Aperte a parede abdominal esquerda com a pinça de ervilha (pinça atraumática ou afastador também pode ser usado) e puxe o tecido para o lado esquerdo do rato para fixar o campo cirúrgico (Figura 2C à direita). Após a laparotomia, diminua a porcentagem de isoflurano para 1,0-1,5% para manutenção da anestesia.
- Use um cotonete para mobilizar o intestino delgado e grosso para o lado direito do rato (ou seja, o lado esquerdo do operador). O tecido adiposo branco epididimal esquerdo na cavidade abdominal está localizado na área inguinal esquerda. Mobilizar o tecido adiposo branco epididimal e o testículo esquerdo para fora do abdômen (Figura 2D esquerda) e esticar o tecido (2D à direita).
- Use uma micropipeta P200 equipada com uma ponta de pipeta de 200 μL para coletar todo o volume de ilhotas de um tubo de 1,5 mL com pipetagem suave (Figura 2E à esquerda), cuidando para que nenhuma ilhota seja deixada no tubo após a coleta. Permitir que as ilhotas coletadas se depositem na ponta da pipeta por gravidade (Figura 2E à direita).
- Coloque a ponta da micropipeta levemente sobre o tecido adiposo distendido. Tomando cuidado para evitar a lavagem excessiva do meio/tampão na ponta, semeie cuidadosamente as ilhotas no tecido (Figura 2F à esquerda). Após a semeadura, confirme a colocação correta das ilhotas sob um microscópio de dissecação (Figura 2F à direita).
- Cobrir as ilhotas com o tecido adiposo branco epididimal (Figura 2G). O uso de suturas ou agentes bioligantes não é necessário.
- Colocar o testículo esquerdo sob o tecido adiposo branco epididimal e devolver os tecidos à cavidade intraperitoneal (Figura 2H). Feche a pele em duas camadas (peritônio, depois músculo e pele) usando uma sutura 4-0 (quaisquer suturas como nylon ou suturas absorvíveis podem ser usadas) (Figura 2I). Injetar ácido acetilsalicílico (300 mg/kg; SQ) próximo à ferida para analgesia pós-operatória. Em seguida, coloque o mouse sob uma lâmpada de calor e monitore até a recuperação completa.
4. Monitorização após transplante de ilhotas (Resumo)
- Avaliar os efeitos terapêuticos do transplante de ilhotas por meio do monitoramento da glicemia, teste de tolerância à glicose e avaliação histológica no dia de pós-operatório (DPO) 28.
- Monitore a glicose no sangue, incluindo as medições de glicose no sangue no teste de tolerância à glicose, usando um pequeno medidor de glicose.
- Colete as amostras de sangue (um pouco de microlitros) da veia da cauda. Em relação à avaliação histológica, a insulina murina (para detecção de ilhotas enxertadas) e o fator de von Willebrand (para detecção de vasos, que é uma evidência de enxerto de ilhotas) foram detectados em ilhotas transplantadas no tecido adiposo epididimal recuperado por imuno-histoquímica.
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Representative Results
Para comparar a eficácia do transplante do transplante de ilhotas cobertas de gordura com a do transplante de ilhotas intraperitoneais, o mesmo número de ilhotas foi implantado no peritônio no espaço paracólico esquerdo dos animais diabéticos receptores de controle. Observou-se que os níveis de glicose no sangue de camundongos com transplante de ilhotas cobertas de gordura diminuíram gradual e significativamente em comparação com camundongos transplantados de ilhotas intraperitoneais (p = 0,0023; Figura 3A). Um mês após o transplante, a glicemia em camundongos com transplante de ilhotas cobertas de gordura foi mantida em níveis mais baixos do que os observados em camundongos transplantados de ilhotas intraperitoneais, conforme avaliado pelo teste intraperitoneal de tolerância à glicose (p = 0,0046; Figura 3B). Além disso, como já relatamos anteriormente, que os níveis plasmáticos de insulina também melhoraram após o transplante de ilhotas cobertas de gordura. A reelevação dos níveis glicêmicos também foi confirmada. Esses dados demonstram que o transplante intraperitoneal de ilhotas cobertas de gordura usando 200 IEQs pode melhorar significativamente as condições diabéticas de camundongos receptores.
