Summary
طريقة زرع الجزر المغطاة بالدهون مناسبة للكشف عن الجزر الصغيرة المحفورة في التجويف داخل الصفاق. والجدير بالذكر أنه لا يتطلب استخدام عوامل الربط الحيوي أو الخياطة.
Abstract
زرع الجزيرة هو علاج بديل خلوي لمرض السكري الحاد. عادة ما يكون التجويف داخل الصفاق هو موقع الزرع لهذا الإجراء. ومع ذلك ، فإن زرع الجزيرة داخل الصفاق له بعض القيود ، بما في ذلك ضعف فعالية الزرع ، والقدرة على اكتشاف الكسب غير المشروع ، ونقص القدرة على استئصال الطعم لتحليل ما بعد الزرع. في هذه الورقة ، يتم استخدام "زرع الجزر المغطاة بالدهون" ، وهي طريقة زرع جزيرة داخل الصفاق تستخدم الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية ، لتقييم الآثار العلاجية للجزر المهندسة بيولوجيا. تكمن بساطة الطريقة في بذر الجزر على الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية واستخدام الأنسجة لتغطية الجزر. في حين يمكن تصنيف هذه الطريقة على أنها تقنية زرع جزيرة داخل الصفاق ، إلا أنها تشترك في الخصائص مع زراعة الأنسجة داخل جزيرة الدهون. تظهر طريقة زرع الجزر المغطاة بالدهون تأثيرات علاجية أكثر قوة من زراعة الأنسجة داخل الأنسجة الدهنية ، بما في ذلك تحسين مستويات الجلوكوز في الدم والأنسولين في البلازما وإمكانية إزالة الكسب غير المشروع. نوصي باعتماد هذه الطريقة لتقييم آليات نقش الجزر في الأنسجة الدهنية البيضاء والآثار العلاجية للجزر المهندسة بيولوجيا.
Introduction
زرع الجزيرة هو علاج بديل خلوي للمرضى الذين يعانون من داء السكري الحاد. أظهرت التقارير الأخيرة أن معدلات استقلال الأنسولين بعد ثلاث سنوات من الزرع تتحسن بنسبة تصل إلى 44٪ 1 وأن ما يقرب من 80٪ من المتلقين الذين يتلقون أكثر من 600000 مكافئ إجمالي للجزيرة يحققون استقلال الأنسولين2. علاوة على ذلك ، في أحدث تقرير لسجل زراعة الجزر التعاوني ، تم الكشف عن أن مستويات الجلوكوز في الدم الصائم تم الحفاظ عليها عند 60-140 مجم / ديسيلتر لأكثر من 5 سنوات في أكثر من 70٪ من المرضى الذين خضعوا لعملية زرع جزيرة وحدها. حددت الدراسة أيضا أن حوالي 90٪ من المرضى الذين خضعوا لعملية زرع جزيرة بمفردهم أو زرع جزيرة بعد زرع الكلى لم يصابوا بأي أحداث سكر الدم شديدة لأكثر من 5 سنوات3.
على الرغم من تحسن النتائج السريرية لهذا العلاج ، إلا أنه لا يزال يتعين معالجة بعض القيود ، بما في ذلك ضرورة إنشاء موقع زرع مثالي. الكبد هو موقع زرع نموذجي لزراعة الجزر السريرية لأنه أكبر عضو يمكن أن يستوعب عددا كبيرا من الجزر. ومع ذلك ، في بعض المرضى ، يكون الكبد غير متوفر (على سبيل المثال ، بسبب ارتفاع ضغط الدم البابي و / أو التهاب الكبد و / أو تليف الكبد4) وبالتالي مواقع أخرى ، بما في ذلك الفضاء تحت المحفظة الكلوي5،6 ، الجيب omental7،8،9،10 ، المساريق 11 ، الجهاز الهضمي 12 ، العضلات الهيكلية 13 ، الأنسجة تحت الجلد13 ، نخاع العظام 14 ، والطحال 15 ، 16،17 ، تم اعتبارها مواقع زرع بديلة.
على الرغم من أنه يمكن إجراء عملية زرع الجزيرة داخل الصفاق بسهولة تحت التخدير الموضعي ، مما يجعل التجويف داخل الصفاق موقعا جذابا لزراعة الجزر السريرية ، إلا أنه عند الزرع ، تنتشر الجزر في جميع أنحاء التجويف داخل الصفاق بأكمله ، مما يجعل اكتشاف النقش الجزري وتأكيد engraftment الناجح أمرا صعبا. لذلك ، لا يتم التعرف على التجويف داخل الصفاق على نطاق واسع كموقع زرع سريري مثالي. بدلا من ذلك ، يتم استخدامه بشكل متكرر كنموذج تحكم للدراسات قبل السريرية للتحقيق في فعالية الجزر المزروعة المغلفة18 والجزر المهندسة بيولوجيا19. ومع ذلك ، من الصعب إجراء مقارنة دقيقة بين الجزر المهندسة بيولوجيا والجزر الضابطة بسبب التحديات في إجراء تقييم دقيق للنقش.
في المقابل ، تم الإبلاغ جيدا عن استخدام الأنسجة الدهنية البيضاء داخل الصفاق في الجيب 8 ، والمساريق ، والمواقع الأخرى خارج الكبد 10،20،21،22،23 والعديد من الدراسات التي تبحث في وظيفة الجزر المهندسة بيولوجيا المزروعة باستخدام الأنسجة الدهنية البيضاء كانت قادرة على الإبلاغ عن نتائج علاجية واعدة20،24،25 ، 26. نظرا لأن استخدام الأنسجة الدهنية البربخية يسهل اكتشاف الجزر المزروعة ، فقد تم تطوير "طريقة زرع الجزر المغطاة بالدهون" ، باستخدام الأنسجة الدهنية البربخية ، للتغلب على قيود زرع الجزر داخل الصفاق. في هذه الورقة ، تم وصف زراعة الجزر المغطاة بالدهون باستخدام الأنسجة الدهنية البربخية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ الإجراء التالي في ثلاث خطوات. تتضمن الخطوة الأولى تحريض مرض السكري في الفئران المتلقية وعزل الجزر المانحة. تتضمن الخطوة الثانية إعداد الجزر قبل الزرع. في الخطوة الثالثة ، يتم إجراء زرع الجزر على الأنسجة الدهنية البربخية وتغطية الجزر باستخدام الأنسجة الدهنية. بعد ذلك ، تم تقييم الآثار العلاجية. يتوافق التعامل مع الفئران والإجراءات التجريبية التي أجريت في هذه الدراسة مع "مبادئ رعاية المختبر" (دليل رعاية واستخدام المختبر ، منشور المعاهد الوطنية للصحةالطبعة 8 ، 2011) ، وتمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة فوكوكا (رقم الموافقة: 186018).
1. التحضير الجراحي
- تحريض داء السكري: تحفيز مرض السكري في 20-25 جم من وزن الجسم ، ذكور الفئران المتلقية البالغة من العمر 8-12 أسبوعا من خلال الحقن في الوريد من محلول الستربتوزوتوسين 18 مجم / مل المحضر في محلول سترات 0.1M (180 مجم / كجم من وزن الجسم). تعتبر الفئران التي تزيد مستويات الجلوكوز في الدم فيها عن 400 مجم / ديسيلتر مصابة بمرض السكري. استخدام الفئران السكري في غضون 1 أسبوع بعد تحريض مرض السكري قبل ضمور مفرط من الأنسجة الدهنية البيضاء البربخ لتغطية الجزر.
- عزل الجزيرة: قم بإجراء عزل جزيرة الفئران قبل يوم واحد من الزرع باتباع طريقة Gotoh27 لعزل الجزيرة.
- باختصار ، هضم أنسجة البنكرياس باستخدام محلول كولاجيناز. عزل الجزر عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة باستخدام محلول فصل الخلايا المناسب. ثم الجزر الاستزراع بين عشية وضحاها في حاضنة عند 22 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 (تم الإبلاغ عن الثقافة عند <37 درجة مئوية لمنع موت الجزر28،29،30،31).