O exame histológico também foi realizado para avaliar o enxerto de ilhotas no tecido adiposo branco epididimal. Em animais receptores de transplante de ilhotas cobertas de gordura, a coloração de hematoxilina-eosina revela a presença de ilhotas dentro do tecido adiposo branco epididimal (Figura 3C, imagem superior). Além disso, a coloração de anticorpos conjugados com fluorescência de ilhotas insulino-positivas facilitou a detecção de microvasos positivos para o fator de von Willebrand dentro do tecido adiposo branco epididimal de todos os camundongos receptores (n = 6; Figura 3C). Em contraste, em camundongos transplantados de ilhotas intraperitoneais, não foram observadas ilhotas enxertadas no tecido adiposo branco epididimal ou na parede abdominal (dados não mostrados).
Figura 1-ABC. Preparação de ilhotas para transplante em tecido adiposo epididimal e cobertura com tecido adiposo branco epididimal. (A) Preparação de instrumentos: a. pipeta auxiliar, b. pontas de pipeta de 10 ml, c. 50 ml de tubos de plástico, d. 15 ml de tubos de plástico, e. 50-200 μL (esquerda) e 200-1000 μL (direita) micropipetas, f. 1,5 ml de tubos de centrífuga plástica, g. 200 e 1000 μL de pontas de micropipeta, h. meio ou tampão contendo albumina ou soro fetal bovino (ou seja, DMEM com baixa glicose contendo 10% de soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina + 100 U/mL de solução de estreptomicina), e i. filtro celular de 40 μm. (B) Ilhotas isoladas com tecidos acinares (à esquerda: indicados por seta) e fibrosos (à direita). Barra de escala = 200 μm. (C) Ilhotas coletadas no tubo de plástico. Esquerda, ilhotas dispersas no prato da cultura. Centro, ilhotas são coletadas no centro do prato de cultura por rodopio. À direita, ilhotas coletadas no centro do prato. Barra de escala = 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1-DEF. Preparação de ilhotas para transplante em tecido adiposo epididimal e cobertura com tecido adiposo branco epididimal. (D) As ilhotas coletadas (esquerda) são transferidas para tubos plásticos de 15 mL (direita). (E) O filtro celular de 40 μm é colocado em cima do tubo de plástico de 50 mL (esquerdo e central). Meio/tampão preparado adicionado a outros 50 mL de tubo de plástico para lavar ilhotas no filtro celular em um novo prato de cultura (à direita). (F) 1. Ilhotas coletadas usando uma micropipeta de 200-1000 μL. 2. Ilhotas derramadas no filtro celular. 3 e 4. Meio/tampão usado para lavar ilhotas no coador em um novo prato de cultura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1-GH. Preparação de ilhotas para transplante em tecido adiposo epididimal e cobertura com tecido adiposo branco epididimal. (G) Ilhotas divididas em tubo de centrífuga plástica de 1,5 mL de acordo com o número de camundongos receptores. Aqui, duzentos 100-200 μm de ilhotas equivalentes (IEQ) foram divididos igualmente em cada tubo. (H) Ilhotas divididas igualmente em tubos de 1,5 mL antes da centrifugação (esquerda). Ilhotas centrifugadas para coletar no fundo do tubo (centro). 20-30 μL de sobrenadante permanecem no tubo após o descarte do excesso de solução (à direita). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2-ABC. O procedimento de transplante de ilhotas no tecido adiposo epididimal e cobertura usando tecido adiposo branco epididimal. (A) Preparação de instrumentos: a. máquina de anestesia para pequenos animais, b. microscópio estéreo, c. fonte de luz, d. instrumentos cirúrgicos desinfetados, e. ilhotas divididas em tubos plásticos de 1,5 mL, micropipetas de f. 50-200 μL, pontas de micropipeta de g. 200 μL e suturas h. 4-0. (B) Rato receptor diabético em decúbito dorsal sob anestesia geral de isoflurano a 2% (esquerda). O abdômen e a região inguinal são desinfetados com etanol a 70% e cobertos por um lenço de papel (à direita). (C) A pele é incisada na posição mediana inferior (esquerda). A parede abdominal esquerda é pinçada por pinça de ervilha e puxada para o lado esquerdo do rato para proteger o campo cirúrgico (direito). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2-DEF. O procedimento de transplante de ilhotas no tecido adiposo epididimal e cobertura usando tecido adiposo branco epididimal. (D) O tecido adiposo branco epididimal esquerdo e o testículo esquerdo são mobilizados para fora do abdome (esquerda) e distendidos (direita). Barra de escala = 1 cm. (E) Ilhotas em tubos de plástico de 1,5 mL são completamente coletadas usando uma micropipeta com ponta de pipeta de 200 μL (esquerda). Ilhotas coletadas (indicadas por seta) deixadas afundar completamente por gravidade até a ponta da pipeta (à direita). (F) Ponta da micropipeta levemente colocada sobre o tecido adiposo distendido (à esquerda). Semeadura de ilhotas (círculo pontilhado) no tecido confirmada por microscópio de dissecação (à direita). Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2-GHI. O procedimento de transplante de ilhotas no tecido adiposo epididimal e cobertura usando tecido adiposo branco epididimal. (G) As ilhotas são cobertas com tecido adiposo branco epididimal. (H) Testículo esquerdo e tecido adiposo branco epididimal retornaram à cavidade intraperitoneal. (I) Imagem após o fechamento do abdômen. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. O efeito terapêutico do transplante de ilhotas cobertas de gordura. (A) Nível de glicose no sangue. Linha azul: transplante de ilhotas cobertas de gordura (n = 6); Linha laranja: transplante intraperitoneal de ilhotas (n = 6) A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância de medidas repetidas e uma diferença significativa foi definida como p < 0,05. (B) Nível de glicose no sangue do teste de tolerância à glicose um mês após o transplante. Linha azul: transplante de ilhotas cobertas de gordura (n = 6); Linha laranja: transplante intraperitoneal de ilhotas (n = 6). A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância de medidas repetidas e uma diferença significativa foi definida como p < 0,05. (C) Imagem histológica de ilhotas enxertadas um mês após o transplante. Imagem superior: coloração de hematoxilina-eosina; Imagem inferior: imuno-histocoloração para insulina murina (verde) e fator de von Willebrand (FvW: vermelho, indicado por seta branca). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de transplante de ilhotas cobertas de gordura incorpora técnicas de duas técnicas de transplante diferentes: transplante de ilhotas intraperitoneais e transplante de ilhotas de tecido adiposo. Como a membrana superficial do tecido adiposo branco epididimal é considerada o tecido adiposo branco que é coberto pelo peritônio e que está ligado ao epidídimo, o método de transplante de ilhotas cobertas de gordura pode ser anatomicamente categorizado como um tipo de transplante de ilhotas intraperitoneais. A técnica pela qual as ilhotas são entregues ao animal receptor, no entanto, são mais semelhantes às utilizadas no transplante de ilhotas intra-adiposas. Nossos dados mostram que o efeito terapêutico do método de transplante de ilhotas cobertas de gordura é superior ao do transplante de ilhotas intraperitoneais. Nosso estudo anterior também mostrou que a eficácia do transplante desse método é quase igual à do transplante de ilhotas subcapsulares renais, um método de transplante de ilhotas com suprema eficácia de transplante23. Especula-se que a utilidade desse método possa ser devida às moléculas de adesão presentes nos tecidos adiposos brancos e adipocitocinas e que se acredita contribuírem para o enxerto de ilhotas 10,23.
O tamanho do tecido adiposo branco epididimal permite que um grande volume de ilhotas seja acomodado. Em contraste, o omento maior do roedor é pequeno demais para conter e acessar facilmente muitas ilhotas. A única limitação física do tecido adiposo branco epididimal como potencial local experimental de transplante de ilhotas é que ele não fornece uma circulação portal de insulina10.