ملاحظة: تعامل مع مزارع الجزيرة المنقاة في خزانة أمان. قم بتعقيم جميع المحاليل المستخدمة لعزل الجزر واستزراعها باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
2. تحضير الجزر الصغيرة للزرع
- اجمع الأدوات والمواد المناسبة كما هو موضح في الشكل 1 أ.
- نظرا لأن الإنزيمات الهاضمة مثل الأميليز والليباز قد تؤدي إلى إصابة الجزر المعزولة والمزروعة ويمكن أن يحدث فقدان للجزر من الوقوع في الأنسجة الليفية الملوثة داخل طبق المزرعة ، قبل الزرع ، استخدم ملقط لاختيار أي مكونات خارج الجزيرة من البنكرياس ، بما في ذلك الأنسجة العنيبية والليفية (الشكل 1 ب) ، تحت المجهر تشريح. بعد الانتقاء ، استخدم مصفاة الخلايا لتصفية الخلايا العنيبية المفردة.
- انقل الجزر المفلترة إلى طبق استزراع جديد يحتوي على أي وسط استزراع مناسب أو محلول عازل (على سبيل المثال ، DMEM مع انخفاض الجلوكوز أو RPMI1640 أو CMRL1066 أو HBSS) مكمل بمصل بقري أو ألبومين لمنع ارتباط الجزيرة بالبلاستيك وتدوير الطبق لوضع الجزر في وسط الطبق (الشكل 1 ج). باستخدام ماصة P200 الدقيقة والمجهر ، اختر الجزر الفردية في أنبوب تجميع مناسب (الشكل 1D).
- ضع مصفاة خلية جديدة 40 ميكرومتر فوق أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل (الشكل 1E يسارا ووسطا) واغسل الفلتر بوسط جديد (الشكل 1E على اليمين).
- استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لإضافة الجزر إلى المصفاة لفصل الجزر والخلايا العنيبية المفردة (الشكل 1 F1 والشكل 1F2).
ملاحظة: ستكون الجزر المنقاة على مصفاة الخلايا نقية بنسبة 100٪ تقريبا. - استخدم ملقط لقلب المصفاة على طبق استزراع جديد غير معالج بحجم 60 أو 100 مم يحتوي على وسط استزراع أو محلول عازل مناسب مكمل بمصل بقري أو ألبومين (الشكل 1 F3 والشكل 1F4). استخدم وسيطا / عازلا طازجا لغسل الجزر في طبق ثقافة جديد. ثم أضف ما يكفي من الوسط / المخزن المؤقت إلى طبق الاستزراع للوصول إلى حجم إجمالي يبلغ حوالي 20 مل.
- عد الجزر تحت المجهر وقسم عدد الجزر بالتساوي بين أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية الفردية سعة 1.5 مل وفقا لعدد الحيوانات المانحة (الشكل 1G). على سبيل المثال ، ستتم إضافة مائتي جزيرة مكافئة من 100-200 ميكرومتر (IEQ) من فأرين إلى كل من أنبوبين.
- الطرد المركزي للجزر في 2100 × غرام في غضون 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من طاف الأسنان. عادة ما يبقى حوالي 20-30 ميكرولتر من المحلول المتبقي في الأنبوب (الشكل 1H).
3. زرع جزيرة على الأنسجة الدهنية البربخ وتغطيتها بالأنسجة الدهنية البيضاء البربخ
- قبل الجراحة ، اجمع آلة تخدير للحيوانات الصغيرة ، مجهر ستيريو ، مصدر ضوء ، ماصة دقيقة 50-200 ميكرولتر مع أطراف ماصة دقيقة 200 ميكرولتر ، مسحات قطنية ، مجموعة خياطة 4-0 ، وأدوات جراحية مطهرة (الشكل 2 أ). الأوتوكلاف مقص كوبر ، مقص العيون ، ملقط البازلاء ، ملاقط ، وحوامل الإبر. بعد التعقيم ، اغمر الجهاز في محلول بوفيدون اليود 1٪ (الشكل 2 أ). استخدم مسحات القطن لتعبئة الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية وللإرقاء في حالات النزيف. استخدم ماصة صغيرة مع نصائح 50-200 ميكرولتر لزرع الجزيرة.
- تسليم التخدير إلى الفأر المتلقي لمرض السكري باستخدام عامل مخدر مستنشق (2٪ إيزوفلوران في الأكسجين). ضع مادة تشحيم العيون على كلتا العينين لمنع الجفاف. ثم ضع الماوس في وضع الاستلقاء (الشكل 2 ب على اليسار) وقم بإزالة الشعر من البطن لمنع العدوى باستخدام ماكينة قص الشعر و / أو كريم مزيل الشعر. تطهير البطن والمنطقة الأربية باستخدام ثلاث جولات متناوبة على الأقل من محلول بوفيدون اليود متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول (الشكل 2 ب على اليمين). قبل الجراحة ، تأكد من عمق التخدير عن طريق عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم. توفير الدعم الحراري أثناء العملية باستخدام وسادة التدفئة واستخدام الستارة الجراحية لتأمين المنطقة الجراحية المعقمة.
- شق الجلد في المنطقة المتوسطة السفلية (الشكل 2C اليسار). يوصى بشق الجلد الذي يبلغ طوله حوالي 2 سم. قم بتثبيت جدار البطن الأيسر باستخدام ملقط البازلاء (يمكن أيضا استخدام ملقط غير رضحي أو مبعد) واسحب الأنسجة إلى الجانب الأيسر من الماوس لتأمين المجال الجراحي (الشكل 2C الأيمن). بعد بضع البطن ، قم بتقليل نسبة الأيزوفلوران إلى 1.0-1.5٪ للحفاظ على التخدير.
- استخدم قطعة قطن لتعبئة الأمعاء الدقيقة والغليظة إلى الجانب الأيمن من الماوس (أي الجانب الأيسر من المشغل). توجد الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية اليسرى في تجويف البطن في المنطقة الأربية اليسرى. قم بتعبئة الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية والخصية اليسرى إلى خارج البطن (الشكل 2D إلى اليسار) وتمديد الأنسجة (2D اليمين).
- استخدم ماصة صغيرة P200 مزودة بطرف ماصة 200 ميكرولتر لجمع الحجم الكامل للجزر من أنبوب واحد سعة 1.5 مل مع ماصة لطيفة (الشكل 2E الأيسر) ، مع الحرص على عدم ترك أي جزر صغيرة في الأنبوب عند التجميع. اسمح للجزر المجمعة بالاستقرار على طرف الماصة عن طريق الجاذبية (الشكل 2E على اليمين).
- ضع طرف الماصة الدقيقة برفق على الأنسجة الدهنية المنتفخة. مع الحرص على منع التدفق المفرط للوسط / المخزن المؤقت في الطرف ، قم بزرع الجزر بعناية على الأنسجة (الشكل 2F اليسار). بعد البذر ، تأكد من الموضع الصحيح للجزر تحت مجهر تشريح (الشكل 2F على اليمين).
- قم بتغطية الجزر بالأنسجة الدهنية البيضاء البربخية (الشكل 2G). ليست هناك حاجة لاستخدام الغرز أو عوامل الربط الحيوي.
- ضع الخصية اليسرى تحت الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية وأعد الأنسجة إلى التجويف داخل الصفاق (الشكل 2H). أغلق الجلد في طبقتين (الصفاق ، ثم العضلات والجلد) باستخدام خياطة 4-0 (يمكن استخدام أي خيوط مثل النايلون أو الغرز القابلة للامتصاص) (الشكل 2I). حقن حمض أسيتيل الساليسيليك (300 ملغ/كغ; SQ) بالقرب من الجرح لتسكين ما بعد الجراحة. ثم ضع الماوس تحت مصباح حراري ومراقب حتى الشفاء التام.