O método é único porque as ilhotas são cobertas com tecidos adiposos, em vez de serem infundidas diretamente no tecido. Ilhotas transplantadas de tecido adiposo intraadiposo podem sofrer a influência da lipotoxicidade, uma vez que a função insulínica prejudicada em animais diabéticos pode levar ao excesso de ácidos graxos livres32. Este método também não requer agentes de bioligação ou sutura para evitar a perda de ilhotas implantadas. Como observado na Figura 3C, as ilhotas permanecem enxertadas com sucesso no tecido adiposo até 1 mês após o transplante e a manutenção do nível glicêmico foi confirmada após a enxertectomia23. Este fenômeno pode ser devido à capacidade do tecido adiposo de prender as ilhotas, que se tornam difíceis de descascar.
As vantagens deste método são que é tecnicamente fácil de realizar, permite uma avaliação metabólica e histológica dos efeitos terapêuticos das ilhotas e facilita a avaliação da expressão gênica e/ou proteica das ilhotas após a enxerectomia. Em comparação com estudos anteriores, a eficácia desse método não é inferior à do transplante de ilhotas em tecido adiposo branco epididimal 10,33,34,35,36. É importante notar que uma semeadura precisa das ilhotas no tecido adiposo branco epididimal sem perda de ilhotas é necessária para um enxerto bem-sucedido. Para garantir o sucesso, todo o volume de ilhotas deve ser aspirado suavemente na ponta da micropipeta a partir do tubo de plástico de 1,5 mL, pois a pipetagem áspera e rápida pode resultar na adesão das ilhotas às paredes do tubo de plástico, dificultando a dispensação. A adesão das ilhotas é uma das principais razões para a semeadura inadequada das ilhotas. Depois de permitir que as ilhotas se depositem na ponta da micropipeta, as ilhotas devem ser implantadas no tecido adiposo epididimal sem rubor. É importante minimizar a depressão do botão do êmbolo ao aspirar e dispensar as ilhotas para evitar a lavagem excessiva do tecido adiposo médio/tampão. Portanto, é essencial esperar até que as ilhotas tenham se agregado completamente na ponta da ponta da micropipeta antes de pressionar o botão de êmbolo da micropipeta para implantação. É suficiente colocar a ponta levemente sobre o tecido adiposo e confirmar a semeadura de ilhotas no tecido por microscopia de luz.
Em conclusão, este método é muito simples, apesar de exigir várias etapas críticas para o seu sucesso. Esperamos que a ampla adoção deste método ajude ainda mais na facilitação do enxerto de ilhotas no tecido adiposo branco e para uma avaliação mais aprofundada dos efeitos terapêuticos das ilhotas de bioengenharia.
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Disclosures
Não temos conflito de interesses.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (19K09839, NS) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
- Barton, F. B., et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
- Balamurugan, A. N., et al. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010. American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).
- Collaborative Islet Transplant Registry. Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).
- Rajab, A., et al. Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection. Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).
- Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen. Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).
- Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation. Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).
- Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch. Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).
- Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch. American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).
- Kasoju, N., et al. Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules. Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation. Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).
- Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation. Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).
- Fujita, M., et al. Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs. Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).
- Sakata, N., et al. Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).
- Cantarelli, E., et al. Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver. Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).
- White, S. A., et al. The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation. Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).
- Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice. PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).
- Sakata, N., et al. Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival. Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).
- Nagaya, M., et al. Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).
- Weaver, J. D., et al. Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites. Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).
- Chen, X., et al. The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass. Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).
- Sakata, N., et al. Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue. Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).
- Navarro-Requena, C., et al. PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation. Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).
- Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes. Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).
- Manzoli, V., et al. Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol. American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions. Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).
- Noguchi, H., et al. Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation. Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).
- Itoh, T., et al. Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model. Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).
- Komatsu, H., et al. Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets. Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).
- Unger, R. H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome. Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).
- Mao, D., et al. A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival. Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).
- Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).
- Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice. Biomaterials. 138, 80-90 (2017).
- Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice. Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).