4. المراقبة بعد زرع الجزيرة (ملخص)
- تقييم الآثار العلاجية لزراعة الجزر من خلال مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم واختبار تحمل الجلوكوز والتقييم النسيجي في يوم ما بعد الجراحة (POD) 28.
- راقب نسبة الجلوكوز في الدم ، بما في ذلك قياسات الجلوكوز في الدم في اختبار تحمل الجلوكوز ، باستخدام مقياس جلوكوز صغير.
- جمع عينات الدم (ميكرولتر صغير) من الوريد الذيل. فيما يتعلق بالتقييم النسيجي ، تم الكشف عن أنسولين الفئران (للكشف عن الجزر المطعمة) وعامل فون ويلبراند (للكشف عن الأوعية ، وهو دليل على نقش الجزيرة) في الجزر المزروعة في الأنسجة الدهنية البربخية المستعادة بواسطة الكيمياء المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لمقارنة فعالية زرع الجزر المغطاة بالدهون مع تلك التي بعد زرع جزيرة داخل الصفاق ، تم زرع نفس العدد من الجزر على الصفاق في الفضاء النظير الأيسر للحيوانات المصابة بالسكري المتلقية للسيطرة. لوحظ أن مستويات الجلوكوز في الدم لدى الفئران المصابة بزراعة الجزر المغطاة بالدهون تنخفض تدريجيا وبشكل ملحوظ مقارنة بالفئران المزروعة داخل جزيرة الصفاق (p = 0.0023; الشكل 3 أ). بعد شهر واحد من الزرع ، تم الحفاظ على نسبة الجلوكوز في الدم في الفئران المصابة بزراعة جزيرة مغطاة بالدهون عند مستويات أقل من تلك التي لوحظت في الفئران المزروعة داخل الصفاق كما تم تقييمها بواسطة اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق (p = 0.0046; الشكل 3 ب). علاوة على ذلك ، كما ذكرنا سابقا ، تحسنت مستويات الأنسولين في البلازما أيضا بعد زرع جزيرة مغطاة بالدهون. كما تم تأكيد إعادة رفع مستويات الجلوكوز في الدم. توضح هذه البيانات أن زرع الجزر المغطاة بالدهون داخل الصفاق باستخدام 200 IEQs يمكن أن يحسن بشكل كبير من حالات مرض السكري للفئران المتلقية.
كما تم إجراء الفحص النسيجي لتقييم نقش الجزيرة في الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. في الحيوانات المتلقية لزراعة الجزر المغطاة بالدهون ، يكشف تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين عن وجود جزر داخل الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية (الشكل 3 ج ، الصورة العلوية). بالإضافة إلى ذلك ، سهل تلطيخ الأجسام المضادة المترافق بالفلورة للجزر الإيجابية للأنسولين الكشف عن الأوعية الدقيقة الإيجابية لعامل فون ويلبراند داخل الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية لجميع الفئران المتلقية (n = 6; الشكل 3 ج). في المقابل ، في الفئران المزروعة داخل جزيرة داخل الصفاق ، لم يلاحظ أي جزر مغمورة في الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية أو جدار البطن (البيانات غير معروضة).
الشكل 1-ABC. تحضير الجزر الصغيرة للزرع على الأنسجة الدهنية البربخية وتغطيتها بالأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. (أ) تحضير الأدوات: أ. مساعدة الماصة ، ب. أطراف ماصة 10 مل ، ج. أنابيب بلاستيكية سعة 50 مل ، د. أنابيب بلاستيكية سعة 15 مل ، ه. 50-200 ميكرولتر (يسار) و 200-1000 ميكرو لتر (يمين) ، و. أنابيب طرد مركزي بلاستيكية سعة 1.5 مل ، ز. 200 و 1000 ميكرو لتر أطراف ماصة ، ح. متوسطة أو عازلة تحتوي على الألبومين أو مصل بقري جنيني (أي DMEM مع انخفاض الجلوكوز الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني و 100 وحدة / مل بنسلين + 100 وحدة / مل محلول ستربتومايسين) ، و I. مصفاة خلية 40 ميكرومتر. (ب) الجزر المعزولة ذات الأسينار (يسار: يشار إليها بالسهم) والأنسجة الليفية (يمين). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ج) الجزر المجمعة في الأنبوب البلاستيكي. اليسار ، الجزر المتفرقة في طبق الثقافة. مركز ، يتم جمع الجزر في وسط طبق الثقافة عن طريق دوامة. الحق ، الجزر التي تم جمعها في وسط الطبق. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 1-DEF. تحضير الجزر الصغيرة للزرع على الأنسجة الدهنية البربخية وتغطيتها بالأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. (د) تنقل الجزر المجمعة (يسار) إلى أنابيب بلاستيكية سعة 15 مل (يمين). (ه) يتم وضع مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر أعلى الأنبوب البلاستيكي سعة 50 مل (اليسار والوسط). تمت إضافة وسيط / مخزن مؤقت معد إلى أنبوب بلاستيكي آخر سعة 50 مل لشطف الجزر الموجودة على مصفاة الخلية في طبق مزرعة جديد (يمين). (و) 1. الجزر التي تم جمعها باستخدام ماصة صغيرة 200-1000 ميكرولتر. 2. سكب الجزر في مصفاة الخلية. 3 و 4. متوسط / مخزن مؤقت يستخدم لغسل الجزر على مصفاة في طبق ثقافة جديد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 1-GH. تحضير الجزر الصغيرة للزرع على الأنسجة الدهنية البربخية وتغطيتها بالأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. (ز) الجزر مقسمة إلى أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 1.5 مل وفقا لعدد الفئران المستقبلة. هنا ، تم تقسيم مائتي جزيرة مكافئة 100-200 ميكرومتر (IEQ) بالتساوي في كل أنبوب. (ح) الجزر مقسمة بالتساوي في أنابيب سعة 1.5 مل قبل الطرد المركزي (يسار). جزر الطرد المركزي لجمع في أسفل الأنبوب (وسط). يبقى 20-30 ميكرولتر من المادة الطافية في الأنبوب بعد التخلص من المحلول الزائد (يمين). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2-ABC. إجراء زرع الجزيرة على الأنسجة الدهنية البربخ وتغطيتها باستخدام الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. (أ) تحضير الأدوات: أ. آلة التخدير للحيوانات الصغيرة ، ب. المجهر المجسم ، ج. مصدر الضوء ، د. الأدوات الجراحية المطهرة ، ه. الجزر المقسمة في أنابيب بلاستيكية سعة 1.5 مل ، f. 50-200 ميكروماصات ، g. 200 ميكرولتر من أطراف الماصة الدقيقة ، و h. 4-0 الغرز. (ب) فأر متلقي لمرض السكري في وضع الاستلقاء تحت التخدير العام بنسبة 2٪ إيزوفلوران (يسار). يتم تطهير البطن والمنطقة الأربية باستخدام 70٪ من الإيثانول وتغطيتها بمناديل معملية ورقية (يمين). (ج) يتم شق الجلد في الموضع المتوسط السفلي (يسار). يتم تثبيت جدار البطن الأيسر بواسطة ملقط البازلاء وسحبه إلى الجانب الأيسر من الفأر لتأمين المجال الجراحي (يمين). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2-DEF. إجراء زرع الجزيرة على الأنسجة الدهنية البربخ وتغطيتها باستخدام الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. (د) يتم تحريك الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية اليسرى والخصية اليسرى خارج البطن (يسار) ومنتفخة (يمين). شريط المقياس = 1 سم. (ه) يتم جمع الجزر في أنابيب بلاستيكية سعة 1.5 مل بالكامل باستخدام ماصة صغيرة بطرف ماصة 200 ميكرولتر (يسار). يسمح للجزر المجمعة (المشار إليها بالسهم) بالغرق تماما عن طريق الجاذبية إلى طرف الماصة (يمين). (F) طرف الماصة الدقيقة يوضع برفق على الأنسجة الدهنية المنتفخة (يسار). بذر الجزيرة (دائرة منقطة) على الأنسجة المؤكدة عن طريق تشريح المجهر (يمين). شريط المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2-GHI. إجراء زرع الجزيرة على الأنسجة الدهنية البربخ وتغطيتها باستخدام الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. (ز) الجزر مغطاة بأنسجة دهنية بيضاء من البربخ. (ح) عادت الخصية اليسرى والأنسجة الدهنية البيضاء البربخية إلى التجويف داخل الصفاق. (I) صورة بعد إغلاق البطن. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3. التأثير العلاجي لزراعة الجزر المغطاة بالدهون. أ: مستوى الجلوكوز في الدم. الخط الأزرق: زرع جزيرة مغطاة بالدهون (ن = 6) ؛ الخط البرتقالي: زرع جزيرة داخل الصفاق (ن = 6) تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل المقاييس المتكررة للتباين وتم تعريف الفرق المعنوي على أنه p < 0.05. ب: اختبار تحمل الجلوكوز في الدم بعد شهر من الزرع. الخط الأزرق: زرع جزيرة مغطاة بالدهون (ن = 6) ؛ الخط البرتقالي: زرع جزيرة داخل الصفاق (ن = 6). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام المقاييس المتكررة لتحليل التباين وتم تعريف الفرق المعنوي على أنه p < 0.05. (ج) صورة نسيجية للجزر المحفورة بعد شهر واحد من الزرع. الصورة العلوية: تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين. الصورة السفلية: تلطيخ مناعي لأنسولين الفئران (أخضر) وعامل فون ويلبراند (vWF: أحمر ، يشار إليه بسهم أبيض). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتضمن طريقة زراعة الجزر المغطاة بالدهون تقنيات من تقنيتين مختلفتين للزراعة: زرع جزيرة داخل الصفاق وزرع جزيرة الأنسجة الدهنية. نظرا لأن الغشاء السطحي للأنسجة الدهنية البيضاء البربخية يعتبر النسيج الدهني الأبيض الذي يغطيه الصفاق والمرتبط بالبربخ ، يمكن تصنيف طريقة زرع الجزيرة المغطاة بالدهون تشريحيا كنوع من زرع الجزر داخل الصفاق. ومع ذلك ، فإن التقنية التي يتم من خلالها تسليم الجزر إلى الحيوان المتلقي ، تشبه إلى حد كبير تلك المستخدمة في زراعة الأنسجة داخل الأنسجة الدهنية. تظهر بياناتنا أن التأثير العلاجي لطريقة زرع الجزر المغطاة بالدهون يتفوق على تأثير زراعة الجزيرة داخل الصفاق. أظهرت دراستنا السابقة أيضا أن فعالية الزرع لهذه الطريقة تساوي تقريبا فعالية زرع جزيرة تحت المحفظة الكلوية ، وهي طريقة لزرع جزيرة ذات فعالية زرع أعلى23. يعتقد أن فائدة هذه الطريقة قد تكون بسبب جزيئات الالتصاق الموجودة داخل الأنسجة الدهنية البيضاء و adipocytokines والتي يعتقد أنها تساهم في نقش الجزيرة10,23.
يسمح حجم الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية باستيعاب كمية كبيرة من الجزر. في المقابل ، فإن الثرب الأكبر للقوارض صغير جدا بحيث لا يمكن احتواؤه بسهولة والوصول إلى العديد من الجزر. القيد المادي الوحيد للأنسجة الدهنية البيضاء البربخية كموقع تجريبي محتمل لزراعة الجزر هو أنه لا يوفر دورة بوابة الأنسولين10.
هذه الطريقة فريدة من نوعها لأن الجزر مغطاة بالأنسجة الدهنية ، بدلا من غرسها مباشرة في الأنسجة. قد تعاني الجزر المزروعة داخل الأنسجة الدهنية من تأثير السمية الدهنية ، حيث يمكن أن يؤدي ضعف وظيفة الأنسولين في الحيوانات المصابة بالسكري إلى زيادة الأحماض الدهنية الحرة32. لا تتطلب هذه الطريقة أيضا عوامل ربط بيولوجي أو خياطة لمنع فقدان الجزيرة المزروعة. كما لوحظ في الشكل 3C ، تظل الجزر محفورة بنجاح داخل الأنسجة الدهنية لمدة تصل إلى شهر واحد بعد عملية الزرع وتم تأكيد الحفاظ على مستوى الجلوكوز في الدم بعد استئصال الطعم23. قد تكون هذه الظاهرة بسبب قدرة الأنسجة الدهنية على حبس الجزر ، والتي يصبح من الصعب تقشيرها.
تتمثل مزايا هذه الطريقة في أنها سهلة الأداء تقنيا ، وتسمح بتقييم التمثيل الغذائي والنسيجي للتأثيرات العلاجية للجزر ، وتسهل تقييم جين الجزيرة و / أو تعبير البروتين بعد استئصال الطعم. بالمقارنة مع الدراسات السابقة ، فإن فعالية هذه الطريقة ليست أدنى من فعالية زرع الجزيرة في الأنسجة الدهنية البيضاء البربخ10،33،34،35،36. من المهم ملاحظة أن البذر الدقيق للجزر على الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية دون فقدان الجزر أمر ضروري لنجاح عملية النقش. لضمان النجاح ، يجب استنشاق الحجم الكامل للجزر برفق في طرف الماصة الدقيقة من الأنبوب البلاستيكي سعة 1.5 مل ، حيث قد يؤدي السحب الخشن والسريع إلى التصاق الجزيرة بجدران الأنبوب البلاستيكي ، مما يجعل الاستغناء عنه صعبا. التصاق الجزيرة هو سبب رئيسي لعدم كفاية بذر الجزيرة. بعد السماح للجزر بالاستقرار عند طرف طرف الماصة الدقيقة ، يجب زرع الجزر على الأنسجة الدهنية البربخية دون الاحمالاح. من المهم تقليل انخفاض زر المكبس عند شفط الجزر وتوزيعها لمنع التنظيف المفرط للأنسجة الدهنية المتوسطة / العازلة. لذلك ، من الضروري الانتظار حتى تتجمع الجزر بالكامل عند طرف طرف الماصة الدقيقة قبل الضغط على زر المكبس في الماصة الدقيقة للزرع. يكفي وضع الطرف برفق على الأنسجة الدهنية وتأكيد بذر الجزر على الأنسجة عن طريق الفحص المجهري الضوئي.
في الختام ، هذه الطريقة بسيطة للغاية ، على الرغم من أنها تتطلب عدة خطوات حاسمة لنجاحها. نأمل في اعتماد هذه الطريقة على نطاق واسع للمساعدة بشكل أكبر في تسهيل نقش الجزر على الأنسجة الدهنية البيضاء ولمزيد من التقييم للآثار العلاجية للجزر المهندسة بيولوجيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة من خلال منحة معونة للبحث العلمي (C) (19K09839، NS) من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
- Barton, F. B., et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
- Balamurugan, A. N., et al. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010. American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).
- Collaborative Islet Transplant Registry. Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).
- Rajab, A., et al. Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection. Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).
- Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen. Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).
- Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation. Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).
- Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch. Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).
- Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch. American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).
- Kasoju, N., et al. Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules. Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation. Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).
- Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation. Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).
- Fujita, M., et al. Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs. Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).
- Sakata, N., et al. Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).
- Cantarelli, E., et al. Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver. Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).
- White, S. A., et al. The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation. Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).
- Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice. PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).
- Sakata, N., et al. Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival. Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).
- Nagaya, M., et al. Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).
- Weaver, J. D., et al. Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites. Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).
- Chen, X., et al. The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass. Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).
- Sakata, N., et al. Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue. Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).
- Navarro-Requena, C., et al. PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation. Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).
- Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes. Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).
- Manzoli, V., et al. Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol. American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions. Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).
- Noguchi, H., et al. Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation. Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).
- Itoh, T., et al. Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model. Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).
- Komatsu, H., et al. Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets. Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).
- Unger, R. H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome. Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).
- Mao, D., et al. A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival. Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).
- Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).
- Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice. Biomaterials. 138, 80-90 (2017).
- Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice. Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).
